Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá tính chất của l ASPARAGINASE tái tổ hợp ở PICHIA PASTORIS x33

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------

-----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:
BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA
L-ASPARAGINASE TÁI TỔ HỢP Ở PICHIA PASTORIS X33

Người hướng dẫn

: TS. Đỗ Thị Tuyên

Sinh viên thực hiện : Vũ Văn Vạn
Lớp

Hà Nội - 2015

: 11-01


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------

-----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:
BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA LASPARAGINASE TÁI TỔ HỢP Ở PICHIA PASTORIS X33

Người hướng dẫn

: TS. Đỗ Thị Tuyên

Sinh viên thực hiện : Vũ Văn Vạn
Lớp

: 11-01

Đề tài được thực hiện tại phòng Công nghệ sinh học enzyme

Hà Nội - 2015


Khóa Luận Tốt Nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS. Đỗ
Thị Tuyên, Phó trưởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh
học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hướng nghiên cứu,
hướng dẫn, sửa luận văn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn cố PGS. TS Quyền Đình Thi, Trưởng phòng
Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam, đã tạo mọi điều kiện về hóa chất, thiết bị, thời gian giúp đỡ
tôi hoàn thiện đề tài này.
Tôi xin cảm ơn Ths. Nguyễn Thị Hiền Trang đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong

quá trình hoàn thành luận văn. Tập thể cán bộ, nghiên cứu sinh, sinh viên phòng
Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi tận tình trong suốt quá trình làm khóa luận, tôi
xin gửi lời cảm ơn sâu sắc.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học
Mở Hà Nội đã luôn quan tâm, tạo điều kiện thận lợi cho tôi trong suốt quá trình học
tập và hoàn thiện luận văn tốt nghiệp.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã luôn
động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập.

Hà Nội, ngày 19, tháng 5, năm 2015

Vũ Văn Vạn

i


Khóa Luận Tốt Nghiệp

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt

Viết đầy đủ

APS

Ammonium persulfate

asn, ASN

L-asparaginase

Bp

Base pairs

Cs

Cộng sự

cDNA

Complement DNA

DNA

Deoxyribonocleic acid

dNTP

2' Deoxynucleoside 5' triphosphate

ĐC

Đối chứng

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

EtBr

Ethidium bromide

Kb

Kilo base

kDa

Kilo dalton

M

Marker (thang chuẩn)

OD

Optical density

PCR

Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng
hợp)

rASN

L-asparaginase tái tổ hợp

RNA

Ribonucleic acid

RNase

Ribonuclease

Rpm

Reolutions per minute (vòng quay/ phút)

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE

Sodium dodecyl
electrophoresis

Taq

Thermus aquaticus

TBE

Tris boric acid EDTA

TEMED

N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine

v/v

Volume/ volume

YNB

Yeast nitrogen base

WHO

World Health Organization

Vũ Văn Vạn

sulfate

polyacrylamide

gel

ii


Khóa Luận Tốt Nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2. 1. Thành phần các loại đệm và dung dịch ................................................. 20
Bảng 2. 2. Danh sách các môi trường sử dụng trong thí nghiệm ............................ 21

Bảng 2. 3. Các thiết bị thí nghiệm .......................................................................... 22
Bảng 2. 4. Thành phần phản ứng cắt plasmid với enzyme SacI .............................. 23
Bảng 2. 5. Trình tự các mồi sử dụng ...................................................................... 25
Bảng 2. 6. Thành phần PCR .................................................................................. 25
Bảng 2. 7. Thành phần gel cô và gel tách ............................................................... 28
Bảng 3. 1. Sàng lọc hoạt tính các dòng biến nạp .................................................... 33

Vũ Văn Vạn

iii


Khóa Luận Tốt Nghiệp

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Phản ứng xúc tác thủy phân L-asparagine của L-asparaginase.................. 7
Hình 1. 2. Cấu trúc phân tử L-asparaginase ........................................................... 10
Hình 1. 3. Cơ chế phản ứng chung được xúc tác bởi L-asparaginase...................... 11
Hình 1. 4. Sơ đồ vector pPICZαA .......................................................................... 18
Hình 1. 5. Sơ đồ tích hợp gene ngoại lai vào vị trí 5’AOX1 hoặc.......................... 19
Hình 2. 1. Đường chuẩn BSA (bovine serum albumin) .......................................... 29
Hình 2. 2. Đường chuẩn NH3 ................................................................................. 30
Hình 3. 1. Điện di đồ sản phẩm cắt pPAsn/SacI ..................................................... 31
Hình 3. 2. Điện di đồ sản phẩm tách DNA nấm men ............................................. 32
Hình 3. 3. Điện di đồ sản phẩm PCR từ khuôn DNA nấm men với mồi gene asn (A)
và mồi AOX1 (B) .................................................................................................. 32
Hình 3. 4. Điện di đồ SDS-PAGE protein ngoại bào của 6 dòng nấm men biểu hiện
L-asparaginase tái tổ hợp ....................................................................................... 34
Hình 3. 5. Ảnh hưởng môi trường tới sự biểu hiện L-asparaginase tái tổ hợp......... 35
Hình 3. 6. Đánh giá mức độ biểu hiện rASN bằng Dolphin 1D .............................. 35

Hình 3. 7. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới hoạt tính L-asparaginase tái tổ hợp
.............................................................................................................................. 36
Hình 3. 8. Điện di đồ sản phẩm tinh sạch L-asparaginase tái tổ hợp....................... 37
Hình 3. 9. Đánh giá độ sạch của rASN bằng Dolphn 1D ........................................ 37
Hình 3. 10. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính rASN ........................................ 39
Hình 3. 11. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính rASN ................................................ 40

Vũ Văn Vạn

iv


Khóa Luận Tốt Nghiệp

MỤC LỤC
MỤC LỤC .............................................................................................................. 1
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 5
1.1 BỆNH UNG THƯ MÁU ............................................................................... 5
1.2 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ L-ASPARAGINASE .......................................... 7
1.2.1 Định nghĩa.............................................................................................. 7
1.2.2 Nguồn gốc .............................................................................................. 8
1.2.3 Phân loại ................................................................................................ 9
1.2.4 Cấu trúc phân tử L-asparaginase ........................................................... 10
1.3 TÁC DỤNG CỦA L-ASPARAGINASE VỚI TẾ BÀO UNG THƯ ............ 10
1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU L-ASPARAGINASE TÁI TỔ HỢP ............... 12
1.5 HỆ BIỂU HIỆN PICHIA PASTORIS X33.................................................... 15
1.5.1.Vector biểu hiên pPICZαA ................................................................... 17
1.5.2 Chuyển gene ngoại lai vào genome nấm men ....................................... 18
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................... 20

2.1. VẬT LIỆU ................................................................................................. 20
2.1.1.Các chủng vi sinh vật và plasmid.......................................................... 20
2.1.2. Hóa chất .............................................................................................. 20
2.1.3.Các dung dịch và đệm .......................................................................... 20
2.1.4. Môi trường .......................................................................................... 21
2.1.4. Thiết bị ................................................................................................ 22
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 23
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy ......................................................................... 23
2.2.2. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào nấm men bằng phương pháp xung
điện ............................................................................................................... 23
2.2.3. Tách chiết DNA tổng số nấm men ....................................................... 24
2.2.4. Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) ...................................................... 25
2.2.5. Điện di gel agarose .............................................................................. 26
Vũ Văn Vạn

1


Khóa Luận Tốt Nghiệp

2.2.6. Khảo sát điều kiện nuôi biểu hiện L-asparaginase................................ 26
2.2.7. Tinh sạch L-asparaginase tái tổ hợp ..................................................... 26
2.2.8. Điện di biến tính protein (SDS-PAGE) ................................................ 27
2.2.9. Xác định hàm lượng protein và hoạt tính enzyme ................................ 28
2.2.10. Ảnh hưởng của một số yếu tố lý hóa lên hoạt độ của rASN ............... 30
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 31
3.1. BIỂU HIỆN L-ASPARAGINASE TÁI TỔ HỢP TRONG P. PASTORIS
X33 ................................................................................................................... 31
3.1.1. Cắt mở vòng vector tái tổ hợp pPAsn bằng SacI .................................. 31
3.1.2. Xây dựng hệ thống biểu hiện P. pastoris X33/ pPAsn ......................... 31

3.1.3. Sàng lọc các dòng P. pastoris X33/ pPAsn tái tổ hợp .......................... 33
3.2. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN L-ASPARAGINASE TÁI TỔ HỢP
Ở NẤM MEN P. PASTORIS X33 ..................................................................... 34
3.2.1. Khảo sát thành phần môi trường biểu hiện ........................................... 34
3.2.1. Khảo sát thời gian biểu hiện ................................................................ 36
3.3. TINH SẠCH L-ASPARAGINASE TÁI TỔ HỢP ...................................... 36
3.4. ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA L-ASPARAGINASE TÁI TỔ
HỢP .................................................................................................................. 38
3.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của rASN .................................. 38
3.4.2. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của rASN .......................................... 39
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................... 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 42

Vũ Văn Vạn

2


Khóa Luận Tốt Nghiệp

MỞ ĐẦU
Ung thư máu là một dạng ung thư ác tính duy nhất không tạo ra u, có tỷ lệ tử
vong cao. Mỗi năm trên thế giới có khoảng 300 nghìn ca mắc bệnh ung thư máu
(chiếm 2,8% trong số tất cả các bệnh ung thư) và 220 nghìn người chết vì bệnh ung
thư máu. Bệnh ung thư máu ở độ tuổi dưới 15 chiếm 21,7% và trên 15 tuổi chiếm
78,2%. Các tế bào bạch cầu bị bệnh thường xâm nhập vào máu khá nhanh chóng
sau đó chúng có thể lây lan đến các bộ phận khác của cơ thể bao gồm các hạch bạch
huyết, gan, lách, hệ thống thần kinh trung ương (não và tủy sống) và tinh hoàn.
Mục đích điều trị bệnh ung thư máu dòng lympho cấp tính là để tiêu diệt các
tế bào bạch cầu ác tính và để có khả năng phục hồi tuỷ xương trở lại bình thường. Y

học hiện nay có nhiều phương pháp điều trị khác nhau đối với bệnh ung thư máu
như: hóa trị liệu, điều trị đích, điều trị sinh học, xạ trị, ghép tế bào gốc. Các loại
thuốc chống ung thư hoạt động dựa trên sự khác nhau giữa tế bào thường và tế bào
ung thư. Tuy nhiên có rất ít sự khác biệt hóa sinh học giữa tế bào thường và tế bào
ung thư.
L-asparaginase đã được chứng minh có hiệu quả trong điều trị ung thư ở
người, hiệu quả nhất trong điều trị ung thư bạch cầu cấp tính. L-asparaginase khai
thác nhu cầu asparagine cao bất thường của tế bào ung thư đặc biệt là ung thư máu.
Nguồn asparagine từ chế độ ăn và từ bản thân cơ thể người cung cấp asparagine
chính cho tế bào ung thư, trong khi đó tế bào bình thường không phụ thuộc vào
nguồn asparagine từ bên ngoài, tế bào thường có thể tự tổng hợp đủ cho quá trình
trao đổi chất nhờ enzyme tổng hợp asparagine. Sự có mặt của enzyme
L-asparaginase làm thủy phân L-asparagine, lấy đi yếu tố sinh trưởng quan trọng
của tế bào ung thư làm cho tế bào ung thư không sống sót được. Vì vậy, việc tìm
kiếm L-asparaginase từ các sinh vật mới giúp các bệnh nhân nhận được phác đồ
điều trị hiệu quả nhất. L-asparaginase tái tổ hợp đang ngày được quan tâm bởi biết
rõ được đặc tính sinh học ít gây tác dụng phụ, ái lực cao với cơ chất và độc tính
thấp.

Vũ Văn Vạn

3


Khóa Luận Tốt Nghiệp

Do đó chúng tôi tiến hành đề tài “Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá tính
chất lý hóa của L-asparaginase tái tổ hợp trong Pichia pastoris X33” với mục
tiêu:
1. Biểu hiện và tinh sạch L-asparaginase tái tổ hợp.

2. Đánh giá tính chất lý hóa của L-asparaginae tái tổ hợp.

Vũ Văn Vạn

4


Khóa Luận Tốt Nghiệp

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 BỆNH UNG THƯ MÁU
Ung thư máu (còn gọi là ung thư bạch cầu, bệnh bạch cầu) là một dạng ung
thư ác tính. Căn bệnh này là hiện tượng trong đó khi tủy và hệ bạch huyết bị rối
loạn và tạo ra những bạch cầu ác tính, khi bạch cầu trong cơ thể người bệnh tăng
đột biến tạo ra các bạch cầu bất thường không hoạt động được. Các bạch cầu ung
thư này dần dần xâm lấn tới các hồng cầu và tiểu cầu, đồng thời chiếm chỗ và làm
giảm sự phát triển của những tế bào máu bình thường khác, vì vậy người bệnh sẽ có
dấu hiệu bị thiếu máu dẫn đến chết. Và đây cũng là căn bệnh ung thư duy nhất
không tạo ra u, bệnh xuất hiện ở bất cứ tuổi nào, nam giới bị ung thư máu nhiều hơn
nữ giới. Độ tuổi thường gặp đối với bệnh ung thư máu dưới 15 tuổi là 21,7% và trên
15 tuổi là 78,2%.
Những triệu chứng chính của bệnh ung thư máu- bệnh bạch cầu: Người bệnh
thường xuyên bị sốt, nhức đầu, dễ cảm lạnh, đau khớp. Những triệu chứng này
thường lặp lại trong thời gian dài. Người bệnh có sức đề kháng yếu do lượng bạch
cầu sinh ra lớn nhưng lại không chống lại được vi khuẩn có hại.
Người bệnh thường xuyên cảm thấy mệt mỏi, yếu sức và da chuyển sang
màu trắng nhạt. Những triệu chứng này xuất hiện là do lượng hồng cầu trong máu bị
thiếu hụt dễ bị nhiễm trùng do lượng bạch cầu không bình thường sản sinh nhiều.
Bệnh nhân hay bị chảy máu răng, dễ bầm do khả năng đông máu bị giảm xuống.
Nếu là bệnh nhân nữ sẽ có biểu hiện ra mồ hôi về đêm.

Nguyên nhân đích thực của bệnh chưa được xác định nhưng có thể là do các
tác động của môi trường như ô nhiễm hóa học (benzen, formaldehyde, khói thuốc
lá, xăng dầu...) hay nhiễm chất phóng xạ (bom nguyên tử, xạ trị kéo dài, Xquang...) hoặc cũng có thể là do di truyền. Người dân ở các vùng nhiễm phóng xạ
thường có tỉ lệ bị bệnh này rất cao (như hai thành phố Hiroshima và Nagasaki sau
thời chiến tranh thế giới thứ hai ở Nhật Bản hay vụ tai nạn nổ lò nguyên tử ở
Vũ Văn Vạn

5


Khóa Luận Tốt Nghiệp

Chernobyk-Ukraine). Nhưng gần đây có một số nghiên cứu kết luận rằng, bệnh ung
thư máu hay bạch cầu cấp đều không qua yếu tố di truyền [1, 2].
Ung thư có thể mãn tính hay cấp tính. Dựa trên dòng bạch cầu bị ảnh hưởng
trong cơ thể như các tế bào dòng tủy hoặc dòng lympho và tiến triển của mỗi dòng
đó, mà bệnh ung thư máu được chia thành bốn loại chính là: Ung thư máu dòng
lympho cấp tính (ALL), ung thư máu dòng tủy cấp tính (AML), ung thư máu dòng
lympho mãn tính (CLL), ung thư máu dòng tủy mãn tính (CML). Mỗi loại bệnh ung
thư máu có đặc trưng và cách điều trị riêng.
Trong đó, bệnh ung thư máu dòng lympho cấp tính là một loại bệnh ác tính
có ảnh hưởng đến các tế bào bạch cầu chưa trưởng thành từ tủy xương. Các tế bào
chưa trưởng thành nhân lên một cách không kiểm soát và chiếm đầy tủy xương.
Điều này cản trở việc sản xuất các tế báo máu bình thường, ở trẻ em, bệnh ung thư
máu dòng lympho cấp tính hay gặp hơn dòng tủy, và hay gặp nhất ở trẻ em từ 3-5
tuổi. Trẻ em bị mắc bệnh này thường xuyên bị thiếu máu, nhiễm trùng tái đi tái lại,
dễ bị các vết bầm tím và chảy máu do tủy xương không sản xuất đủ các tế bào hồng
cầu, bạch cầu và tiểu cầu. Nếu không điều trị kịp thời bệnh nhân có thể tử vong
trong vài tháng.
Y học hiện nay có nhiều phương pháp điều trị khác nhau đối với bệnh ung

thư máu như: hóa trị liệu, điều trị đích, điều trị sinh học, xạ trị, ghép tế bào gốc. Có
thể phối hợp nhiều biện pháp điều trị. Sự lựa chọn biện pháp điều trị tùy thuộc chủ
yếu vào: thể bệnh, tuổi của người bệnh, sự xuất hiện tế bào bạch cầu trong tủy.
Trong đó hóa trị liệu là phương pháp có triển vọng tốt đối với bệnh nhân, đây là
phương pháp dùng thuốc (các hóa chất chống ung thư) để chữa bệnh, thường được
áp dụng để chữa các ung thư của hệ thống tạo huyết (bệnh bạch cầu, u lympho ác
tính...) hoặc ung thư đã lan tràn toàn thân mà phẫu thuật và tia xạ không có khả
năng điều trị được.
Mục đích điều trị bệnh ung thư máu dòng lympho cấp tính là để tiêu diệt các
tế bào bạch cầu ác tính và có khả năng để phục hồi tuỷ xương trở lại bình thường.
Bởi vậy, hóa trị liệu là phương thức điều trị chính đối với bệnh này. Thông thường,
sự kết hợp giữa các thuốc hoá chất (và các thuốc steroid) được sử dụng theo một
Vũ Văn Vạn

6


Khóa Luận Tốt Nghiệp

phác đồ. L-asparaginase đã được chứng minh có khả năng ngăn chặn sự tăng trưởng
của các tế bào bạch cầu bằng cách thủy phân L-asparagine thành L-aspartate và
ammonia, gây ra sự suy giảm nhanh chóng của L-asparagine trong huyết tương, do
vậy các tế bào này không tổng hợp đủ lượng protein cần thiết và sẽ tự chết. Sử dụng
enzyme có ưu điểm là tỷ lệ thuyên giảm cao và đáp ứng khá nhanh. Tuy nhiên
nhược điểm là chi phí rất lớn liên quan đến việc điều trị kết hợp với nhu cầu cao.
Do đó, có nhiều nghiên cứu đến việc sản xuất enzyme này từ vi sinh vật.
1.2 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ L-ASPARAGINASE
1.2.1 Định nghĩa
L-asparaginase (L-asparagine-aminohydrolase EC 3.5.1.1) là một enzyme
xúc tác phản ứng thủy phân L-asparagine thành axit L-aspartate và ammonia theo

phương trình (Hình 1.1)

Hình 1.1. Phản ứng xúc tác thủy phân L-asparagine của L-asparaginase

L-asparaginase là enzyme đầu tiên được nghiên cứu sâu về hoạt tính kháng
bạch cầu trong cơ thể người. Nó là enzyme được lựa chọn như thuốc sử dụng trong
liệu pháp kết hợp để điều trị bạch cầu cấp tính dòng lympho ở trẻ em [3].
Khối lượng phân tử của L-asparaginase từ vi khuẩn E. coli là 133 - 144 kDa
và tính chất của L-asparaginase từ E. coli đã được nghiên cứu khá kỹ: được cấu tạo
từ 4 hợp phần [4], hằng số Michaclis-Menten Km = 1,25 X 10-5 điểm đẳng điện ở
pH 4,9 [5], L-asparaginase tinh sạch luôn có khoảng 2-4% hoạt tính glutaminase và
5% hoạt tính D-asparaginase [6]. 5-diazon-4-oxo-L-norvalin (DONV) là cơ chất của
enzyme đồng thời cũng là chất ức chế enzyme hoạt động, L-asparaginase có nguồn

Vũ Văn Vạn

7


Khóa Luận Tốt Nghiệp

gốc từ sinh vật khác có khối lượng phân tử dao động trong khoảng 140 - 150 kDa
[6, 7].
1.2.2 Nguồn gốc
L-asparaginase hiện diện nhiều trong mô động vật: vi khuẩn, thực vật, và
trong huyết thanh của một số động vật gặm nhấm, nhưng không có trong người.
L-asparaginase đã được tách chiết và tinh sạch từ nhiều nguồn khác nhau: từ Proteus
vulgaris. Erw. carotovora [8], Acinetobacter [9]. Serratia marcescens [10].
Mycobacterium bovis [11], Streptomyces griseus [12], Achrombacteraceae [13], gan
chuột Guinea Pig [14] và từ Pisum sativum [15].

Trong nấm men: Sản xuất L-asparaginase từ Rhodotorula sp. (nấm men bất
toàn đỏ), đã được nghiên cứu bởi Foda và cộng sự (1980) [16]. Một homodimer
L-asparaginase từ Rhodosporidium toruloides cũng được nghiên cứu bởi
Ramakrishnan và cộng sự (1996) [17].
Trong xạ khuẩn: Gunasekaran và cộng sự (1995) đã sản xuất L-asparaginase
bởi Nocardia sp. [18]. Sản xuất L-asparaginase nội bào và ngoại bào từ Streptomyces
longsporusflavus (F-15) đã được mô tả bởi Fattah và cộng sự (1998)[19].
Streptomyces sp. phân lập từ ruột cá Therampon jarbua và Villorita cyprinoids có hoạt
tính L-asparaginase.
Trong thực vật: L-asparaginase đã được sản xuất từ cây thuộc họ đậu Lupin
araboreus và Lupin artgustiplius. Hoạt tính của L-asparaginase cũng đã được tìm thấy
ở trong đất, rễ của cây thông Pinus pinaster và Pinus radiata bởi Bell và Adams
(2004) [20].
Trong vi khuẩn: L-asparaginase từ vi khuẩn là vấn đề được quan tâm lớn
trong y tế. Sản xuất L-asparaginase trong Pseudomonas flourescens AG đã được báo
cáo bởi Mardashev và cộng sự (1975) [21]. Mycobacterium phlei cũng đã được tìm
thấy là một nguồn L-asparaginase tốt bởi Pastuszak năm 1976. L-asparaginase từ
Thermus thermophilus không thủy phân L-glutamine đã được công bố bởi Pritsa và
Kyriakidis (2001) [22]. L-asparaginase từ Erwinia sp. mới, đã được công bố bởi
Borkotaky và Bezbaruah và cộng sự [3].
Vũ Văn Vạn

8


Khóa Luận Tốt Nghiệp

Tuy nhiên không phải mọi enzyme L-asparaginase thu nhận từ các nguồn
nêu trên đều có hoạt tính kháng ung bướu. Hoạt tính của nó còn phụ thuộc vào ái
lực đối với cơ chất và vào những yếu tố khác ảnh hưởng đến khả năng hoạt động

của enzyme [23]. Trong đó L-asparaginase từ hai vi khuẩn E. coli và Erw.
chrysanthemy hiện đang sử dụng kết hợp để điều trị bệnh bạch cầu cấp dòng
lympho [1].
1.2.3 Phân loại
Hai isozyme của L-asparaginase trong đó xúc tác thủy phân L-asparagine
thành L-aspartate và ammonia, được sản xuất bởi E. coli là: L-asparaginase I (EcAI)
và L-asparaginase II (EcAII). Mặc dù hai enzyme này xúc tác cho một phản ứng
giống nhau, nhưng chúng có thể được phân biệt bởi tính tan trong dung dịch amoni
sulfate độ nhạy cảm với nhiệt độ kích hoạt. EcAI có ở trong tế bào chất và xúc tác
quá trình thủy phân cả L-asparagine và L-glutamine. Trong khi EcAII tồn tại trong
điều kiện yếm khí trong khoang chu chất của màng tế bào vi khuẩn và có tính đặc
hiệu cao cho sự thủy phân của L-asparaginase [24].
EcAII khác với EcAI do có dải pH tối ưu rộng hơn và EcAII có ái lực với
L-asparagine (Km = 11,5 µM) cao hơn nhiều EcAI (Km= 5 mM) do đó EcAl
thường dễ bị loại trong quá trình tinh sạch. Bên cạnh đó, các bệnh nhân cũng được
nhận một liều lượng L-asparaginase như nhau thì hiệu quả điều trị của EcAII cao
hơn của Erw. carotovora [25].
Sản xuất EcAII đuợc tăng lên đáng kể (>100 lần) trong điều kiện yếm khí với
amino acid là nguồn carbon chính của vi khuẩn. Trong trường hợp này,
L-asparaginase có khả năng tham gia vào con đường oxaloacetate. EcAII có hoạt
tính sinh học khi ở trạng thái tetramer tạo thành một khối không gian đặc thù gồm 4
tiểu phần giống hệt nhau, mỗi tiểu phần có kích thước 35 kDa (Hình 1.2A).

Vũ Văn Vạn

9


Khóa Luận Tốt Nghiệp

1.2.4 Cấu trúc phân tử L-asparaginase

A

B
Hình 1. 2. Cấu trúc phân tử L-asparaginase

Trung tâm hoạt động nằm giữa vùng đầu N của một tiểu đơn vị với vùng đầu
C của tiểu đơn vị liền kề (Hình 1.2 B). Một cặp Thr còn lại (EcAIl Thr12 và Thr89)
nằm ở hai bên của mối liên kết có thể tách ra. Sự hình thành một phức hợp Thr12acyl đã dẫn đến Thr12 chứ không phải Thr89 chính là nucleophin trong phản ứng
L-asparaginase. Thr12 cùng với Tyr25 là một phần của vòng di động đạt được sự ổn
định trên bề mặt liên kết. Các phần khác của trung tâm hoạt động là cố định bao
gồm Thr89, Asp90 và Lys162. Glu283 từ tiểu đơn vị liền kề đóng vai trò quan trọng
trong hỗ trợ liên kết với cơ chất [26].
Chỗ nối chuyển từ phải sang trái (quay trái) của xoắn β4 và β5 trong vùng
đầu N được quan sát thấy trong tất cả các L-asparaginase. Như vậy chỗ nối khó
quan sát được này được cho là quan trọng trong việc xúc tác của enzyme. Hơn nữa,
lượng axit amin còn lại từ chỗ nối được bảo tồn trong tiến hóa vì chúng cung cấp
một phần quan trọng cho sự tiếp xúc giữa các dimer trong tetramer. Sự hình thành
liên kết hydro giữa các nguyên tử O của Ala20 EcAII từ vòng di động tại trung tâm
hoạt động và các chuỗi nguyên tử N chính của Leu127 từ chỗ nối là đặc trưng của
tất cả các L-asparaginase [26].
1.3 TÁC DỤNG CỦA L-ASPARAGINASE VỚI TẾ BÀO UNG THƯ

Vũ Văn Vạn

10


Khóa Luận Tốt Nghiệp

Phản ứng xúc tác bởi L-asparaginase là một quá trình thủy phân đơn giản Lasparagine tương tự như cơ chế xúc tác thủy phân của serine proteinase - những
proteinase chứa nhóm -OH của gốc serine trong trung lâm hoạt động và có vai trò
đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme, các enzyme này thường
hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
thông qua hai bước chính (Hình 1.3).
Bước 1: Ban đầu, nhóm -OH của enzyme hoạt động như một tác nhân
nucleophin tấn công nguyên tử carbon trong nhóm carbonyl của cơ chất
L-asparagine. Sau khi tấn công nguyên tử carbon trên bề mặt cơ chất dẫn đến hình
thành một acyl-enzyme trung gian thông qua một trạng thái chuyển tiếp. Sự ổn định
điện tích âm tạo ra trên nguyên tử O trong trạng thái chuyến tiếp thông qua liên kết
hydro giữa nguyên tử O còn trống mang điện tích âm và nhóm N-H liền kề.
Bước 2: Cơ chế tương tự bước 1 nhưng sự tấn công nguyên tử carbon của
asparagine được thực hiện bởi tác nhân nucleophin là phân tử H2O.

Hình 1. 3. Cơ chế phản ứng chung được xúc tác bởi L-asparaginase

Để tạo ra được một loại thuốc hiệu quả trong điều trị bệnh ung thư, phải xác
định được một số khác biệt cơ bản giữa tế bào bình thường và tế bào ung thư. Các
hóa chất trị liệu phải khai thác sự khác biệt này sao cho chỉ có các tế bào ung thư bị
tổn thương còn các tế bào bình thường không bị ảnh hưởng. L-asparaginase đã dựa
trên nhu cầu cao bất thường amino acid asparagine của các tế bào ung thư để tiêu
diệt chúng.
Asparagine là một amino acid cần thiết của các tế bào để sản xuất protein.
Asparagine hoặc có thể được sản xuất trong tế bào thông qua một enzyme là
asparagine synthetase hoặc nó có thể hấp thụ vào các tế bào từ bên ngoài (chẳng
Vũ Văn Vạn

11

Khóa Luận Tốt Nghiệp

hạn, nó được tiêu thụ trong chế độ ăn uống của bệnh nhân, hấp thụ vào cơ thể và
được cung cấp cho các tế bào của cơ thể). Tế bào ung thư, cụ thể hơn là các tế bào
ung thư bạch huyết phải phụ thuộc vào nguồn asparagine từ bên ngoài để tồn tại bởi
chúng không thể tự tổng hợp đủ asparagine cần cho sự tăng cường của các tế bào ác
tính. Điều này có nghĩa là chúng sử dụng cả nguồn asparagine từ chế độ ăn uống
cũng như asparagine bản thân chúng tổng hợp được để đáp ứng nhu cầu lớn
asparagine này [27].
Enzyme L-asparaginase thủy phân nguồn asparagine ở bên ngoài tế bào buộc
các tế bào dựa hoàn toàn vào những gì chúng có thể tự tổng hợp được. Tế bào bình
thường gần như không cần nhiều asparagine để tồn tại và có thể tự tổng hợp được
asparagine và do đó bị ảnh hưởng ít hơn khi thiếu asparagine khi điều trị
asparaginase.
1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU L-ASPARAGINASE TÁI TỔ HỢP
Trên thế giới
L-asparaginase tái tổ hợp đã được sản xuất bằng cách sử dụng kỹ thuật di
truyền. Năm 1990, Bonlhron đã tách dòng gene asn B mã hóa L-asparaginase II của
E. coli, bằng cách sử dụng PCR và giải trình tự gene [28].
Đến năm 1992, cDNA mã hóa cho L-asparaginase từ hạt của cây họ đậu
Lupin arborens đã được mô tả đặc tính [29]. Cũng năm đó, gene này đã được Dickson
và cộng sự tách dòng thành công [30]. Jennings và cộng sự năm 1993 đã biểu hiện
L-asparaginase II được mã hóa bởi gene ansB trong Salmonella enterica, quá trình biểu
hiện được điều hòa tích cực bởi một protein thụ thể cAMP (CRP) và sinh vật kỵ
khí [31].
Năm 2001, Wang và cộng sự đã nhân dòng gene mã hóa ASN, chèn gene
vào vector biểu hiện PBV 220 tạo plasmid tái tổ hợp pASN biểu hiện trong E. coli.
Hoạt tính của enzyme tái tổ hợp cao hơn enzyme tự nhiên [32].
Guo và cộng sự (2002) nghiên cứu tiềm năng chống ung thư của

L-asparaginase tái tổ hợp và so sánh tác dụng chống ung thư của L-asparaginase tái
Vũ Văn Vạn

12


Khóa Luận Tốt Nghiệp

tổ hợp với enzyme tự nhiên trong in vitro và in vivo [33]. Cùng năm 2002, gene
L-asparaginase từ E. coli được nhân dòng và biểu hiện trong S. cerevisiae . Hầu hết
enzyme được biểu hiện ngoại bào [34].
L-asparaginase từ Erw. carotovora biểu hiện trong E. coli và được tinh sạch
như mô tả của Borisova và cộng sự (2003) [35]. Năm 2005 Kotzia và cộng sự nhân
dòng L-asparaginase từ Erw. carotovora NCYC1526 biểu hiện trong E. coli.
Enzyme được tinh sạch bằng sắc ký trao đổi anion và sắc ký ái lực trên asparagine
cố định [36].
Đến năm 2006, Ferrara và cộng sự đã nhân dòng gene asp3 mã hóa cho
L-asparaginase II từ S. cerevisiae được và biểu hiện trong nấm men P. pastoris, dưới
sự kiểm soát của promoter AOX1. Lượng enzyme trong mỗi khối tế bào khô đạt
800 U/g [37].
Năm 2007, Kotzia và Labrou cũng đã nhân dòng và biểu hiện L-asparaginase
Erw. chrysanthemy 3937 (Erl-ASNase) trong E. coli BL21 (DE3) pLysS. Các enzyme
có thể được giữ cố định một cách hiệu quả trên sepharose CL-6B. Enzyme cố định
giữ lại hầu hết hoạt tính của nó (60%) và có tính ổn định cao ở 4oC [38].
Năm 2008, Magdy và cộng sự đã nhân dòng được gene L-asparaginase II từ
E. coli W3110 bằng vector DNA Pgex-2T. Enzyme này được biểu hiện mạnh trong
E. coli BL21 (DE3) và được tinh sạch qua cột DEAE-Sepharose, enzyme tinh sạch
có trọng lượng 40 kDa khi điện di kiểm tra trên gel SDS-PAGE [39].
Năm 2009, L-asparaginase từ Helicobacter pylori (HPA) đã được nhân dòng
và biểu hiện trong các tế bào E. coli, hiệu suất biểu hiện đạt 6% protein tổng số,

hoạt tính riêng của asparaginase đạt 92 U/mg trong khi tỷ lệ thủy phân glutamine
tương ứng chỉ là 8,3 x 10-3 U/mg bởi vậy có triển vọng sản xuất enzyme không độc
hại để điều trị bệnh bạch cầu [40].
Năm 2010, Ferrara và cộng sự đã nghiên cứu tách chiết được L-asparaginase
biểu hiện trong khoang chu chất của chủng P. pasioris tái tổ hợp chứa gen asp3 từ
nấm men S. cerevisiae [41].

Vũ Văn Vạn

13


Khóa Luận Tốt Nghiệp

Năm 2011, Thenmozhi và cộng sự đã tối ưu hóa sản xuất L-asparaginase
trong Bacillus cereus MAB5. Hàm lượng L-asparaginase sản xuất (51,54 IU/ml) từ
môi trường tối ưu có chứa đậu nành (6,2828 g/l), asparagine (5,5 g/l), dăm gỗ
(1,3838 g/l) và NaCl (4,535 g/l). Đồng thời, gene asn B mã hóa L-asparaginase từ
Y. pseudotuberculosis IP 32953 được nhân dòng bằng vector pBad24 và biểu hiện
trong E. coli BL21 (DE3) được báo cáo bởi Sidoruk và cộng sự [42].
Đến năm 2012, một loại vi khuẩn chịu nhiệt thuộc họ Entcrobacteriacae, có
thể sinh trưởng ở 44,5°C được phân lập từ phân bò. Gene mã hóa L-asparaginase II
được khuếch đại bằng PCR và biểu hiện trong vector pET 20b với đuôi 6X histidine
tag ở đầu C. Protein được tinh sạch bằng sắc ký ái lực gắn niken. Protein tinh sạch
cho thấy hoạt tính tối ưu ở 37oC và pH 6-7. Enzyme ổn định ở 50oC và duy trì 33%
và 28% hoạt tính sau 45 và 60 phút. Các thông số động học của enzyme: Km và
Vmax tương ứng là 0,89 mM và 0,18 U/mg [43].
Năm 2013, Jia đã nhân dòng, biểu hiện và mô tả đặc tính của các gene mã
hóa L-asparaginase (asnZ) từ chủng vi khuẩn B. subtilis B11-06. Enzyme tái tổ hợp
cho thấy độ bền nhiệt cao và ái lực thấp với L-glutamine. Gene asnZ mã hóa

L-asparaginase II được khuếch đại bằng phương pháp PCR và biểu hiện trong
chủng B. subtilis 168 sử dụng vector pMA5. Hoạt tính của enzyme tái tổ hợp đạt
9,98 U/ml, cao hơn đáng kể so với B. subtiiis 11-06. pH và nhiệt độ tối ưu của
enzyme tương ứng là 7,5 và 40°C. Enzyme khá ổn định ở khoảng pH 6,0 – 9,0 và
duy trì 9% hoạt tính sau 2 giờ ủ ở 50°C hoặc 60°C. Các thông số động học cho
L-asparagine là Km = 0,43 mM, Vmax = 77,51 mM/ phút [44].
Năm 2014, Chen đã chỉ ra rằng L-asparaginase là một trong những phương
pháp hóa lý trị liệu quan trọng nhất chống lại bệnh bạch cầu lymphoblastic cấp tính
ở trẻ em, một dạng phổ biến nhất của ung thư ở trẻ em [45, 46].
Năm 2015, Yao và cộng sự đã nghiên cứu lâm sàng điều trị của ngoại vi tế
bào T bằng L-asparaginase và kết hợp với hóa trị để kiểm tra tính hiệu quả và tác
dụng phụ của L-asparaginase [47], Yong và cộng sự đã nghiên cứu lâm sàng về
L-asparaginase trong điều trị extranodal NK lymphoma/T-cell ,nghiên cứu tập trung
vào dược tính của L-asparaginase, hiệu quả của một loạt các phác đồ
Vũ Văn Vạn

14


Khóa Luận Tốt Nghiệp

L-asparaginase chứa trong điều trị ENKTL và hướng nghiên cứu lâm sàng trong
tương lai của các phác đồ L-asparaginase chứa trong ENKTL [48].
Tại Việt Nam
Ngô Kế Sương và cộng sự đã tách chiết và cố định L-asparaginase từ E. coli
trong đề tài cấp nhà nước 2001-2003. Từ 6 chủng E. coli, 2 chủng SH-1 và SH-2
được xác nhận là có khả năng đồng hóa mạnh L-asparagine, sử dụng amino acid
này làm nguồn duy nhất cung cấp carbon và nitơ cho sinh trưởng, phát triển và sinh
tổng hợp L-asparaginase. Bằng phương pháp cấy chuyền và nuôi trong các môi
trường tăng dần nồng độ L-asparagine đã chọn được 2 dòng mới từ chủng gốc SH-2

(SH-2a và SH-2b) có hoạt tính L-asparaginase lần lượt 0,08 và 0,1 IU/mg tế bào
[49]. Tuy nhiên nghiên cứu này chỉ tuyển chọn các chủng E. coli tự nhiên sinh tổng
hợp L-asparaginase.
Trong Quyết định số 1641/QD-BCT ngày 4/4/2012 của Bộ trưởng Bộ Công
thương có đề tài “ Nghiên cứu quy trình sản xuất asparaginase tái tổ hợp, ứng dụng giảm
lượng acrylamide tạo thành trong sản xuất bánh nướng". Trong đề tài này cũng đề ra mục tiêu
sản xuất L- asparaginase tái tổ hợp, nhưng lại nhằm mục đích khử độc acrylamide
có trong thực phẩm chế biến.
Giai đoạn (2013-2014),đề tài cấp Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam: "Nghiên
cứu qui trình sản xuất L-asparaginase tái tổ hợp thử nghiệm diệt các dòng tế bào ung thư và định
hướng dùng hỗ trợ điều trị bệnh ung thư máu" do PGS. TS. Quyền Đình Thi chủ nhiệm. đã
biểu hiện thành công gene mã hóa L-asparagianse II từ Erw. chrysanthermy trong
E. coli và trong P. pastoris. Bước đầu đã đánh giá được một số tính chất lý hóa
cũng như khả năng ức chế một số dòng tế bào ung thư của L-asparaginase tái tổ hợp
biểu hiện trong E. coli [50-53].
Năm 2014, Nguyễn Tiến Cường và cs đã biểu hiện, tinh sạch và đánh giá
tính chất của rASN trong P. pastoris, hoạt tính đạt 6,251 U/mg với độ sạch 3,471
lần [54].
1.5 HỆ BIỂU HIỆN PICHIA PASTORIS X33

Vũ Văn Vạn

15


Khóa Luận Tốt Nghiệp

Các hệ thống tế bào chủ cho biểu hiện protein được sử dụng rộng rãi thường
là các sinh vật nhân sơ. Hơn 3 thập niên trước, E. coli được sử dụng rộng rãi như tế
bào vật chủ cho biểu hiện protein. Chúng được sử dụng để sản xuất các protein tái

tổ hợp từ các cDNA nhân chuẩn đã được nhân dòng. E. coli là một sinh vật nhân sơ
điển hình hay được sử dụng, tuy nhiên sự biểu hiện thành công protein tái tổ hợp
trong E. coli phụ thuộc vào cấu trúc sơ cấp, thứ cấp, cấu trúc bậc ba cũng như chức
năng của protein mục tiêu. Tuy nhiên trong nhiều trường hợp, việc biểu hiện các
đoạn gene lớn trong tế bào E. coli còn có những hạn chế như protein tái tổ hợp bị tồn
tại ở dạng không tan, dạng thể vùi và không được tiết ra ngoài môi trường. Do đó,
kể cả có những quy trình tinh sạch cẩn thận, nhưng trong sản phẩm cuối cùng có thể
chứa các hợp chất gây độc từ vi khuẩn.
Để tránh những vấn đề này, các nhà nghiên cứu đã phát triển các hệ thống
biểu hiện nhân chuẩn trong nấm men, côn trùng và các tế bào động vật có vú. S.
cerevisiae là hệ thống eukaryote đầu tiên được sử dụng do những hiểu biết về di
truyền sinh lý và S. cerevisiae được cho là an toàn đối với người. Tuy nhiên, quá
trình biểu hiện protein ở S. cerevisiae không phải lúc nào cũng phù hợp cho sản xuất
protein ở quy mô lớn do có thể mất plasmid quá trình glycosyl hóa vượt mức và
năng suất thấp. Ngoài ra, các protein tái tổ hợp được tiết ra thường bị giữ tại vùng
chu chất, làm tăng thời gian và chi phí để tinh sạch.
Nấm men P. pastoris được phát triển để thay thế hệ thống biểu hiện S. cerevisiae,
P. pastoris được chọn vì có những ưu điểm vượt trội hơn so với S. cerevisiae.
Những thuận lợi của hệ thống P. pastoris có một promoter hiệu quả cao và được
điều hòa chặt chẽ bởi gene cảm ứng bằng methanol mã hóa alcohol oxidase,
enzyme đầu tiên của con đường sử dụng methanol. Khi có mặt methanol, khoảng
30% protein nội bào là alcohol oxidase. Khi không có methanol, gene AOX1 phản
ứng rất nhạy với sự bổ sung methanol vào môi trường. Hơn nữa có thể chọn lọc
được thời điểm cảm ứng gene nhân dòng để thu hồi được tối đa protein tái tổ hợp
trong quá trình lên men quy mô lớn. P. pastoris cũng không tổng hợp ethanol nên có
thể có mật độ tế bào cao cùng với việc tiết lượng lớn protein. Đồng thời các
protein của bản thân loại nấm men này được tiết ra môi trường ở mức độ
Vũ Văn Vạn

16

Khóa Luận Tốt Nghiệp

thấp, vì vậy sẽ đơn giản hóa được việc tinh sạch các protein tái tổ hợp đã tiết. Ngoài
ra P. pastoris có khả năng phát triển ở pH từ 3 đến 7 do đó có thể điều chỉnh pH để
cho quá trình phân giải protein tiết ra do hoạt động của protease là thấp nhất và có
thể phát triển với mật độ cao hơn nhiều lần so với S. cerevisiae. Đồng thời có thể
biểu hiện protein với hàm lượng từ milligram tới gram cả trong nghiên cứu phòng
thí nghiệm lẫn trong sản xuất quy mô công nghiệp.
1.5.1.Vector biểu hiên pPICZαA
Có nhiều loại vector được sử dụng trong biểu hiện protein ngoại lai nhưng
mỗi loại vector, tùy theo mục đích sử dụng, được thiết kế phù hợp với một số chủng
nhất định. Nói chung một vector phải mang các đặc điểm cơ bản sau: có tâm tái bản
giúp nhân lên lượng lớn vector, phải có ít nhất một điểm cắt enzyme giới hạn giúp
chèn đoạn DNA vào vector (vị trí đa điểm - multiple cloning site MCS) và cần phải
mang dấu chuẩn chọn lọc giúp sàng lọc các thể mang vector. Ngoài ra với vector
biểu hiện cần có promoter mạnh để điều khiển biểu hiện protein ngoại lai.
Vector pPICZαA có kích thước 3,6 kb thường được sử dụng để biểu hiện
protein tái tổ hợp trong P. pastoris. Protein tái lổ hợp được biểu hiện gắn với
peptide đầu N của trình tự tín hiệu tiết nhân tố α prepro peptide (MF - α1) bắt nguồn
từ S.cerevisiae. Vector cho phép biểu hiện mức cao, protein ngoại lai được cảm ứng
biểu hiện bởi methanol trong hệ P. pastoris X33, SMD1168H và KM71H. Vector
pPICZαA có chứa các điều kiện cần thiết như: đầu 5’AOX1 chứa promoter điều
khiển biểu hiện gene mong muốn và được cảm ứng bởi methanol, có tín hiệu tiết
MF - α1 prepro điều khiển biểu hiện tiết protein tái tổ hợp, có chứa gene kháng
zeocin giúp sàng lọc các thể mang vector ở E. coli và Pichia tạo thuận lợi cho việc
tách dòng vector trong E. coli và biểu hiện protein ngoại lai trong P. pastoris (Hình
1.4)

Vũ Văn Vạn

17


Khóa Luận Tốt Nghiệp

Hình 1. 4. Sơ đồ vector pPICZαA

1.5.2 Chuyển gene ngoại lai vào genome nấm men
Quá trình chèn vector biểu hiện vào genome nấm men dựa trên nguyên tắc
trao đổi đơn (single crossove) ở các trình tự tương đồng. Vector pPICZα không
chứa gene HIS4 nên việc chèn vector tái tổ hợp chỉ có thể xảy ra ở locus AOX1.
Các vector biểu hiện trong P. pastoris thường chứa một đoạn DNA của promoter có
chứa điểm cắt giới hạn đặc biệt, có tác dụng hướng vector đã mở vòng tích hợp vào
genome (Hình 1.5) [55].

Vũ Văn Vạn

18


Khóa Luận Tốt Nghiệp

Hình 1. 5. Sơ đồ tích hợp gene ngoại lai vào vị trí 5’AOX1 hoặc
aox1::ARG4 của genome nấm men P. pastoris

Đầu tiên, vector cần được mở vòng tại locus 5’ AOX1 bằng 1 trong 3 loại
enzyme SacI, PmeI hoặc BstXI. Tiếp đó, vector được mở vòng này sẽ được chèn
vào vùng 5’ AOX1 hoặc 5’ aox1 ở genome của nấm men. Do đó, chủng biểu hiện

được sử dụng sẽ quyết định chủng tái tổ hợp cho phép chuyển hóa methanol mạnh
(Mut+) hay yếu (MutS). Nếu sử dụng chủng biểu hiện P. pastoris Mut+ mà xảy ra
trao đổi chéo kép sẽ thay thế hẳn vùng AOX1 trong genome nấm men thì chủng tái
tổ hợp nhận được sẽ có kiểu hình MutS [55].

Vũ Văn Vạn

19