Bảo quản tinh trùng lợn trong nitơ lỏng (196 0c)

TRƯỜNG ĐH NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
BỘ MÔN CNSH ĐỘNG VẬT

Đề Tài: “ Bảo quản tinh trùng lợn

trong nitơ lỏng (1960C)”
Giáo viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Hữu Đức
GV. Nguyễn Tố Loan
Nhóm 3

Hà Nội 2010


I. Đặt Vấn Đề
• Chăn nuôi là một ngành
nông nghiệp quan trọng
trong nền kinh tế quốc dân.
Chăn nuôi cung cấp thịt,
trứng, sữa, sức kéo… cho
con người.
• Trong đó nghành chăn nuôi
lợn chiếm 1 phần không
nhỏ( theo niên giám thống
kê 2004 số lượng lớn là
26143,7 nghìn con.)


I. Đặt Vấn Đề
• Việc bảo tồn và phát
huy hết giá trị nguồn

gen lợn đực giống
thông qua công nghệ
sinh sản là một vấn
đề có mức ảnh
hưởng lớn đến nền
sản xuất chăn nuôi
lợn đực giống và lợn
thương phẩm


I. Đặt Vấn Đề
• Tuy nhiên công nghệ bảo quản tinh trùng lợn
đực giống ở nước ta mới chỉ tiến hành phương
pháp bảo quản tinh trùng lợn đực giống dạng
ngắn ngày mà chưa chú trọng đến phương pháp
bảo quản tinh trùng lợn đực giống dài ngày.
• Vậy chúng tôi thực hiên đề tài sinh viên nghiên
cứu khoa học trong khuôn khổ chương trình
Việt – Bỉ với tên gọi: Bảo quản lạnh tinh trùng
lợn trong Nitơ lỏng (- 196oC)


II. Mục Đích Nghiên Cứu
 Bước đầu thăm dò môi trường đông lạnh và
giải đông tinh trùng lợn
 Bước đầu thiết lập quy trình đông lạnh và bảo
quản tinh trùng lợn trong nitơ lỏng (- 196oC)
 Nhằm thúc đẩy quá trình thương mại hóa, trao
đổi giống và cải tiến chất lượng đàn lợn thương
phẩm tại Việt Nam

 Nhằm bảo tồn giống lợn đực tốt có chất lượng
và nâng cao hiệu quả sinh sản của đàn lợn
thương phẩm tại Việt Nam


III. Nội Dung &Phương Pháp Nghiên Cứu
1. Phạm vi và đối tượng nghiên cứu
 Tinh trùng lợn đực giống ? được khai thác từ
các cơ sở chăm nuôi lợn đực giống tại vùng Hà
Nội, Bắc Ninh, Hưng Yên
 Tuổi của lợn đực giống ? và trọng lượng của
lợn đực giống ?
 Thời gian lấy tinh ?
 Khoảng cách giữa 2 lần lấy tinh ?
 Phương pháp lấy tinh ?


2. Đánh giá chất lượng tinh trùng
trước khi đông lạnh


Lượng tinh dịch lợn (ml):
Lượng tinh dịch lợn thường
được đo băng pipet chia vạch.
Lượng tinh dịch TB của lợn nội
>=100ml
Lượng tinh dịch TB của lợn
ngoại = [250,400] ml
 Nồng độ tinh trùng (106/ml): Là
số lượng tinh trùng có trong 1ml

tinh dịch. Phương pháp đánh
giá nồng độ tinh trùng là:
 Phương pháp buồng đếm hồng
cầu


2. Đánh giá chất lượng tinh trùng
trước khi đông lạnh
 Độ pH của tinh dịch lợn có pH = [7.2,7.5]
Ta có thể đo pH bằng giấy đo pH, hoặc máy đo
pH
 Màu sắc tinh dịch lợn: tinh dịch lợn thường có
màu trắng sữa. Nếu tinh dịch có màu khác
thường thì có thể tinh dịch đã bị nhiễm bẩn và
không thể dùng được


2. Đánh giá chất lượng tinh trùng
trước khi đông lạnh
 Sức đề kháng của tinh trùng (R): là sức đề
kháng của tinh trùng trong dung dịch đẳng
trương. Người ta thường dùng nước muối 1%
để kiểm tra và đánh giá lượng tinh dịch cần pha
loãng 1 đơn vị tinh dịch đến khi toàn bộ tinh
dịch ngừng hoạt động.
Mùi vị tinh trùng thường có mùi tanh. Nếu tinh
trùng có mùi thối khắm hay khai thì tinh trùng
cũng đã nhiễm bẩn.

2. Đánh giá chất lượng tinh trùng
trước khi đông lạnh
 Tỷ lệ sống của tinh trùng
liên quan đến mức độ
hoạt động của tinh trùng
 Đo tỉ lệ sống của tinh
trùng dựa trên nguyên
lý nhuộm Eosin. Tinh
trùng chết sẽ bắt màu
thuốc nhuộm còn tinh
trùng sống sẽ không
bắt màu thuốc nhuộm.


2. Đánh giá chất lượng tinh trùng
trước khi đông lạnh
 Tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng: là tinh trùng có
hình dáng khác so với tinh trùng bình thường.


2. Đánh giá chất lượng tinh trùng
trước khi đông lạnh
Độ tiến của tinh trùng: được đánh giá thông qua thước
Macleod.
 Mức của thước Macleod
Vạch 0: Tinh trùng Bất Động
Vạch 1: Tinh trùng di động nhưng không tiến tới
Vạch 2: Tinh trùng di động nhưng tiến tới yếu
Vạch 3: Tinh trùng di động tiến tới vừa phải
Vạch 4: Tinh trùng di động tiến tới nhanh

3. Môi trường bảo quản đông lạnh
3.1. Chất bảo quản lạnh tinh trùng
 Chất có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào của tinh
trùng như ethylen glycol, propanediol (PROH), propylen
glycol, glycerol, dimethylsulphoxide (DMSO)
Chất bảo quản tinh trùng không có khả năng đi qua
màng tế bào: sucrose, glucose, glactose, pyrrolydine…
 Người ta thường kết hợp 2 chất bảo quản tinh trùng trên
giúp cho quá trình khử nước trong tinh trùng và cân
bằng áp suất trong tế bào chất của tinh trùng được diễn
ra nhanh hơn, giúp bảo vệ tinh trùng trong quá trình
đông lạnh


3.2. Các chất tham gia bảo quản
đông lạnh tinh trùng
 Glucose: cung cấp năng lượng và giải
độc cho tinh trùng và là chất bảo vệ lạnh
cho tinh trùng
 Sodium citrate: làm chất đệm ổn định pH
 Lòng đỏ trứng gà: nhằm chống lạnh cho
tinh trùng.
 Dung dịch chất bảo quản lạnh


4. Phân lập tinh trùng lợn
 Trước khi tiến hành đông lạnh tinh trùng ta nên tiến
hành phâp tách tinh trùng nhằm tách được tinh trùng

sống ra khỏi tinh trùng chết và các mảnh vỡ tế bào trong
tinh dịch nhằm tăng hiệu quả bảo tồn tinh dịch.

 Phân lập tinh trùng lợn băng phương pháp swim up:
Nguyên tắc của phương pháp này là tinh dịch sẽ bơi lên
phĩa trên và thoát khỏi tinh dịch bên dưới.

 Phân lập tinh trùng băng phương pháp gradient không
liên tục: Phương pháp này dựa trên quá trình ly tâm thì
tinh trùng khỏe sẽ bơi nhanh hơn so vơi tinh trùng chết
và các mảnh tế bào.


5.1 Phương pháp đông lạnh tinh trùng chậm

Tinh trùng tốt
A>0.7

Ly tâm
Pha với môi trường
Tăng dần nồng độ
chất bảo quản lạnh

Giảm nhiệt độ chậm
với tốc độ ?oC/ phút
Đến nhiệt độ [-5oC,-9oC]

Giảm nhiệt độ nhanh
Với tốc độ ?oC/ phút
Đến nhiệt độ -80oC

Tiến hành bảo quản
Trong nito lỏng (-196oC)


5.1.Phương pháp đông lạnh tinh trùng
chậm
• Chất bảo quản lạnh được sử dụng hiện nay là 1,2
propanediol (PROH). Với PROH, kết quả đạt được tốt
nhất khi dùng kèm với sucrose để làm chất bảo quản.
• Môi trường dùng trong quy trình trữ lạnh gồm có môi
trường cơ bản là môi trường đệm phosphate (PBS) bảo
quản bên ngoài tế bào.
• Nồng độ PROH và sucrose trong từng môi trường là:
• Làm lạnh 1: 1,5M PROH (?0C phút)
• Làm lạnh 2: 1,5M PROH + 0,1M sucrose (?0C phút)
• Sau đó tinh dịch được cho vào các ống trữ thể tích
khoảng ?ml và trữ theo chương trình:
• Từ nhiệt độ phòng xuống -700C: giảm 1-20C/phút


5.1.Phương pháp đông lạnh tinh trùng chậm
• Từ nhiệt độ phòng xuống -70 0C: giảm 1-2 0C/phút
• Tạo mầm tinh thể: Dùng một vật kim loại nhúng vào
nitơ lỏng trước khi chạm vào thành ống trữ tinh
• Giai đoạn làm lạnh chậm đến -30 0C: giảm 0,3
0
C/phút
• Giai đoạn làm lạnh nhanh: giảm 30-50 0C/phút,
hoặc có thể cho trực tiếp vào nitơ lỏng.

5.2. Phương pháp đông lạnh tinh trùng
băng thủy tinh hóa
• Nguyên lý của kĩ thuật thủy tinh hóa là ở môi
trường đẳng trương và nhiệt độ làm lạnh nhanh
ở -130oC trở đi thì nước sẽ hình thành dạng hạt
kết tinh hay dạng hạt thủy tinh.
• Phương pháp thủy tinh hóa nhằm đặt tinh trùng
vào áp suất môi trường cao nhằm diến ra sự
khử nước nhanh, sau đó tiến hành đặt trực tiếp
tinh trùng vào nito lỏng


5.2. Phương pháp đông lạnh tinh trùng
bằng thủy tinh hóa

Tinh trùng tốt
A> 0.7

Ly tâm
Pha với môi trường
Có nồng độ
chất bảo quản lạnh cao

Đặt ngay tinh trùng
Vào nito lỏng


5.2. Phương pháp đông lạnh tinh trùng

bằng thủy tinh hóa
• Các chất bảo vệ đông lạnh được sử dụng trong kỹ thuật
thủy tinh hóa gần giống như trong kỹ thuật đông lạnh
chậm , nhưng nồng độ sử dụng cao hơn.
• Gồm 2 chất bảo vệ đông lạnh có khả năng thấm qua
màng tế bào (ethylene glycol,propylene glycol, acetamid,
glycerol, raffinose, dimethylsulphoxide (DMSO) và 1,2propanediol (PrOH). ) để khử nước bên trong tế bào và
1 chất bảo vệ đông lạnh không có khả năng thấm qua
màng tế bào (sucrose, trehalose, glucose và galactose )
làm đối trọng, giúp quá trình khử nước bên trong tế bào
xảy ra nhanh hơn.


5.2.1 Dụng cụ trong kỹ thuật thủy tinh hóa
• OPS (open-pulled straw): đây là một loại straw
có đường kính trong nhỏ hơn rất nhiều so với
đường kính nguyên thủy của các loại straw
0,25ml thường dùng.Lượng môi trường có chứa
tinh trùng khi được hút vào trong OPS chỉ
khoảng ?µl, đầu OPS chứa môi trường và tinh
trùng được bảo vệ bằng 1 straw 0,5ml; đầu còn
lại được gắn một nút nhựa nhằm tránh trường
hợp OPS bị nổi lên bề mặt khi thả vào nitơ lỏng.
OPS là loại dụng cụ được sử dụng phổ biến
nhất trong kỹ thuật đông lạnh cực nhanh hiện
nay


5.2.1 Dụng cụ trong kỹ thuật thủy tinh hóa
• ryoloop: dụng cụ này bao

gồm một vòng tròn rỗng bằng
nhựa mềm, gắn với một cán
nhựa hoặc kim loại. Dung dịch
thủy tinh hóa tạo thành mộp
lớp màng mỏng trong phần
rỗng của vòng tròn và tinh
trùng được đặt ngay trên lớp
màng mỏng này, sau đó toàn
bộ dụng cụ có chứa tinh trùng
được làm lạnh trong hơi nitơ
lỏng


5.2.1 Dụng cụ trong kỹ thuật thủy tinh hóa
• Cryotop: đây là loại dụng cụ chỉ mới
được phát minh trong một vài năm
gần đây (2000) nhưng được xem là
dễ sử dụng và có hiệu quả sau rã
đông cao nhất. Dụng cụ bao gồm một
bản phim trong mỏng được bảo vệ
bởi một nắp nhựa, gắn với 1 cán cầm
bằng nhựa. Tinh trùng được đặt trên
bề mặt bản phim với một lượng môi
trường rất nhỏ và toàn bộ mẫu được
nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng. Ngoài
ưu điểm dễ thao tác, cryotop nhanh
hơn rất nhiều so với OPS, điều này
giúp tăng tỉ lệ sống của tinh trùng sau
khi rã đông. tốc độ làm lạnh và rã
đông khi sử cryotp nhanh hơn

5.2.2. Ưu điểm của kỹ thuật thủy tinh hóa
• Phương pháp thủy tinh hóa có thời gian nhanh
hơn và có hiệu quả kinh tế cao hơn so với kỹ
thuật động lạnh chậm
• Nồng độ chất bảo vệ đông lạnh cao giúp quá
trinh khử nước trong kỹ thuật thủy tinh hóa diễn
ra nhanh hơn, hiệu quả hợn, tỉ lệ tinh trùng sống
nhiều hơn
• Kỹ thuật thủy tinh hóa giúp bảo vệ an toàn hơn
và it gây biến đổi tinh trùng hơn so với kỹ thuật
đông lạnh chậm