Nghiên cứu tăng khả năng sinh tổng hợp kháng sinh DIHYDROCHAL COMYCIN của chủng xạ khuẩn STREPTOMYCES SP KCTC 0041BP

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------ -- --

------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
“ NGHIÊN CỨU TĂNG KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
KHÁNG SINH DIHYDROCHALCOMYCIN CỦA CHỦNG XẠ
KHUẨN STREPTOMYCES SP.KCTC 0041BP”

Giáo viên hướng dẫn
Sinh viên thực hiện
Lớp
Khóa

: ThS. Nguyễn Thị Ngọc Anh
: Nguyễn Thị Hoa
: KSCNSH – 1102
: 18

Hà Nội – 2015


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP-2015

NGUYỄN THỊ HOA- LỚP1102

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Nguyễn
Thị Ngọc Anh đã tận tình hướng dẫn, truyền thụ cho em những kiến thức chuyên
môn vô cùng quý báu cũng như lòng nhiệt tình trong suốt quá trình hoàn thành
khóa luận tốt nghiệp của mình.
Em xin chân thành cảm ơn TS. Tạ Thị Thu Thủy – Chủ nhiệm khoa Công
Nghệ Sinh Học – Viện Đại Học Mở Hà Nội, cùng toàn thể các thầy cô giáo, anh
chị kĩ thuật viên các bạn sinh viên Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử đã luôn
bên cạnh động viên, khích lệ, ủng hộ em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Em xin cảm ơn các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ Sinh học – Viện
Đại Học Mở Hà Nội đã tận tình dạy dỗ cho em những kiến thức cơ bản đồng thời
đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận này.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình , bạn bè, những người
đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và
nghiên cứu.
Do thời gian và khả năng của bản thân còn hạn chế, vì vậy bài khóa luận
của em không tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận được sự chỉ bảo của
thầy cô và sự đóng góp ý kiến của các bạn để khóa luận của em được đầy đủ và
hoàn chỉnh hơn.
Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn !
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2015.
Sinh viên
Nguyễn Thị Hoa


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP-2015

NGUYỄN THỊ HOA- LỚP1102

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU…………………………………………………………………..................... ….1

PHẦN 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 3
1.1

TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH ...................................................................... 3

1.1.1. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH ......................................................... 3
1.1.2. ĐỊNH NGHĨA VỀ KHÁNG SINH ...................................................................... 3
1.1.3. PHÂN LOẠI KHÁNG SINH ............................................................................... 4
1.1.4. CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA KHÁNG SINH ....................................................... 5
1.1.5. CÁC NGHIÊN CỨU GẦN ĐÂY VỀ KHÁNG SINH ......................................... 7
1.1.6. KHÁNG SINH DYHYDROCHALCOMYCIN .................................................. 8
1.2.

ĐẠI CƯƠNG VỀ XẠ KHUẨN ......................................................................... 15

1.2.1. CÁC ĐẶC ĐIỂM CHUNG VÀ VAI TR̉ CỦA XẠ KHUẨN TRONG TỰ
NHIÊN................................................................................................................ 15
1.2.2. CẤU TẠO CỦA XẠ KHUẨN ........................................................................... 17
1.2.3. SỰ H̀ NH THÀNH CHẤT KHÁNG SINH Ở XẠ KHUẨN............................... 20
1.2.4. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA
XẠ KHUẨN ....................................................................................................... 21
1.2.5. CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES SP.KCTC4001 BP ........................ 22
1.3.

ĐỘT BIẾN TĂNG KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH Ở VI SINH VẬT....... 24

1.3.1. MỤC ĐÍCH ........................................................................................................ 24
1.3.2. ĐỘT BIẾN NHÂN TẠO BẰNG TÁC NHÂN VẬT LÍ .................................... 24
1.3.3. ĐỘT BIẾN NHÂN TẠO BẰNG TÁC NHÂN HÓA HỌC ............................... 25
1.3.4. MỘT SỐ THÀNH TỰU ỨNG DỤNG ĐỘT BIẾN GEN TĂNG KHẢ NĂNG

SINH KHÁNG SINH Ở VI SINH VẬT ............................................................ 25
PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 27
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .................................................................................... 27
2.1.1. CÁC CHỦNG GIỐNG VI SINH VẬT................................................................ 27
2.1.2. HÓA CHẤT, DỤN CỤ VÀ THIẾT BỊ ................................................................ 27
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................... 29
2.2.1. PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY CÁC CHỦNG VI SINH VẬT ............................ 29
2.2.2. PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN GIỐNG .............................................................. 31
2.2.3. PHƯƠNG PHÁP GÂY ĐỘT BIẾN XẠ KHUẨN BẰNG TIA UV .................... 32
2.2.4. PHƯƠNG PHÁP ĐỘT BIẾN XẠ KHUẨN BẰNG HÓA CHẤT MNNG ......... 34


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP-2015

NGUYỄN THỊ HOA- LỚP1102

2.2.5. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG SINH ............................ 37
2.2.6. TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG SINH ................................................................ 39
PHẦN 3. KẾT QUẢ ...................................................................................................... 41
3.1. NGHIÊN CỨU TẠO VÀ LỰA CHỌN CHỦNG ĐỘT BIẾN CÓ KHẢ NĂNG
SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH CAO BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỘT BIẾN ( XỬ
LÝ UV/ HÓA CHẤT... .......... ............................................................................................41
3.1.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ĐỘT BIẾN BẰNG UV.....................41
3.1.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ĐỘT BIẾN TĂNG KHẢ NĂNG
SINH KHÁNG SINH BẰNG XỬ LÝ VỚI MNNG....................... ....... ....................42
3.2. SO SÁNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES
SP.KCTC0041 BP TỰ NHIÊN VỚI ĐỘT BIẾN.......................................................... 43
3.2.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC ...................................................................................... 43
3.2.2. KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH ..................................................................... 45
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................................... 48

4.1. KẾT LUẬN ............................................................................................................. 48
4.2. ĐỀ XUẤT ................................................................................................................ 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 49


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP-2015

NGUYỄN THỊ HOA- LỚP1102

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN

Axit Deoxyribonucleic

ARN

Axit Ribonucleic

CKS

Chất kháng sinh

D

Đường kính trung bình vòng vô khuẩn tính theo milimet

Gram (-)

Gram dương

Gram (+)

Gram âm

H

Giờ

HSCC

Hệ sợi cơ chất

HSKS

Hế sợi khí sinh

ISP2

The International Streptomyces Project (Chương trình
Streptomyces quốc tế)

LB

Luria Bertani

MNNG

N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin

NST

Nhiễm sắc thể

Nu

Nucleotit

S

Độ lệch thực nghiệm hiệu chỉnh (độ lệch chuẩn)

v/p

Vòng/phút

VSV

Vi sinh vật

XK

Xạ khuẩn


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP-2015

NGUYỄN THỊ HOA- LỚP1102

DANH MỤC CÁC BẢNG
STT

Bảng 1.1

Nội dung
Dự đoán chức năng của các gen ORFs trong nhóm gen sinh
tổng hợp dihydrochalcomycin

Bảng 2.1 Dụng cụ, thiết bị dùng trong đề tài

Trang
11
28

Ảnh hưởng của thời gian chiếu UV đến khả năng sinh trưởng
Bảng 3.1 và sinh kháng sinh của chủng Steptomyces spKCTC 0041 BP

41

tự nhiên.
Bảng 3.2

Ảnh hưởng của nồng độ MNNG đến khả năng sinh trưởng và
sinh kháng sinh của chủng Steptomyces sp KCTC 0041 BP

43


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP-2015

NGUYỄN THỊ HOA- LỚP1102

DANH MỤC CÁC HÌNH
STT

Nội dung

Trang

Hình 1.1

Cơ chế tác dụng của kháng sinh

5

Hình 1.2

Công thức cấu tạo hóa học của Dihydrochalcomycin

9

Hình 1.3
Hình 1.4
Hình 1.5
Hình 1.6
Hình 1.7

Dự đoán con đường sinh tổng hợp gốc đường khử và bước
cuối hoàn thành cấu trúc kháng sinh Dihydrochalcomycin
Khuẩn lạc, khuẩn ty và bào tử xạ khuẩn
Khuẩn lạc của chủng Streptomyces sp. KCTC 0041 BP trên
môi trường ISP2

Hình ảnh bào tử của chủng Streptomyces sp. KCTC 0041 BP
Hình dạng KTKS và KTCC của chủng Streptomyces sp.
KCTC 0041 BP

13
18
23
23
24

Hình 2.1

Tác dụng gây đột biến của tia UV

33

Hình 2.2

Công thức cấu tạo của MNNG

35

Hình 2.3

Tác dụng gây đột biến của MNNG

35

Hình 3.1
Hình 3.2

Hình 3.3
Hình 3.4

Đĩa xạ khuẩn sau đột biến và đĩa sàng lọc xạ khuẩn sau đột
biến
Khuẩn lạc của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041
BP đột biến
Màu sắc dịch nuôi của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.
KCTC 0041 BP đột biến
Kết quả thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đục lỗ
thạch của chủng U-M1(1) và chủng U-M8(2)

42
44
45
46

Kết quả thử hoạt tính kháng sinh bằng khoanh giấy lọc của
Hình 3.5

chủng Streptomyces sp KCTC 0041 BP tự nhiên(1), chủng
U-M1(2), chủng U-M8(3), methanol(4)

46


MỞ ĐẦU
Thuốc kháng sinh là một trong những đột phá lớn của y học hiện đại đầu thế kỉ
20. Nhờ loại thần dược này mà nhiều căn bệnh do vi sinh vật gây ra đã có thể kiểm
soát được một cách hữu hiệu. Tuy nhiên, ngày nay y học hiện đang rất lo ngại trước

sự gia tăng không ngừng của hiện tượng kháng thuốc của nhiều loài vi sinh vật.
Những loại kháng sinh thời gian trước được xem như vị cứu tinh thì ngày nay đã tỏ
ra không còn hiệu quả chữa trị nữa. Kho tàng thuốc kháng sinh ngày càng trở nên
hạn hẹp và khan hiếm hơn. Tốc độ phát triển của các loại kháng sinh kháng các loại
vi sinh vật gây bệnh mới cũng không thể bắt kịp sức tăng trưởng và biến đổi của các
mầm bệnh kháng thuốc. Hiện tượng kháng kháng sinh đã trở thành vấn đề mang
tính toàn cầu và đặc biệt nổi trội ở các nước đang phát triển. Với gánh nặng của các
bệnh nhiễm khuẩn và những chi phí có liên quan trong việc chữa trị đã trở thành
gánh nặng lớn của các bệnh nhân. Chính vì vậy, song sng với việc sử dụng thuốc
kháng sinh một cách hợp lý của người bệnh thì việc nghiên cứu, phát triển và ứng
dụng sản xuất các loại kháng sinh mới là nghĩa vụ và trách nghiệm của các nhà
khoa học trên thế giới.
Từ những phương pháp tạo ra các kháng sinh tổng hợp và bán tổng hợp thì
công nghệ vi sinh sinh tổng hợp kháng sinh tiếp tục khẳng định vai trò của mình.
Trong hơn 10.000 chất kháng sinh được tìm ra thì có khoảng 2.000 chất do thực vật
tạo ra, khoảng 8.000 chất là kháng sinh do vi sinh vật tổng hợp, trong đó xạ khuẩn
tổng hợp trên 80%.Kháng sinh Dihydrochalcomycin cũng là một kháng sinh mới,
được xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC 0041BP sản xuất và hiện nay đang được
các nhà khoa học hết sức quan tâm.
Kháng sinh Dihydrochalcomycin là kháng sinh thuộc nhóm Macrolide, có 16
cacbon, là kháng sinh ngoại bào tử từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC
0041BP. Kháng sinh này có hoạt tính chống lại các vi khuẩn Gram (+) rất mạnh, có
vai trò ứng dụng quan trọng trong các nghiên cứu lâm sàng, có ưu điểm vượt trội vs
các kháng sinh Macrolide 12 và 14 cacbon do chưa có hiện tượng kháng thuốc của
vi khuẩn cũng như các phản ứng phụ đối với đối tượng điều trị.

1


Tuy nhiên, khả năng sinh kháng sinh của chủng xạ khuẩn tự nhiên này chưa

cao, rất cần có các biện pháp cải thiện năng suất nhằm thu được hàm lượng sinh
kháng sinh cao hơn. Vì vậy nhóm nghiên cứu thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tăng
khả năng sinh tổng hợp kháng sinh Dihydrochalcomycin của chủng xạ khuẩn
Streptomyces sp. KCTC 0041BP ”
* Mục tiêu nghiên cứu:
Nghiên cứu tạo chủng chủng Streptomyces sp. KCTC0041 BP đột biến gen
bằng phương pháp chiếu tia UV và sử dụng hóa chất MNNG từ đó chọn ra các
chủng có hoạt tính kháng sinh cao, có nhiều ứng dụng thực tế.
* Nội dung nghiên cứu:
- Tạo chủng đột biến bằng phương pháp chiếu trực tiếp tia UV lên tế bào xạ
khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041 BP tự nhiên.
- Sử dụng chủng đột biến UV tiếp tục làm tăng khả năng sinh kháng sinh bằng
hóa chất MNNG.
- Sàng lọc và lựa chọn chủng đột biến có khả năng sinh kháng sinh cao hơn
chủng tự nhiên.
- So sánh đặc điểm sinh học và khả năng sinh kháng sinh giữa chủng tự nhiên
và chủng đột biến

2


PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về kháng sinh
1.1.1. Lịch sử về kháng sinh
Năm 1928, nhà sinh vật học người Anh, Alexander Fleming trong khi nghiên
cứu tụ cầu ống thấy xung quanh khuẩn lạc mốc xanh nhiễm vào hộp petri nuôi tụ
cầu tạo thành vòng vô khuẩn. Hiện tượng kì lạ này đã được Fleming nghiên cứu,
phân lập thuần khiết và xác định được mốc xanh đó là Penicillium Notatum – một
chủng tạo Penicillin.
Năm 1938, Fleming nhận được thư của hai nhà khoa học từ trường Đại học

Oxford là Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey, với lời đề nghị được hợp tác
với ông để tiếp tục thực hiện công trình nghiên cứu về penicillin và họ đã thử
nghiệm thành công penicillin trên chuột vào 1940.
Năm 1941, nhóm đã chọn được loại nấm Penicillium ưu việt nhất là chủng
Penicillum chrysogenium, chế ra loại penicillin có hoạt tính cao hơn cả triệu lần
penicillin do Fleming tìm thấy lần đầu năm 1928.
Năm 1945, Fleming được giải thưởng Nobel về y học cùng với Ernst Boris
Chain và Howard Walter Florey.
Một số kháng sinh khác: sulfornamid được Gerhard Domard (Đức) tìm ra vào
năm 1932 và streptomycin được Selman Waksman và Albert Schat tìm ra vào năm
1934. Sau này đặc biệt ở hai thập kỷ cuối của thế kỷ XX, công nghệ sinh học và hóa
dược phát triển mạnh, người ta đã tìm ra được rất nhiều loại kháng sinh mới. Ngày
nay con người biết được khoảng 8000 chất kháng sinh khác nhau có nguồn gốc từ
nấm mốc, xạ khuẩn và vi khuẩn, 100 loại được dùng trong Y khoa và Thú y.
1.1.2. Định nghĩa về kháng sinh
Thời kì vàng son của kháng sinh bắt đầu từ khi sản xuất penicillin để dùng
trong lâm sàng (1941). Khi đó người ta đã định nghĩa:" Kháng sinh là những sản
phẩm trao đổi chất tự nhiên được các vi sinh vật tiết ra (vi khuẩn, vi nấm), có tác
dụng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật khác", theo
Waksman1942.

3


Tuy nhiên, với sự phát triển của khoa học, người ta có thể tổng hợp, bán tổng
hợp các kháng sinh tự nhiên (chloramphenicol); tổng hợp nhân tạo các chất có tính
kháng sinh: sulfamid, quinolon hay chiết xuất từ vi sinh vật những chất diệt được tế
bào ung thư (actinomycin). Vì thế định nghĩa kháng sinh đã được thay đổi: “Kháng
sinh là tất cả các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp với nồng độ rất
thấp có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự phát triển hoặc tiêu diệt đối với các vi sinh

vật gây bệnh, đồng thời không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên con người, động
vật và thực vật bằng con đường cung cấp chung”[3].
Để biểu thị độ lớn giá trị hoạt tính sinh học của kháng sinh trong 1 ml dung
dịch (đơn vị/ml) hay 1 mg chế phẩm (đơn vị/mg), thường dùng đơn vị kháng sinh.
Đơn vị kháng sinh là lượng kháng sinh tối thiểu hoà tan trong một thể tích môi
trường xác định, có tác dụng ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật kiểm định trong thời
gian xác định[3]. Đơn vị kháng sinh quốc tế là UI, ví dụ 1 UI penicillin = 0,6 µg,
còn 1 UI streptomycin = 1,0 µg (Hopwood, 2007).

1.1.3. Phân loại kháng sinh
Việc phân loại nhằm khái quát một cách có hệ thống danh mục các CKS do
việc tìm ra các CKS ngày càng nhiều. Nhờ đó tiết kiệm thời gian khi nghiên cứu các
CKS mới về cấu trúc hoá học, cơ chế tác dụng và khả năng ứng dụng trong công tác
chữa bệnh.
Có thể phân loại kháng sinh dựa trên nhiều phương diện như phổ tác dụng, cơ
chế tác dụng, nguồn gốc, con đường sinh tổng hợp hay cấu trúc hóa học. Tuy nhiên,
phân loại theo cấu trúc hóa học là phương pháp khoa học nhất, đưa ra một cái nhìn
tổng quát nhất đối với các nhóm kháng sinh.
Theo cấu trúc hóa học, kháng sinh được phân thành 9 nhóm chính [3]:
- Nhóm 1: Các kháng sinh cacbonhydrate
- Nhóm 2: Các lactonemacrolide
- Nhóm 3: Các kháng sinh quinolone và dẫn xuất
- Nhóm 4: Các kháng sinh peptide và amino acid
- Nhóm 5: Các kháng sinh dị vòng chứa nitơ
- Nhóm 6: Các kháng sinh dị vòng chứa oxy
- Nhóm 7: Các kháng sinh mạch vòng no
4


- Nhóm 8: Các kháng sinh chứa nhân thơm

- Nhóm 9: Các kháng sinh mạch thẳng

1.1.4. Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Các kháng sinh tác dụng cơ bản qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp rất
khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh. Chúng liên kết vào các vị trí chính xác
hay các phân tử đích của tế bào vi sinh vật mà tạo ra các phản ứng trao đổi chất làm
ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh.
Các đích tác dụng đặc trưng cho từng nhóm kháng sinh, tuy nhiên trong nhiều
trường hợp người ta vẫn chưa biết được chính xác hết. Có 6 mức tác dụng khác
nhau đối với tế bào vi khuẩn hoặc nấm: tác dụng lên thành tế bào, tác dụng lên
màng nguyên sinh chất, tác dụng lên quá trình tổng hợp DNA, tác dụng lên quá
trình tổng hợp protein, tác dụng lên sự trao đổi chất hô hấp và cuối cùng là tác dụng
lên sự trao đổi chất trung gian.

Hình 1.1: Cơ chế tác dụng của kháng sinh
1.1.4.1. Ức chế quá trình tổng hợp thành tế bào của vi khuẩn
- Các β-Lactam ngăn cản sự tổng hợp các mucopeptide, làm rối loạn quá trình
nhân lên của vi khuẩn. Khi có mặt kháng sinh, vi khuẩn có thể vẫn tiếp tục nhân lên
với vách không hoàn chỉnh hoặc không có vách nhưng chúng dễ bị tiêu diệt bởi
thực bào, nhân tố lý hóa học.
5


- Xycloserin tác động bằng cách ngăn cản tập hợp các tetra và pentapeptide do
ức chế enzym tổng hợp D-alanin.
- Bacitracin: thay đổi tính thẩm thấu chọn lọc của màng nguyên tương của vi
khuẩn.

1.1.4.2. Ức chế chức năng của màng tế bào
-

Thay đổi chức năng năng lượng, ảnh hưởng sự hô hấp tế bào: gramicidin,

sideromycin.
-

Kháng sinh gắn lên màng tế bào chất làm thay đổi cân bằng thẩm thấu của

màng tế bào như kháng sinh polypeptide: polymycin, colistin và kháng sinh chống
nấm nistatin.

1.1.4.3. Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein
-

Nhóm aminoglycoside gắn với receptor trên tiểu phần 30S của ribosome,

ngăn cản phức hợp khởi đầu hoạt động bình thường, can thiệp tiếp cận tRNA làm
cho quá trình dịch mã không chính xác.
-

Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phần 50S của ribosome ức chế enzyme

peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide mới
thành lập.
-

Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phần 50S của ribosome làm

ngăn cản sự thành lập phức hợp đầu tiên để tổng hợp chuỗi polypeptide.

1.1.4.4. Ức chế quá trình tổng hợp nucleic acid
-

Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã

tạo thành mRNA (RNA thông tin).
-

Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho hai mạch

đơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của DNA.
-

Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA(paminobenzonic acid) có tác dụng

cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp nucleic acid.
-

Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác có quá trình tạo nhân

purine làm ức chế quá trình tạo nucleic acid.

1.1.4.5. Ức chế quá trình trao đổi chất folate
Folic acid là cơ sở cho sự tổng hợp methionine, purine và pyrimidine, từ đó
tổng hợp nên protein và các acid nucleic của vi khuẩn. Sulfamid và trimethoprim có
6


cấu trúc hoá học tương tựp-aminobenzoic acid (PABA) và folic acid. Khi sử dụng,
sulfamid đối kháng cạnh tranh với PABA một tiền chất để tổng hợp folic acid, sẽ

gây thiếu purine, nucleic acid. Trimethoprim ức chế dihydrofolate reductase ngăn
quá trình chuyển hóa dihydrofolate thành tetrahydrofolate (dạng hoạt động của folic
acid), làm cho sự hoạt động của tế bào bị rối loạn.

1.1.5. Các nghiên cứu gần đây về kháng sinh
Những năm 1940 – 1959 được coi là thời kỳ hoàng kim của việc nghiên cứu
CKS với hàng loạt CKS mới liên tiếp được phát hiện như : gramixidin, tiroxidin do
Rene Jules Dobos phát hiện năm 1939, streptomycin do Waksman phát hiện năm
1941, erythromycin do Gurre phát hiện năm 1952…Cùng với việc phát hiện ra các
CKS mới, công nghệ lên men sản xuất CKS cũng ra đời và dần được hoàn thiện
[21].
Ngay từ những năm 1950, CKS đã được nghiên cứu sử dụng trong việc
phòng chống bệnh, kích thích sự tăng trưởng của động vật nuôi và cây trồng. CKS
thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau trên
thế giới.
Tốc độ tìm kiếm các CKS trong thời gian gần đây vẫn diễn ra nhanh chóng,
nhiều trung tâm nghiên cứu khoa học về y học, dược phẩm và nông nghiệp tại nhiều
nước trên thế giới vẫn liên tục phát triển được hàng loạt các CKS mới có giá trị ứng
dụng trong thực tiễn.
Năm 1999 một chất kháng sinh mới khác được phát hiện có tác dụng ngăn
chặn hiện tượng cholesterol, tăng sức đề kháng đối với các chất độc của chuột,
ngoài ra kháng sinh này còn có hoạt tính chống nấm gây bệnh mạnh. Đó là kháng
sinh loposomal HA – 92, được tách từ xạ khuẩn Streptomyces CDRLL – 312.
Năm 2003, nhiều nước trên thế giới vẫn tiếp tục phát hiện được hàng loạt các
CKS mới. Tại Nhật Bản, chất kháng sinh mới là yatakemycin đã được tách chiết từ
xạ khuẩn Streptomycessp. TP – A0356 bằng phương pháp sắc ký cột. CKS này có
khả năng kìm hãm sự phát triển của nấm Aspergillus fumigalus và Candida
albicans. Ngoài ra chất này còn có khả năng chống lại các tế bào ung thư [5].

7

Năm 2007, tại Hàn Quốc đã phân lập được loài xạ khuẩn Streptomyces sp.
C684 sinh CKS laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng
methicillin và các cầu khuẩn kháng vancomycin [28].
Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hỗ trợ
của nhiều ngành khoa học khác đã giúp cho việc tìm kiếm và ứng dụng CKS đạt
được những thành tựu rực rỡ. Để sản xuất CKS con người không chỉ tìm kiếm
những chủng vi sinh vật sinh CKS từ tự nhiên mà còn cải tạo chúng bằng nhiều
phương pháp như dùng kỹ thuật di truyền và công nghệ gen, gây đột biến định
hướng, chọn dòng gene sinh tổng hợp, tạo và dung hợp tế bào trần để tạo ra các
chủng có hoạt tính kháng sinh cao, đồng thời nhằm mục đích tìm kiếm các loại
kháng sinh mới và quý trong thời gian ngắn [10], [26].
1.1.6. Kháng sinh Dihydrochalcomycin
Macrolide là kháng sinh được sử dụng để chống nhiều vi khuẩn là cầu khuẩn
Gr+ hiếu khí và kị khí, tác dụng tốt với vi khuẩn nội bào ( Mycoplasma, Rickettsia,
Chlamydia), điều trị nhiễm trùng gây ra bởi Haemophilus influenzae, nhiễm trùng
đường hô hấp và nhiễm trùng mô mềm … Kháng sinh macrolide là sản phẩm tự
nhiên chiết xuất từ xạ khuẩn Streptomyces, có phổ kháng khuẩn rộng hơn so với
\kháng sinh penicillin, có khả năng thâm sâu vào ổ mủ nên là một chọn lựa tốt cho
\phòng ngừa nhiễm khuẩn hô hấp, có tác dụng hiệp lực với polypeptide, sulfamid.
Nhóm macrolide có độc tính rất thấp, thường chỉ sốt, nôn mửa, dị ứng da.
Kháng sinh macrolide cấu tạo gồm một vòng lacton lớn (có từ 12-16 nguyên
tử C) gắn với các phân tử đường bằng các liên kết glycosid. Dựa vào số nguyên tử
C trong vòng lacton, kháng sinh macrolide được chia thành 3 nhóm: macrolide 12C,
14C và 16C.Trong đó, kháng sinh nhóm macrolide 16C có vai trò quan trọng nhất
với nhiều ưu điểm vượt trội hơn so với macrolide l2C và 14C vì kháng sinh nhóm
này chưa xuất hiện hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn[20].
Có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng kháng sinh thuộc nhóm macrolide có khả
năng ức chế cạnh tranh trung tâm hoạt động của enzyme petidyltransferase của tế

bào vi khuẩn như carbomycin, spiramycin, chalcomycin....nhưng duy nhất chỉ có
kháng sinh macrolide l6C có thể liên kết trực tiếp với trung tâm hoạt động của

8


enzyme peptidyltransferase và từ đó bất hoạt quá trình tổng hợp protein của vi
khuẩn.
Với nhiều ưu điểm như vậy kháng sinh nhóm macrolide 16C là nhóm kháng
sinh đang được nỗ lực nghiên cứu bởi rất nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới với
mục tiêu chính là: tạo ra các kháng sinh không bị ảnh hưởng bởi cơ chế kháng thuốc
của vi khuẩn và từ đó nghiên cứu và phát triển nhóm kháng sinh polyketide
synthase (PKS) thế hệ mới.
1.1.6.1. Cấu trúc của Dihydrochalcomycin
Dihydrochalcomycin thuộc nhóm kháng sinh macrolide 16C, là sản phẩm
trao đổi bậc 2 của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC 0041BP, được tách chiết
lần đầu tiên và xác định cấu trúc năm 1996.
- Về cấu tạo, Dihydrochalcomycin có công thức phân tử Macrolide 16C, là sản
phẩm axeton, benzen, clorofom, etylaxetat và metalnol, không tan trong nước và nhexan.
- Về cấu trúc, Dihydrochalcomycin được tạo ra bởi 3 phần cấu trúc liên kết
với nhau trong đó phần trung tâm hoạt động là Macrocyclic lacton, phần này sau đó
được gắn với 2 gốc đường khử là D-Mycinose và D-Chalcose tại vị trí lần lượt là C20

và C5 thông qua cầu nối O-glycosydic.

Hình 1.2: Cấu trúc của Dihydrochalcomycin
1.1.6.2. Vai trò và hoạt tính sinh học
Qua nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng, kháng sinh dihydrochalcomycin đã
biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn rất mạnh có thể ức chế và tiêu diệt cả vi khuẩn Gr9

và Gr+. Chủng xạ khuẩn tạo ra dihydrochalcomycin đã được phân lập, đồng thời cấu
trúc hóa học của chúng cũng được xác định bởi nhóm nghiên cứu tại Hàn Quốc,
kháng sinh này được xác định là chất dẫn của kháng sinh chalcomycin đã được xác
định trước đó bởi nhóm nghiên cứu khác [14], [19]. Mặc dù toàn bộ cơ chế tác dụng
của dihydrochalcomycin chưa được nghiên cứu hoàn toàn đầy đủ nhưng một số
nghiên cứu đã khẳng định hoạt tính sinh học của dihydrochalcomycin hoàn toàn
tương tự như hoạt tính của kháng sinh chalcomycin và mycinamycin[17].
Nghiên cứu về cấu trúc tinh thể phóng xạ để xác định cơ chế hoạt động của
kháng sinh, nhóm của Hansen đã chứng minh được cấu trúc nhân macrocyclic
lacton của kháng sinh này hình thành phức hệ và gắn với tiểu phần lớn của
ribosome vi khuẩn tại điểm tách chuỗi polypeptide ra khỏi tâm hoạt động của
enzyme peptidyltransferase. Từ đó kháng sinh này có hoạt tính ức chế sinh tổng hợp
protein của vi khuẩn [18], [22].
1.1.6.3.

Các nghiên cứu về Dihydrochalcomycin

a) Lập thư viện gen và giải trình tự nhóm gen sinh tổng Dihydrochalcomycin

Qua thời gian nghiên cứu cấu trúc dihydrochalcomycin, kháng sinh này được
xác định cấu trúc bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR – Nuclear
Magnetic Resonance) và được phân loại thuộc nhóm kháng sinh PKS loại I. Nhóm
nghiên cứu đã tách và lập được thư viện gen, tách được nhóm gen tham gia vào con
đường sinh tổng hợp dihydrochalcomycin từ chủng xạ khuẩn Streptomyces
sp.KCTC 0041BP. Toàn bộ nhóm gen tham gia sinh tổng hợp có chuỗi trình tự là
75,5kb đã được xác định trong đó có chứa 23 ORFs chứa thông tin di truyền, mã
hóa cho các gen tham gia con đường sinh tổng hợp dihydrochalcomycin. Đồng thời
các gen này cũng được dự đoán cấu trúc (Bảng 1.1). Trình tự các gen này đã được
đăng bản quyền trên GenBank với mã số AY118081 [16].

10


Bảng 1.1: Dự đoán chức năng của các gen ORFs trong nhóm gen sinh tổng hợp
dihydrochalcomycin
Số amino
acid
608
Ger1
Ger2
684
331
Ger3
Ger4
308
GerA
334
GerB
381
GerMI
271
GerN
485
GerR
823
GerPI
401
GerPII
407

GerG
274
GerD
323
GerE
295
GerF
196
GerMII
255
GerPIII
420
GerH
73
GerKI
326
403
GerMIII
418
GerTI
280
GerR
439
GerS1
Tên

GerS2
GerS3
GerS4
GerS5

GerY
GerTII
GerK2
Ger29

1976
3734
1618
1357
404
425
248
580

Dự đoán chức năng trong nhóm gen sinh tổng hợp
Transferase protein
Hypothetical protein
Hypothetical protein
Conserved hypothetical protein
Oxidoreductase
3,4-dehydratase like protein
O-methyltransferase
NDP-4,6- dideoxyhexose 3,4-enoyl reductase
Beta glucosidase
Cytochrome P450 hydroxylase
Cytochrome P450 hydroxylase
Type II thioesterase
dTDP-glucose 4,6- dehydratase
Alpha-D-glucose-1-phosphate thymidyltransferase
NDP-hexose 3-epimerase

3-O-methyltransferase
Cytochrome P450
Ferredoxin
dTDP-hexose 4-ketoreductase
2-O-methyltransferase
Glycosyltransferase
rRNA methyltransferase
PKS[LM(KSQ,AT,ACP)M1(KS,AT,KR,ACP),
M2(KS,AT,DH,KR,ACP)]
PKS [M3(KS,AT,DH,KR,ACP)]
PKS[M4(KS,AT,KR*,ACP),M5(KS,AT,DH,ER,KR,ACP)]
PKS [M6(KS,AT,KR,ACP)]
PKS [M7(KS,AT,ACP), TEI]
NDP-hexose-3,4-isomerase
Glycosyltransferase
Post-PKS reductase
Putative transcriptional regulator

11


b) Tách và dự đoán chức năng nhóm gen tham gia sinh tổng hợp đường
D-chalcose và D-mycinose
Các gen tham gia sinh tổng hợp đường khử D-chalcose và D-mycinose đã
được xác định và giải trình tự từ pGERI-5 cosmid. So sánh độ tương đồng về trình
tự các chuỗi amino acid của các gen trong cosmid với trình tự amino acid của các
gen đã biết trên ngân hàng gen thế giới GenBank. Các gen tham gia sinh tổng hợp 2
gốc đường khử này đã được dự đoán cấu trúc, từ đó dự đoán được con đường sinh
tổng hợp gốc đường này.
Trong con đường sinh tổng hợp, dTDP-4-keto-6-deoxyglucose là gốc đường

trung gian cho quá trình tổng hợp cả 2 gốc đường chalcose và mycinose, được tổng
hợp từ glucose-1-phosphate với hoạt tính xúc tác của các enzyme GerD có chức
năng là dTDP-glucose synthase và GerE có chức năng là dTDP-glucose 4,6dehydartase.
Quá trình sinh tổng hợp đường D-chalcose bắt đầu từ gốc đường trung gian
4-keto-6-deoxyglucose với hoạt tính xúc tác của các enzyme 3,4-isomerase (GerY)
để tạo đồng phân, tiếp theo là phản ứng loại nhóm OH bởi 3,4-dehydratase (GerB)
và phản ứng khử của enzyme 3,4-enoylreductase (GerN) để tạo ra 3-keto-4,6dideoxyglucose. Sản phẩm tại vị trí 3-keto sẽđược chuyển thành 3'-OH nhờ
enzyme 3-ketoreductase (GerKII) tạo dTDP-4,6-dideoxyglucose. Tiếp đó, gốc
đường này được chuyển đến nối với nhân macrolidetại vị trí C5nhờ hoạt tính xúc tác
của chalcosylglycosyltransferase (GerTII) và cuối cùng methyl hóa nhóm -OH tại vị
trí C3 nhờ hoạt động của enzyme O-methyltransferase (GerMI) tạo gốc đường Dchalcose.
Gốc đường D-mycinose đã được nghiên cứu trong cấu trúc kháng sinh
tylosin vì vậy con đường sinh tổng hợp đã được chứng minh trong các nghiên cứu
về kháng sinh này [15]. Phản ứng sinh tổng hợp được bắt đầu từ dTDP-4-keto-6deoxyglucose để tạo thành dTDP-D-allose với xúc tác của hai enzyme 3-epimerase
(GerF) và 4-ketoreductase (GerKI). Tiếp theo là phản ứng gắn gốc đường allose vào
nhân macrolacton tại vị trí C20 nhờ hoạt tính xúc tác của glycosyltransferase
(GerTI). Cuối cùng hai enzyme 2-O-methyltransferase (GerMIII) và 3-O-

12


methyltransferase (GerMII) xúc tác phản ứng methyl hóa nhóm OH tại vị trí C2, C3
tạo gốc đường D-mycinose.
Bước cuối cùng hoàn thành cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin với hoạt
động của enzyme hydroxylase (GerPI)xúc tác gắn nhóm OH vào vị trí C8, và
enzyme epoxidase (GerPII) với hoạt tính tạo vòng lacton tại vị trí C12-C13 của vòng
dihydromacrolacton [25].

Hình 1.3: Dự đoán con đường sinh tổng hợp gốc đường khử và bước cuối hoàn
thành cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin [25]

c) Sinh tổng hợp dTDP-6-deoxy-β-D-allose, chứng minh hoạt tính của
dTDP-4-keto-6-deoxyglucose reductase (GerKI).
Trong nghiên cứu này nhóm đã chứng minh hoạt tính và vai trò của gen
GerKI trong sinh tổng hợp D-mycinose. GerKI mã hóa cho enzyme 4ketoreductase, tham gia phản ứng xúc tác chuyển gốc đường 4-keto-6-deoxyglucose
thành 6-deoxy-D-allose. Cùng với kết quả này sản phẩm được tạo thành đó là
dTDP-6-deoxy-D-allose đã được xác định cấu trúc bằng phân tích NMR và HPLC
(sắc ký lỏng hiệu năng cao). Kết quả nghiên cứu này có ý nghĩa khoa học rất quan
trọng bởi vì đây là đường khử hoàn toàn mới lần đầu tiên được tổng hợp nhờ phản

13


ứng enzyme invitro và nhờ đó đã tìm ra phương pháp sinh tổng hợp một gốc đường
quan trọng [25].
d) Chứng minh hoạt tính của gen glycosyltransferases GerTI và GerTII
bằng phương pháp gây đột biến gen
Theo kết quả nghiên cứu, hoạt tính và chức năng của gen GerTI và GerTII đã
được sáng tỏ bằng phương pháp đột biến gen để tạo chủng đột biến không có chứa
GerTI và GerTII. Chức năng của gen này là mã hóa cho sinh tổng hợp enzyme
glycosyltransferase. Các enzyme này tham gia vận chuyển và gắn gốc đường
mycinose và chalcose vào nhân macrolacton. Phân tích đánh giá sản phẩm trung
gian từ chủng đột biến, nhóm nghiên cứu còn chứng minh được bước cuối cùng của
quá trình hình thành kháng sinh và thu được hợp chất có hoạt tính sinh học mới
[25].
e) Nghiên cứu biểu hiện gen GerF trong nhóm gen sinh tổng hợp gốc
đường khử dTDP-6-deoxy-D-allose
Kết quả nghiên cứu biểu hiện gen GerF trong tế bào vi khuẩn E. coli
BL21(DE3)đã chứng minh hoạt tính của gen GerF mã hóa cho enzyme dTDP-4keto-6-deoxyglucose 3-epimerase, xúc tác tạo đồng phân quang học chuyển vị trí OH ở vị trí C3 của đường dTDP-4-keto-6-deoxyglucose, tham gia vào chuyển hóa
đường dTDP-4-keto-6-deoxyglucose thành đường dTDP-6-deoxy-D-allose trong
quá trình sinh tổng hợp đường khử D-mycinose trong cấu trúc kháng sinh

dihydrochalcomycin. Kết quả enzyme GerF được biểu hiện thành công trên E. coli
BL21 (DE3) có khối lượng phân tử là 38kDa, đồng thời xác định được điều kiện
thích hợp để biểu hiện gen GerF và enzyme này được sinh ra ở dạng tan là ở 26oC,
trong 8h, nồng độ IPTG 10mmol[8]..
f) Nghiên cứu gây đột biến gen gerMI mã hóa cho enzyme Omethyltransferase của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.KCTC 0041BP bằng
phương pháp tiếp hợp.
Trong kết quả nghiên cứu này đã chứng minh được chức năng của gen gerMI
trong con đường sinh tổng hợp kháng sinh dihydrochalcomycin của chủng xạ khuẩn
Streptomyces sp. KCTC 0041BP. Chức năng của gen gerMI là mã hóa sinh tổng
hợp enzyme O-methyltransferase, xúc tác phản ứng methyl hóa nhóm -OH tại vị trí
14


C3 của đường dTDP-4,6-dideoxyglucose tạo gốc đường D-chalcose trong cấu trúc
kháng sinh dihydrochalcomycin. Kết quả tạo được vector đột biến gen gerMI trong
vector pKC1139 và biến nạp thành công vào tế bào E. coli ET 12567/pUZ8002[14].
g) Nghiên cứu tạo đột biến gen mã hóa cho enzyme 2-O-methyltransferaza
(gen gerMIII) bằng phương pháp tiếp hợp trên xạ khuẩn Streptomyces sp.
KCTC 0041BP
Kết quả đã tiếp hợp chuyển gen Plasmid pKC 1139 chứa đoạn gen đột biến
UM3 – NeoR – DM3 vào tế bào xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC 0041 hoang dại
trên môi trường MS agar thành công. Sàng lọc được các chủng xạ khuẩn trên môi
trường R2YE có bổ sung kháng sinh Neo và Apr để tạo chủng có trao đổi chéo đơn
và trao đổi chéo kép.
Kết quả tạo được vector đột biến gen gerMIII trong vector pKC1139 và biến
nạp thành công vào tế bào E. coli ET 12567/pUZ8002[13].
i) Bước đầu nghiên cứu tách chiết và kiểm tra sản phẩm kháng sinh của
chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC 0041BP
Nhóm đã bước đầu tách chiết thành công AND tổng số của chủng xạ khuẩn
Streptomyces sp. KCTC 0041BP sau đột biến. Đã sàng lọc được các chủng M3-110, M3-8-21, M3-3-13 có xảy ra quá trình trao đổi chéo kép làm mất gen gerMIII

bằng phản ứng nhân gen PCR thành công với các cặp mồi đặc hiệu. Giải trình tự
gen chứng minh chủng xạ khuẩn đã đột biến gen ger MII thành công. Bước đầu
chứng minh được chức năng của gen ger MIII trong con đường sinh tổng hợp kháng
sinh dihydrochalcomycin của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC 0041BP.
1.2.

Đại cương về xạ khuẩn

1.2.1. Các đặc điểm chung và vai trò của xạ khuẩn trong tự nhiên.
Xạ khuẩn là một nhóm VSV rất đa dạng trong đó đa số sinh trưởng hiếu khí
và tạo khuẩn ty phân nhánh tương tự như nấm. Xạ khuẩn có danh pháp khoa học là:
Actinobacteria, tên tiếng Anh là: Actinomycetes - bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp
“actys” (tia) và “mykes” (nấm). Ban đầu xạ khuẩn được coi là nấm nhỏ vì chúng
sinh trưởng giống với nấm. Mạng lưới phân nhánh của thể sợi thường phát triển ở
cả bề mặt cơ chất rắn (tạo thành hệ sợi khí sinh) lẫn bên trong tạo thành hệ sợi cơ
chất (HSCC).
15


Đa số xạ khuẩn sinh bào tử, bào tử rất khác nhau vềhình dạng và kích thước.
Phần lớn xạ khuẩn sống tự do, hoại sinh và phân bố rộng rãi trong đất, nướcvà xác
thực vật. Xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng về mặt sinh thái trong vòng tuần hoàn tự
nhiên. Chúng phân hủy và sử dụng các chất hữu cơ khó phân hủy như axithumic
trong đất. Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng hòa tan lignin và phân hủy các hợp
chất liên quan đến lignin bằng cách sinh các enzym thủy phân xenlulozơ và
hemixenlulozơ và các peroxidaza ngoại bào,[28], [25].
Trong quá trình trao đổi chất, xạ khuẩn còn có thể sinh ra các chất hữu cơ
như các loại vitamin nhóm B (B1, B2, B6 B12), một số axit hữu cơ như axit lactic,
axitaxetic,axit amin như axit glutamic, metionin, tryptophan, lizin.
Về mặt phân loại, lớp xạ khuẩn có 5 phân lớp, 6 bộ trong đó bộ được nhắc

đến nhiềunhất (có giá trị trong y học và kinh tế) bộ Actinomycetales. Bộ
Actinomycetales có 13 dưới bộ, 42 họ và khoảng 200 chi, [34].
Xạ khuẩn thường được chia thành hai loại: Streptomyces và không phải
Streptomyces (non-Streptomyces). Chi xạ khuẩn được biết nhiều nhất là
Streptomyces, với khoảng 500 loài, tất cả đều có G-C cao (69 ÷ 73 %) trong ADN.
Streptomyces đặc biệt nhiều trong đất nơi chúng phân hủy hoại sinh rất nhiều phức
các chất hữu cơ bằng các enzym ngoại bào. Theo Waskman thì trong một gam đất
có khoảng 29.000 ÷ 2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm 9-45% tổng số
VSV,[31].Thực tế, mùi mốc đặc trưng của nhiều loại đất liên quan đến sự sản sinh
hợp chất hữu cơ dễ bay hơi gọi là geosmin,[38].
Một trong những đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình
thành CKS, 60 ÷ 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh CKS. Cho
tới nay khoảng hơn 8000 CKS hiện biết trên thế giới thì có tới 80% là do xạ khuẩn
sinh ra,[14]. Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc từ các loại xạ khuẩn hiếm như
Micromonospora,Actinomadura,

Actinoplanes,

Streptoverticillium,

Streptosporangium… Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm đã cung cấp nhiều
CKS có giá trị đang dùng trong y học như Gentamixin, Tobramixin, Vancomixin,
Rosamixi.
Một số xạ khuẩn có thể gây bệnh cho người, động vật. Các bệnh này được
gọi tên chung là Actinomycosis,[11].
16


1.2.2. Cấu tạo xạ khuẩn.
Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram (+), toàn bộ cơ thể

chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất,
nguyên sinh chất, chất nhân.
+ Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác
dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp: lớp
ngoài cùng dày khoảng 60 ÷ 120 Å, khi già có thể đạt tới 150 ÷ 200Å, lớp giữa rắn
chắc, dày khoảng 50Å, lớp trong dày khoảng 50Å. Các lớp này chủ yếu cấu tạo từ
các lớp glucopeptitbao gồm các gốc N -axetyl glucozamin liên kết với N-axetyl
muramic. Khi xử lý bằng lysozym, thành tế bào bị phá huỷ tạo thành thể sinh chất
(protoplast), cấu trúc sợi cũng bị phá huỷ khi xử lý tế bào với hỗn hợp este clorofom và các dung môi hoà tan lipit khác. Nguyên nhân là do lớp ngoài cùng có
cấu tạo chủ yếu bằng lipit (thành HSKS có nhiều lipit hơn so với HSCC) khác với
nấm. Thành tế bào xạ khuẩn không chứa xenlulozơ và kitin nhưng chứa nhiều
enzym tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua
màng tế bào,[16], [23], [26], [29].
+ Căn cứ vào thành phần hoá học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 4
nhóm chính,[14], [8].
-

Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6 diaminopimelic (L
- ADP) và glyxin. Chi Streptomyces thuộc nhóm này.

-

Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 diaminopimelic (m - ADP) và glyxin.

-

Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 diaminopimelic.

-

Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 diaminopimelic, arabinozơ và galactozơ.
+ Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu tạo

chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein. Chúng có vai trò đặc biệt quan
trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn.
+ Nguyên sinh chất và nhân tế bào xạ khuẩn không có khác biệt lớn so với tế
bào vi khuẩn. Tuy nhiên, điểm khác biệt của xạ khuẩn so với các sinh vật prokaryot
17


ở chỗ chúng có tỷ lệ G-C rất cao trong ADN, thường lớn hơn 55%, trong khi đó ở vi
khuẩn tỷ lệ này chỉ là 25 ÷ 45%,[10].
Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram (+) nên ngoài yếu tố di truyền trong
nhiễm sắc thể (NST) còn có các yếu tố di truyền ngoài NST, chúng có thể tự nhân
lên mà được Lederberg gọi là plasmid. Các plasmid đem lại cho tế bào nhiều đặc
tính chọn lọc quý giá như: có thêm khả năng phân giải một số hợp chất, chống chịu
với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyển gen, sản xuất các CKS
trong đất và môi trường tuyển chọn,[13].
Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng là
đường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác. Nguồn nitơ hữu cơ là protein,
pepton, cao ngô, cao nấm men. Nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối amôn…Khả năng
đồng hoá các chất ở các loài hay chủng xạ khuẩn khác nhau là khác nhau.

Hình1.4. Khuẩn lạc, khuẩn ty và bào tử xạ khuẩn.
(ảnh từ trái qua phải)
1.2.2.1. Khuẩn lạc
Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và
không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử),[9].
Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng da, dạng vôi, dạng
nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, da

cam, vàng, nâu, xám, trắng…tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh.
Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tuỳ loài và tuỳ vào
điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm… Đường kính mỗi
khuẩn lạc chỉ chừng 0,52 mm nhưng cũng có khuẩn lạc đạt tới đường kính 1cm
18