Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn malolactic và ứng dụng trong công nghệ sản xuất rượu vang

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------------

NGUYỄN ĐÌNH DŨNG

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN
VI KHUẨN MALOLACTIC VÀ ỨNG DỤNG
TRONG CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT RƯỢU VANG

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60420107

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2015


MỞ ĐẦU
Rượu vang là đồ uống có cồn được sản xuất từ quá trình lên men dịch quả
nói chung mà phổ biến nhất là từ quả nho. Do nho là loại quả có thành phần hoá học
thích hợp cho nấm men phát triển và có hương thơm đáp ứng được những yêu cầu
cho sản xuất rượu vang chất lượng cao. Trải qua lịch sử hình thành và phát triển lâu
đời, rượu vang nho với nồng độ rượu vừa phải từ 10-14%v là đồ uống có lợi cho
sức khỏe của con người với giá trị dinh dưỡng cao, hương vị thơm ngon rất được ưa
chuộng ở khắp nơi trên thế giới. Từ nhiều năm nay, rượu vang nho đã trở thành
thức uống phổ biến ở nước ta. Thị trường rượu vang trong nước rất phát triển, tuy
nhiên vẫn chưa đáp ứng được yêu cầu cả về chất và lượng. Theo số liệu của Tổng
cục thống kê, kể từ năm 2010 đến nay, rượu vang nhập khẩu đã tăng khoảng 25%/
năm. Trong đó, Ninh Thuận được biết đến là vùng trồng nho chính có sản lượng lớn
nhất cả nước, hiện trồng chủ yếu là giống nho Red Cardinal thường dùng để ăn tươi

hơn là để lên men rượu vì cho màu sắc nhạt, không hấp dẫn. Do vậy, chất lượng
rượu vang Việt Nam hiện nay chưa thật cao khi so sánh với rượu vang nhập khẩu
do hương và vị sản phẩm chưa đạt tiêu chuẩn, màu sắc dễ bị nâu hoá, sản phẩm bị
lắng cặn…Với tiềm năng về thị trường lớn như ở nước ta, việc cải tiến công nghệ
để sản xuất rượu vang nho là vấn đề đang rất được quan tâm.
Nhiều nước trên thế giới đã giải quyết được vấn đề này bằng những nghiên
cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất rượu vang nho đi sâu làm rõ các cơ chế như: sự
chuyển hóa các thành phần trong nho thành các chất thơm trong rượu vang, tác
động của điều kiện môi trường đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn
malolactic trong quá trình lên men malolactic[26, 27]…Quá trình lên men rượu
vang là quá trình lên men thực hiện chủ yếu nhờ nấm men và một phần bởi vi khuẩn
lactic có mặt trên quả nho hoặc trên thiết bị làm rượu. Nấm men sử dụng hệ enzym
của mình để chuyển hóa glucoza và một số đường khác thành rượu và các sản phẩm
phụ khác (rượu bậc cao, este, các axít hữu cơ...), trong khi đó vi khuẩn lactic
chuyển hóa axít malic thành axít lactic và CO 2 bằng quá trình lên men malolactic.
Lên men malolactic đóng vai trò quan trọng trong sản xuất rượu vang đỏ và 1 số
loại vang trắng, đây là một quá trình không thể thiếu trong việc làm biến đổi các
thành phần hóa học, mang lại cho rượu vang những hương vị đặc trưng. Với điều
kiện, công nghệ sản xuất rượu vang của Việt Nam hiện nay, việc phân lập và tuyển
chọn một số chủng vi khuẩn lactic để tối ưu hóa quá trình lên men malolactic là rất
cần thiết. Điều này đã giúp các nhà sản xuất rượu vang kiểm soát quá trình sản xuất
rượu vang được tốt hơn, giảm rủi ro tạo ra các sản phẩm hỏng hoặc có chất lượng
không ổn định, đồng thời làm đa dạng các chủng loại rượu vang phục vụ cho nhu
cầu người tiêu dùng. Từ đó mở ra hướng nghiên cứu mới cho công nghệ sản xuất
rượu vang nho chất lượng cao của Việt Nam giải quyết những vấn đề thực tiễn của


ngành sản xuất rượu vang trong nước.Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu
tuyển chọn vi khuẩn malolactic và ứng dụng trong công nghệ sản xuất rượu vang”.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu chung về rượu vang
1.1.1 Vài nét về rượu vang
Rượu vang là thức uống có cồn được sản xuất bằng phương pháp lên men
không chưng cất từ dịch nho. Nhờ tác nhân lên men (lên men một giai đoạn) hoặc
nhờ nấm men và vi khuẩn lactic (lên men hai gian đoạn) đã tạo cho rượu vang có
hương vị đặc trưng, cũng như giá trị dinh dưỡng cao hơn hẳn các loại rượu khác.
Thuật ngữ “Rượu vang”- tiếng la tinh là “vinum”, được bắt nguồn từ chữ “vinea”,
có nghĩa là cây nho. Trước tiên việc sản xuất rượu vang được tiến hành bằng cách
ép lấy dịch quả nho, sau đó lên men hoàn toàn tự nhiên trong các hang đá. Người La
Mã có công truyền bá nghề trồng nho làm rượu sang Pháp Marseilles từ thế kỉ II,
sau đó là vùng Champagne và Monselle Valley vào khoảng thế kỉ IV. Pháp bắt đầu
xuất khẩu rượu vang sang Anh và Đức vào thế kỉ XII. Vào năm 1857, lần đầu tiên
trong lịch sử, Louis Pasteur công bố những nghiên cứu về quá trình lên men, xác
định rõ vai trò quan trọng của nấm men trong quá trình lên men rượu và sự biến đổi
hoá sinh trong quá trình lên men của nấm men. Đến nay đã có hàng trăm loại rượu
vang khác nhau đáp ứng được nhu cầu đa dạng của người tiêu dùng. Phân loại rượu
vang được dựa trên màu sắc: vang màu và vang trắng, trong các loại vang màu thì
rượu vang đỏ có giá trị cao nhất. Ngày nay nguyên liệu chế biến rượu vang được mở
rộng ra các loại nguyên liệu quả khác nhau, phong phú về màu sắc và chất lượng.
1.1.2 Công nghệ sản xuất rượu vang
Lên men là một quá trình trao đổi chất dưới tác dụng của các enzyme tương
ứng. Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men mà người ta chia các kiểu
lên men khác nhau. Có hai hình thức lên men chính là lên men yếm khí và lên
men hiếu khí. Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm
men, chúng sẽ chuyển hóa đường thành ethanol và CO 2. Thực chất đây là quá
trình oxi hoá - khử có mặt các enzyme của nấm men. Năng lượng sinh ra phục vụ
cho hoạt động sống của nấm men hoặc bị tiêu hao dưới dạng nhiệt. Sự thay đổi
nhiệt độ trong quá trình lên men có thể dẫn tới sốc nhiệt làm ảnh hưởng tới hoạt
tính của nấm men. Do vậy giữ nhiệt độ ổn định trong quá trình lên men là một

yếu tố quan trọng giúp quá trình lên men được hoàn thành.


Quá trình lên men rượu chia làm hai thời kỳ chính:
- Thời kỳ phát triển sinh khối: giai đoạn này với sự có mặt của oxy, tế bào nấm
men phát triển sinh khối.
- Thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu và CO 2: giai đoạn này nấm men
hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện xúc
tác sinh học trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rượu và CO 2.
Sản phẩm thu hồi của quá trình lên men rất phức tạp. Ngoài ethanol còn
nhiều chất khác như este, rượu bậc cao, các axit hữu cơ, glycerol, dầu fusel... Tỷ lệ
các sản phẩm phụ này phụ thuộc vào điều kiện của môi trường lên men.
Như vậy, ban đầu là quá trình lên men rượu được nấm men Saccharomyces
cerevissiae đảm nhận. Tiếp theo là hoạt động của các vi khuẩn Leuconostoc oenos,
Lactobacillus, Pediococcus chuyển hoá đường sót trong rượu vang non và quan
trọng hơn cả là quá trình lên men axít malic thành axít lactic và axít xitric thành axít
axetic, axetoin, diaxetyl, butađiol 2-3, góp phần đáng kể vào sự hình thành hương vị
đặc trưng của rượu vang “Đây chính là quá trình lên men Malolactic”. Trong
công nghệ sản xuất rượu vang, quá trình lên men malolactic được tiến hành sau khi
lên men chính, dịch lên men được gọi là “vang non” được tiến hành lắng gặn cặn và
được chuyển sang bồn hay nồi lên men tiếp theo.
1.2 Vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic là một bộ phận của hệ vi sinh vật tự nhiên trên quả nho, trong
dịch đường và rượu vang. Vi khuẩn lactic là những tế bào Gram dương, dị dưỡng
hoá năng hữu cơ, hoạt tính catalaza âm tính và axít lactic được xem là sản phẩm
cuối cùng của quá trình trao đổi chất của chúng [34]. Các loài thường gặp trong
sản xuất rượu vang chủ yếu thuộc các giống sau: Pediococcus, Leuconostoc,
Oenococcưs và Lactobacillus. Sự xuất hiện của các loại vi khuẩn lactic này trên
bề mặt quả nho là rất nhỏ, khoảng 100 tế bào/g quả (Lafon- Lafourcade et al.
1983).

Trong suốt quá trình sản xuất rượu vang, các vi khuẩn lactic phát triển, không
chỉ về số lượng mà còn có cả sự thay đổi của các loài. Vi khuẩn phân lập được
trên vỏ quả nho trước khi thu hoạch thuộc chủ yếu là các loài Lactobacillus
plantarum, L. hilgardii và L. casei (Carre, 1982). Loài Oenococcus oeni trước đây
được gọi là Leuconostoc oenos (Dicks et al. 1995) xuất hiện muộn hơn nhưng lại
là quan trọng nhất, rất hiếm khi chúng có mặt trên lá nho, quả nho và chỉ có số
lượng rất ít.
Lên men malolactic có thể hoàn thành ở cuối pha tĩnh hoặc đầu pha suy vong.
Nhưng nếu có các điều kiện là thích hợp, lên men malolactic có thể kết thúc ở


cuối pha phát triển. Cuối cùng, khi kết thúc lên men malolactic, cần phải Sulfit
hoá rượu vang để loại bỏ hoàn toàn các vi khuẩn còn sống.
1.2.1 Phân loại và kiểu hình của các vi khuẩn lactic trong rượu vang
Các vi khuẩn lactic thuộc nhóm các vi sinh vật Gram dương và do vậy được
nhuộm mầu bằng phép thử Gram có liên quan tới cấu tạo của thành tế bào. Các vi
khuẩn Leucơnostoc và Oenococcus (hình 1-2) có dạng hình cầu. Đó là các tế bào
nhỏ (kích thước từ 0,5 - 1 Lim) tròn hoặc hơi dài tạo ra các cặp hoặc chuỗi.
Tuỳ vào sự đa dạng của các sản phẩm trao đổi chất của các loại đường, các
vi khuẩn lactic được phân biệt thành 2 nhóm:
- Nhóm sinh axít lactic (> 85%) từ glucoza được gọi là lên men đồng hình
như các loài thuộc giống Pediococcus và loài Lactobacillus mali.
Nhóm mà bên cạnh axít lactic, còn sản xuất axít axêtic, êtanol và C02, được
gọi là lên men dị hình.
1.2.2 Vi khuẩn Oenococcus oeni
Mặc dù có rất nhiều loài vi khuẩn malolactic sử dụng trong sản xuất rượu
vang nhưng O. oeni vẫn là loài vi khuẩn được lựa chọn bởi đa số các nhà sản xuất
rượu vang. O. oeni có tên gọi trước đây là Leuconostoc oenos, là một loài hiếu khí
tùy tiện và có thể sinh trưởng trên môi trường có pH thấp (pH 4,2-4, 8) được bổ
sung nước cà chua hoặc nước nho [26]. Ở các vùng sản xuất rượu nho, nó có mặt

trong dịch hèm cũng như trong rượu vang non. Nguồn cacbon (có nguồn gốc từ
các loại đường), nitơ (từ các axit amin tự do hoặc các chuỗi peptit ngắn), các
vitamin (axit nicotinic, thiamin và uracil) là toàn bộ nhu cầu cho sự sinh trưởng
tối ưu của vi khuẩn này. Tế bào O. oeni có hình cầu và tồn tại ở dạng chuỗi khi
sinh trưởng trên môi trường rắn.
1.3 Quá trình lên men malolactic
1.3.1 Bản chất của quá trình lên men malolactic
Trong lên men rượu vang người ta gọi quá trình phân giải axit malic và
xitric dưới tác dụng của enzym malolactic của O. oeni là quá trình lên men lactic,
một quá trình quan trọng bậc nhất trong giai đoạn lên men phụ của rượu vang và
sâm panh [3, 42]. Trong rượu vang non, các loại trực khuẩn và cầu khuẩn lactic bị tiêu
diệt gần như hoàn toàn và chỉ còn sót lại số lượng ít ỏi các tế bào vi khuẩn O. oeni từ
102-103 CFU/ml. Tuy nhiêu, đây chính là tác nhân chính của một quá trình quan trọng
nhất trong giai đoạn lên men phụ kéo dài đó là quá trình lên men malolactic. Đặc trưng
cơ bản nhất của quá trình này là sự chuyển hoá hoàn toàn các diaxít như malic và


xitric có trong dịch quả và một phần sinh ra sau quá trình lên men chính (khoảng 10
g/1) thành các monoaxít như lactic và axetic bởi các vi khuẩn O. oeni [32].

1.3.2 Vai trò của quá trình lên men malolactic
Những nghiên cứu gần đây cho thấy, rượu vang được trải qua lên men
malolactic cho chất lượng cao hơn hẳn khi không trải qua giai đoạn này. Sự biến đổi
chất lượng của vang sau quá trình lên malolactic đã được chỉ ra là vì ba lí do chủ
yếu sau [3,4,42].
- Để giảm độ chua của vang do axit malic (diaxit) được chuyển thành axit
lactic (monoaxit).
- Làm tăng tính ổn định sinh học của rượu vang bởi vì sự phát triển của vi
khuẩn sẽ làm nghèo nguồn dinh dưỡng và loại khỏi môi trường hai axit hữu cơ quan
trọng là axit malic và axít xitric.

- Làm tăng tổ hợp thơm của vang vì các hợp chất diaxetyl, axetoin và 2,3butanediol tạo ra từ quá trình chuyển hóa axit xitric bởi vi khuẩn là các hợp phần
tạo nên hương thơm cho vang.
1.3.3 Ảnh hưởng của quá trình lên men malolactic đến thành phần và chất
lượng rượu vang
1.3.3.1 Sự giảm độ chua
Mỗi phân tử axit L-malic chuyển hóa tạo ra axit L-lactic do sự mất đi nhóm
cacboxyl và làm giảm tương ứng độ axit của rượu vang. Độ giảm axít sau quá trình
lên men malolactic rất khác nhau phụ thuộc vào nồng độ axít malic.
1.3.3.2 Những thay đổi về hương
Các nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chủng vi khuẩn malolactic khác nhau
có thể tăng hoặc giảm cường độ của các đặc tính hương và vị của rượu vang và
những thay đổi này phụ thuộc vào chủng vi khuẩn.
1.3.3.3 Ảnh hưởng đến màu sắc của rượu vang đỏ
Lên men malolactic cũng làm tăng sự kết tủa anthocyanin và tannin. Phản ứng
này làm ổn định màu của rượu. Tính chất cảm quan của rượu cũng được tăng lên
nhiều. Hương của rượu trở nên quyến rũ hơn. Rượu trở nên mềm mại hơn do sự khử
gần như hoàn toàn axit malic thành axít lactic. Kết thúc quá trình lên men
malolactic, hương và vị của rượu đầy đủ hơn nhưng lại thanh hơn.
1.4 Các kỹ thuật nhằm cải thiện quá trình lên men malolactic


-

Sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic

-

Sử dụng chế phẩm enzim malolactic để chuyển hoá axít malic

-

Sử dụng chủng nấm men tái tổ hợp gen malolactat decacboxylaza trong
sản xuất vang

-

Các phương pháp lên men malolactic và khả năng ứng dụng để nâng cao
chất lượng rượu vang

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên liệu, chủng vi sinh và hóa chất
-Chủng nấm men: Chủng nấm men S.cerevisiae SH09 phân lập tại Ninh Thuận
năm 2008.
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp công nghệ
Qui trình lên men rượu vang:
Sy rô nho được pha với tỷ lệ 20%, sau đó bổ sung đường kính để đạt nồng độ
chất khô 250 Bx. Lên men bằng chủng nấm men S.cerevisiae SH09. Kết thúc quá
trình này, tiếp tục lên men dịch trong vòng 10 ngày ở nhiệt độ 25°C, thu được rượu
vang non. Bổ sung vi khuẩn malolactic (tỷ lệ giống 10 6 tế bào/ml) để tiến hành lên
men malolactic.
2.2.2 Phương pháp vi sinh vật
- Phương pháp phân lập vi khuẩn malolactic từ nguồn nguyên liệu quả, lá
nho
- Phương pháp xác định khả năng lên men của chủng vi khuẩn malolactic
- Phương pháp xác định hình thái, kích thước tế bào và nảy chồi của các
chủng vi khuẩn malolactic trên kính hiển vi.
- Phương pháp xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu đánh
them phương pháp [1]…
2.2.3 Phương pháp phân tích lý hóa

-

Phương pháp đo pH


-

Phương pháp đo độ đục

-

Xác định axít bay hơi.

-

Phương pháp phân tích axít tổng số

Xác định hàm lượng cồn theo TCVN 378:1986. Etanol được xác định
bằng phương pháp cất trên thiết bị Distiller của Merck, sau đó xác định độ cồn bằng
alcohol metter.
Xác định hàm lượng axít L-malic, L-lactic và axít axetic bằng phương
pháp kit chuẩn enzim (Boehringer Mánnhein, Đức).

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn malolactic cho sản xuất rượu vang
3.1.1 Phân lập các chủng vi khuẩn malolactic tại Ninh Thuận
Các vi khuẩn có khả năng phân giải axít malic trong rượu vang được gọi là
vi khuẩn malolactic. Để phân lập được các chủng malolactic này, trước hết phải tiến
hành phân lập sơ bộ có định hướng (vi khuẩn gram dương, catalaza âm tính, khả
năng phân giải CaCO3,...) để thu nhận được các chủng vi khuẩn lactic, rồi tiếp theo

xác định khả năng lên men malolactic của các chủng nhằm tìm ra chủng có đặc tính
công nghệ phù hợp nhất cho lên men malolactic rượu vang đỏ.
Phân lập sơ bộ các chủng vi khuẩn lactic và có định hướng lên men
malolactic từ lá và quả nho tại Ninh Thuận, kết quả được trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1. Đặc tính sinh lý của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được


Tên

Mầu sắc và hình dạng khuẩn lạc

Hình dạng tế bào

NT1

Vàng nhạt, tròn, nhẵn, nhỏ

NT2

chủng

Gram

Phân giải
CaCO3

(+)

Que ngắn, chuỗi 2, 3 tế bào

+

+

Trắng, tròn, xù xì, to

Cầu nhỏ, chuỗi 2 tế bào

+

+

NT3

Trắng, tròn, gồ ghề, to

Cầu, chuỗi 2 , 3 tế bào

+

+

NT4

Trắng, tròn, nhẵn, nhỏ

Cầu nhỏ, chuỗi 2 tế bào

+

+

NT5

Trắng, tròn, gồ ghề, vừa

Cầu to, chuỗi 2 tế bào

+

+

NT6

Trắng, tròn, nhẵn, to

Que ngắn, chuỗi 2, 3 tế bào

+

+

NT7

Vàng nhạt, tròn, xù xì, vừa

Que dài, chuỗi 2 tế bào

+

+

NT8

Trắng, tròn, nhẵn, nhỏ

Cầu, chuỗi 3, 4 tế bào

+

+

NT9

Trắng nhạt, tròn, nhẵn, nhỏ

Cầu, chuỗi 2, 4

+

+

NT10

Trắng, tròn, nhẵn, nhỏ

Cầu, chuỗi 2,4 tế bào

+

+

NT11

Trắng sữa, nhẵn, to

Cầu, chuỗi 2 tế bào

+

+

NT12

Trắng, tròn, nhẵn, nhỏ

Cầu, chuỗi 2, 3 tế bào

+

+

NT13

Trắng , tròn, nhẵn, nhỏ

Que dài, chuỗi 2 tế bào

+

+

NT14

Trắng, tròn, nhẵn, nhỏ

Cầu, chuỗi 3, 4 tế bào

+

+

NT15

Vàng, tròn, nhẵn, to

Que ngắn, đơn bào

+

+

NT16

Vàng, tròn, xù xì, dẹt

Que dẹt, đơn bào

+

+

NT17

Vàng, xù xì, nhỏ

Que dẹt, chuỗi 2 tế bào

+

+

NT18

Trắng, xù xì, to

Que ngắn, chuỗi 2 tế bào

+

+

NT19

Trắng, tròn, to

Que, chuỗi 2, 4 tế bào

+

+

NT20

Vàng, xù xì, to

Que, chuỗi 2 tế bào

+

+

Kết quả bảng 3.1 cho thấy 20 chủng vi khuấn đều gram (+) và có vòng phân
giải CaCO3 đã được phân lập. Trong đó, tương ứng với mỗi loại nguyên liệu là lá
nho và quả nho. Các chủng này đều có hình thái khuấn lạc tròn, nhưng có bề mặt
nhẵn hoặc xù xì, kích thước thay đổi từ nhỏ sang to và chủ yếu có mầu trắng. Hình


dạng tế bào của các vi khuẩn này cũng thay đổi từ hình que đến hình cầu, có các tế
bào đơn lẻ hoặc chuỗi đôi, chuỗi 3 và 4.
3.1.2 Xác định khả năng lên men malolactic của các chủng vi khuẩn phân lập
Các chủng vi khuấn lactic phân lập được đã được thí nghiệm lên men trong
bình dulham nhằm xác định khả năng sinh khí và kiểu hình lên men, hoặc được thí
nghiệm dưới các điều kiện có hoặc không có ôxy để xác định đặc tính kỵ khí hoặc
hiếu khí. Kết quả của các thí nghiệm này được trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Đặc tính trao đổi chất của các chủng vi khuân lactic phân lập được
Tên

Sinh Khí

chủng

Kiểu hình lên
men

Kiểu hô hấp

Phân giải axít
malic

Hoạt tính
catalaza

NT1

+

Dị hình

Hiếu khí

-

-

NT2

-

Đồng hình

Kỵ khí tùy tiện

-

-

NT3

+

Dị hình

Kỵ khí

+

-

NT4

+

Dị hình

Hiếu khí

-

-

NT5

+

Dị hình

Hiếu khí

-

-

NT6

+

Dị hình

Kỵ khí

+

-

NT7

-

Đồng hình

Kỵ khí

-

-

NT8

+

Dị hình

Kỵ khí tuỳ tiện

+

-

NT9

+

Dị hình

Kỵ khí

+

-

NT10

+

Dị hình

Kỵ khí tuỳ tiện

+

-

NT11

-

Đồng hình

Kỵ khí

-

-

NT12

+

Dị hình

Kỵ khí tuỳ tiện

+

-

NT13

-

Đồng hình

Kỵ khí

-

-

NT14

+

Dị hình

Kỵ khí tuỳ tiện

+

-


Tên

Sinh Khí

chủng

Kiểu hình lên
men

Kiểu hô hấp

Phân giải axít
malic

Hoạt tính
catalaza

NT15

+

Dị hình

Hiếu khí

-

-

NT16

-

Đồng hình

Kỵ khí

-

-

NT17

+

Dị hình

Hiếu khí

-

-

NT18

+

Dị hình

Hiếu khí

-

-

NT19

+

Dị hình

Kỵ khí

+

-

NT20

+

Dị hình

Kỵ khí tuỳ tiện

-

-

Từ bảng 3.2, chúng tôi chọn 8 chủng là NT3, NT6, NT8, NT9, NT10, NT12,
NT14, NT19 có khả năng lên men malolactic. Chúng đều là các chủng có hoạt tính
catalaza âm tính, lên men dị hình, kỵ khí hoặc kỵ khí tuỳ tiện cho nghiên cứu tiếp
theo.
Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuấn có khả năng lên men malolactic
cao.
Chúng tôi lấy 8 chủng đã chọn NT3, NT6, NT8, NT9, NT10, NT12, NT14,
NT19 cho nuôi cấy trong môi trường nước nho axít (AG), nhiệt độ nuôi cấy là 25oC.
Kết quả tuyển chọn các chủng vi khuấn có khả năng lên men malolactic cao trong
môi trường nước nho axít (AG) được trình bày ở bảng 3.3
Bảng 3.3 Khả năng lên men malolactic của 8 chủng vi khuẩn phân lập được
Chủng vi khuấn

Hàm lượng axít malic (g/l)
Trước lên men

Sau lên men

Hàm lượng axít lactic (g/l)
Trước lên men

Sau lên men

Thời gian lên
men (ngày)

NT3

2,15

0,81

0,3

1,38

29

NT6

2,15

0,39

0,3

1,39

31

NT8

2,15

0,92

0,3

1,05

26

NT9

2,15

0,28

0,3

1,56

24

NT10

2,15

0,49

0,3

1,37

40

NT12

2,15

0,20

0,3

1,61

23

NT14

2,15

1,01

0,3

1,01

28

NT19

2,15

1,29

0,3

0,98

36


Từ những kết quả trên chúng tôi chọn chủng NT9 và NT12 vì có khả năng
phân giải axít malic tốt nhất với hàm lượng axít malic còn dư trong dịch lên men
thấp nhất chủng NT9 là 0,28 g/l, chủng NT12 là 0,20 g/l. Chủng NT9 và NT12 còn
có khả năng lên men malolactic triệt để nhất trong thời gian ngắn từ 23 đến 24 ngày,
được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.3 Xác định khả năng chịu SO2 của 02 chủng vi khuẩn malolactic phân lập được
Để đánh giá khả năng chịu SO2 và khả năng chịu etanol của các chủng
malolactic phân lập được chúng tôi tiến hành lên men 2 chủng vi khuấn malolactic
là NT9 và NT12 trên môi trường nước nho axít (AG) được sulphit hóa với hàm
lượng K2S2O5 100 mg/l và bổ sung etanol tới nồng độ 14%v/v, nhiệt độ nuôi cấy là 25oC.
Bảng 3.4 Hàm lượng axít malic và axít lactic trước và sau lên men
Malolactic trên môi trường nước nho axít (AG) được sulphit hóa với hàm
lượng K2S2O5. bổ sung etanol tới nồng độ 14%v/v
Chủng
vi khuẩn
malolactic

Axít malic (g/l)
Trước lên men

Axít lactic (g/l)

Sau lên men

Trước lên men

Sau lên men

Thời gian lên
men (ngày)

NT9

2,15

1,45

0,3

0,8

30

NT12

2,15

0,14

0,3

1,68

25

Từ kết quả bảng 3.4 chúng tôi nhận thấy Chủng NT9 không có khả năng chịu
SO2 và etanol nên quá trình lên men malolactic diễn ra không hoàn toàn. Hàm
lượng axít malic còn lại rất cao, là 1,45 g/l sau 30 ngày lên men. Còn chủng vi
khuẩn còn lại là NT12 có khả năng phân giải malic rất tốt trong điều kiện môi
trường được sulphit hóa, có nồng độ cồn cao, thể hiện ở hàm lượng malic còn lại
sau lên men là không đáng kể là 0,14 g/l và có thời gian lên men nhanh là 25 ngày.
3.2 Nghiên cứu quá trình lên men malolactic của Chủng NT9 và Chủng NT12
trên môi trường rượu vang non
Rượu vang non lên men từ dịch nho như 2.2.1 bởi chủng nấm men S.
cervisiae SH09 (có thành phần etanol 12,8% v/v, đường sót 5,2 g/l, axít tong số 5,39
g/l) được lên men malolactic bởi 2 chủng NT9, NT12 ở điều kiện nhiệt độ 25oC.
Kết quả phân giải axít malic được trình bày ở bảng 3.5 và hình 3.1
Bảng 3.5 Hàm lượng axít malic trước và sau quá trình lên men malolactic của
2 chủng vi khuẩn malolactic trên môi trường rượu vang non
Chủng vi
khuấn
NT9

Axít malic (g/l)
Trước lên men
2,15

Sau lên men
0,75


NT12

2,15

0,12

Hình 3.1 So sánh hàm lượng axít malic trước và sau quá trình lên men
malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic trên môi trường rượu vang non
Kết quả trên bảng 3.5 và hình 3.1 cho thấy:
Khả năng phân giải axít malic
- Chủng NT9 hàm lượng axít malic còn dư trong dịch sau lên men là (0,75 g/l).
- Chủng NT12 hàm lượng axít malic còn dư trong dịch sau lên men là (0,12 g/l).

Hình 3.2. So sánh hàm lượng axít lactic trước và sau quá trình lên men
malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic trên môi trường rượu vang non
Kết quả trên hình 3.2 cho thấy:
Từ các nhận xét trên chúng tôi nhận thấy Chủng NT12 có khả năng phân giải
axít malic tương đối tốt trên môi trường vang non. Khả năng phân giải axít malic
Chủng NT12 có khả năng phân giải nhanh và mạnh hơn so với Chủng NT9, tạo ra
axit lactic có hàm lượng rất cao là 1,64 g/l.
Dịch lên men của các chủng malolactic còn được phân tích thành phần axít
axetic kết quả được trình bày ở bảng 3.7 và hình 3.3


Bảng 3.7 Hàm lượng axít axetic trước và sau lên men malolactic của 2 chủng
vi khuẩn malolactic
Chủng vi khuấn

Axít axetic (g/l)
Trước lên men

Sau lên men

NT9

0,22

0,35

NT12

0,22

0,25

Kết quả trên bảng 3.7 và hình 3.3 cho thấy:
Khả năng tạo ra Axít axetic
- Chủng NT9 hàm lượng Axít axetic được tạo thành trong dịch sau lên men là (0,35
g/l).
- Chủng NT12 hàm lượng Axít axetic được tạo thành trong dịch sau lên men thấp
nhất là (0,25 g/l).

Hình 3.3 So sánh hàm lượng axít axetic trước và sau lên men malolactic của 2
chủng vi khuẩn malolactic
Dịch lên men của các chủng malolactic còn được phân tích thành phần
diaxetyl kết quả trình bầy ở bảng 3.8 và hình 3.4
Bảng 3.8 Hàm lượng diaxetyl trước và sau lên men malolactic của 2 chủng vi
khuẩn malolactic
Chủng vi khuấn

Diaxetyl (g/l)
Trước lên men

Sau lên men

NT9

0,20

0,25

NT12

0,20

0,27


Kết quả trên bảng 3.8 cho thấy:
Chủng vi khuẩn NT12 có khả năng tạo ra hàm lượng axít axetic thấp (0,25
g/l) và tạo ra diaxetyl cao (0,27 mg/l). Diaxetyl là một chất quan trọng trong quá
trình lên men malolactic. Đối với vang đỏ, hàm lượng của nó từ 0,2-0,4 mg/l sẽ
đóng góp tích cực vào giá trị cảm quan của rượu.
Từ những nhận xét trên, có thể rút ra kết luận là chủng vi khuẩn NT12 của
có một số ưu điểm hơn Chủng NT9. Đặc biệt, khả năng tạo diaxetyl không cao của
Chủng NT12 là rất phù hợp cho sản xuất các loại rượu vang đỏ không có mùi bơ, ngậy.
3.3 Nghiên cứu khả năng tạo chất thơm của các chủng vi khuẩn malolactic
Ngoài khả năng khử axít L-malic thành axít L-lactic, lên men malolactic còn
tác động tới sự cân bằng hương và vị của rượu vang thành phẩm do nó tạo ra nhiều
chất thơm và bay hơi.
Hàm lượng một số chất hay hơi tạo thành sau quá trình lên men malolactic rượu
vang non của các chủng là được trình bày ở bảng 3.9
Bảng 3.9 Một số chất bay hơi tạo thành sau quá trình lên men malolactic
của 02 chủng

Tên chủng

Axít axetic (mg/L)

Trước MLF

Sau

Axít Axetolactic
(mg/L)
Sau

MLF

Trước
MLF

MLF

Diaxetyl (mg/L)

Trước MLF

Sau

2,3 Butanediol
(mg/L)
Sau

MLF

Trước
MLF

MLF

NT9

216

405

1,15

1,48

0,21

0,25

234

345

NT12

221

251

1,17

1,78

0,32

0,31

231

415

Hình 3.5 So sánh hàm lượng axit axetic tạo thành sau quá trình lên men


malolactic của 2 chủng
Từ kết quả của bảng 3.9 và hình 3.5, chúng tôi chọn Chủng NT12 cho các
nghiên cứu tiếp theo vì Chủng NT12 có 1 số đặc tính sau.
- Khả năng chịu SO2 là tốt nhất trong các chủng phân lập được: K2S2O5
100mg/l
- Khả năng lên men malolactic trên môi trường rượu vang non là tốt nhất
trong các chủng phân lập được.
- Khả năng tạo chất thơm tốt nhất trong trong các chủng phân lập được.
3.4 Nghiên cứu xác định các điều kiện tối ưu quá trình lên men malolactic O.oeni
NT12
3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất dinh dưỡng bổ sung đến quá trình lên
men malolactic
Thí nghiệm đã được tiến hành lên men malolactic trên 3 mẫu sử dụng
chất dinh dưỡng bổ sung (chế phẩm Essentials Oenos) và 01 mẫu đối chứng.

Hình 3.6 Hàm lượng axít malic được phân giải trong quá trình tàng trữ có bổ
sung dinh dưỡng khác nhau theo thời gian.
Từ kết quả của hình 3.6, có thể lựa chọn nồng độ Essentials Oenos thấp nhất là
0,025 g/l để bổ sung cho quá trình lên men malolactic.
3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men malolactic
Tiến hành thí nghiệm với 4 mẫu lên men malolactic bổ sung vi khuẩn lactic
tại các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Kết quả về thời gian lên men malolactic cũng
như sự hình thành một số tính chất quan trọng của rượu vang được trình bày ở bảng
3.12
Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự chuyển hóa axít malolaic
thành axít lactic trong quá trình lên men malolactic
Nhiệt độ
lên men
(0C)

Axit malic
(g/1)

Axit lactic
(g/1)

Axít bay hơi
(g/1) axít
axetic)

Thời gian lên
men malolactic
(ngày)

15

1,45

0,92

0,28

45

20

0,12

1,80

0,30

23

25

0,12

1,81

0,35

20

30

0,11

1,82

0,46

19

Do vậy, nhiệt độ của quá trình lên men malolactic được chọn là 20°C.
Tiến hành lên men malolactic ở điều kiện nhiệt độ 20°C, có bổ sung chế
phẩm Essentials Oenos nồng độ 0,025 g/1, sau đó xác định thành phần của rượu
vang kết quả được trình bày ở bảng 3.13

Bảng 3.13 Thành phần của rượu vang sau khi kết thúc quá trình lên men
malolactic
Trước lên men

Sau lên men

malolactic
12,8

malolactic
12,3

Axít tổng số (g/1 H2SO4)

5,39

4,9

Axít bay hơi (g/1 axít axetic)

0,23

0,28

Axít malic (g/1)

2,04

0,12

Axít lactic (g/1)

0,45

1,78

pH

3,4

3,5

Thành phần
Etanol (%v/v)

Từ những kết quả thu được, chúng tôi đưa ra kết luận sau
Quá trình lên men malolactic của chủng trên môi trường rượu vang non đạt
hiệu quả cao nhất với hàm lượng axít malic chỉ còn lại 0,12 g/1 ở điều kiện bổ sung
chế phẩm Essentials Oenos nồng độ 0,025 g/1, nhiệt độ lên men 20°C và thời gian
lên men là 23 ngày.
3.4.3 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic đến chất lượng rượu vang
Thí nghiệm dưới đây trình bày các kết quả của quá trình lên men mallolactic
được thực hiện với các thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic khác nhau. Quá trình lên
men được thực hiện như ở mục 2.2.1 nho sau khi nghiền và xử lý với K 2S205 và
enzym Pectinex, được lên men với chủng nấm men S.cerevisiae SH09, vi khuẩn


lactic J được cho vào các thời điểm trước, giữa và sau quá trình lên men rượu.
Bảng 3.14 Thời gian lên men và hàm lượng axít malic, axít lactic sau quá trình
lên men malolactic ở các thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic khác nhau
Mẫu

Axít malic (g/1)

Axít lactic (g/1)

Thời gian lên men (ngày)

ĐC

0,10

1,64

23

F

0,09

1,68

14

M

0,09

1,66

12

E

0,09

1,69

14

Đã xác định được các điều kiện tối ưu của quá trình lên men malolactic cho
chủng NT 12 trên môi trường rượu vang non trong quy trình sản xuất rượu vang đỏ:
Nồng độ Essentials Oenos thấp nhất là 0,025 g/l để bổ sung cho quá trình lên
men malolactic.Nhiệt độ lên men là 200C. Thời gian lên men là 23 ngày. Bổ sung

bổ sung vi khuẩn lactic sau 48 h của quá trình lên men rượu, khi hàm lượng đường
khử giảm xuống khoảng 25%.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
Từ những kết quả thu được, có thể rút ra một số kết luận sau đây:
1. Từ 20 chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ vùng trồng nho Ninh Thuận,
được 8 chủng có khả năng chuyển hóa axit malic thành axit lactic.
2. Tuyển chọn được chủng NT12 có khả năng phân giải malolactic tốt nhất hàm
lượng axít malic còn dư trong dịch sau lên men malolactic là 0,12 g/l.
3. Đã xác định được các điều kiện tối ưu của quá trình lên men malolactic cho
chủng NT12 trên môi trường rượu vang non trong quy trình sản xuất rượu vang đỏ:

- Nồng độ Essentials Oenos thấp nhất là 0,025 g/l để bổ sung cho quá trình
lên men malolactic.
- Nhiệt độ lên men là 200C.
- Thời gian lên men là 23 ngày.


- Bổ sung bổ sung vi khuẩn lactic sau 48 h của quá trình lên men rượu, khi
hàm lượng đường khử giảm xuống khoảng 25%.
2. Đề nghị
Tiếp tục nghiên cứu xác định thêm một số điều kiện tối ưu cho chủng NT 12 để
ứng dụng và sản xuất thử nghiệm rượu vang đỏ chất lượng cao tại Việt Nam.