Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phân lập thành phần flavonoit từ lá cây me rừng (phyllanthus emblica)

Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ là ô nhiễm môi trường và nảy
sinh những vấn đề khác, ví dụ như các căn bệnh nguy hiểm (ung thư, kháng sinh, cúm
H1N1, H7N9,...). Nguyên nhân của các căn bệnh trên đến từ nhiều nguồn khác nhau,
có thể do ô nhiễm môi trường, do kháng sinh. Trước tình trạng đó, nhiều quốc gia trên
thế giới đã tiến hành các chương trình nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất từ thiên
nhiên, với hy vọng các dược phẩm mới có nguồn gốc thực - động vật sẽ giúp giảm
thiểu các căn bệnh nguy hiểm nêu trên, tăng cường công tác chăm sóc sức khỏe và
kéo dài tuổi thọ con người. Những nghiên cứu tìm kiếm các họp chất có hoạt tính sinh
học cao để ứng dụng trong y học, nông nghiệp và các mục đích khác trong đời sống
con người đã và đang trở thành những nhiệm vụ quan trọng của các quốc gia trên thế
giới.
Là quốc gia nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, lượng mưa tương đối lớn,
độ ẩm cao (khoảng trên 80%), nhiệt độ trung bình khoảng từ 15 - 27°c, Việt Nam có
điều kiện thuận lợi cho các sinh vật phát triển và tạo ra sự phong phú của nhiều loài
động thực vật và nhiều hệ sinh thái khác nhau. Điều này có ý nghĩa rất quan trọng tới
sự phát triển của nền y học cổ truyền của Việt Nam.
Trong số các loài thực vật của Việt Nam, các loài thực vật thuộc họ Thầu dầu
hiện đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học. Ví dụ như: cây Me rừng
ịPhyỉỉanthus embỉica), thuộc họ Thầu dầu, là một loài cây đã được sử dụng làm thuốc
chữa bệnh từ lâu trong y học dân gian như chữa huyết áp cao, viêm ruột, viêm da, đau
họng, đau răng, rắn cắn,... Tuy nhiên, để có được cơ sở khoa học nhằm phát triển và
ứng dụng cụ thể loài cây này, cần có những nghiên cứu cụ thể về hóa học, hoạt tính
sinh học và những nghiên cứu sâu hon về duợc lý để giải thích tác dụng trong y học
cổ truyền của loài cây này, qua đó tạo cơ sở để tìm kiếm phuơng thuốc điều trị bệnh.
Xuất phát từ ý nghĩa thục tiễn trên tôi chọn đề tài cho khoá luận tốt nghiệp là:

Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

“Nghiên cứu phân lập thành phần Oavonoit từ ỉá cây Me rừng”.
Khóa luận tập trung nghiên cứu thành phần ílavonoit từ lá cây Me rừng bao
gồm những nội dung chính là:

1. Thu mẫu lá cây Me rừng (Phyllanthus emblica), xử lý mẫu và tạo dịch chiết.
2. Phân lập các họp chất ílavonoit.
Xác định cấu trúc hóa học của các họp chất đã phân lập đuợc.


CHƯƠNG 1: TỒNG QUAN

1.1.
1.1.1.

Giới thiệu chung về cây Me rừng
Thực vật học cây me rừng
Cây Me rừng (Hình 1.1) hay còn được gọi là chùm ruột núi, chùm ruột rừng,

bông ngót, cam tú, ngưu cam tú, du cam tú, mắc kham. Cây có tên khoa học là
Phyllanthus emblica. Đây là cây gỗ nhỏ hoặc bụi, cao 3-8(-10) m, vỏ mỏng, màu nâu
nhạt, nâu hoặc màu xám, nhẵn. Thân thường cong queo, phân cành nhiều, cành nhỏ
mềm, cành già màu xám nhạt, mang các nhánh nhỏ, có lông. Cành mang lá mảnh,
màu xanh nhạt. Cành mang lá và lá cùng sắp xếp gần như trên một mặt phẳng. Phiến
lá hình bầu dục khuôn, hai đầu tù, kích thước (3-)12-20 X (l-)3,5 - 5 mm, nhẵn; gần
như không cuống hoặc rất ngắn. Lá kèm rất nhỏ, hình tam giác, màu đỏ nâu. Hoa đơn

tính cùng gốc.

Hình 1.1. Mẩu lá, quả và tiêu bản cây me rừng
Hoa nhỏ mọc thành xim co ở nách lá phía dưới cành, gồm nhiều hoa đực và 12 hoa cái. Hoa đực có cuống ngắn; đài gồm 6 mảnh màu hồng hoặc xanh nhạt, hình
bầu dục. Hoa cái gần như không cuống; đài có 6 thuỳ tương tự hoa đực. Quả hình cầu,
kích thước 13-25 X 20-30 mm, mọng nước, màu vàng xanh; khi khô thành quả nang,
tự mở. Hạt dạng 3 cạnh, màu hồng nhạt hay nâu nhạt [1, 2, 4, 5].

1.1.2.

Phân bố sinh thái
Cây mọc phổ biến khắp nơi ở Việt Nam, nhất là ở các tỉnh miền núi và trung


du phía bắc [1, 2, 4, 5].
Me rừng là loài có vùng phân bố rộng ở nhiều nước châu Á, từ Ấn Độ đến
Myanmar, Nepal, Thái Lan, Malaysia, Lào, Campuchia, miền nam Trung Quốc. Hiện
me rừng đã được đưa vào trồng tại Nhật Bản, Hoa Kỳ và Australia.

1.1.3.

Công dụng
Nhiều bộ phận của loài Me rừng (p. emblỉca L.) có hoạt tính kháng khuẩn,

kháng oxy hóa, chống suy giảm miễn dịch, kháng độc và bảo vệ tế bào gan do các
kim loại màu gây ra [1, 2, 4, 5],...
Trong y học dân gian, lá được dùng chữa phù thũng, viêm da, mẩn ngứa. Hạt
dùng chữa hen, viêm cuống phổi và thiểu năng mật. Rễ dùng để chữa huyết áp cao,
đau thượng vị, viêm ruột và lao hạch bạch huyết [5],...
Quả thường dùng ăn tươi, làm ô mai, nước hoa quả, giải khát, hầm thịt, làm

thuốc nhuộm răng, nước gội đầu để kích thích mọc tóc. Quả cũng được dùng làm
thuốc chữa bệnh thiếu vitaminC (bệnh Scorbut), viêm đau gan, vàng da, rối loạn tiết
mật, viêm đau dạ dày, kiết lỵ, tiêu chảy, nhuận tràng, kích thích tiêu hóa, lợi tiểu, đái
đường, giải nhiệt, xuất huyết, cầm máu, thiếu máu, giảm huyết áp, đau nhức đầu, đau
nhức mắt, giảm sốt, choáng váng, ho, viêm phế quản, viêm sưng phổi,... Hạt dùng
chữa hen suyễn, viêm phế quản, thiểu năng mật,... Hoa được dùng làm thuốc nhuận
tràng, giải nhiệt và làm thuốc xổ. Lá me dùng làm thuốc giải nhiệt, chữa phù thũng và
một số bệnh ngoài da. Vỏ thân dùng làm thuốc chữa tiêu chảy, lỵ amip, cầm máu. Rễ
cây được dùng để chữa trị các bệnh cao huyết áp, đau thượng vị, viêm ruột, lao hạch
bạch huyết,... Cộng đồng các dân tộc tại miền núi ở Việt Nam và các nước
Trung Quốc, Thái Lan, Malaysia, Ấn Độ,... thường sử dụng các bộ phận của cây Me,
đặc biệt là quả để ăn cũng như làm thuốc khá rộng rãi [1, 2, 4, 5].

1.1.4.

Thành phần hóa học
Quả me rừng có vị chua, nguồn nguyên liệu rất giàu vitamin c. Trong quả chứa

các trigalloyglucose, ellagic acid, corilagin, terchebin, phylleblin, phyllemblic acid và


emblicol. Các nghiên cứu gần đây cho biết cả vitamin c và acid gallic cùng có đặc tính
kháng oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩn. Hoạt tính ức chế các quá trình oxy hóa có
thể còn do tác dụng của các tannin, emblicanin A, emblicanin B, punigluconin và
pedunculagin ở trong quả me rừng [5].
Phyllemblin được coi là hoạt chất có tác dụng tương tự như adrenalin, gây
giảm đau, an thần, đặc biệt là với hệ thần kinh trung ương [5],...
Những acid hữu cơ trong quả me rừng như: acid aspartic, ellagic, gallic,
myristic, ascorbic, các alanine, glycine, histidine, methionine, niacin, tyrosine cùng
với một số họp chất tannin được coi là có tác dụng phòng chống một số dạng ung thư

và kìm hãm sự phát triển của virut HIV [5],...
Lá là nguồn nguyên liệu giàu ílavonoid, tannin và sterol. Từ lá có thể tách
chiết được các hoạt chất ellagic acid, amlaic acid, kaempferol-3- glucoside,
kaempíerol, lupeol, a-amyrin acetat, các phytosterol C29 như P- sitosterol,
poriíerasterol, P-sitosterol-3-O-D-glucopyranosid [5],...
Vỏ cây chứa P-sitoserol,(+)-leucodelphinidin (3,75%), lupeol (2,25%) và
tannin. Thành phần chủ yếu trong tannin gồm phyllembin, gallotannin như 1,2,3trigalloyglucose, ellagitannin terchebin, corilagin, chebulagic acid, chebulinic acid.
Hạt chứa khoảng 16% dầu béo, chủ yếu là các linoleic acid (44%), oleic acid (28,4%),
linolenic acid, stearic acid, palmatic và myristic acid [5].


r
r
r
Dưới đây là ví dụ vê câu trúc một sô họp chât từ cây me rừng:
□H

Keamfero

□

Quercetin

Emblicanin A

Emblicanin B Hình 1.2.
Cấu trúc một

) họp chất từ cây me rừng

1.2.

Giới thiệu về lóp chất Havonoit [10-14]
Flavonoit là một trong những nhóm họp chất phân bố rộng rãi nhất trong tự

nhiên. Cho đến nay có hơn 4000 Flavonoit được tìm thấy từ thực vật.
Ban đầu chúng được phát hiện với vai trò là các sắc tố của thực vật vào mùa
thu khi các loài hoa, lá cây dần chuyển sang màu vàng, da cam, đỏ. Các Flavonoit
cũng được tìm thấy trong rau, quả, quả hạch, hạt, cỏ, gia vị, thân cây, các loại hoa
cũng như trong chè và rượu vang đỏ. Flavonoit có mặt trong hầu hết các bộ phận của
cây như lá, hoa, quả, phấn, rễ,... và cư trú ở thành tế bào. Nó tham gia vào sự tạo
thành màu sắc của cây đặc biệt là hoa (tạo cho hoa những màu sắc rực rỡ để quyến rũ
các loại côn trùng giúp cho sự thụ phấn của cây).
Các ílavonoit là lóp chất phổ biến có trong thực vật. Chúng là họp chất có cấu
tạo gồm 2 vòng benzen A, B được nối với nhau bởi một dị vòng c với bộ khung
cacbon C6-C3-C6. Việc phân loại các ílavonoit dựa trên sự khác nhau của nhóm C3
(các glicosit của nó có màu vàng nhạt và màu ngà; antoxianin và antoxianiđrin màu
đỏ, xanh, tía và các dạng không màu; isoílavon, catecin và leucoantoxianiđrin là các
chất tan trong nước và thường nằm trong không bào).

o

Hình 1.5. Khung cơ bản của các Hình 1.6. Khung cơ bản của các Aavonol

5

4

c

Flavanonol-3

Flavon
(Hình 1.4)
và của
ílavonol
rất 1.4.
phổ Khung
biến trong
tự nhiên.
Hình
1.3. Khung
cơ bản
các (Hình 1.5)
Hình
cơ bản
của cácCông
thức cấu tạo của chúng
ílavanchỉ khác nhau ở vị trí cacbon số 3.

ílavon

Trong thực vật, các ílavon và ílavonol thường không tồn tại dưới dạng tự do
mà thường dưới dạng glycozit.
Bên cạnh các họp chất có dạng khung ílavan, ílavon, ílavonol còn có các họp


chất thuộc dạng Flavanonol-3 (Hình 1.6) và một số họp chất thuộc khung Chalcon
(Hình 1.7), khung auron (Hình 1.8).

Hình 1.7. Khung cơ bản của các Hình 1.8. Khung cơ bản của các họp hợp chất
chalcon

1.3.

chất Auron

Các phương pháp chiết mẫu thực vật
Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất có

trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân cực trung
bình,...) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau.

1.3.1.

Chọn dung môi chiết
Thường thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau.

Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm. Dung môi dùng
trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận.
Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá thứ cấp
đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên
cứu), không độc, không dễ bốc cháy.
Dung môi lẫn tạp chất thì ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình
chiết do vậy cần phải được chưng cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng.
Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butylaxetylcitrar và tributylphosphat. Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá
trình sản xuất hoặc trong khâu bảo quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy
bằng nhựa.
Methanol và chloroform thường chứa dioctylphtalat [di-(2- etylhexyl)phtalat

hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá


trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể
làm bẩn dịch chiết của cây. Chloroform, metylen clorit và methanol là những dung
môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây như: lá, thân,
rễ, củ, quả, hoa,...
Những tạp chất của chloroform như CH2CI2, CtbClBr có thể phản ứng với
một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác. Tương tự
như vậy, sự có mặt của lượng nhỏ axit clohiđric (HC1) cũng có thể gây ra sự phân
huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp chất khác. Chloroform có thể gây
tổn thương cho gan và thận nên khi làm việc với chất này cần được thao tác khéo léo,
cẩn thận ở nơi thoáng và phải đeo mặt nạ phòng độc. Metylen clorit ít độc hơn và dễ
bay hơi hơn chloroform.
Methanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hiđrocacbon thế
clo. Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế
bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành phần
trong tế bào. Trái lại, khả năng phân cực của chloroform thấp hơn, nó có thể rửa giải
các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực
cùng với các họp chất phân cực trung bình và thấp. Vì vậy khi chiết bằng ancol thì các
chất này cũng bị hoà tan đồng thời. Thông thường dung môi cồn trong nước có những
đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng methanol
trong suốt quá trình chiết. Thí dụ trechlonolide A thu được từ Trechonaetes aciniata
được chuyển thành trechonolide B bằng quá trình phân huỷ 1-hydroxytropacocain
cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense được chiết trong methanol nóng.
Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà thay
vào đó là dùng dung dịch nước của methanol.
Đietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ bay
hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit dễ nổ, peroxit

của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với những họp chất không có khả năng tạo
cholesterol như các carotenoit. Tiếp đến là axeton cũng có thể tạo thành axetonit nếu
1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit. Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc
bazơ thường được dùng với quá trình phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lý các dịch
chiết bằng axit - bazơ có thể tạo thành những sản phẩm mong muốn.
Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp trong cây
được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết
tránh được sự phân huỷ chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn.
Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá
30 - 40°c, với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hon.

1.3.2.

Quá trình chiết
Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:

-

Chiết ngâm.

-

Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet.

-

Chiết lôi cuốn theo hơi nước.
Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong

quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian. Thiết bị sử
dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy để điều chỉnh tốc độ chảy
thích họp cho quá trình tách rửa dung môi. Dung môi có thể nóng hoặc lạnh nhưng
nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trước đây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng
kim loại nhưng hiện nay có thể dùng bình thuỷ tinh.
Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp
chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ rồi
chất chiết được lấy ra. Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ thực hiện qua 3 lần
dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa. Sự kết thúc
quá trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau.
Ví dụ:


-

Khi chiết các ancaloit, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất này bằng sự tạo
thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân: Đragendroff và tác nhân
Mayer.

-

Các ílavoloit thường là những hợp chất màu, vì vậy khi dịch chiết chảy ra mà không
có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này trong cặn chiết.
Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi
cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý nhằm đạt hiệu quả cao.


Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lóp chất mà ta
có thể tách thô một số lóp chất ngay trong quá trình chiết.

1.4.

Các phương pháp sắc kỷ trong phân lập các họp chất hữu cơ
Phương pháp sắc ký (chromatography) là một phương pháp phổ biến và hữu

hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các họp chất hữu cơ nói
chung và các họp chất thiên nhiên nói riêng.

1.4.1.

Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký
Sắc ký là phương pháp tách các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất hấp

phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha: pha tĩnh và pha động.
Sắc ký gồm có pha tĩnh và pha động. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của
hỗn họp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính
bị hấp phụ, tính tan,...). Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và
pha tĩnh. Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lóp pha tĩnh
này đến lóp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết quả
là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so
với các chất tương tác yếu hơn với pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách
các chất qua quá trình sắc ký.

1.4.2.

Cơ sở của phương pháp sắc ký
Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha

tĩnh và pha động. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của
lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là áp

suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir:
n
1+b.c


Trong đó:

n - Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng.
n«, - Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp
phụ nào đó. b - Hằng số.
c - Nồng độ của chất bị hấp phụ.

1.4.3.

Phân loại các phương pháp sắc ký
Trong phương pháp sắc ký pha động là các lưu thể (các chất ở trạng thái khí

hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn. Dựa vào trạng
thái tập họp của pha động, người ta chia sắc ký thành hai nhóm lớn: sắc ký khí và sắc
ký lỏng. Dựa vào cách tiến hành sắc ký, người ta chia ra thành các phương pháp sắc
ký chủ yếu sau:

1.4.3.

L Sắc ký cột (C.C)
Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các

loại silicagel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC, ODS,
Dianion. Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷ tinh hoặc kim loại,
phổ biến nhất là cột thuỷ tinh). Độ mịn của chất hấp phụ hết sức quan trọng, nó phản

ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng
nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao và ngược lại. Tuy nhiên nếu
chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm. Trong một số
trường hợp nếu lực trọng trường không đủ lớn thì gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi
không chảy được), khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình
(MPC), áp suất cao (HPLC).
Trong sắc ký cột, tỷ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất quan
trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là
phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc ký, tỷ lệ giữa quãng đường đi của chất
cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là
Rf, với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau. Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta
có thể tách từng chất ra khỏi hỗn họp. Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất quan


trọng và tuỳ thuộc vào yêu cầu tách. Nếu tách thô thì tỉ lệ này thấp (từ 1/5 - 1/10), còn
nếu tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác
nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20-1/30.
Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng. Tuỳ vào lượng chất
và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các phương pháp khác nhau.
Nếu lượng chất nhiều và chạy thô, thì phổ biến là tẩm chất vào silicagel rồi làm khô,
tơi hoàn toàn, đưa lên cột. Nếu tách tinh, thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà
tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu.
Có hai phương pháp đưa chất hấp phụ lên cột:

-

Phương pháp 1: Nhồi cột khô. Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột
khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp
chặt trong cột. Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt.

-

Phương pháp 2: Nhồi cột ướt, tức là chất hấp phụ được hoà tan trong dung môi chạy
cột trước với lượng dung môi tối thiểu. Sau đó đưa dần vào cột đến khi đủ lượng cần
thiết.
Lun ý: không được để bọt khí bên trong cột (nếu có bọt khí gây nên hiện
tượng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách), cột không được nứt, gẫy, dò.
Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách. Nếu tốc độ
dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Còn nếu tốc độ dòng chảy quá thấp thì
sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc.

1.4.3.2.

sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lóp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và định hướng

cho sắc ký cột. SKLM được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silicagel trên đế nhôm
hay đế thuỷ tinh. Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu chất trực tiếp. Bằng việc
sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng silicagel dày hơn), có thể đưa lượng
chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc ký, người ta có thể cạo riêng phần silicagel


có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích họp để thu được từng chất
riêng biệt. Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu
đặc trưng cho từng lóp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%.

1.5.

Một số phương pháp hoá lỷ xác định cấu trúc của các họp chất hữu cơ [5-

7]
Cấu trúc hoá học các họp chất hữu cơ được xác định nhờ vào các phương pháp
phổ kết họp. Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng chất mà người ta sử dụng
phương pháp phổ cụ thể nào. cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối họp các phương
pháp phổ càng cao. Trong một số trường hợp, để xác định chính xác cấu trúc hoá học
của các họp chất, người ta phải dựa vào các phương pháp bổ sung khác như chuyển
hoá hoá học, kết họp với các phương pháp sắc ký so sánh,...

1.5.1.

Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR)
Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên

kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại. Mỗi kiểu liên kết
được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau. Do đó, dựa vào phổ hồng ngoại,
có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng trong hợp chất, ví dụ: dao động hoá trị
của nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl là 3300- 3450 cm"1, của nhóm
cacbonyl c = o trong khoảng 1700- 1750 cm"1,...

1.5.2.

Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS)
Phổ khối lượng được sử dụng khá phổ biến để xác định cấu trúc hóa học của các

họp chất hữu cơ.
Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân
tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Phổ MS còn cho các pic ion mảnh
khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại
được cấu trúc hoá học các hợp chất. Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng, như
những phương pháp chủ yếu sau:

-

Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization mass spectroscopy) dựa vào sự phân mảnh


ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ biến là 70eV.

-

Phổ ESI-MS (Electron Spray Ionization mass spectroscopy) gọi là phổ phun mù điện
tử. Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS,
do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các
liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ.

-

Phổ FAB (Fast Atom Bombing mass spectroscopy) là phổ bắn phá nguyên tử nhanh
với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do đó phổ thu được cũng dễ thu
được pic ion phân tử.

-

Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy), cho phép xác
định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao.
Ngoài ra, hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc ký kết
hợp với khối phổ khác như: GC-MS (sắc ký khí-khối phổ), LC-MS (sắc ký lỏng-khối
phổ). Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành phần
của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong ngành dược).

1.5.3.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy,

NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu
nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết họp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai
chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của họp chất, kể cả cấu
trúc lập thể của phân tử.
Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon) là sự
cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (!H và 13C) dưới tác dụng của từ trường
ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ chuyển dịch hoá học
(chemical shift). Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác
spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling).

1.5.3.1.

Phổ 1H-NMR
Trong phổ !H-NMR, độ chuyển dịch hoá học (ô) của các proton được xác định


trong thang ppm từ 0-14ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng như
đặc trưng riêng của từng phần. Dựa vào những đặc trưng của độ chuyển dịch hoá học
và tương tác spin mà ta có thể xác định được cấu trúc hoá học của họp chất.

1.5.3.2.

Phổ 13C-NMR
Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở

một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của phổ 13C-NMR là
ppm, với dải thang đo rộng 0 - 230ppm.

1.5.3.3.

PhoDEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer)

Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên
phổ DEPT, tín hiệu của các cacbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu của CH và CH3 nằm
về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 135°. Trên phổ DEPT 90° chỉ
xuất hiện tín hiệu phổ của các CH.

1.5.3.4.
-

Phổ 2D-NMR

Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence)’. Các tương tác trực tiếp
H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này. Trên phổ, một trục là phổ !HNMR, còn trục kia là 13C-NMR. Các tương tác HMQC nằm trên đỉnh các ô vuông
trên phổ.

-

Phổ COSY (HOMOCOSY)

Chemical Shift Correlation

Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các proton
đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại
với nhau.

-

Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ biểu diễn tương
tác xa trong không gian phân tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần
của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc.

-

Phổ NOESY {Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương
tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến
khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu


trúc không gian của phân tử.
Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE differences để
xác định cấu trúc không gian của phân tử. Bằng việc đưa vào một xung đúng bằng từ
truờng cộng hưởng của một proton xác định thì các proton có cùng phía về không gian
cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và cho tín hiệu với cường
độ mạnh hơn.
Ngoài ra, còn sử dụng phổ X-RAY (nhiễu xạ Rơngen) để xác định cấu trúc
không gian của toàn bộ phân tử của hợp chất kết tinh ở dạng đơn tinh thể. Nhưng
phạm vi sử dụng của nó hạn chế vì yêu cầu cần tiên quyết của phương pháp này là cần
phải có đơn tinh thể. Đây là một điều kiện không phổ biến đối với các hợp chất hữu
cơ.
Như trên đã đề cập, ngoài việc sử dụng các loại phổ, người còn sử dụng kết
họp với các chuyển hoá hoá học cũng như các phương pháp phân tích, so sánh kết họp
khác. Đặc biệt đối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng
lấp nhiều khó xác định chính xác được chiều dài các mạch. Đối với phân tử có các
đơn vị đường thì việc xác định chính xác loại đường cũng như cấu hình đường thông

thường phải sử dụng phương pháp thuỷ phân rồi xác định bằng phương pháp so sánh
LC-MS hoặc GC-MS với các đường chuẩn dự kiến.


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1.

Mẩu thưc vât
••
Mầu cây Me rừng thu thập tại Mê Linh - Vĩnh Phúc. Người thu thập và định

loài: TS Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam giám định. Tiêu bản mẫu (VNB_21) được lưu tại
Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Hình ảnh mẫu
và tiêu bản (Hình 1.1).

2.2.
2.2.1.

Phương pháp phân lập các họp chất
sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lóp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien

60F254 (Merck 1,05715), RPi8 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở
hai bước sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%
được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện đến khi hiện màu.

2.2.2.

Sắc ký lớp mỏng điểu chế
Sắc ký lóp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silicagel 60G

F254 (Merck, ký hiệu 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai bước sóng
254 nm và 368 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4
10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất,
sau đó cạo lóp Silicagel có chất, giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp.

2.2.3.

Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silicagel pha thường và pha đảo.

Silicagel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silicagel pha đảo
ODS hoặc YMC (30-50 pm, FuJisilisa Chemical Ltd.).

2.3.
23.1.

Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất
Điểm nóng chảy (Mp)
Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler micro - hotstage của Viện Hóa sinh


biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.3.2.

Phổ khối lượng ịESI-MS)
Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization mass spectra)

được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hoá học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.3.3.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): !H-NMR (500 MHz) và 13C- NMR (125

MHz) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học, Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.3.4.

Độ quay cực [a]D
Độ quay cực được đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter của Viện

Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.4.

Dung cu và thiết bi

2.4.1.

Dụng cụ và thiết bị tách chiết
Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch được sử dụng

bao gồm:
+ Bình chiết 30 lít

+ Máy cô quay chân không
+ Đèn tử ngoại hai bước sóng 254 và 368 nm
+ Tủ sấy chân không
+ Máy sấy
+ Micropipet
+ Bình sắc ký loại phân tích và điều chế + Cột
sắc ký pha thường các loại đường kính
+ Cột sắc ký pha ngược trung áp +
Máy phun dung dịch thuốc thử +
Bếp điện


2.4.2.

Dụng cụ và thiết bị xác định cẩu trúc
+ Máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR AM500 FT-NMR spectrometer.
+ Máy sắc ký lỏng cao áp ghép nối khối phổ (ESI) AGILENT 1200 LC-MSD

Trap spectrometer.
+ Thiết bị đo điểm nóng chảy Kofler micro-hotstage.
+ Thiết bị đo độ quay cực JASCO.

2.5.

Hoá chất
+ Silicagel 60 (0,04 - 0,063 mm) Merck.
+ Silicagel pha đảo ODS hoặc YMC (30 - 50 ịim, FuJisilisa Chemical

Ltd.).
+ Bản mỏng tráng sẵn pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715).

+ Bản mỏng tráng sẵn pha ngược RP18 F254s (Merck).
+ Bản mỏng điều chế pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck).
+ Các loại dung môi hữu cơ như methanol, etanol, ethyl acetate, chloroform,
hexane, acetone,... là loại hoá chất tinh khiết của Merck.


CHƯƠNG 3. THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1.

Chiết và phân lập các họp chất
Mầu lá của cây me rừng, được rửa sạch, phơi khô trong bóng râm, sau đó sấy

khô bằng tủ sấy ở nhiệt độ 50°c, sau cùng đem nghiền nhỏ thành bột thu được 7 kg
bột khô.
Phần lá khô của Phyllanthus emblỉca (7 kg) được đem nghiền nhỏ sau đó đem
chiết với MeOH 3 lần. Phần dịch chiết được quay khô với áp suất giảm để tạo thành
cặn chiết MeOH (430 g). Cặn MeOH được hòa vào nước và phân lóp lần lượt với
Hexan và EtOAc để thu được các dịch chiết rồi quay khô thu được cặn chiết Hexan
(124 g) và EtOAc (186 g).


Hình 3.1. Sơ đồ tạo dịch chiết phân đoạn
Do thời gian thực nghiệm có hạn, nội dung nghiên cứu của khóa luận chỉ dừng
lại trong phân lập phần dịch chiết EtOAc, các phân đoạn khác đang đuợc tiến hành tại
đơn vị nghiên cứu.


Từ phần cặn chiết EtOAc tiến hành sử dụng sắc ký cột thủy tinh với dung môi
rửa giải là CHCI3 : MeOH (chạy gradient với tỷ lệ dung môi từ 100% CHCI3 đến

100% MeOH), thu được ba phân đoạn lần lượt là PE_Et_A (30,6 g); PE_Et_B (41,2
g) và PE_Et_C (104,7 g). Do yêu cầu của thời gian nghiên cứu, do đó trong khóa luận
này chỉ chọn phân đoạn dễ nghiên cứu nhất, phân đoạn PE_Et_B, với lượng vết hiển
thị trên bản TLC rất rõ. Từ PE_Et_B, tiến hành sử dụng sắc ký cột thủy tinh với dung
môi rửa giải là Cloroíom : metanol: nước (Tỷ lệ 6:1:0,1) thu được họp chất PU1
(120,1 mg) và PUW1 (39,7 mg).

Hình 3.2. Sơ đồ chiết và phân lập các họp chất từ lá me rừng

3.2.

Hằng số vật lỷ và các dữ kiện phổ của các hợp chất


3.2.1.

Hợp chất 1 (PU1)
Các thông số vật lý của họp chất PU1, các số liệu như sau: Tinh thể màu vàng
Phổ ESI-MS m/z: 303,1 [M+H]+, 325,0 [M+Na]+ và 300,9 [M-H]Công thức phân tử C15H10O7 (M = 302)

1H-NMR (600 MHz, CD3OD) ô (ppm): 6,26 (d, J = 2,0 Hz, H-6); 6,52 (d, J = 2,0
Hz, H-8); 7,83 (d, J = 2,0 Hz, H-2’); 6,99 (d, J = 8,5 Hz, H-5’); 7,70 (dd, J = 2,0, 8,5
Hz, H-6’).

3.2.2.

Hợp chất 2 (PUW1)
Các thông số vật lý của họp chất PUW1 như sau: chất rắn màu vàng. Phổ ESI-

MS m/z: 291 [M+H]+, 289 [M-H]". Công thức phân tử CI5HI406, M = 290. Các số

liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân ^-NMR, 13C-NMR và HSQC, HMBC được trình
bày trên bảng.