Lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp và tách kháng sinh spinosad thô từ xạ khuẩn saccharopolyspora spinosa y6

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
ơ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:

“Lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp và tách kháng sinh
Spinosad thô từ xạ khuẩn Saccharopolyspora spinosa Y6”
Giáo viên hướng dẫn : Th.S Nguyễn Thành Chung
TS. Tạ Thị Thu Thủy
Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Yên CNSH – 11-01

Hà Nội, 2015


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

LỜI CẢM ƠN
Trước hết, em xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành nhất đến toàn thể các thầy cô
giáo trong Khoa Công Nghệ Sinh Học, Viện Đại Học Mở Hà Nội đã trang bị cho em
kiến thức, thiết bị, và hóa chất nghiên cứu để em có thể hoàn thành khóa luận này.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo – ThS.Nguyễn Thành Chung
- người đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn em trong quá trình thực hiện đề
tài.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS. Tạ Thị Thu Thủy cùng toàn thể các thầy
cô giáo Phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử - Khoa Công Nghệ Sinh Học, Viện
Đại Học Mở Hà Nội, các anh chị kỹ thuật viên, cùng toàn thể các bạn trong Phòng
thí nghiệm Sinh Học Phân Tử đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, động viên em trong quá

trình thực hiện đề tài này.
Ngoài ra, em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân đã
động viên em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài.
Trong quá trình nghiên cứu đề tài, mặc dù bản thân đã có nhiều cố gắng, xong
không thể tránh được những sai sót, nên em rất mong nhận được những góp ý của quý
thầy - cô cũng như các bạn trong lĩnh vực nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2015


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1
PHẦN I. TỔNG QUAN ĐỀ TÀI.................................................................................... 3
1.1 Tổng quan về kháng sinh ............................................................................................ 3
1.1.1 Lịch sử hình thành kháng sinh ........................................................................... 3
1.1.2 Định nghĩa về chất kháng sinh. .......................................................................... 4
1.1.3 Phân loại kháng sinh ......................................................................................... 5
1.1.4. Cơ chế tác dụng của kháng sinh ........................................................................ 8
1.2

Đại cương về xạ khuẩn .......................................................................................... 12

1.2.1 Các đặc điểm chung và vai trò của xạ khuẩn trong tự nhiên. ............................. 12
1.2.3 Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn ...................................................... 18
1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn. ................. 19
1.2.4.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon ....................................................................... 19

1.2.4.2 Ảnh huởng của nguồn Nitơ ........................................................................... 20
1.2.4.3 Ảnh hưởng của pH ....................................................................................... 20
1.2.4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ ................................................................................ 20
1.2.4.5 Ảnh hưởng của yếu tố vi lượng ..................................................................... 20
1.3

Xạ khuẩn Saccharapolyspora spinosa ................................................................... 21

1.4

Kháng sinh Spinosad ............................................................................................. 21

1.4.1 Cấu trúc của Spinosad ..................................................................................... 21
1.4.2 Tính chất lý hóa của spinosad ........................................................................ 22
1.4.3 Vai trò và hoạt tính sinh học của Spinosad ..................................................... 23
1.4.4
1.5

Những nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam về spinosad .............................. 23
Mục tiêu và nội dung đề tài ................................................................................... 24

1.5.1 Mục tiêu đề tài ....................................................................................................... 24


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

1.5.2 Nội dung đề tài.............................................................................................. 24
PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................... 25

2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị..................................................................................... 25
2.1.1 Vật liệu ........................................................................................................... 25
2.1.2 Hóa chât ............................................................................................................... 25
2.1.3. Thiết bị .................................................................................................................. 26
2.1.4 Môi trường ............................................................................................................. 27
2.2. Phương pháp nghiên cứu..............................................................................................
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật. ........................................................................ 29
2.2.2. Phương pháp bảo quản giống ................................................................................ 31
2.2.3 Phương pháp lựa chọn môi trường thích hợp sinh tổng hợp spinosad từ
Saccharopolyspora spinosa Y6....................................................................................... 33
2.2.4 Phương pháp lựa chọn điều kiện thích hợp nuôi cấy xạ khuẩn sinh tổng hợp
kháng sinh ....................................................................................................................... 33
2.2.5 Phương pháp tách chiết kháng sinh thô bằng dung môi hữu cơ ............................ 35
2.2.6 Phương pháp sắc lý lớp mỏng TLC....................................................................... 36
PHẦN III. KẾT QUẢ ................................................................................................... 38
3.1 Xác định biểu đồ sinh trưởng phát triển, và sinh kháng sinh của xạ
khuẩn…………. .............................................................................................................. 38
3.2

Lựa chọn môi trường lên men sinh kháng sinh. ................................................... 40

3.3

Lựa chọn điều kiện thích hợp nuôi cấy xạ khuẩn sinh tổng hợp kháng sinh ........ 41

3.3.1 Lựa chọn nhiệt độ thích hợp .......................................................................... 41
3.3.2 Lựa chọn pH thích......................................................................................... 42
3.3.3 Lựa chọn hàm lượng glucozơ thích hợp ........................................................... 43
3.3.4. Lựa chọn hàm lượng saccarozơ thích hợp ....................................................... 44
3.3.5 Lựa chọn hàm lượng cao nấm men thích hợp.................................................. 45

3.3.6 Lựa chọn hàm lượng MgCl2 thích hợp ........................................................... 46
3.4. Tách kháng sinh Spinosad thô bằng dung môi hữu cơ ......................................... 47


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

3.4.1 Lựa chọn dung môi tách kháng sinh Spinosad từ dịch lên men .......................... 47
3.4.2 Lựa chọn thời gian chuyển kháng sinh Spinosad vào pha dung môi ................. 48
3.4.3 Tách Spinosad thô từ chủng Saccharapolyspora spinosa Y6 ............................ 50
3.5

Kiểm tra hoạt tính kháng sinh Spinoad thô .......................................................... 51

3.5.1 Kiểm tra hoạt tính kháng sinh Spinosad thô bằng phương pháp sử dụng
khoanh giấy lọc ....................................................................................................... 51
3.5.2 Kết quả thử hoạt tính Spinosad trên bản chạy TLC ......................................... 52
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ....................................................................... 55
4.1. Kết luận .................................................................................................................... 55
4.2 Đề xuất ...................................................................................................................... 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 56


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt

Chú thích

CKS

Chất kháng sinh

VSV

Vi sinh vật

LB

Luria Bertani

l

lit

g

gam

HSCC

Hệ sợi cơ chất

Gram(+)

Gram dương

Gram(-)

Gram âm

D

Đưòng kính vòng kháng khuẩn

VK

Vi khuẩn

CNSH

Công nghệ sinh học


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Cơ chế tác dụng của các kháng sinh ............................................................. 12
Bảng 1.2 Tính chất vật lý và hóa học của Spinosad .................................................... 22
Bảng 2.1 Dụng cụ, thiết bị dùng trong đề tài ............................................................... 26
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ............................................................................... 42
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của pH ....................................................................................... 43
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng glucozơ ............................................................ 44

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng saccarozơ ......................................................... 45
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men ..................................................... 46
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng ............................................................. 47
Bảng 3.7. Thử hoạt tính kháng sinh sau quay cô bằng khoanh giấy lọc ...................... 48
Bảng 3.8. Thử hoạt tính dịch sau phân pha bằng đục lỗ thạch .................................... 48
Bảng 3.9. Thử hoạt tính dịch sau thay đổi thời gian phân pha .................................... 49
Bảng 3.10. Thử hoạt tính kháng sinh trên bản chạy TLC với Bacillus subtilis ........... 53


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Khuẩn lạc của xạ khuẩn .................................................................................... 15
Hình 1.2 Khuẩn ty ở xạ khuẩn ......................................................................................... 17
Hình 1.3 Bào tử xạ khuẩn ................................................................................................ 18
Hình 1.4 Bào tử xạ khuẩn Saccharopolyspora spinosa ................................................... 21
Hình 3.1.Hình thái xạ khuẩn
Saccharopolyspora spinosa Y6

Hình 3.2. Dịch nuôi xạ khuẩn
Saccharopolyspora spinosa Y6 ....... 38

Hình 3.3: Đường cong sinh trưởng và phát triển của xạ khuẩn ....................................... 39
Hình 3.4. Khảo sát hoạt tính kháng sinh của chủng xạ khuẩn Saccharopolyspora spinosa
Y6 ..................................................................................................................................... 39
Hình 3.5 Thử hoạt tính kháng sinh của các môi trường lên men khác nhau .................. 41
Hình 3.6 Kháng sinh thô được hòa tan trong methanol .................................................. 51
Hình 3.7 Thử hoạt tính kháng sinh bằng sử dụng khoanh giấy lọc ................................. 52

Hình 3.8. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp TLC với chủng xạ khuẩn
Sacharopolyspora spinosa Y6 ......................................................................................... 53


MỞ ĐẦU
Công nghệ sinh học (CNSH) là bộ môn tập hợp các ngành khoa học và công
nghệ gồm: sinh học phân tử, di truyền học, vi sinh vật học, sinh hóa học, công nghệ
học, nhằm tạo ra các quy trình công nghệ khai thác ở quy mô công nghiệp các hoạt
động sống của vi sinh vật, tế bào động, thực vật để sản xuất các sản phẩm có giá trị
phục vụ đời sống, phát triển kinh tế - xã hội và bảo vệ môi trường.
CNSH đã và đang được ứng dụng vào trong rất nhiều lĩnh vực như công nghiệp,
nông nghiệp, y học, dịch vụ, du lịch… nhằm phục vụ cho mọi như cầu của cuộc sống
như dinh dưỡng, giải trí, chăm sóc sức khỏe... Bằng những kiến thức sinh học về thực
vật, động vật, nấm, vi khuẩn,... những nhà khoa học đang cố gắng tạo ra những cây
trồng, vật nuôi có năng suất và chất lượng cao, những loại thực phẩm, dược phẩm phục
vụ cho việc chữa bệnh cho con người.
Nông nghiệp và các sản phẩm của nông nghiệp có vai trò quan trọng cung cấp
năng lượng, dinh dưỡng cho cơ thể. Để phòng trừ các bệnh do vi sinh vật (VSV) gây
nên, người nông dân thường sử dụng thuốc hóa học với liều lượng cao. Điều này một
mặt dẫn đến hiện tượng kháng thuốc ở các loài sâu bệnh, mặt khác sẽ dẫn đến hiện
tượng ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người và các
động vật khác, làm mất cân bằng sinh thái.
Thế giới và Việt Nam đang hướng tới một nền nông nghiệp sạch bằng cách sử
dụng các biện pháp sinh học. Biện pháp sử dụng các tác nhân sinh học thay thế các tác
nhân hóa học được xem là một chiến lược quan trọng vì nó an toàn cho con người và
cho môi trường. Một trong những biện pháp được thực hiện đó chính là việc sử dụng
các VSV có khả năng sinh kháng sinh kháng lại sâu bệnh. Trong các nhóm VSV có
khả năng sinh kháng sinh thì xạ khuẩn là nhóm được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất
vì xạ khuẩn có khả năng sinh kháng sinh với tỉ lệ cao.
Trong đó Spinosad nhận đuợc sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học trên

thế giới bởi tác dụng tiêu diệt sâu bệnh hiệu quả, độc tính của Spinosad thấp, thời gian

Nguyễn Thị Yên - 1101

1


phân hủy ngắn nên không gây ảnh hưởng tới sức khỏe con người và môi trường.
Spinosad được sinh tổng hợp từ loài xạ khuẩn Saccharopolyspora spinosa. Tuy nhiên
tại Việt Nam Spinosad chưa được tách chiết mà phải nhập dưới dạng sản phẩm thương
mại từ nước ngoài.
Từ lí do trên, em tiến hành nghiên cứu, thực hiện đề tài “Lựa chọn điều kiện
nuôi cấy thích hợp và tách chiết kháng sinh Spinosad thô từ xạ khuẩn
Saccharopolyspora spinosa Y6” nhằm tạo tiền đề cho việc nghiên cứu và sản xuất
kháng sinh spinosad ở Việt Nam.

Nguyễn Thị Yên - 1101

2


PHẦN I. TỔNG QUAN ĐỀ TÀI
1.1 Tổng quan về kháng sinh
1.1.1 Lịch sử hình thành kháng sinh
Từ lâu con người đã biết dùng nấm mốc (mold, milew) trên đậu phụ để đắp chữa
các vết thương nhỏ. Nhiều thế kỷ trước tại châu Âu, châu Mỹ, người ta đã biết cách
dùng bánh mỳ, ngô hay giày da cũ đã lên mốc để điều trị các vết lở loét, lên mủ ở da.
Theo quan điểm khoa học hiện nay thì thì mốc meo trên đậu phụ hay trên bánh mỳ
thực tế có chứa chất kháng sinh, chỉ có điều người xưa chưa biết vi khuẩn, nấm mốc là
gì, lại càng không biết chất kháng sinh là gì.

Cho đến năm 1928 Nhà vi khuẩn học người Anh Alexander Fleming phát hiện
lần đầu tiên trong môi trường nuôi cấy tụ cầu vàng bị nhiễm nấm và xung quanh loại
nấm này tụ cầu vàng không thể phát triển được. Nghiên cứu hiện tượng lạ này, ông xác
định được nấm đó là Penicillum notaum có khả năng tiết ra một chất có khả năng ức
chế sự phát triển của Staphylococcus aureus, sau này được gọi là Penicillin.
Năm 1929, ông đã đem phát hiện của mình về Penicillin công bố và khẳng định
rằng chất Penicillin có thể trở thành một thứ thuốc quan trong nhưng ông không có khả
năng và kỹ thuật để chiết xuất. Trong 10 năm sau đó, ông âm thầm làm các công việc
khác trong khi vẫn tìm cách chiết tách Penicilin, còn báo cáo của ông về Penicilin dần
rơi vào quên lãng khi giới y học lúc đó cho rằng nấm chỉ đem lại bệnh tật, chứ không
thể chữa bệnh được.
Năm 1938, ông nhận được thư của hai nhà khoa học từ trường Đại học
Oxford là Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey, với lời đề nghị được hợp tác
với ông để tiếp tục thực hiện công trình nghiên cứu về Penicilin. Và sự hợp tác đã
mang lại thành công, họ đã tách được Penicillin từ nấm Penicillum và thử nghiệm trên
chuột vào năm 1940.

Nguyễn Thị Yên - 1101

3


Năm 1941, nhóm nghiên cứu đã chọn được loại nấm Penicilin ưu việt nhất là
chủng Penicilin chrysogenium, chế ra loại Penicilin có hoạt tính cao hơn cả triệu lần
Penicilin do Fleming tìm thấy lần đầu năm 1928.
Năm 1944, Penicillin đã được sản xuất trên quy mô lớn ở Mỹ để phục vụ chữa
trị các bệnh nhiễm khuẩn cho thương binh trông chiến tranh thế giới thứ II. Sau đó,
một số cũng sản xuất được Penicillin G và Penicillin V.
Năm 1945, Fleminh được nhận giải thưởng Nobel về y học cùng với Ernst Boris
chain và Howard Walter Florey.

Việc phát hiện ra Penicillin là một bước ngoặt lớn trong lịch sử y học thế giới,
làm tiền đề cho các nhà khoa học khác tìm ra những loại kháng sinh mới như:
Streptomycescin được Waksman tìm ra vào năm 1944 bởi sự nuôi cấy nấm
Streptomycesgriseu. Đến này với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học và
hóa được con người đã biết được hơn 8000 chất kháng sinh khác nhau có nguồn gốc từ
nấm mốc, vi khuẩn và xạ khuẩn , 150 kháng sinh được dùng trong y khoa và thú y.
1.1.2 Định nghĩa về chất kháng sinh.
Năm 1942 Tiến Sĩ Selman A.Waksman đưa ra đinh nghĩa đầu tiên về kháng
sinh: “Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất tự nhiên được các vi sinh vật tiết
ra (vi khuẩn, vi nấm), có tác dụng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với
các vi sinh vật khác".
Về sau, với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, người ta có thể tổng hợp, bán
tổng hợp các kháng sinh tự nhiên (Chloramphenicol); tổng hợp nhân tạo các chất có
tính kháng sinh: sulfamid, quinolon hay chiết xuất từ vi sinh vật những chất diệt được
tế bào ung thư (actinomycin).
Vì thế định nghĩa kháng sinh đã được thay đổi: “Kháng sinh là tất cả các hợp
chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp với nồng độ rất thấp có khả năng đặc hiệu
kìm hãm sự phát triển hoặc tiêu diệt đối với các vi sinh vật gây bệnh, đồng thời không
có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên con người, động vật và thực vật bằng con đường
cung cấp chung”.

Nguyễn Thị Yên - 1101

4


Để biểu thị độ lớn giá trị hoạt tính sinh học của kháng sinh trong 1 ml dung dịch
(đơn vị/ml) hay 1 mg chế phẩm (đơn vị/mg), thường dùng đơn vị kháng sinh. Đơn vị
kháng sinh là lượng kháng sinh tối thiểu hoà tan trong một thể tích môi trường xác
định, có tác dụng ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật kiểm định trong thời gian xác định .

Đơn vị kháng sinh quốc tế là UI, ví dụ 1 UI penicillin = 0,6 µg, còn 1 UI streptomycin
= 1,0 µg (Hopwood, 2007).
1.1.3 Phân loại kháng sinh
Có nhiều cách phân loại kháng sinh, tùy theo mục đích nghiên cứu và cách sử
dụng chúng: phổ tác dụng, cơ chế tác dụng, nguồn gốc, con đường sinh tổng hợp hay
cấu trúc hóa học .
Dựa vào mức độ tác dụng
Chất kháng sinh (CKS) diệt khuẩn gồm những kháng sinh có cơ chế tác dụng
đến khả năng tạo vách tế bào, sinh tổng hợp ADN và ARN, giải phóng men autolyza,
vi khuẩn tự phân giải như: nhóm Lactamin gồm các loại Penicillin và các CKS thuộc
nhóm Cephalosporin, nhóm Aminoglucozid (Streptomycin, Neomycin, Kanamycin,
Gentamycin, Framomycin), nhóm đa peptid : Colistin, Bacitracin, Vanomycin.
CKS kìm khuẩn gồm các chất ức chế sinh tổng hợp protein của vi khuẩn bằng
cách gắn vào các enzym hay các ribosome 30S, 50S và 70S như: Sulphamid Teracillin,
Chloramphenicol, Erythromycin, Novobiocin.
Dựa vào phổ tác dụng kháng sinh
-

Nhóm có phổ tác dụng hẹp, chỉ tác dụng lên một loại hay một nhóm vi khuẩn nào
đó: Penicillin cổ điển chỉ dụng lên vi khuẩn Gram (+) hay nhóm thuốc tác dụng
lên vi khuẩn Gram (-) như Streptomycin.

-

Nhóm kháng sinh có phổ tác dụng rộng, chúng có tác dụng với cả vi khuẩn Gram
(+), Gram (-), Rickestsia, virus cỡ lớn, đơn bào: Chloramphenicol, Tetracillin.

-

Nhóm kháng sinh dùng ngoài là các CKS không hoặc ít được hấp thụ ở đường

tiêu hóa. CKS nhóm này thường độc, bao gồm các kháng sinh có tác dụng với vi

Nguyễn Thị Yên - 1101

5


khuẩn Gram (-) như: Baxitraxin, Heliomycin; tác dụng với vi khuẩn Gram (-)
như: Neomycin, Polymycin.
-

Nhóm kháng sinh chống lao: Rifamycin.

-

Nhóm kháng sinh chống nấm như: Nystatin, Grycefulvin, Ampoterytin-B.
Dựa vào nguồn gốc
-

Kháng sinh có nguồn gốc từ sinh vật, xạ khuẩn.

-

Nhóm kháng sinh có nguồn gốc hóa dược hay do con người tổng hợp lên.
Dựa vào cơ chế tác dụng

Dựa vào cơ chế tác dụng người ta phân chia thành 2 nhóm:
Nhóm kháng sinh có tác dụng lên tế bào vi khuẩn gồm các kháng sinh:
-

Kháng sinh tác dụng lên quá trình tạo vách tế bào: Penicillin và các chất thuộc
nhóm ß – lactamin, Vanomycin, Baxitracin…

-

Kháng sinh tác dụng lên màng tế bào. Các chất này làm rối loạn tính thấm của
vỏ và màng nguyên sinh chất của tế bào vi khuẩn, làm cho chức năng hàng rào
bị phá hủy, vi khuẩn bị rối loạn quá trình đồng hóa và dị hóa. Do vậy mất khả
năng lấy chất dinh dưỡng cần thiết và thải các sản phẩm của quá trình dị hóa ra
ngoài: Colistin, Polymycin…

Nhóm kháng sinh tác dụng lên hệ phi bào làm rối loạn các hoạt động sống của tế bào
trong nguyên sinh chất bao gồm:
-

Kháng sinh làm rối loạn và ức chế tác dụng và tổng hợp protein của tế bào vi
khuẩn ở mức ribosome. Vi khuẩn không tạo nên các chất tham gia vào quá trình
phân chia, di truyền của tế bào vi khuẩn.

-

Kháng sinh ức chế sự tổng hợp nên các axit nucleic: ADN và ARN. Các kháng
sinh này rất độc, dùng để chữa ung thư, ít dùng trong thú y.

Nguyễn Thị Yên - 1101

6


Dựa theo cấu trúc hóa học

Phân loại theo cấu trúc hóa học là phương pháp khoa học nhất, đưa ra một cái
nhìn tổng quát nhất đối với các nhóm kháng sinh. Theo đó, kháng sinh được phân
thành 9 nhóm chính:
-

Các kháng sinh cacbonhydrat
Các saccarit thuần nhất như: nojimycin
Các aminoglycosid: streptomycin
Các ortozomycin: eveminomycin
Các N-glycosid: streptortycin
Các glycoside peptid: vancomycin
Các glycolipid: moenomycin

-

Các lacton macrocyclic
Các kháng sinh macrolid: erythromycin
Các kháng sinh polyen: nystatin
Các anzamycin: rifamycin
Các macrotetrolid: tetranactin

-

Các kháng sinh quynon và dẫn xuất
Các tetracycline: tetracyclin
Các antracyclin: adriamycin
Các naftoquynon: actinorodin
Các benzoquynon: mitomycin

-

Các kháng sinh peptid và axit amin
Các dẫn xuất axit amin: cycloserin
Các kháng sinh β-lactam: penicillin
Các kháng sinh peptid: bacitracin
Các cromopeptid: actinomycin

Nguyễn Thị Yên - 1101

7


Các depsipeptid: valinomycin
Các peptid tạo kelat: bleomycin
-

Các kháng sinh dị vòng chứa nitơ
Các kháng sinh nucleozid: polyoxin

-

Các kháng sinh dị vòng chứa oxy
Kháng sinh polyete: monenzin

-

Kháng sinh mạch vòng no
Các dẫn chất alkan: cycloheximid
Kháng sinh steroid: axit fuzidic

-

Kháng sinh chứa nhân thơm
Các dẫn chất benzen: chloramphenicol
Các chất nhân thơm ngưng tụ: griseofulvin
Các ete thơm: novobiocin

-

Các kháng sinh mạch thẳng
Các chất chứa P: phosphomycin

1.1.4. Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Các kháng sinh tác dụng cơ bản qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp rất khác
nhau của tế bào VSV gây bệnh. Chúng liên kết vào các vị trí chính xác hay các phân tử
đích của tế bào VSV mà tạo ra các phản ứng trao đổi chất. Các đích tác dụng đặc trưng
cho từng nhóm kháng sinh, tuy nhiên trong nhiều trường hợp người ta vẫn chưa biết
được chính xác hết. Có 6 mức tác dụng khác nhau đối với tế bào vi khuẩn, nấm: thành
tế bào, màng nguyên sinh chất, tổng hợp gen (sao chép và dịch mã DNA), tổng hợp
protein-phiên mã mRNA, trao đổi chất hô hấp và trao đổi chất trung gian.
Sự ức chế tổng hợp thành tế bào
Các nhà hóa học đã làm thay đổi các β-lactam tự nhiên như Penicillin G+, để tạo
ra các dẫn xuất bán tổng hợp như meticilin và cephalotin, các chất này bền hơn trong
môi trường axit của dạ dày, dễ hấp thụ hơn trong đường ruột, ít mẫn cảm hơn với sự

Nguyễn Thị Yên - 1101

8

bất hoạt các enzyme vi khuẩn hoặc hoạt động mạnh hơn chống lại nhiều vi khuẩn. Các
β-lactam đơn giản nhất là các monolactams, ít được sử dụng vì chúng chỉ có tác dụng
chống lại các vi khuẩn Gram âm hiếu khí.
Các tác nhân kháng vi khuẩn khác như vacomicin, thu được từ Streptomyces
orientalis, và xicloxerin, một tác nhân bán tổng hợp, lại ức chế sự tạo thành tế bào theo
một cách khác. Chúng can thiệp trực tiếp vào các cầu alanin – alanin đặc thù nối giữa
các đơn vị axit N – acetylmuramic (NAM) ở nhiều vi khuẩn Gram dương. Các vi
khuẩn thiếu cầu alanin– alanin sẽ đề kháng một cách tự nhiên với loại thuốc này.
Một loại thuốc khác cũng ngăn ngừa sự tạo thành tế bào, baxitracin lại phong
tỏa sự tiết N– acetylglucozamin (NAG) và NAM từ tế bào. Giống như các β-lactam
vancomicin, xicloxerin và baxitracin đều dẫn đến sự dung giải tế bài do tác động của
áp suất thẩm thấu.
Vì tất cả loại thuốc này đều ngăn cản vi khuẩn tăng số lượng nguyên liệu thành
tế bào, song không gây tác động lên peptidoglucan, nên chúng chỉ tác động hiệu quả
lên các tế bào vi khuẩn đang sinh trưởng hoặc đang sinh sản, các tế bào nghỉ không bị
ảnh hưởng. Tất nhiên chúng không gây hại đối với các tế bào động thực vật, vì các tế
bào này không mang thành tế bào chứa peptidoglucan.
Sự phá vỡ màng tế bào chất
Một số thuốc kháng vi sinh vật phá vỡ màng tế bào chất của tế bào đích, bằng
cách gắn vào màng và làm hư hỏng tính nguyên vẹn của màng. Đây là cơ chế tác dụng
của một nhóm kháng sinh có tên là polyen. Một trong các polyen là amphotericin B có
khả năng kháng nấm, có khả năng gắn vào ecgosterol-một cấu tử lipit của màng tế bào
nấm, trong quá trình gắn kết nó sẽ phá vỡ màng và gây ra sự dung giải tế bào. Màng tế
bào của người cũng khá mẫn cảm với loại kháng sinh này do chúng có chứa
cholesterol.
Màng tế bào của hầu hết vi khuẩn đều thiếu các sterol, do vậy các vi khuẩn này
đề kháng một cách tự nhiên với amphotericin B. Tuy nhiên, có các tác nhân khác có
khả năng phá vỡ màng tế bào vi khuẩn. Một ví dụ về các tác nhân kháng khuẩn này là

Nguyễn Thị Yên - 1101

9


Polimicin do Bacillus polymycin tạo ra. Polimicin có tác dụng chống lại các vi khuẩn
Gram âm, song vì có tính độc với thận của người nên được sử dụng để chống lại các
tác nhân gây bệnh nằm trên bề mặt ngoài cơ thể đã đề kháng với các loại thuốc kháng
khuẩn khác.
Sự ức chế tổng hợp protein
Nhiều tác nhân kháng vi sinh vật lợi dụng sự khác biệt giữa các riboxom để tấn
công chọn lọc vào sự dịch mã protein của vi khuẩn mà không gây ảnh hưởng đáng kể
đến các vi sinh vật nhân chuẩn.
Các thành phần khác nhau của riboxom sẽ là đích của các loại thuốc kháng vi
sinh vật. Các tiểu phần 30S và 50S của một riboxom nhân sơ giữ vai trò trong sự mở
đầu tổng hợp protein, nhận biết codon, gắn phức hệ tARN-amino axit vào vị trí và tạo
các liên kết peptid.
Trong số các tác nhân kháng vi sinh vật tấn công vào tiểu phần 30S của riboxom,
các aminoglicozit và các tetracilin (như là streptomycin, amikacin, tobramicin và
gentarnicin) làm thay đổi hình dạng của các tiểu phần 30S, từ đó làm cho riboxom
không có khả năng đọc các codon của mARN một cách chính xác. Hoặc như các
tetracilin phong tỏa vị trí neo của tARN, qua đó ngăn cản sự gắn các amino acid bổ
sung vào chuỗi polypeptide đang được hình thành.
Các tác nhân kháng vi sinh vật khác can thiệp vào chức năng của tiểu phần 50S.
Cloramphenicol và các loại kháng sinh tương tự phong tỏa vị trí enzyme của tiểu phần
50S, qua đó ngăn ngừa sự dịch mã. Clindamicin và các tác nhân kháng vi sinh vật có
tên là macrolit, liên kết với một vị trí khác của tiểu phần 50S, ngăn cản sự chuyển động
của riboxom từ codon này tới codon tiếp theo, kết quả là sự dịch mã bị đóng băng và
sự tổng hợp protein bị ngừng lại.
Sự ức chế tổng hợp axit nucleic
Các hợp chất có khả năng hoạt động như các tác nhân kháng vi sinh vật, bằng

cách can thiệp vào chức năng của các axit nucleic được gọi là các chất tương tự
nucleotide, do sự giống nhau về mặt cấu trúc của các hợp chất này với các nucleotide

Nguyễn Thị Yên - 1101

10


thông thường. Cấu trúc một số chất tương tự nucleotide cho phép chúng gắn được vào
ADN hoặc ARN của các tác nhân gây bệnh, tại đó, chúng làm biến dạng các phân tử
axit nucleic và ngăn ngừa sự sao chép, phiên mã và dich mã xảy ra sau đó.
Các chất tương tự nucleotide thường được sử dụng để chống lại virut, vì
enzyme ADN polymeraza của virut có khả năng gắn các nucleotide không hoạt động
vào các axit nucleic lớn hơn hàng trục đến hàng trăm lần so với các enzyme polimeraza
của vật chủ. Hơn nữa, sự tổng hợp axit nucleic lại được diễn ra trong tế bào chất, các
đặc điểm này làm cho virut mẫn cảm với các chất tương tự nucleotide hơn vật chủ của
chúng. Đặc biệt, các chất tương tự nucleotide cũng có tác dụng lên các tế bào ung thư
trong giai đoạn phân chia nhanh.
Sự ức chế tổng hợp axit folic
Trao đổi chất có thể định nghĩa đơn giản là tổng số các phản ứng hóa học diễn
ra bên trong một cơ thể. Trong khi hầu hết các sinh vật đều có chung một số phản ứng
trao đổi chất (ví dụ như con đường đường phân) thì các phản ứng hóa học khác lại chỉ
bắt gặp ở một số loại sinh vật. Bất cứ khi nào sự khác biệt giữa các quá trình trao đổi
chất của một tác nhân gây bệnh và vật chủ của nó tồn tại thì các tác nhân kháng trao
đổi chất đều có thể gây hiệu quả
Sunfanilamit và các hợp chất tương tự được gọi là sunfonamit hoạt động như
các loại thuốc kháng trao đổi chất vì chúng là những chất tương tự về mặt cấu trúc và
hóa học với axit paraaminobenzoic (PABA) – một hợp chất thiết yếu trong các phản
ứng đồng hóa tạo thành các axit nucleotide. Nhiều sinh vật, trong đó có một số tác
nhân gây bệnh, nhờ tác dụng của enzyme chuyển hóa PABA thành axit dihydrofolic,

rồi thành axit tetrahydrofolic (THF) – một dạng của axit folic được sử dụng như một
coenzyme trong sự tổng hợp các nucleotide purin và pirimidin. Là các chất tương tự
của PABA, các sunfonamit cạnh tranh với các phân tử PABA về vị trí hoạt động của
enzyme tham gia vòa sự tạo thành axit dihydrofolic. Điều này dẫn tới sự giảm sản suất
THF, ảnh hưởng tới tổng hợp nucleotide, qua đó làm chậm sự tổng hợp các protein.

Nguyễn Thị Yên - 1101

11


Như vậy kết quả cuối cùng của sự cạnh tranh bởi sunfonamit với PABA là sự ngừng
trao đổi chất của tế bào.
Nhìn chung, có thể phân chia cơ chế tác dụng của kháng sinh theo các nhóm
kháng sinh như bảng 1.1.
Bảng 1.1 Cơ chế tác dụng của các kháng sinh
Nơi tác dụng

Kháng sinh

Thành tế bào

Bacitracin

Tổng hợp mucopeptid

Diệt khuẩn

Các cephalosporin

Thành tế bào

Kháng khuẩn

Các penicillin

Thành tế bào

Kháng khuẩn

Cycloserin

Tổng hợp peptid của thành tế bào

Kháng khuẩn

Vancomycin

Tổng hợp mucopeptid

Kháng khuẩn

Amphotericin B

Chức năng của màng

Diệt nấm

Nystatin

Chức năng của màng

Diệt nấm

Polymycin

Tương tác của màng

Diệt khuẩn

Tổng hợp protein

Kháng khuẩn

Tổng hợp protein

Kháng khuẩn

Màng tế bào

Các Ribosom Chloramphenicol
Tiểu phần

Erythromycin

Quá trình bị ngăn cản

Loại tác dụng

50S

Tiểu phân

Các aminoglycosid Tổng hợp protein và làm sai lệch Diệt khuẩn

30S

quá trình này
Các tetracyclin

Tổng hợp protein

Kháng khuẩn

Các axit

Actinomicin

Tổng hợp ADN và m.ARN

Diệt khuẩn

nucleic

Griseofulvin

Phân chia tế bào

Kháng nấm

ADN hoặc

Mitomycinl

Tổng hợp ADN

Diệt nấm

Rifampin

Tổng hợp mARN

Diệt khuẩn

ARN

1.2 Đại cương về xạ khuẩn
1.2.1 Các đặc điểm chung và vai trò của xạ khuẩn trong tự nhiên.
Xạ khuẩn là một nhóm VSV đa dạng trong đó đa số sinh trưởng hiếu khí và tạo
khuẩn ty phân nhánh tương tự như nấm. Xạ khuẩn có danh pháp khoa học là:

Nguyễn Thị Yên - 1101

12


Actinobacteria, tên tiếng Anh là: Actinomycetes- bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “actys”
(tia) và “mykes” (nấm). Ban đầu xạ khuẩn được coi là nấm nhỏ vì chúng sinh trưởng
giống với nấm. Mạng lưới phân nhánh của thể sợi thường phát triển ở cả bề mặt cơ
chất rắn (tạo thành hệ sợi khí sinh), bên trong tạo thành hệ sợi cơ chất (HSCC).
Đa số xạ khuẩn sinh bào tử, sống tự do, hoại sinh, phân bố rộng rãi trong đất,

nước và xác thực vật. Xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng về mặt sinh thái trong vòng
tuần hoàn tự nhiên. Chúng phân hủy và sử dụng và các chất hữu cơ khó phân hủy như
axit humic trong đất. Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng hòa tan lignin và phân hủy
các hợp chất liên quan đến lignin bằng cách sinh các enzyme thủy phân xenlulozo và
hemixenlulozo và các peroxidaza ngoại bào.
Trong quá trình trao đổi, xạ khuẩn có thể sinh ra các chất hữu cơ như các loại
vitamin nhóm B (B1,B2,B6, B12), một số acid hữu cơ như acid lactic, acid axetic, acid
amin như acid glutamic, metionin, tryptophan, lizin.
Về mặt phân loại, lớp xạ khuẩn có 5 phân lớp, 6 bộ trong đó được nhắc đến
nhiều nhất (có giá trị trong y học và kinh tế) là bộ Actinomyetales. Bộ
Actinomycestales có 13 dưới bộ, 42 họ và khoảng 200 chi.
Xạ khuẩn thường được chia thành hai loại: Streptomyces và không phải
Streptomyces (non-Streptomyces). Chi xạ khuẩn được biết nhiều nhất là Streptomyces,
với khoảng 500 loài, tất cả đều có G-C cao (69% ÷ 73%) trong AND. Steptomyces đặc
biệt nhiều trong đất nơi chúng phân hủy hoại sinh rất phiên phức các chất hữu cơ bằng
các enzyme ngoại bào. Theo Waskman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 ÷
2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm 9 – 45% tổng số VSV. Thực tế, mùi mốc đặc trưng
của nhiều loại đất liên quan đến sự sản sinh hợp chất hữu cơ dễ bay hơi gọi là geosmin.
Một trong những đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành
chất kháng sinh, 60 ÷ 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh chất kháng
sinh. Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có tới
80% là do xạ khuẩn sinh ra. Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc từ các loại xạ
khuẩn

Micromonospora,

Actinomadura,

Actinoplanes,

Streptoverticillium,

Streptosporangium… Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm đã cung cấp nhiều chất

Nguyễn Thị Yên - 1101

13


kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học như gentamixin, tobramixin, vancomixin,
rosamixi.
Một số xạ khuẩn có thể gây bệnh cho người, động vật. Các bệnh này được gọi
tên chung là Actinomycosis.
1.2.2. Cấu tạo xạ khuẩn
Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram (+), toàn bộ cơ chế chỉ
là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh
chất, chất nhân.
Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10– 20nm có tác dụng duy
trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp: lớp ngoài cùng dày
khoảng 60 ÷ 120 Ā, lớp giữa rắn chắc dày khoảng 50A, lớp trong dày khoảng 50A.
Các lớp này chủ yếu cấu tạp từ các lớp glucopeptit bao gồm các gốc N- Axetyl
glucozamin liên kết với N-axetyl (protoplast), cấu trúc sợi cũng bị phá hủy khi xử lý tế
bào với hỗn hợp este-clorofom và các dung môi hòa tan lipit (thành HSKS có nhiều
lipit hơn so với HSCC) khác với nấm. Thành tế bào xạ khuẩn không chứa xenlulozo và
kitin nhưng chứa nhiều enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận
chuyển vật chất qua màng tế bào.
Căn cứ vào thành phần hóa học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 4 nhóm
chính:
-

Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L- 2,6,diaminopimelic (LADP) và glyxin.

-

Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso – 2,6 –
diaminopimelic (m-ADP) và glyxin.

-

Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso-2,6-diaminopimeclic.

-

Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso-2,6-diaminopimelic,
arabinozo và galactozo.
Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50nm được cấu tạo chủ yếu

bởi 2 thành phần là photpholipit và protein. Chúng có vai trò đặc biệt trong quá trình
trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn.

Nguyễn Thị Yên - 1101

14


Nguyên sinh chất và nhân tế bào xạ khuẩn không có khác biệt lớn so với tế bào
vi khuẩn. Tuy nhiên, điểm khác biệt của xạ khuẩn so với các sinh vật prokaryot ở chỗ
chúng có tỷ lệ G-C rất cao trong AND, thường lớn hơn 55%, trong khi đó ở vi khuẩn tỷ
lệ này chỉ là 25 ÷45%.
Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram (+) nên ngoài yếu tố di truyền trong nhiễm

sắc thể (NST) còn có các yếu tố di truyền ngoài NST, chúng có thể tự nhân lên được
lederberg gọi là plasmid.
Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng là
đường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác. Nguồn Nitơ hữu cơ là protein,
pepton, cao ngô, cao nấm men. Nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối amon… Khả năng
đồng hóa các chất ở các loài hay chủng xạ khuẩn khác nhau là khác nhau.
1.2.2.1 Hình thái khuẩn lạc

Hình 1.1 Khuẩn lạc của xạ khuẩn
Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và
không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử).
Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng da, dạng vôi, dạng
nhưng tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam,
vàng, nâu, xám, trắng…tùy thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh.

Nguyễn Thị Yên - 1101

15


Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tùy loài và tùy vào điều
kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm… Đường kính mỗi khuẩn
lạc chỉ chừng 0,25mm nhưng cũng có khuẩn lạc đat tới đường kính 1cm. Khuẩn lạc có
3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc
tổ ong.

Nguyễn Thị Yên - 1101

16

1.2.2.2 Hình thái khuẩn ty

Hình 1.2 Khuẩn ty ở xạ khuẩn
Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một loại cắm
sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (HSCC hay khuẩn ty cơ chất) với chức năng
chủ yếu là dinh dưỡng. Một loại phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh
(HSKS hay khuẩn ty khí sinh) với chức năng chủ yếu là sinh sản.
Nhiều loại chỉ có HSCC nhưng cũng có loại lại chỉ có HSKS (như chi
Sporichthya). Khi đó HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh sản vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng.
Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau. Các sản phẩm trong
quá trình trao đổi chất như: chất kháng sinh, độc tố, enzyme, vitamin, axit hữu cơ…có
thể được tích lũy trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra trong môi
trường.

Nguyễn Thị Yên - 1101

17