Nghiên cứu xây dựng phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----o0o-----

NGUYỄN THỊ KIM DUNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG KHÁNG NGUYÊN
TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮCXIN CÚM

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội – 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ KIM DUNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG KHÁNG NGUYÊN
TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮCXIN CÚM

Chuyên ngành:

Vi sinh vật học

Mã số:

60420107

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.

Đỗ Tuấn Đạt

PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà

Hà Nội – 2015


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến:
- TS. Đỗ Tuấn Đạt, Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1
- PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà, Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học, trường
Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội.
Là những người Thầy đã tận tình quan tâm dạy bảo cùng những kinh nghiệm
quý báu và tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô trong khoa Sinh học - trường Đại
học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, đã giảng dạy và dìu dắt tôi
trong suốt quá trình học tập vừa qua.
Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, đồng nghiệp, bạn bè đã
động viên, giúp đỡ và chia sẻ để tôi có đủ nghị lực hoàn thành nhiệm vụ học tập của
mình.
Tôi xin trân trọng cảm ơn !

Hà Nội, ngày 18 tháng 11 năm 2015
Học viên

Nguyễn Thị Kim Dung


MỤC LỤC


DANH MỤC BẢNG


DANH MỤC HÌNH



MỞ ĐẦU
Bệnh cúm đã và đang đe dọa toàn cầu. Trong ba thế kỷ qua, cứ
khoảng 10 đến 40 năm, thế giới lại chứng kiến một đại dịch cúm. Trước khi
có vắcxin, mỗi đợt dịch có hàng triệu người chết. Năm 1918 chứng kiến đại
dịch cúm nghiêm trọng nhất lịch sử thế giới, thậm chí còn được cho là đại
dịch kinh hoàng nhất trong các loại bệnh dịch. Tác nhân gây dịch là vi rút
cúm A/H1N1 đã gây tổn thất chưa từng thấy. Dịch cúm gia cầm A/H5N1
xuất hiện từ giữa tháng 12/2003 tại Hàn Quốc, sau đó lan rộng ra một số
nước châu Á trong đó có Việt Nam. Từ đầu tháng 4/2009, Mexico đã thông
báo trường hợp nhiễm cúm A/H1N1. Vi rút này nhanh chóng lan ra rất nhiều
quốc gia trên thế giới và đã có thời điểm Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG)
phải đưa ra các cảnh báo coi đây như là một đại dịch cúm mới. Gần đây nhất,
vào năm 2013, trường hợp nhiễm cúm A/H7N9 đầu tiên được thông báo ở
Trung Quốc và đang tiếp tục dấy lên một mối lo ngại cho châu Á nói riêng
cũng như toàn Thế giới nói chung về một căn nguyên cúm mới nguy hiểm
đối với sức khoẻ con người.
Bệnh cúm là một trong những bệnh nhiễm trùng đường hô hấp tạo

nên gánh nặng lớn đối với sức khỏe của cộng đồng, TCYTTG và hơn 40%
quốc gia trên Thế giới khuyến cáo sử dụng vắcxin phòng vi rút cúm. Do vậy,
phát triển các vắcxin cúm cho người đang đặt ra như là một yêu cầu rất cấp
bách hiện nay. Là một cơ sở nghiên cứu và sản xuất vắcxin cho người ở Việt
Nam, Công ty TNHH MTV Vắcxin và sinh phẩm số 1 đã tiến hành xây dựng
các quy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm A/H5N1, cúm A/H1N1 và tiến
tới là vắcxin cúm A/H7N9 trên nuôi cấy tế bào. Một trong những thông số rất
quan trọng để đánh giá chất lượng vắcxin trong phòng thí nghiệm đó là đặc
tính của kháng nguyên vi rút cúm có mặt trong các sản phẩm của quá trình
sản xuất vắcxin. Xây dựng các phương pháp để đánh giá, từ đó đưa ra các

8


tiêu chuẩn về chất lượng kháng nguyên là một việc làm hết sức cần thiết.
Điều này giúp cho việc đánh giá được chất lượng vắcxin và kiểm tra độ ổn
định của quy trình sản xuất. Do vậy, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài :
“Nghiên cứu

xây dựng phương pháp đánh giá chất

lượng kháng

nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm” trên sản xuất vắc xin cúm
A/H5N1 và cúm A/H1N1, với 2 mục tiêu :
1. Nghiên cứu xây dựng và áp dụng các phương pháp đánh giá chất
lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm
2. Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy
trình sản xuất vắcxin cúm.

9


Chương 1 - TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm chung của vi rút cúm
Vi rút cúm thuộc họ Othomyxoviridae là họ vi rút đa hình thái, có vỏ ngoài,
genom là ARN đơn, (-), phân đoạn, bao gồm 5 nhóm vi rút: vi rút cúm A, vi rút cúm
B, vi rút cúm C, vi rút Thogoto và vi rút Isa. Trong đó, vi rút cúm A lưu hành phổ
biến trên gia cầm, người và động vật khác như lợn, ngựa…là căn nguyên gây nên
các đại dịch lớn trên toàn cầu. Vi rút cúm B và C chỉ lưu hành ở người và thường
chỉ gây nên các vụ dịch vừa và nhỏ. Các vi rút cúm A, B và C rất giống nhau về cấu
trúc. Thể vi rút có chiều ngang từ 80-120 nm, và thường có hình gần như tròn,
ngoài ra vi rút cũng có thể hiện diện một số dưới dạng hình sợi. Thể vi rút cúm
được cấu tạo từ một vỏ vi rút bao gồm 2 loại glycoprotein, quấn quanh một phần
nhân trung tâm. Phần nhân trung tâm chứa bộ gene RNA và các protein khác có
chức năng đóng gói và bảo vệ thể RNA này. Đối với 1 vi rút, thông thường bộ gene
không chỉ có 1 mảnh nucleic acid; thay vào đấy, sẽ chứa 7 hoặc 8 mảnh RNA có
chiều âm và phân đoạn. Vi rút cúm A có bộ gene mã hoá cho 11 protein trên 8 đoạn
RNA: hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), nucleoprotein (NP), M1, M2,
NS1, NS2 (NEP), PA, PB1, PB1-F2 và PB2.
1.2. Hình thái và cấu trúc hạt vi rút cúm
Hạt vi rút cúm có hình dáng rất đa dạng: hình cầu, hình trứng hoặc đôi khi có
hình sợi kéo dài tới 2000 nm, đường kính trung bình từ 80-120 nm. Các hạt virion
của vi rút A và B có vỏ bao bọc. Vỏ vi rút có bản chất là protein có nguồn gốc từ
màng tế bào vật chủ, bao gồm một số protein được glycosyl hóa và một số protein
dạng trần không được glycosyl hóa. Vi rút cúm có genom nhiều đoạn, ở typ A và B
có 8 đoạn ARN(-) với tổng khối lượng 5x106, còn ở typ C có 7 đoạn. Trong virion
có chứa enzyme ARN- polymeraza phụ thuộc ARN, enzyme này cần cho quá trình
phiên mã vì genom ARN chuỗi (-). Protein capsit kết hợp với ARN tạo nucleocapsit
đối xứng xoắn.

10


Hình 1.1. Cấu trúc hạt vi rút cúm [10]
Nucleocapsit được bao bọc bởi màng protein nền M1 (M: matrix), phía ngoài
màng được bao bọc bởi vỏ ngoài là lớp lipit kép có nguồn gốc từ màng sinh chất
của tế bào chủ. Protein M2 đâm xuyên và nhô ra khỏi vỏ ngoài, tạo thành các kênh
ion, làm cho pH của endosom thay đổi.
Bề mặt vi rút có hai loại gai mọc nhô ra: hemaglutinin (H) và neuraminidaza
(N). Gọi là hemaglutinin vì vi rút gây ngưng kết hồng cầu ở một số loài.
Gai H dài 10 nm gồm 3 tiểu đơn vị glycoprotein giống nhau gộp lại (trimer).
Mỗi tiểu đơn vị cấu tạo gồm 2 chuỗi polypeptit kí hiệu là HA1 và HA2, gắn với
nhau bởi cầu nối disunphua. Trong hạt vi rút, phân tử hemaglutinin gắn vào màng
lipit của vỏ ngoài ở vùng kỵ nước, phía đầu –COOH của HA2. Epitop của kháng
nguyên hemaglutinin rất dễ bi biến đổi do luôn có sự biến đổi trong ARN genom,
làm thay thế axit amin tại một số vị trí trên phân tử HA1. Sự thay đổi này nằm ở vị
trí gắn hemaglutinin vào thụ thể của tế bào. HA chứa peptit dung hợp, khi ở pH
trung tính vùi vào trong gai, nhưng ở pH thấp thì peptit lại nhô ra ngoài. Các peptit

11


dung hợp tạo lỗ, lồng vào lớp lipit kép của màng tế bào chủ làm cho màng tế bào
chủ và vỏ ngoài của vi rút dung hợp với nhau.
Xen giữa các gai H là các N hình nấm. Đầu gai có cấu trúc hình hộp do 4
tiểu đơn vị có dạng hình như cầu giáp nối với nhau mà thành. Đầu được nối với
cuống chứa vùng kỵ nước, nhờ thế mà gai N cắm sâu vào vỏ ngoài của vi rút.
Thụ thể của tế bào dành cho hemaglutinin có cấu tạo từ axit sialic (còn gọi là
neuraminic) liên kết với gốc đường trong glycol protein bằng dây nối glycozit.

Enzym neuraminic (silidaza) phân giải thụ thể ở màng nhầy đường hô hấp bằng
cách cắt liên kết glycozit, giải phóng axit neuraminic. Động tác này cho phép vi rút
đi qua màng nhầy và thoát khỏi các chất ức chế “không đặc hiệu”. Neuraminidaza
phá hủy thụ thể của hemaglutinin trên bề mặt hồng cầu mặc dù tế bào này không
phải là đối tượng gây nhiễm. Neuraminidaza cũng tham gia vào giải phóng vi rút ra
khỏi tế bào.
Vi rút typ A có 16 loại gai H và hầu hết các loại gai này có ở vi rút gây nhiễm
ở động vật (chim, gà, vịt, ngỗng, gà tây, lợn ngựa và một số loại động vật có vú
khác). Ba loại gai H quan trọng có ở vi rút gây bệnh cho người là H1, H2 và H3.
Trước đây có H0 và HW (H lợn), nhưng về sau 2 gai này được coi là H1.
Có 9 loại gai N, trong đó N1 và N2 là quan trọng nhất vì gây bệnh cho
người.

12


Hình 1.2. Hình ảnh vi rút cúm B [1].
Vi rút cúm B với virion dạng hình cầu điển hình với đường kính hạt vi rút
thay đổi từ 80- 120nm. Bên ngoài vỏ bao ngoài hạt vi rút là các gai ngắn dài khoảng
12nm rõ nét bám xung quanh. Nhuộm PTA 0,25% (thước đo 100nm).

Hình 1.3. Hình ảnh vi rút cúm A/H1N1 [1].

13


Hình 1.4. Hình ảnh vi rút cúm A/H1N1 [1].
Vi rút cúm A/H1N1 đa dạng về hình thái (hình cầu- 1.3.; hình que- 1.4.) và
kích thước thay đổi, đường kính hạt vi rút từ 80-120nm, dài đến 1μm. Trên bề mặt
hạt vi rút là các gai ngắn xếp đều đặn. Nhuộm PTA 0,25% (thước đo 100nm).

Hình 1.5.

Hình ảnh

vi rút

cúm

A/H5N1

[1]

Vi

rút

cúm

A/H5N1

với

hình

dạng

kích

và

thước

thay đổi:

hình cầu,

hình que,

14


đường kính hạt vi rút khoảng 100nm, dài đến 1μm. Các gai ngắn sắp xếp đều trên
bề mặt hạt vi rút với chiều dài của gai khoảng 17nm. Nhuộm PTA 0,25% (thước đo
100nm).
1.3. Cấu trúc hệ gen vi rút cúm và các protein mã hóa
Hệ gen của vi rút cúm A và B có 8 đoạn gen trong khi vi rút cúm C có 7 đoạn
gen ( không có gen NA). Cấu trúc hệ gen của vi rút cúm đã được tìm hiểu nhờ kỹ
thuật phân tích điện di virion ARN vi rút trên gen polyacrylamit. Cấu trúc gen của
vi rút cúm như sau: Đọan gen 1 mã hóa cho PB2, đoạn gen 2 mã hóa cho PB1, đoạn
gen 3 mã hóa cho PA, đoạn 4 cho HA, đoạn 5 cho NP, đoạn 6 cho NA, đoạn 7 cho
M1 và M2, đoạn 8 cho NS1 và NS2. Trình tự nucleotit của ARN vi rút cúm PR8/34
và rất nhiều phân typ khác được công bố từ năm 1982 [28]. Vi rút R8/34 có 13.588
nucleotit.

Bảng 1.1. Các phân đoạn ARN của vi rút cúm và chức năng [26]

Phân
đoạn
ARN

Protein

TLPT
(kDa)

Kích
thước
(bp)

Chiều dài
chuỗi
polypeptit
(axit amin)

Số
phân tử
trên 1
virion

1

PB2

85 700

2341

759

30-60

2

PB1

86 500

2341

757

30-60

3

PA

84 200

2233

716

30-60

15

Chức năng

Tìm thấy trong quá trình tổng
hợp ARNtt. Đóng vai trò làm
enzyme phiên mã: gắn kết, kéo
dài, tham gia vào quá trình sinh
tổng hợp vi rút thế hệ mới trong
tế bào chủ.
Tìm thấy trong quá trình tổng
hợp ARN virion (vARN)


4

5

6

HA

NP

NA

M1

61 468

56 101

50 087

1778

1565

1413

27 801

7

566

498

454

500

Phân tử có cấu trúc trimer, cắt
bởi enzyme thủy phân thành
HA1 và HA2, là cơ sở cho khả
năng nhiễm trùng. HA gắn với tế
bào túc chủ, dung hợp giải
phóng phức hợp RNP, mở đầu
cho quá trình nhân lên của vi rút.

1000

Là thành phần protein chủ yếu
của phức hợp RNP, chứa một

trong các khàng nguyên đặc hiệu
typ, phân biệt 3 typ cúm A,B,C.

100

Phân tử có cấu trúc tetramer,
thủy phân bằng protease, cho
phép vi rút tiến qua lớp niêm
mạc tới các tế bào của đường hô
hấp trong quá trình nhiễm trùng.
Loại bỏ phân tử axit sialic của
phân tử HA từ các virion mới
được tổng hợp, làm lộ HA ra
ngoài, tăng khả năng nhiễm
trùng.

252

3000

1027
M2

11 010

97

20-60

NS1

26 815

230

20-60

121

130200

8

890
NS2

14 216

16

M1: là kháng nguyên đặc hiệu
typ, có chức năng ổn định vrrus,
điều khiển hoạt tính ARNprotease và tham gia vào quá
trình lắp rắp vi rút (70%).
M2: kênh ion.
Là protein không cấu trúc, kết
thúc quá trình tổng hợp protein
của tế bào túc chủ, chỉ có trong
tế bào nhiễm vi rút.

Đoạn ARN đơn của vi rút cúm C mã hóa cho protein liên kết haemaglutininesteraza (HEF) có chức năng gắn dính vào thụ thể (receptor), hoạt động hòa mạng
của HA và phá hủy thụ thể của NA, trong khi ở vi rút cúm A và B những đặc tính do
các đoạn gen riêng biệt mã hóa. Chiều dài của các đoạn gen và các protein mã hóa
được liệt kê trong bảng trên. Đoạn gen ngắn không mã hóa ở mỗi đầu bao gồm
chuỗi 11-13 nucleotit tại đầu 5’ và 9-12 nucleotit tại đầu 3’ có tính ổn định cao hơn
so với các đoạn gen khác và giống nhau ở cả 3 loại vi rút A, B và C [44].
Ba gen lớn nhất mã hóa cho các thành phần của ARN polymeraza PB1, PB2
và PA của vi rút A và vi rút cúm B, C [66]. Đoạn gen 1 và 2 đều dài 2341 nucleotit
mã hóa cho protein PB2 gồm 759 axit amin và PB1 757 axit amin. Đoạn gen 3 dài
2233 nucleotit mã hóa cho protein PA có 716 axit amin.
NP là protein cấu trúc chính tạo thành RNP. NP còn là kháng nguyên đặc
hiệu typ, khác nhau giữa vi rút cúm A, B và C. NP được đoạn ARN 5 dài 1565
nucleotit mã hóa [64]. NP chứa 498 axit amin và có trọng lượng phân tử 56.101
dalton. NP của vi rút cúm B chứa 560 axit amin và tương đồng 47% so với vi rút
cúm A trong khi NP của vi rút cúm C có 565 axit amin và có một số vùng tương
đồng với vi rút cúm A và B [28].
Tên gọi của protein HA (hemagglutinin) xuất phát từ khả năng gây ngưng kết
hồng cầu của vi rút bằng cách gắn với các thụ thể đặc biệt có chứa axit sialic. HA có
3 vai trò quan trọng trong quá trình sao chép vi rút:
1. HA gắn với thụ thể có chứa axit sialic trên bề mặt tế bào và tạo thành sự gắn
kết giữa vi rút và tế bào.
2. HA chịu trách nhiệm cho sự xâm nhập của vi rút vào tế bào bằng cách gián
tiếp tạo nên sự hòa mạng endocytose của vi rút và màng nội bào làm cho
nucleocapsit vi rút giải phóng vào trong bào tương.

17


3. HA là kháng nguyên chính tạo nên kháng thể trung hòa và các vụ dịch cúm

đều liên quan đến sự thay đổi cấu trúc kháng nguyên.
Đoạn ARN 4 có chiều dài 1.742 đến 1.778 nucleotit và mã hóa cho 562 đến
566 axit amin. HA do đoạn ARN 4 mã hóa và được tổng hợp nên ribosom gắn màng
và di chuyển vào lumen của lưới nội chất (ER) tế bào bị nhiễm như là polypeptit
đơn HA0 (trọng lượng phân tử 76.000 dalton). Phụ thuộc vào phân typ vi rút, loại tế
bào chủ và điều kiện nuôi cấy HA tồn tại cả 2 dạng: Dạng tiền thân không phân tách
HA0 hoặc dạng phân tách với hai chuỗi có cầu nối disulfit (HA1 có trọng lượng
47.000 dalton và HA2- 29.000 dalton). Quá trình phân tách là điều kiện quyết định
để vi rút có khả năng lây nhiễm và do vậy liên quan đến độc tính và khả năng lây
truyền [42]. HA chính là đoạn gen đầu tiên của vi rút cúm được xác định trình tự.
HA1 có từ 319 đến 326 axit amin và HA2 có từ 221 đến 222 axit amin. Tùy thuộc
vào các phân typ HA, số lượng các axit amin bị phân tách giữa HA 1 và HA2 là 1 đến
6. HA nguyên vẹn có thể tách chiết từ hạt virion vi rút cúm hoặc từ tế bào bị nhiễm
bằng chất tẩy hòa tan màng, khi chất tẩy bị loại bỏ, vùng transmembrane kỵ nước
kết hợp lại và tạo thành HA hình hoa thị. Tuy nhiên, xử lý vi rút bằng promelin sẽ
giải phóng ra HA bảo toàn tính kháng nguyên và cấu trúc ba chiều, có khả năng hòa
tan trong nước và chứa toàn bộ HA 1 cùng với 175 axit amin đầu tiên trong số 221
axit amin của HA2 [61] . Vị trí gắn thụ thể HA nằm ở vùng ngoại biên của các tiểu
đơn vị phân tử. Cấu trúc vị trí đó có tính đồng dạng cao giữa các phân typ (Tyr- 98,
Tyr – 153, His – 183, Glu – 190, Leu – 194) [41, 63]. Bởi vì tính đặc hiệu gắn thụ
thể khác nhau giữa khí quản người (α 2, 3) và khí quản lợn (α 2, 3 và α 2, 6), số
lượng các phân tử có thể chuyển từ loài này sang loài khác và có thể bị giới hạn
[18]. Sự phân tác HA0 thành HA1 và HA2 là cần thiết để chuyển dạng pH thấp và do
vậy cần thiết đối với hoạt tính gây nhiễm của vi rút. Những HA đó đều chứa chuỗi
R-X-K-/R-R ở cầu nối peptit và được phân tách trong tế bào bằng furin, một
proteaza của mạng trans-Golgi [25, 43]. HA chỉ có arginnine đơn ở cầu nối peptit
không bị phân tách khi nuôi cấy trên tế bào (trừ chủng A/WSN/33) nhưng sẽ bị
phân tách bởi tpypsin ngoại sinh. Khi nuôi cấy trên trứng gà có phôi, HA có

18

arginine đơn ở cầu nối peptit sẽ bị phân tách do proteaza [25]. Nhiều nghiên cứu
cho rằng vị trí phân tách có liên quan đến độc tính vi rút và chủng vi rút độc lực có
chứa kiểu nhận biết furin trong khi chủng vi rút không độc lực chỉ chứa arginine
đơn [22, 25, 42]. Tuy nhiên cũng có một số chủng cúm H5 không độc lực có vị trí
nhận biết furin. Những chủng không độc lực này có chuỗi oligosaccharit ở gần vị trí
phân tách, điều này có ảnh hưởng đến hoạt tính của proteaza khi phân tách và chuỗi
này không tìm thấy ở những chủng H5 độc lực [21, 22].
Trong các chủng vi rút cúm người chỉ có A/WSN/33 có khả năng nuôi cấy
trên nhiều loại tế bào mà không cần có trypsin và các nghiên cứu về hệ gen đã cho
thấy NA của WSN cần thiết cho sự phân tách HA của WSN .
NA là glycoprotein thứ hai đặc hiệu cho phân typ của vi rút cúm A, B.
NA/PR/8/34 đoạn gen ARN 6 có 1413 nucleotit mã hóa cho 453 axit amin.
Đoạn ARN thứ bảy mã hóa cho 2 protein M1 và M2. Đoạn có 1027 nucleotit
mã hóa cho M1 có 252 axit amin, trọng lượng phân tử 27.801 dalton [29]. M1 là
kháng nguyên đặc hiệu typ của vi rút cúm và có tính ổn định giữa các phân typ của
vi rút cúm và có tính ổn định giữa các phân typ [28]. Protein M2 có hoạt động kênh
trao đổi ion nhờ hoạt hóa pH. Kênh này được chặn đặc hiệu bởi thuốc kháng vi rút
cúm amantadin. Hoạt động của kênh ion cần thiết cho việc bỏ lớp ngoài của vi rút
trong khoang nội bào của tế bào bị nhiễm. Đột biến của vùng M2 liên quan đến việc
kháng amantadin [16].
Đoạn ARN 8 của vi rút cúm A, B và đoạn ARN 7 của vi rút cúm C mã hóa
cho 2 loại protein NS1 và NS2. NS1 protein có trọng lượng phân tử 26.000 dalton.
NS1 là protein đa chức năng trong chu trình sống của vi rút cúm. NS2 protein có
trọng lượng phân tử 11.000 tồn tại trong virion (130-200 phân tử) và tạo thành phức
hợp với M1.
1.4. Quá trình nhân lên của vi rút cúm
Trước hết gai H của vi rút gắn vào thụ thể có chứa axit neuraminic của tế bào
chủ, rồi tiến hành nhập bào tạo endosom. Tiếp đó, xảy ra quá trình dung hợp giữa

vỏ ngoài của vi rút với màng endosom. Điều này thực hiện được nhờ gai H chồi lên

19


khi pH trong endosom thấp. Sau khi dung hợp ribonucleprotein và ARNpolymeraza chui vào tế bào chất. Việc “cởi áo” làm hoạt hóa ARN- polymeraza của
vi rút. Phân tử mARN được phiên mã trong nhân từ các chuỗi ARN khuôn đơn, (-)
của vi rút khi sử dụng mồi là đoạn 10 – 13 nucleotit cắt ra tử đầu 5 ’ của mARN có
gắn mũ của vật chủ, sau đó được gắn đuôi PolyA cũng lấy từ mARN của tế bào chủ.
Enzym cắt mồi là endonucleaza do vi rút mang theo. Phân tử mARN mới hoàn thiện
của vi rút ra khỏi nhân, vào tế bào chất để tiến hành sao chép genom trong nhân.
Kết quả quá trình phiên mã từ 8 đoạn ARN genom (-) tạo ra 10 phân tử
mARN, bởi vì đoạn 7 và 8 mỗi đoạn phiên mã tạo ra 2 phân tử mARN. 6 phân tử (1
– 6) dịch mã cho ra 6 protein, còn 2 phân tử (7 – 8) do có 2 khung đọc nên mỗi
phân tử tạo ra 2 phân tử protein. Điều này được thực hiện không phải do sử dụng
mARN đa gen (polycistronic) thật sự như ở prokaryota, bởi vì riboxom ở eukaryote
chỉ nhận diện bộ ba khởi đầu AUG nằm sát đầu 5’ của mARN.
Như vậy từ 1 ARN đã cho ban đầu, chúng chỉ tạo ra được 1 protein. Hai đoạn
7 và 8 tiến hành phiên mã cho ra 2 mARN có chiều dài đủ. Mỗi trường hợp tổng
hợp một loại protein bổ sung cho dịch mã từ mARN đã được chế biến nhờ bộ máy
cắt ghép (splicing) của tế bào chủ. Giống như các gen chồng lớp, một lần nữa đây là
ví dụ cho thấy các vi rút ARN đã tận dụng tối đa genom nhỏ bé của mình như thế
nào.
Khác với đa số vi rút ARN, protein cấu trúc sau khi được tổng hợp lại được
chuyển vào nhân và quá trình lắp rắp ribonucleoprotein xảy ra trong nhân. Các
glycoprotein HA và NA được tổng hợp trên mạng lưới nội chất hạt sau đó được di
chuyển tới các vùng chuyên biệt trên màng sinh chất. Protein M cũng di chuyển đến
màng và liên kết với màng nhờ gai HA và NA. Ribonucleoprotein và ARNpolymeraza cũng từ nhân di chuyển ra tế bào chất rồi tới màng sinh chất, nơi đã có
protein M và các gai HA, NA. Virion ra khỏi tế bào chất theo lối nảy chồi với sự
tham gia của neuraminidaza. Nếu enzyme này bị ức chế thì virion không được giải

phóng.

20


Genom phân nhiều đoạn của vi rút cúm là nguyên nhân dẫn đến sự thay đổi
kháng nguyên liên tục. Có 2 kiểu thay đổi kháng nguyên:
- Thay đổi lớn: Hiện tượng hoán vị kháng nguyên (antigenic shift) xảy ra khi có hai
hay nhiều chủng vi rút, với nhiều đoạn ARN khác biệt nhau về mặt di truyền, cùng
lúc xâm nhiễm vào một tế bào. Các đoạn genom hoán vị với nhau. Ví dụ: thay
đoạn mã hóa cho hemaglutinin của người bằng đoạn của động vật, kết quả là tạo ra
chủng vi rút mới với kháng nguyên H thay đổi, làm cho vi rút kháng lại kháng thể
đã được hình thành trong đáp ứng miễn dịch lần trước.
Biến chủng vi rút có thể lây nhiễm vào vật chủ mới mà chủng bố mẹ chúng
không có khả năng gây nhiễm. Sự hoán vị kháng nguyên được coi là nguyên nhân
gây ra các vụ đại dịch cúm.
- Thay đổi nhỏ: Một khái niệm khác liên quan đến sự thay đổi kháng nguyên nhưng ở
mức độ thấp gọi là biến thể kháng nguyên (antigenic drift). Do đột biến kháng
nguyên xảy ra ở gen mã hóa cho hemaglutinin dẫn đến sự thay đổi một số axit
amin trong protein hemaglutinin (mặc dù về cơ bản hemaglutinin vẫn là protein
như cũ). Chủng vi rút biến thể kháng nguyên trở thành chủng được chọ lọc trong
quần thể do chúng có khẳ năng nhiễm vào ký chủ chưa miễn dịch. Hiện tượng biến
thể kháng nguyên tăng lên từ mùa này sang mùa khác đã gây khó khăn cho việc
sản xuất vắcxin hữu hiệu phòng ngừa dịch cúm. Sự biến thể kháng nguyên là
nguyên nhân gây ra các vụ dịch nhỏ, tản phát [2].

21


Hình 1.6. Vi rút cúm A/H5N1 và quy trình vi rút cúm xâm nhập vào tế bào,

nhân lên thành vi rút mới [13]
1.5. Sự phát triển của vi rút cúm trên tế bào
Vi rút cúm đầu tiên được nuôi trên trứng gà có phôi. Sau này, các vi rút cúm
có thể được nuôi trên trứng gà có phôi hoặc trong một số hệ nuôi cấy tế bào tiên
phát. Việc nuôi cấy vi rút trên trứng gà có phôi vẫn được lựa chọn làm quy trình sản
xuất vắcxin cúm trên thế giới. Hiện nay, các hệ nuôi cấy tế bào như thận khỉ tiên
phát (PMKC) hay thận chó Madin- Darby (MDCK) thường được dùng để phân lập
vi rút cúm từ mẫu bệnh phẩm của người. Tế bào MDCK có độ nhạy 100% trong
phân lập vi rút cúm A trong khi đó độ nhạy của Vero chỉ 71,4% và MRC-5 là
57,1%.
Sự phát triển của vi rút trên nuôi cấy tế bào và tạo các đám hoại tử trong một
số dòng tế bào tiên phát như tế bào thận khỉ, thận bê, thận chuột đồng, thận gà.
Ngoài ra nếu sử dụng các dòng tế bào thường trực thì trypsin phải được bổ sung để
hoạt hóa các phân tử protein HA trong quá trình xâm nhập vào tế bào chủ của vi rút.
1.6. Kỹ thuật di truyền ngược
Giống như hầu hết các loại vi rút ARN sợi (-), vi rút cúm nhân lên trong nhân
của tế bào bị nhiễm. Sau khi dung hợp với màng tế bào, phức hợp của

22


ribonucleoprotein của vi rút (vRNP) được phóng thích vào tế bào chất. Phức hợp
vRNP, bao gồm ARN của vi rút (vARN), nucleoprotein (NP) và 3 loại protein
polymeraza (PA, PB1, PB2), được chuyển vào nhân và quá trình phiên mã tái bản
diễn ra tại đây, vARN sợi (-) không thể trực tiếp làm khuôn tổng hợp protein mà
vARN được bao bọc trong NP phải được phiên mã thành mARN nhờ phức hợp
polymeraza của vi rút. Trong quá trình tái bản vARN được sử dụng làm khuôn để
tổng hợp sợi ARN bổ sung (cARN), sợi cARN này lại được làm khuôn để tổng hợp
sợi vARN. Như vậy, đơn vị chức năng tối thiểu để vi rút cúm có thể tái bản là
vRNP.

Những nỗ lực tạo ra vi rút cúm trong phòng thí nghiệm từ những năm 1980
khi Plotch và Beaton, Krug tinh khiết được vRNP từ những vi rút bị phá hủy bằng
chất tẩy rửa và từ tế bào bị gây nhiễm. Đến cuối thập niên 80, Parvin và sau đó là
Honda đã thành công trong việc tái tạo phức hợp RNP có hoạt tính trong phòng thí
nghiệm từ những thành phần polymeraza NP riêng lẻ. Từ đấy rất nhiều hệ thống di
truyền ngược để tạo ra vi rút cúm đã được phát triển. Hệ thống di truyền ngược đầu
tiên được Palese và cộng sự thiết lập vào năm 1989 [33].
Một đoạn ARN tách chiết từ vi rút hoặc phiên mã từ cDNA trong phòng thí
nghiệm được ủ với polymeraza của vi rút (PA, PB1, PB2) và nucleoprotein (NP)
tinh sạch để tái tạo ra phức hợp vRNP. Phức hợp rRNP này được biến nạp vào tế
bào eukaryote đã bị gây nhiễm bằng một chủng vi rút cúm trợ giúp từ trước, vi rút
cúm trợ giúp có nhiệm vụ cung cấp các vRNP còn lại. Kết quả tạo ra một chủng vi
rút cúm tái tổ mới mang 7 đoạn ARN của vi rút cúm trợ giúp vào một đoạn ARN
được biến nạp vào. Năm 1994, Hobom và các đồng nghiệp [36] đã sử dụng enzyme
ARN polymeraza I để tổng hợp ARN của vi rút cúm bên trong tế bào, thiết lập một
hệ thống khác để tạo ra vi rút cúm mà vẫn sử dụng tới vi rút trợ giúp. Tuy nhiên
công trình này đã thúc đẩy việc ứng dụng kỹ thuật di truyền ngược trong các nghiên
cứu về vi rút cúm.
Trong các kỹ thuật di truyền ngược sau này, vARN được tạo dòng cDNA
trong các plasmid có khả năng tổng hợp vARN và các protein của vi rút cúm. Vì

23


vậy các gen của vurus cúm có thể được chủ động làm biến đổi theo ý muốn. Các
plasmit mang các cDNA được biến nạp vào tế bào. Bên trong tế bào, vARN và các
protein của vi rút được tổng hợp, sự lắp ráp các vARN và các protein dẫn đến sự
hình thành vi rút mới bên trong tế bào. Các vi rút này có khả năng nhân lên và phát
triển bình thường như một vi rút được phân lập [35]. Năm 1999, Neumann và cộng
sự đã tạo ra thành công vi rút cúm từ 17 plasmit ( 8 plasmit mã hóa tổng hợp 8 ARN

của vi rút, 9 plasmit biểu hiện tổng hợp 9 loại protein). Sau đó hệ thống này được
cải tiến, rút số plasmid phải sử dụng xuống 12.
Năm 2000, Hofmann và cộng sự đã cải biến hệ thống ARN polymeraza I
thành hệ thống ARN polymeraza I/II. Đoạn cDAN được cài đặt giữa trình tự
promoter ARN polymeraza II (cytomegalovi rút early promoter) và trình tự poly
(A). Do đó, quá trình phiên mã bằng ARN polymeraza I tạo ra ARN sợi âm của vi
rút, còn quá trình phiên mã bởi ARN polymeraza II tạo ra sợi mARN. Như vậy cả
vARN và mARN được tổng hợp cùng từ một khuôn, kết quả đã làm giảm số lượng
plasmid cần dùng từ 12 xuống 8. Vì vậy, hệ thống này có thể sử dụng cho nhiều
dòng tế bào hơn. Đến năm 2005, Neumann và cộng sự đã thiết lập được một hệ
thống di truyền ngược mới chỉ sử dụng từ 3 đến 4 plasmit. Đây là hệ thống mà rất
nhiều cấu trúc phiên mã bởi ARN polymeraza I được kết hợp lại với nhau trong
cùng một plasmid, cũng như các cấu trúc phiên mã bởi ARN polymeraza II được
kết hợp vào một plasmid khác.
Sự thành công của hệ thống các plasmid mang nhiều trình tự AND mã hóa
cho nhiều ARN, đã gợi ý rằng có tạo ra một hệ thống di truyền ngược mới chỉ có
một plasmid bằng cách kết hợp hệ thống trên và hệ thống ARN polymeraza I/II. Khi
đó, plasmid duy nhất được thiết kế gồm 4 đơn vị phiên mã ARN polymeraza I/II
cho các cDNA mã hóa PA, PB1, PB2, NP; 4 đơn vị phiên mã ARN polymeraza I
cho 4 cDNA mã hóa cho HA, NA, M, NS.
Trong những năm gần đây kỹ thuật di truyền ngược đã được áp dụng để tạo
ra các chủng vi rút cúm có sự sắp xếp lại các đoạn gen và có khả năng nhân lên rất
mạnh. Tùy từng trường hợp, các chủng vi rút cúm có tỷ lệ sắp xếp lại gen theo tỷ lệ

24


6:2 đã được tạo ra. Trong đó các đoạn gen HA và NA của nhiều chủng vi rút cúm
hoang dại khác nhau (bao gồm các chủng cúm người và gia cầm như A/H1N1,
A/H3N2, A/H5N1 và H5N3) còn 6 đoạn còn lại là của chủng PR8 [32, 46, 65]. Quy

trình kỹ thuật di truyền ngược có sự tham gia của các tế bào động vật như các tế bào
293T, hỗn dịch tế bào 293T/MDCK và tế bào Vero [37]. Tuy nhiên nếu chủng vi rút
được tạo ra nhằm mục đích làm chủng sản xuất thì theo TCYTTG khuyến cáo,
không sử dụng tế bào 293T trong kỹ thuật di truyền ngược [48].
Kỹ thuật di truyền ngược đã được ứng dụng vào nhiều nghiên cứu, lĩnh vực
khác nhau. Những chủng vi rút giảm độc lực được tạo bởi kỹ thuật di truyền ngược
có thể được sử dụng như là vắcxin sống để tạo kháng thể bảo vệ kháng lại vi rút
hoang dại. Vi rút cúm tạo miễn dịch dịch thể, đáp ứng miễn dịch niêm mạc và miễn
dịch tế bào mạnh. Hơn nữa, vi rút cúm là vi rút không gây ung thư. Kháng thể
kháng lại các phân typ khác nhau của vi rút cúm không có hoặc rất ít miễn dịch
chéo do vậy có thể dễ dàng vượt qua hàng rào bảo vệ của kháng thể có sẵn đối với
các vector trong vật chủ. Những đặc tính quý nêu trên đã mang lại khả năng có thể
sử dụng vi rút cúm như một vector vắcxin tiện lợi. Để tiêm chủng nhắc lại có hiệu
quả, có thể dùng các phân typ vi rút cúm khác nhau sản xuất ra cùng một loại kháng
nguyên. Một vị trí đã được xác định có thể dung hòa kháng nguyên ngoại lai là vị trí
kháng nguyên B của phân tử HA. Vi rút cúm phân typ H1 và H3 đã được sử dụng
để biểu thị trình tự kháng nguyên ELDKWAS của vi rút HIV. Vi rút cúm cũng được
sử dụng như là vector biểu thị kháng nguyên sốt rét và Pseudomonas aeruginosa
[14, 40]. Chủng vi rút cúm tạo bởi kỹ thuật di truyền ngược còn được sử dụng để
nghiên cứu chức năng vi rút.
1.7. Dịch tễ học bệnh cúm
Dịch cúm xảy ra theo xu hướng khác nhau ở các năm, thường xảy ra vào
mùa đông ở bắc và nam bán cầu, nhưng xuất hiện hàng năm ở khu vực nhiệt đới. Vi
rút cúm có khả năng tấn công cao, nên tỷ lệ mắc bệnh do vi rút cúm trong dân số là
tương đối cao. Tăng tỷ lệ mắc và tử vong do cúm xảy ra ở cực trị của nhóm tuối và
ở người đang mắc sẵn một bệnh khác.

25