Nghiên cứu tách chiết và phân tích cấu trúc kháng sinh thu được từ chủng xạ khuẩn STREPTOMYCES SP KCTC 0041BP sau khi đã đột biến mất GEN MIII

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------ -- --

------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CứU TÁCH CHIếT VÀ PHÂN TÍCH CấU TRÚC KHÁNG
SINH THU ĐƯợC Từ CHủNG Xạ KHUẩN STREPTOMYCES SP. KCTC
0041BP SAU KHI ĐÃ ĐộT BIếN MấT GEN GER MIII.

Giáo viên hướng dẫn

:Th.s Nguyễn Thị Ngọc Anh

Sinh viên thực hiên

:Nguyễn Hoài Linh

Lớp

: 11 - 02

Hà Nội - 2015


Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài em đã nhận được rất nhiều sự

quan tâm, giúp đỡ của quý thầy cô, gia đình và bạn bè.
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất em xin gửi tới cô giáo - ThS. Nguyễn Thị Ngọc
Anh - người đã định hướng nghiên cứu, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho
em trong suốt quá trình thực tập và hoàn thành đề tài nghiên cứu của mình.
Em xin chân thành cảm ơn TS. Tạ Thị Thu Thủy – Chủ nhiệm khoa Công Nghệ
Sinh Học – Viện Đại Học Mở Hà Nội, cùng toàn thể các thầy cô giáo, anh chị kĩ
thuật viên các bạn sinh viên Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử đã luôn bên cạnh
động viên, khích lệ, ủng hộ em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Bước đầu tìm hiểu, thực hiện đề tài với vốn kiến thức còn hạn chế và nhiều bỡ
ngỡ. Mặc dù bản thân đã có nhiều cố gắng, nhưng không thể tránh khỏi những
thiếu sót nên em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của quý Thầy – Cô để
bài khóa luận của em được đầy đủ và hoàn chỉnh hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Nguyễn Hoài Linh.

Nguyễn Hoài Linh

i

Lớp 11-02


Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ..........................................................................................................i

MỤC LỤC ..............................................................................................................ii
DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... v
DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... vi
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 4
1.1.

Tổng quan về kháng sinh. ........................................................................... 4

1.1.1.

Lịch sử về kháng sinh. ................................................................................ 4

1.1.2.

Định nghĩa về kháng sinh............................................................................ 4

1.1.3.

Phân loại kháng sinh. .................................................................................. 5

1.1.4.

Cơ chế tác dụng của kháng sinh. ................................................................. 6

1.1.5.

Các nghiên cứu gần đây về kháng sinh........................................................ 7

1.2.

Tổng quan về xạ khuẩn Streptomyces. ........................................................ 9

1.2.1.

Vai trò của xạ khuẩn trong tự nhiên . .......................................................... 9

1.2.2.

Giới thiệu về xạ khuẩn Streptomyces. ....................................................... 10

1.2.3.

Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn. ............................................... 10

1.3.

Xạ khuẩn Streptomyces. sp KCTC 0041BP. ............................................. 11

1.3.1.

Đặc điểm nuôi cấy. ................................................................................... 11

1.3.2.

Đặc điểm sinh lý, sinh hóa. ....................................................................... 13

1.3.3.

Khả năng kháng khuẩn với một số vi sinh vật kiểm định........................... 13

1.3.4.

Phân loại. .................................................................................................. 13

1.4.

Xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC0041 bp đã được đột biến GerMIII. ..... 13

1.5.

Tổng quan về kháng sinh dyhidrochalcomycin. ........................................ 14

1.5.1.

Cấu trúc của dyhidrochalcomycin. ............................................................ 15

1.5.2.

Vai trò và hoạt tính sinh học. .................................................................... 15

1.5.3.

Các nghiên cứu về dihydrochalcomycin. ................................................... 16

1.6.

Đại cương về gen gerMIII (2-O-methyltransferase). ................................. 21

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 23

Nguyễn Hoài Linh

ii

Lớp 11-02


Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

2.1. Vật liệu hóa chất và thiết bị............................................................................ 23
2.1.1. Vật liệu. ....................................................................................................... 23
2.1.2. Hóa chất. ..................................................................................................... 23
2.1.3. Môi trường nuôi cấy. .................................................................................. 24
2.1.4. Thiết bị. ...................................................................................................... 25
2.2. Phương pháp nghiên cứu. ............................................................................... 25
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy chủng vi sinh vật. .................................................... 25
2.2.2. Phương pháp bảo quản giống. ...................................................................... 27
2.2.3. Phương pháp tách chiết kháng sinh thô bằng dung môi hữu cơ. ................... 27
2.2.4. Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh bằng khoanh giấy lọc. ...................... 29
2.2.5. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography – TLC). ........ 30
2.2.6.

Phương pháp Prep – TLC (Prepare TLC). ............................................... 31

2.2.7.

Phương pháp sắc ký lỏng kết hợp khối phổ (Liquid Chromatography

Mass).

....................................................................................................... 33

2.2.8. Phương pháp ion hóa tia điện ESI (Electrophoresis Spray Ionization). ........ 34
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 35
3.1. Tách chiết kháng sinh thô bằng dung môi hữu cơ. ......................................... 35
3.2. Thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khoanh giấy lọc. ....................... 36
3.3. Tthử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC. ............. 38
3.4. Tinh sạch kháng sinh bằng Prep – TLC (Prepare-TLC)................................... 40
3.5. Kết quả phân tích kháng sinh bằng phương pháp sắc ký lỏng kết hợp khối phổ
(LC-Mass) và phương pháp ESI-Mass. .................................................................. 41
3.6. Quy trình tách và thu nhận kháng sinh thô quy mô phòng thí nghiệm. ............ 43
3.7. Qui trình tinh sạch quy mô phòng thí nghiệm. ................................................ 45
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT. .................................................................. 46
4.1. Kết Luận. ........................................................................................................ 46
4.2.Đề Xuất. .......................................................................................................... 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 47

Nguyễn Hoài Linh

iii

Lớp 11-02


Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Chú thích

Amp

Ampicillin

Bp

Base paire

C

Carbon

CKS

Chất kháng sinh

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTPs

Deoxynucleotide triphosphates

RNA

Ribonucleic Acid

Gr+

Gram dương

Gr-

Gram âm

Neo

Neomycin

VSV

Vi sinh vật

HPLC

High Perfomance Liquid
Chromatography

LB

Luria Bertani

TLC

Thin Layer Chromatography

LC-Mass

Liquid Chromatography Mass

PKS

Polyketide Synthase

ESI-Mass

Electrophoresis Spray Ionization Mass

dvC

Đơn vị Cacbon

Nguyễn Hoài Linh

iv

Lớp 11-02


Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Khuẩn lạc của chủng Streptomyces sp. KCTC 0041BP trênmôi trường
ISP2 ...................................................................................................................... 12
Hình 1.2. Hình dạng KTKS và KTCC của chủng Streptomyces sp. KCTC 0041BP
phóng đại (× 4.500-15.000) ................................................................................... 13
Hình 1.3.Cấu trúc của Dihydrochalcomycin ......................................................... 15

Hình 1.4. Dự đoán con đường sinh tổng hợp gốc đường khử và bước cuối hoàn
thành cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin ..................................................... 19

Hình 1.5. Nhóm gen sinh tổng hợp dihyrochalcomycin phân lập từpGERI-5
cosmid . ........................................................................................................ 22
Hình 3.1. Phân pha chiết dịch kháng sinh .................................................... 35
Hình 3.2. Sản phẩm kháng sinh của các chủng đã đột biến sau khi quay cô. 36
Hình 3.3. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của các chủng Streptomyces sp.
KCTC 0041BP đã đột biến. .......................................................................... 37
Hình 3.4. Kết quả kiểm tra chạy TLC của chủng Streptomyces sp. KCTC
0041BP(W) và các chủng đột biến M3-1-10(10), M3-8-13(13) . .................. 38
Hình 3.6. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh sau khi tinh sạch. ...................... 40
Hình 3.5. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp TLC với chủng
xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC 0041BP ban đầu(W) và các chủng đột biến
M3-1-10(10), M3-8-13(13). ......................................................................... 39
Hình 3.7. Kết quả chạy TLC sau khi tách khỏi bột silicagel. ........................ 41
Hình 3.8A và hình 3.8B: Phân tích cấu trúc phân tử Dihydrochalcomycin
bằng LC-Mass. ............................................................................................. 42
Hình 3.9A và hình 3.9B: Phân tích cấu trúc của dẫn xuất kháng sinh từ chủng
đột biến gen GerMIII.................................................................................... 43
Hình 3.10. Sơ đồ quy trình thu nhận kháng sinh thô. .................................... 44
Hình 3.11. Sơ đồ quy trình tinh sạch quy mô phòng thí nghiệm. .................. 45

Nguyễn Hoài Linh

v

Lớp 11-02

Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Dự đoán chức năng của các gen ORFs trong nhóm gen sinh tổng
hợp dihydrochalcomycin. ............................................................................. 17
Bảng 3.1. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của chủng Streptomyces sp.
KCTC 0041BP ban đầu và các chủng đột biến M3-8-13, M3-1-10.............. 37
Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp TLC với chủng
đột biến M3-1-10, M3-8-13 và chủng wild type. .......................................... 38

Nguyễn Hoài Linh

vi

Lớp 11-02


Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
Bệnh nhiễm khuẩn là một trong những nguyên nhân hàng đầu đe dọa đến sự
an toàn của con người. Những trận đại dịch không những cướp đi sinh mạng con
người mà thậm chí còn dẫn đến sự diệt vong của một đế chế hùng mạng. Chính điều
đó đã thôi thúc các nhà khoa học trên thế giới phải tìm ra được một chất có khả
năng phòng chống và điều trị các bệnh nhiễm khuẩn.
Ngày nay với sự phát triển vượt bậc của công nghệ sinh học đã tìm ra rất nhiều
chất kháng sinh (CKS) phục vụ đời sống con người. Trong số hơn 10.000 CKS
được tìm ra thì có khoảng 2.000 chất do thực vật tạo ra, khoảng 8.000 chất là kháng
sinh do vi sinh vật tổng hợp, trong đó xạ khuẩn tổng hợp trên 80% [11].

Tuy nhiên, do việc sử dụng các CKS không hợp lý đã làm xuất hiện hiện
tượng kháng kháng sinh. Số lượng các vi khuẩn kháng với chất kháng sinh ngày
càng gia tăng. Vì vậy, đi kèm với các biện pháp sử dụng kháng sinh an toàn, hợp lý
thì việc nghiên cứu sản xuất ra các chất kháng sinh mới có nhiều đặc tính ưu việt
thực sự rất cần thiết.
Xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC0041BP đang được nghiên cứu ở nhiều
nước như Hàn Quốc, Việt Nam. Đây là chủng hoang dại sinh tổng hợp ra
Dihydrochalcomycin và đã được phân lập, xác định cấu trúc hóa học bởi nhóm
nghiên cứu tại Hàn Quốc [19].
Kháng sinh Dihydrochalcomycin (C35H58O14) là kháng sinh thuộc nhóm
Macrolide 16C, được sử dụng trong điều trị nhiễm trùng đường hô hấp. Kháng sinh
Dihydrochalcomycin được tách chiết từ chủng xạ khuẩn Streptomycessp. KCTC
0041BP, có tác dụng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn Gr- (Gram âm) và Gr+ (Gram
dương) bằng cách liên kết vào tiểu phần 50S của ribosome, ngăn cản quá trình sinh
tổng hợp protein của vi khuẩn. Nhiều nhà khoa học đã và đang quan tâm nghiên
cứu về loại kháng sinh này bởi nhiều ưu điểm vượt trội của nó như ít độc, dung nạp
tốt, thải trừ nhanh, có hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh và đặc biệt chưa xuất hiện
hiện tượng kháng thuốc.

Nguyễn Hoài Linh

1

Lớp 11-02


Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

Các nhóm nghiên cứu trên thế giới xác định toàn bộ nhóm gen của xạ khuẩn
này. Toàn bộ nhóm gen tham gia sinh tổng hợp có chuỗi trình tự là 75.5kb và có

khoảng 23 ORF chứa thông tin di truyền và mã hóa của các gen tham gia con đường
tổng hợpDihydrochalcomycin: gerB, gerM1, gerN, gerR, gerP1, gerP2, gerG, gerE,
gerD, gerF, gerM2, gerP3, gerH, gerK1, gerM3, gerT1, gerA, gerS1, gerS2, gerS3,
gerS4, gerS5, gerY, gerT2, gerK2. Hiện nay, đã có một số gen được nghiên cứu
chứng minh chức năng của chúng là: gerT1, gerT2, gerK1, gerF, gerR, gerM2,
gerM1 [1], [4], [5], [13].
Trong 31 gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp kháng sinh
Dihydrochalcomycin, gen gerMIII có chức năng mã hóa tổng hợp enzyme 2- Omethyltransferase.Enzyme2-O-methyltransferase (GerMIII) cùng với 3 - Omethyltransferase (GerMII) sẽ xúc tác phản ứng methyl hóa nhóm -OH tại vị trí C2,
C3 tạo gốc đường D-mycinose.
Gen gerMIII đã có khóa luận tốt nghiệp “Nghiên cứu tạo đột biến gen mã hóa
cho enzyme 2 - O-methyltransferaza (gen GerM3 ) bằng phương pháp tiếp hợp trên
xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC0041BP’’ - Ngô Văn Luân (2013). Sau khi đã đột
biến gen gerMIII và đã được chứng minh bằng sàng lọc trên môi trường có bổ sung
kháng sinh Apramycin và Neomycin tạo chủng đột biến có trao đổi chéo đơn và
chủng có trao đổi chéo kép. Tuy nhiên mới bước đầu sàng lọc chủng đột biến có
trao đổi kép làm mất gen ger MII. Để chứng minh đột biến mất gen ger MII và làm
rõ hơn chức năng của gen ger MII, năm 2014 khóa luận tối nghiệp “Bước đầu
nghiên cứu tách chiết và kiếm tra sản phẩm kháng sinh của chủng xạ khuẩn đột
biến gen ger MII từ chủng Streptomyces sp. KCTC 0041BP ban đầu” - Nguyễn Thị
Hà (2014).
Tuy nhiên mới bước đầu tách chiết và phân tích một lượng nhỏ sản phẩm
kháng sinh từ chủng xạ khuẩn đột biến.Vì vậy nhóm nghiên cứu thực hiện đề tài :
“Nghiên cứutách chiếtvà phân tích cấu trúc kháng sinh thu được từ chủng xạ
khuẩn Steptomyces sp. KCTC0041BP sau khi đã đột biến mất gen ger MIII”.
Mục tiêu đề tài:

Nguyễn Hoài Linh

2

Lớp 11-02


Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

- Tách chiết và thử hoạt tính kháng sinh thô của chủng xạ khuẩn Streptomyces
sp. KCTC 0041BP đã đột biến mất gen gerMIII
- Phân tích cấu trúc kháng sinh thu được từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.
KCTC 0041BP.
Nội dung thực hiện:
- Tách kháng sinh thô bằng phương pháp quay cô chân không.
- Xác định hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khoanh giấy lọc.
- Xác định hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp chạy sắc ký bản mỏng TLC.
- Nghiên cứu tách và tinh sạch kháng sinh bằng Prep-TLC(Preparative-TLC).
- Phân tích kháng sinh bằng phương pháp sắc ký lỏng kết hợp phối khổ ( LCMass) và phương pháp ESI-Mass.
- Xây dựng quy trình tinh sạch kháng sinh thô trong phòng thí nghiệm.

Nguyễn Hoài Linh

3

Lớp 11-02


Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Tổng quan về kháng sinh.

1.1.1. Lịch sử về kháng sinh.
Năm 1928, nhà sinh vật học người Anh Alexander Fleming trong khi nghiên
cứu tụ cầu ông nhận thấy xung quanh khuẩn lạc mốc xanh nhiễm vào hộp petri nuôi
tụ cầu tạo thành vòng vô khuẩn.Hiện tượng kì lạ này đã được Fleming nghiên cứu,
phân lập thuần khiết và xác định được mốc xanh đó là Penicillium notatum – một
chủng tạo penicillin.
Năm 1938, Fleming nhận được thư của hai nhà khoa học từ trường Đại học
Oxford là Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey, với lời đề nghị được hợp tác
với ông để tiếp tục thực hiện công trình nghiên cứu về penicillin và họ đã thử
nghiệm thành công penicillin trên chuột vào 1940.
Năm 1941, nhóm đã chọn được loại nấm Penicillium ưu việt nhất là chủng
Penicillum chrysogenium, chế ra loại penicillin có hoạt tính cao hơn cả triệu lần
penicillin do Fleming tìm thấy lần đầu năm 1928.
Năm 1945, Fleming được giải thưởng Nobel về y học cùng với Ernst Boris
Chain và Howard Walter Florey.
Một số kháng sinh khác : sulfornamid được Gerhard Domard (Đức) tìm ra vào
năm 1932 và streptomycin được Selman Waksman và Albert Schat tìm ra vào năm
1934. Sau này đặc biệt ở hai thập kỷ cuối của thế kỷ XX, công nghệ sinh học và hóa
dược phát triển mạnh, người ta đã tìm ra được rất nhiều loại kháng sinh mới. Ngày
nay con người biết được khoảng 8000 chất kháng sinh khác nhau có nguồn gốc từ
nấm mốc, xạ khuẩn và vi khuẩn, 100 loại được dùng trong Y khoa và Thú y.
1.1.2. Định nghĩa về kháng sinh.
Thời kì vàng son của kháng sinh bắt đầu từ khi sản xuất penicillin để dùng
trong lâm sàng (1941). Khi đó người ta đã định nghĩa :" Kháng sinh là những sản
phẩm trao đổi chất tự nhiên được các vi sinh vật tiết ra (vi khuẩn, vi nấm), có tác
dụng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật khác", theo
Waksman1942.

Nguyễn Hoài Linh

4

Lớp 11-02


Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

Tuy nhiên, với sự phát triển của khoa học, người ta có thể tổng hợp, bán tổng
hợp các kháng sinh tự nhiên (chloramphenicol); tổng hợp nhân tạo các chất có tính
kháng sinh: sulfamid, quinolon hay chiết xuất từ vi sinh vật những chất diệt được tế
bào ung thư (actinomycin). Vì thế định nghĩa kháng sinh đã được thay đổi: “Kháng
sinh là tất cả các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp với nồng độ rất
thấp có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự phát triển hoặc tiêu diệt đối với các vi sinh
vật gây bệnh, đồng thời không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên con người, động
vật và thực vật bằng con đường cung cấp chung”[3].
Để biểu thị độ lớn giá trị hoạt tính sinh học của kháng sinh trong 1 ml dung
dịch (đơn vị/ml) hay 1 mg chế phẩm (đơn vị/mg), thường dùng đơn vị kháng sinh.
Đơn vị kháng sinh là lượng kháng sinh tối thiểu hoà tan trong một thể tích môi
trường xác định, có tác dụng ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật kiểm định trong thời
gian xác định[3]. Đơn vị kháng sinh quốc tế là UI, ví dụ 1 UI penicillin = 0,6 µg,
còn 1 UI streptomycin = 1,0 µg (Hopwood, 2007).
1.1.3. Phân loại kháng sinh.
Việc phân loại nhằm khái quát một cách có hệ thống danh mục các CKS do
việc tìm ra các CKS ngày càng nhiều. Nhờ đó tiết kiệm thời gian khi nghiên cứu các
CKS mới về cấu trúc hoá học, cơ chế tác dụng và khả năng ứng dụng trong công tác
chữa bệnh.
Có thể phân loại kháng sinh dựa trên nhiều phương diện như phổ tác dụng, cơ
chế tác dụng, nguồn gốc, con đường sinh tổng hợp hay cấu trúc hóa học. Tuy nhiên,
phân loại theo cấu trúc hóa học là phương pháp khoa học nhất, đưa ra một cái nhìn

tổng quát nhất đối với các nhóm kháng sinh.
Theo cấu trúc hóa học, kháng sinh được phân thành 9 nhóm chính [3]:
- Nhóm 1: Các kháng sinh cacbonhydrate
- Nhóm 2: Các lactonemacrolide
- Nhóm 3: Các kháng sinh quinolone và dẫn xuất
- Nhóm 4: Các kháng sinh peptide và amino acid
- Nhóm 5: Các kháng sinh dị vòng chứa nitơ

Nguyễn Hoài Linh

5

Lớp 11-02


Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

- Nhóm 6: Các kháng sinh dị vòng chứa oxy
- Nhóm 7: Các kháng sinh mạch vòng no
- Nhóm 8: Các kháng sinh chứa nhân thơm
- Nhóm 9: Các kháng sinh mạch thẳng
1.1.4. Cơ chế tác dụng của kháng sinh.
Các kháng sinh tác dụng cơ bản qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp rất
khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh. Chúng liên kết vào các vị trí chính xác
hay các phân tử đích của tế bào vi sinh vật mà tạo ra các phản ứng trao đổi chất làm
ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh.
Các đích tác dụng đặc trưng cho từng nhóm kháng sinh, tuy nhiên trong nhiều
trường hợp người ta vẫn chưa biết được chính xác hết. Có 6 mức tác dụng khác
nhau đối với tế bào vi khuẩn hoặc nấm: tác dụng lên thành tế bào, tác dụng lên
màng nguyên sinh chất, tác dụng lên quá trình tổng hợp DNA, tác dụng lên quá

trình tổng hợp protein, tác dụng lên sự trao đổi chất hô hấp và cuối cùng là tác dụng
lên sự trao đổi chất trung gian [7].
1.1.4.1. Ức chế quá trình tổng hợp thành tế bào của vi khuẩn.
Các β-Lactam ngăn cản sự tổng hợp các mucopeptide, làm rối loạn quá trình
nhân lên của vi khuẩn. Khi có mặt kháng sinh, vi khuẩn có thể vẫn tiếp tục nhân lên
với vách không hoàn chỉnh hoặc không có vách nhưng chúng dễ bị tiêu diệt bởi
thực bào, nhân tố lý hóa học.
Xycloserin tác động bằng cách ngăn cản tập hợp các tetra và pentapeptide do
ức chế enzym tổng hợp D-alanin.
Bacitracin: thay đổi tính thẩm thấu chọn lọc của màng nguyên tương của vi khuẩn.
1.1.4.2. Ức chế chức năng của màng tế bào.
Thay đổi chức năng năng lượng, ảnh hưởng sự hô hấp tế bào: gramicidin,
sideromycin.
Kháng sinh gắn lên màng tế bào chất làm thay đổi cân bằng thẩm thấu của
màng tế bào như kháng sinh polypeptide: polymycin, colistin và kháng sinh chống
nấm nistatin.

Nguyễn Hoài Linh

6

Lớp 11-02


Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

1.1.4.3. Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein.
Nhóm aminoglycoside gắn với receptor trên tiểu phần 30S của ribosome, ngăn
cản phức hợp khởi đầu hoạt động bình thường, can thiệp tiếp cận tRNA làm cho
quá trình dịch mã không chính xác.

Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phần 50S của ribosome ức chế enzyme
peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide mới
thành lập.
Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phần 50S của ribosome làm
ngăn cản sự thành lập phức hợp đầu tiên để tổng hợp chuỗi polypeptide.
1.1.4.4. Ức chế quá trình tổng hợp nucleic acid.
Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã
tạo thành mRNA (RNA thông tin).
Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho hai mạch
đơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của DNA.
Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA(paminobenzonic acid) có tác dụng
cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp nucleic acid.
Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác có quá trình tạo nhân purine
làm ức chế quá trình tạo nucleic acid.
1.1.4.5. Ức chế quá trình trao đổi chất folate.
Folic acid là cơ sở cho sự tổng hợp methionine, purine và pyrimidine, từ đó
tổng hợp nên protein và các acid nucleic của vi khuẩn. Sulfamid và trimethoprim có
cấu trúc hoá học tương tựp-aminobenzoic acid (PABA) và folic acid. Khi sử dụng,
sulfamid đối kháng cạnh tranh với PABA một tiền chất để tổng hợp folic acid, sẽ
gây thiếu purine, nucleic acid. Trimethoprim ức chế dihydrofolate reductase ngăn
quá trình chuyển hóa dihydrofolate thành tetrahydrofolate (dạng hoạt động của folic
acid), làm cho sự hoạt động của tế bào bị rối loạn.
1.1.5. Các nghiên cứu gần đây về kháng sinh.
Những năm 1940 – 1959 được coi là thời kỳ hoàng kim của việc nghiên cứu CKS
với hàng loạt CKS mới liên tiếp được phát hiện như : gramixidin, tiroxidin do Rene

Nguyễn Hoài Linh

7

Lớp 11-02


Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

Jules Dobos phát hiện năm 1939, streptomycin do Waksman phát hiện năm 1941,
erythromycin do Gurre phát hiện năm 1952…Cùng với việc phát hiện ra các CKS mới,
công nghệ lên men sản xuất CKS cũng ra đời và dần được hoàn thiện [21].
Ngay từ những năm 1950, CKS đã được nghiên cứu sử dụng trong việc phòng
chống bệnh, kích thích sự tăng trưởng của động vật nuôi và cây trồng. CKS thu hút
được sự quan tâm của các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau trên thế giới.
Tốc độ tìm kiếm các CKS trong thời gian gần đây vẫn diễn ra nhanh chóng,
nhiều trung tâm nghiên cứu khoa học về y học, dược phẩm và nông nghiệp tại nhiều
nước trên thế giới vẫn liên tục phát triển được hàng loạt các CKS mới có giá trị ứng
dụng trong thực tiễn.
Năm 1999 một chất kháng sinh mới khác được phát hiện có tác dụng ngăn
chặn hiện tượng cholesterol, tăng sức đề kháng đối với các chất độc của chuột,
ngoài ra kháng sinh này còn có hoạt tính chống nấm gây bệnh mạnh. Đó là kháng
sinh loposomal HA – 92, được tách từ xạ khuẩn Streptomyces CDRLL – 312.
Năm 2003, nhiều nước trên thế giới vẫn tiếp tục phát hiện được hàng loạt các
CKS mới. Tại Nhật Bản, chất kháng sinh mới là yatakemycin đã được tách chiết từ
xạ khuẩn Streptomycessp. TP – A0356 bằng phương pháp sắc ký cột. CKS này có
khả năng kìm hãm sự phát triển của nấm Aspergillus fumigalus và Candida
albicans. Ngoài ra chất này còn có khả năng chống lại các tế bào ung thư [5].
Năm 2007, tại Hàn Quốc đã phân lập được loài xạ khuẩn Streptomyces sp.
C684 sinh CKS laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng
methicillin và các cầu khuẩn kháng vancomycin [28].
Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hỗ trợ của
nhiều ngành khoa học khác đã giúp cho việc tìm kiếm và ứng dụng CKS đạt được
những thành tựu rực rỡ. Để sản xuất CKS con người không chỉ tìm kiếm những

chủng vi sinh vật sinh CKS từ tự nhiên mà còn cải tạo chúng bằng nhiều phương
pháp như dùng kỹ thuật di truyền và công nghệ gen, gây đột biến định hướng, chọn
dòng gene sinh tổng hợp, tạo và dung hợp tế bào trần để tạo ra các chủng có hoạt

Nguyễn Hoài Linh

8

Lớp 11-02


Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

tính kháng sinh cao, đồng thời nhằm mục đích tìm kiếm các loại kháng sinh mới và
quý trong thời gian ngắn [10], [26]
1.2.

Tổng quan về xạ khuẩn Streptomyces.

1.2.1. Vai trò của xạ khuẩn trong tự nhiên .
Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc chủng vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất
rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí
cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được.
Theo Waskman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 - 2.400.000 mầm xạ
khuẩn, chiếm 9-45% tổng số VSV [22].
Sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường, chúng
có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8 - 7,5. Xạ khuẩn
có rất ít trong lớp đất kiềm hoặc axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số
lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm.
Trong quá trình trao đổi chất, xạ khuẩn còn có thể sinh ra các chất hữu cơ như

các loại vitamin nhóm B (B1, B2, B6, B12), một số acid hữu cơ như acid lactic,
acid acetic; acid amin như acid glutamic, metionin, tryptophan, lizin.
Một trong những đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình
thành chất kháng sinh, 60 - 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh
chất kháng sinh. Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế
giới thì có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra [3]. Trong số đó có trên 15% có nguồn
gốc từ các loại xạ khuẩn hiếm như Micromonospora Actinomadura, Actinoplanes,
Streptoverticillium, Streptosporangium…. Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm đã
cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học như gentamixin,
tobramixin, vancomixin, rosamixi.
Ngoài ra, xạ khuẩn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá nhiều hợp
chất trong đất, nước. Dùng để sản xuất nhiều enzym như proteaza amylaza,
xenluloza…một số axit amin và axit hữu cơ.
Một số xạ khuẩn có thể gây bệnh cho người, động vật. Các bệnh này được gọi
tên chung là Actinomycosis [11].

Nguyễn Hoài Linh

9

Lớp 11-02


Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

1.2.2. Giới thiệu về xạ khuẩn Streptomyces.
Chi Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao được Wakman và Henrici đặt
tên năm 1943 [27].
Đường kính sợi xạ khuẩn khoảng 1 - 10 µm, khuẩn lạc thường không lớn và
có đường kính khoảng 1 - 5 mm. Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào cơ chất.

Bề mặt khuẩn lạc thường được phủ bởi khuẩn ti khí sinh dạng nhung, dày hơn cơ
chất, đôi khi có tính kỵ nước.
Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử. Trên đầu sợi khí sinh
hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử. Cuống sinh bào tử có những hình
dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc, vòng ... Bào tử được hình
thành trên cuống sinh bào tử bằng hai phương pháp phân đoạn và cắt khúc. Bào tử
xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng 1,5 µm.
Màng bào tử có thể nhẵn, gai, khối u, nếp nhăn...tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và môi
trường nuôi cấy. Thường trên môi trường có nguồn đạm vô cơ và glucoza, các bào
tử biểu hiện các đặc điểm rất rõ.
Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh cũng rất khác nhau tùy theo nhóm
Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi khi nuôi cấy trên môi trường khác
nhau. Vì vậy mà ủy ban Quốc tế về phân loại xạ khuẩn ISP đã nêu ra các môi
trường chuẩn và phương pháp chung để phân loại nhóm VSV này.
Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn Gr (+),
hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ưu thường là 25-30ºC, pH tối ưu
6,5 - 8,0. Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn
ưa nhiệt và ưa lạnh). Chi xạ khuẩn này có khả năng tạo thành số lượng lớn các CKS
ức chế vi khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thư, virus và nguyên sinh động vật [23]
1.2.3. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn.
Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình
thành CKS. Trong số 8000 CKS hiện biết trên thế giới có trên 80% là có nguồn gốc
từ xạ khuẩn [3].

Nguyễn Hoài Linh

10

Lớp 11-02

Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

Một trong những tính chất của các CKS có nguồn gốc từ VSV nói chung và từ xạ
khuẩn nói riêng là có tác dụng chọn lọc. Mỗi CKS chỉ có tác dụng với một nhóm VSV
nhất định. Hầu hết CKS có nguồn gốc xạ khuẩn đều có phổ khángkhuẩn rộng. Khả
năng kháng khuẩn của các CKS là một đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn.
Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành CKS. Một số tác giả
cho rằng sự hình thành CKS là do cơ chế giúp cho VSV tồn tại trong môi trường tự
nhiên. Số khác cho rằng, sự hình thành CKS là do sự cạnh tranh trong môi trường
dinh dưỡng. Hầu hết các tác giả cho rằng kháng sinh là sản phẩm chuyển hóa thứ
cấp được hình thành vào cuối pha tích lũy thừa, đầu pha cân bằng của chu kỳ sinh
trưởng [14].
Mặc dù CKS có cấu trúc khác nhau và VSV sinh ra chúng cũng đa dạng,
nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất định.
- CKS được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thông qua một chuỗi
phản ứng enzym.
- CKS được hình thành từ hai hoặc ba chất chuyển hóa sơ cấp khác nhau.
- CKS được hình thành bằng con đường polyme hóa các chất chuyển hóa sơ
cấp, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác.
Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều CKS có
cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau. Quá trình sinh tổng hợp CKS phụ
thuộc vào cơ chế điều khiển đa gene, ngoài các gene chịu trách nhiệm tổng hợp
CKS, còn có cả các gene chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzym và
cofactor.
1.3.

Xạ khuẩn Streptomyces. sp KCTC 0041BP.

1.3.1. Đặc điểm nuôi cấy.

Năm 1996, chủng Streptomyces.spKCTC 0041BP có khả năng tạo CKS
Dihydrochalcomycin được Kim và cs phân lập tại Hàn Quốc. Đặc điểm nổi bật của
xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ
cuống bào tử khi hình thành bào tử). Hệ sợi mảnh, đường kính thay đổi trong
khoảng 0,2 - 2 µm.

Nguyễn Hoài Linh

11

Lớp 11-02


Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

Xạ khuẩn Streptomyces sp.KCTC 0041BP sinh sản vô tính bằng bào tử. Trên
đầu sợi khí sinh hình thành cuống bào tử và chuỗi bào tử. Cuống sinh bào tử có hình
thẳng hoặc lượn sóng (Rf - Rectiflexibiles). Bào tử được hình thành trên cuống sinh
bào tử bằng hai phương pháp phân đoạn và cắt khúc. Bào tử có hình bầudục, hình
lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng 1,5 µm. Bề mặt bào tử trơn nhẵn Sm
(Smooth). Màng bào tử có nếp nhăn trên môi trường ISP2.
Khuẩn lạc thường không lớn, có đường kính khoảng 1 - 5 mm. Khuẩn lạc rắn
chắc, mọc đâm sâu vào cơ chất. Bề mặt khuẩn lạc thường được bao phủ bởi khuẩn ti
khí sinh dạng nhung, dày (Hình 1). Nó có khả năng phát triển tốt trên môi trường
ISP1, ISP2, ISP4, Gause 2 và R2YE, đặc biệt là môi trường ISP2 và R2YE.

Hình 1.1. Khuẩn lạc của chủng Streptomyces sp. KCTC 0041BP trên
môi trường ISP2.

Nguyễn Hoài Linh

12

Lớp 11-02


Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

Hình 1.2. Hình dạng KTKS và KTCC của chủng Streptomyces sp. KCTC 0041BP
phóng đại (× 4.500-15.000).
1.3.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa.
Chủng Streptomyces sp. KCTC 0041BP có thể sinh trưởng trong dải nhiệt độ
25 - 32 °C, thích hợp nhất ở 28 – 30 °C và hoàn toàn không phát triển được ở 37 °C
hoặc cao hơn.
Chủng phát triển tốt ở khoảng pH = 6 ÷ 9. Ở pH< 6 hoặc pH > 9 thì chủng
phát triển kém hoặc không phát triển. Chủng Streptomyces sp. KCTC 0041BP hình
thành sắc tố melanin trên môi trường thạch tyrosine (ISP-7).
1.3.3. Khả năng kháng khuẩn với một số vi sinh vật kiểm định.
Xạ khuẩn Streptomyces sp.KCTC 0041BP sinh kháng sinh có khả năng ức chế
vi khuẩn Gr (+) và vi khuẩn Gr (-). Tuy nhiên, kháng sinh này có khả năng ức chế
cao hơn đối với vi khuẩn Gr (+). Điều này được giải thích bởi vi khuẩn Gr (-) có lớp
thành tế bào dày và nhiều lớp hơn so với vi khuẩn Gr (+), vì vậy chúng ít chịu ảnh
hưởng bởi kháng sinh hơn. Trong các vi khuẩn Gr+ được nghiên cứu, khả năng ức
chế vi sinh vật của xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC 0041BP lên vi khuẩn Bacillus
cereus là lớn nhất (D = 21,33 mm), tiếp theo là vi khuẩn Bacillus subtilis (D =
19,50 mm) [1].
1.3.4. Phân loại.
Khi đối chiếu với các khóa phân loại khác nhau, chủng Streptomycessp.KCTC
0041BP rất giống với loài Streptomyces bikiniensis. Theo khóa phân loại của
Waksman năm 1961, loài này thuộc nhóm cuống sinh bào tử thẳng, không phân

nhánh; trong môi trường đạm đều có sắc tố màu nâu sẫm tới màu đen, melanin
dương tính; khuẩn ty khí sinh từ màu trắng tới màu xám.
1.4.

Xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC0041 bp đã được đột biến GerMIII.
Gen GerMIII thuộc nhóm gen tham gia vào con đường sinh tổng hợp kháng

sinh Dihydrochalcomycin từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC 0041BP đã
được đăng bản quyền trên gen bank với mã số AY 118081.

Nguyễn Hoài Linh

13

Lớp 11-02


Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

Trong 31 gen tham gia vào con đường sinh tổng hợp, gen GerMIII được dự
đoán với chức năng là mã hóa, tổng hợp enzyme 2-O-methyltransferase. Enzyme 2O-methyltransferase (GerMIII) cùng với 3-O-methyltransferase (GerMIII) sẽ xúc
tác phản ứng methyl hóa nhóm –OH tại vị trí C2, C3 tạo gốc đường D-mycinose.
Theo kết quả nghiên cứu, hoạt tính và chức năng của gen GerMIII đã được
chứng minh bằng phương pháp đột biến gen (tiếp hợp gen) để tạo chủng xạ khuẩn
đột biến không có chứa gen GerMIII.
Tiếp tục phân tích đánh giá sản phẩm trung gian từ chủng xạ khuẩn đột biến
gen GerMIII, tách chiết và tinh sạch hợp chất có hoạt tính sinh học mới.
1.5.

Tổng quan về kháng sinh dyhidrochalcomycin.

Macrolide là kháng sinh được sử dụng để chống nhiều vi khuẩn là cầu khuẩn

Gr+ hiếu khí và kị khí, tác dụng tốt với vi khuẩn nội bào (Mycoplasma, Rickettsia,
Chlamydia), điều trị nhiễm trùng gây ra bởi Haemophilus influenzae, nhiễm trùng
đường hô hấp và nhiễm trùng mô mềm … Kháng sinh macrolide là sản phẩm tự
nhiên chiết xuất từ xạ khuẩn Streptomyces, có phổ kháng khuẩn rộng hơn so với
kháng sinh penicillin, có khả năng thấm sâu vào ổ mủ nên là một chọn lựa tốt cho
phòng ngừa nhiễm khuẩn hô hấp, có tác dụng hiệp lực với polypeptide, sulfamid.
Nhóm macrolide có độc tính rất thấp, thường chỉ sốt, nôn mửa, dị ứng da.
Kháng sinh macrolide cấu tạo gồm một vòng lactone lớn (có từ 12-16 nguyên
tử C) gắn với các phân tử đường bằng các liên kết glycosidic. Dựa vào số nguyên tử
C trong vòng lactone, kháng sinh macrolide được chia thành 3 nhóm: macrolide
12C, 14C và 16C. Trong đó, kháng sinh nhóm macrolide 16C có vai tròquan trọng
nhất với nhiều ưu điểm vượt trội hơn so với macrolide l2C và 14C vì kháng sinh
nhóm này chưa xuất hiện hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn [22].
Có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng kháng sinh thuộc nhóm macrolide có khả
năng ức chế cạnh tranh trung tâm hoạt động của enzyme petidyltransferase của tế
bào vi khuẩn như carbomycin, spiramycin, chalcomycin....nhưng duy nhất chỉ có
kháng sinh macrolide l6C có thể liên kết trực tiếp với trung tâm hoạt động của
enzyme peptyltransferase và từ đó bất hoạt quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn.

Nguyễn Hoài Linh

14

Lớp 11-02


Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

Với nhiều ưu điểm như vậy kháng sinh nhóm macrolide 16C là nhóm kháng
sinh đang được nỗ lực nghiên cứu bởi rất nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới với
mục tiêu chính là: tạo ra các kháng sinh không bị ảnh hưởng bởi cơ chế kháng thuốc
của vi khuẩn và từ đó nghiên cứu và phát triển nhóm kháng sinh polyketide
synthase (PKS) thế hệ mới.
1.5.1. Cấu trúc của dyhidrochalcomycin.
Dihydrochalcomycin có công thức phân tử là (C35H58O14), tan trong Aceton,
Benzen, Chloroform, Ethylacetat, Methanol, không tan trong nước và n – Hexan
(Kim và cs, 1996).
Dihydrochalcomycin thuộc nhóm kháng sinh macrolide 16C, là sản phẩm trao
đổi chất bậc 2 của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC 0041BP, được tách chiết
lần đầu tiên và xác định cấu trúc năm 1996.

Hình 1.3.Cấu trúc của Dihydrochalcomycin [19].
Về cấu trúc, kháng sinh dihydrochalcomycin cấu tạo gồm 3 thành phần chính:
Trung tâm là macrocylic lacton, phần trung tâm được gắn với 2 gốc đường khử là
D-mycinose và D-chalcose lần lượt tại vị trí C20 và C5 thông qua cầu nối Oglycosydic. Hai gốc đường này tham gia tạo tính tan và tính gắn với đích tác dụng
thuốc có vai trò vô cùng quan trọng trong việc thể hiện hoạt tính sinh học trong các
chất chứa nó và trong kháng sinh này (Ta Thi Thu Thuy và cs, 2008) [14].
1.5.2. Vai trò và hoạt tính sinh học.

Nguyễn Hoài Linh

15

Lớp 11-02


Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

Qua nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng, kháng sinh dihydrochalcomycin đã biểu
hiện hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh có thể ức chế và tiêu diệt cả vi khuẩn Gr- và
Gr+. Đã phân lập thành công chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC 0041BP tạo
ra chất kháng sinh này, đồng thời cấu trúc hóa học của kháng sinh này cũng được
xác định bởi nhóm nghiên cứu tại Hàn Quốc, kháng sinh này được xác định là chất
dẫn xuất của kháng sinh chalcomycin đã được xác định trước đó bởi nhóm nghiên
cứu khác [15],[20]. Mặc dù toàn bộ cơ chế tác dụng của dihydrochalcomycin chưa
được nghiên cứu hoàn toàn đầy đủ nhưng một số nghiên cứu đã khẳng định hoạt
tính sinh học của dihydrochalcomycin hoàn toàn tương tự như hoạt tính của kháng
sinh chalcomycin và mycinamycin [18].
Nghiên cứu về cấu trúc tinh thể phóng xạ để xác định cơ chế hoạt động của
kháng sinh, nhóm của Hansen đã chứng minh được cấu trúc nhân macrocyclic
lactone của kháng sinh này hình thành phức hệ và gắn với tiểu phần lớn của
ribosome vi khuẩn tại điểm tách chuỗi polypeptide ra khỏi tâm hoạt động của
enzyme peptidyltransferase. Từ đó kháng sinh này có hoạt tính ức chế sinh tổng hợp
protein của vi khuẩn [15], [19].
1.5.3. Các nghiên cứu về dihydrochalcomycin.
1.5.3.1. Lập thư viện gen và giải trình tự nhóm gen sinh tổng hợp
dyhidrochalcomycin.
Qua thời gian nghiên cứu cấu trúc dihydrochalcomycin, kháng sinh này được
xác định cấu trúc bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR – Nuclear
Magnetic Resonance) và được phân loại thuộc nhóm kháng sinh PKS loại I. Nhóm
nghiên cứu đã tách và lập được thư viện gen, tách được nhóm gen tham gia vào con
đường sinh tổng hợp dihydrochalcomycin từ chủng xạ khuẩn Streptomyces
sp.KCTC 0041BP. Toàn bộ nhóm gen tham gia sinh tổng hợp có chuỗi trình tự là
75,5kb đã được xác định trong đó có chứa 23 ORFs chứa thông tin di truyền, mã
hóa cho các gen tham gia con đường sinh tổng hợp dihydrochalcomycin. Đồng thời
các gen này cũng được dự đoán cấu trúc (Bảng 1.1). Trình tự các gen này đã được
đăng bản quyền trên GenBank với mã số AY118081 [11].

Nguyễn Hoài Linh

16

Lớp 11-02


Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

Bảng 1.1. Dự đoán chức năng của các gen ORFs trong nhóm gen sinh tổng hợp
dihydrochalcomycin.
Tên

Số amino acid

Ger1
Ger2
Ger3
Ger4
GerA
GerB
GerMI
GerN
GerR
GerPI
GerPII
GerG
GerD
GerE
GerF

GerMII
GerPII
GerH
GerK
GerMII
GerTI
GerR
GerS1

608
684
331
308
334
381
271
485
823
401
407
274
323
295
196
255
420
73
326
403
418

280
439

GerS2
GerS3
GerS4
GerS5
GerY
GerTII
GerK2
Ger29

1976
3734
1618
1357
404
425
248
580

Dự đoán chức năng trong nhóm gen sinh tổng hợp
Transferase protein
Hypothetical protein
Hypothetical protein
Conserved hypothetical protein
Oxidoreductase
3,4-dehydratase like protein
O-methyltransferase
NDP-4,6- dideoxyhexose 3,4-enoyl reductase

Beta glucosidase
Cytochrome P450 hydroxylase
Cytochrome P450 hydroxylase
Type II thioesterase
dTDP-glucose 4,6- dehydratase
Alpha-D-glucose - 1-phosphate thymidyltransferase
NDP-hexose 3-epimerase
3 - O-methyltransferase
Cytochrome P450
Ferredoxin
dTDP-hexose 4-ketoreductase
2 - O-methyltransferase
Glycosyltransferase
rRNA methyltransferase
PKS[LM(KSQ,AT,ACP)M1(KS,AT,KR,ACP),
M2(KS,AT,DH,KR,ACP)]
PKS [M3(KS,AT,DH,KR,ACP)]
PKS[M4(KS,AT, KR*, ACP), M5(KS, AT, DH, ER, KR, CP]
PKS [M6(KS,AT,KR,ACP)]
PKS [M7(KS,AT,ACP), TEI]
NDP - hexose-3,4-isomerase
Glycosyltransferase
Post-PKS reductase
Putative transcriptional regulator

1.5.3.2. Tách và dự đoán chức năng nhóm gen tham gia sinh tổng hợp đường Dchalcose và D-mycinose.
Các gen tham gia sinh tổng hợp đường khử D-chalcose và D-mycinose đã
được xác định và giải trình tự từ pGERI-5 cosmid. So sánh độ tương đồng về trình
Nguyễn Hoài Linh

17

Lớp 11-02


Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp

tự các chuỗi amino acid của các gen trong cosmid với trình tự amino acid của các
gen đã biết trên ngân hàng gen thế giới GenBank. Các gen tham gia sinh tổng hợp 2
gốc đường khử này đã được dự đoán cấu trúc, từ đó dự đoán được con đường sinh
tổng hợp gốc đường này.
Trong con đường sinh tổng hợp, dTDP-4-keto-6-deoxyglucose là gốc đường
trung gian cho quá trình tổng hợp cả 2 gốc đường chalcose và mycinose, được tổng
hợp từ glucose-1-phosphate với hoạt tính xúc tác của các enzyme GerD có chức
năng là dTDP-glucose synthase và GerE có chức năng là dTDP-glucose 4,6dehydartase.
Quá trình sinh tổng hợp đường D-chalcose bắt đầu từ gốc đường trung gian 4keto-6-deoxyglucose với hoạt tính xúc tác của các enzyme 3,4-isomerase (GerY) để
tạo đồng phân, tiếp theo là phản ứng loại nhóm OH bởi 3,4-dehydratase (GerB) và
phản ứng khử của enzyme 3,4-enoylreductase (GerN) để tạo ra 3-keto-4,6dideoxyglucose. Sản phẩm tại vị trí 3-keto sẽđược chuyển thành 3'-OH nhờ
enzyme 3-ketoreductase (GerKII) tạo dTDP-4,6-dideoxyglucose. Tiếp đó, gốc
đường này được chuyển đến nối với nhân macrolide tại vị trí C5 nhờ hoạt tính xúc
tác của chalcosylglycosyltransferase (GerTII) và cuối cùng methyl hóa nhóm -OH
tại vị trí C3 nhờ hoạt động của enzyme O-methyltransferase (GerMI) tạo gốc đường
D-chalcose.
Gốc đường D-mycinose đã được nghiên cứu trong cấu trúc kháng sinh tylosin
vì vậy con đường sinh tổng hợp đã được chứng minh trong các nghiên cứu về kháng
sinh này [2]. Phản ứng sinh tổng hợp được bắt đầu từ dTDP-4-keto-6-deoxyglucose
để tạo thành dTDP-D-allose với xúc tác của hai enzyme 3-epimerase (GerF) và 4ketoreductase (GerKI). Tiếp theo là phản ứng gắn gốc đường allose vào nhân
macrolacton tại vị trí C20 nhờ hoạt tính xúc tác của glycosyltransferase (GerTI).Cuối
cùng hai enzyme 2-O-methyltransferase (GerMIII) và 3-O-methyltransferase
(GerMII) xúc tác phản ứng methyl hóa nhóm OH tại vị trí C2, C3 tạo gốc đường Dmycinose.

Nguyễn Hoài Linh

18

Lớp 11-02