Nghiên cứu thu nhận chế phẩm vi sinh vật tổng hợp enzym pectinase, cellulase và ứng dụng trong sản xuất cà phê nhân theo phương pháp lên men

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LÊ HỒNG PHÚ

NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM
VI SINH VẬT TỔNG HỢP ENZYME
PECTINASE, CELLULASE VÀ ỨNG DỤNG
TRONG SẢN XUẤT CÀ PHÊ NHÂN THEO
PHƢƠNG PHÁP LÊN MEN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

TP.HCM - 2012


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LÊ HỒNG PHÚ

NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM
VI SINH VẬT TỔNG HỢP ENZYME
PECTINASE, CELLULASE VÀ ỨNG DỤNG
TRONG SẢN XUẤT CÀ PHÊ NHÂN THEO
PHƢƠNG PHÁP LÊN MEN
Chuyên ngành: Hóa Sinh
Mã số:
1.05.10

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC LƢỢNG
TP. HCM – 2012


LỜI CẢM ƠN
Chân thành cảm ơn đến thầy:
PGS. TS. NGUYỄN ĐỨC LƢỢNG
Ngƣời đã khơi gợi cho tôi những ý tƣởng về đề tài và cũng là ngƣời hƣớng dẫn cho
tôi thực hiện đề tài.
Trân trọng cảm ơn cô
PGS. TS. ĐỒNG THỊ THANH THU
PGS. TS. PHẠM THỊ ÁNH HỒNG
là những giảng viên để tôi suốt đời học hỏi và đã hỗ trợ tôi rất nhiều về mặt tinh
thần và học thuật.
Trân trọng cảm ơn TS. LÊ PHI NGA đã giúp đỡ và tạo điều kiện hết sức cho tôi
hoàn thành đề tài.
Tri ân ba suốt đời tận tụy vì sự tiến bộ của con, vô cùng cảm ơn mẹ với trái tim
nhân hậu là nguồn động viên lớn lao trong con.
Cảm ơn NGUYỄN THỊ KIM CHÂU, ngƣời luôn hết lòng ủng hộ và giúp đỡ lớn lao
để tôi hoàn thành tốt luận án.
Cảm ơn tất cả những thành viên trong nhóm dự án nghiên cứu sản xuất cà phê chất
lƣợng cao nhằm mục đích xuất khẩu
1.
2.
3.
4.
5.
6.

7.

Nguyễn Thảo Nguyên
Đỗ Đại Nghĩa
Nguyễn Thị Minh Trinh
Nguyễn Hữu Thái
Ngô Tiến Hiễn Vinh
Lê Thị Lệ
Phạm Mỹ Vẹn

8. Nguyễn Thị Kim Châu
9. Nguyễn Thị Ngà
10. Cao Hoàng Tấn
11. Nguyễn Văn Hân
12. Nguyễn Thị Bảo Anh
13. Nguyễn Thị Cẩm Vân
14. Võ Ngọc Thanh

Đã nỗ lực cùng tôi vƣợt qua nhiều khó khăn và hỗ trợ tôi hoàn tất những nội dung
nghiên cứu của luận án.
Và cuối cùng cho tôi đƣợc cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa và đồng nghiệp tại Khoa
CNSH ĐH Quốc Tế nơi tôi đang công tác đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn
thành luận án.
Tác giả luận án
Lê Hồng Phú


I

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu
và kết quả trong Luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong
bất kỳ công trình nào khác.
Tác giả Luận án


II

MỤC LỤC
Lời cam đoan ..................................................................................................................... I
Mục lục ............................................................................................................................. II
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt ...........................................................................VI
Danh mục các bảng ....................................................................................................... VII
Danh mục các hình ..........................................................................................................IX

MỞ ĐẦU ........................................................................................................1
CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN ........................................................................7
1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÀ PHÊ ...................................................................... 7
1.1.1 Sơ lƣợc lịch sử phát triển cây cà phê ở Việt Nam ........................................... 7
1.1.2 Giá trị kinh tế của cà phê ................................................................................. 7
1.1.3 Tình hình sản xuất cà phê ................................................................................ 8
1.1.4 Tầm quan trọng của ngành chế biến cà phê ở Việt Nam ................................. 8
1.1.5 Những vấn đề kỹ thuật cần nghiên cứu trong chế biến cà phê ........................ 8
1.2. TRÁI CÀ PHÊ ..................................................................................................... 10
1.2.1 Cấu tạo trái cà phê ......................................................................................... 10
1.2. 2 Thành phần hóa học ...................................................................................... 11
1.2.2.1 Thành phần hóa học của vỏ quả ............................................................. 11
1.2.2.2 Thành phần hóa học của lớp nhớt .......................................................... 12
1.3 NHÂN CÀ PHÊ .................................................................................................... 12

1.3.1 Thành phần hóa học của nhân cà phê ............................................................ 12
1.3.1.1 Carbohydrates ........................................................................................ 13
1.3.1.2 Hợp chất chứa nitơ ................................................................................. 14
1.3.1.3 Acid chlorogenic .................................................................................... 17
1.3.1.4 Hương thơm cà phê ................................................................................. 18
1.3.1.5 Acid carboxylic ....................................................................................... 19
1.3.1.6 Các chất khoáng...................................................................................... 20
1.3.2. Tính chất vật lý ............................................................................................ 20
1.4 PECTIN ................................................................................................................ 21
1.4.1 Cấu tạo pectin ................................................................................................ 21
1.4.2 Tính chất của pectin ....................................................................................... 22
1.4.2.1 Tính chất làm đông đặc ........................................................................... 22
1.4.2.2 Tính tạo gel của pectin ............................................................................ 22
1.4.2.3 Tính nhớt của dung dịch pectin............................................................... 22
1.4.2.4 Pectin ở trái cà phê ................................................................................. 23
1.4.3 Ứng dụng ....................................................................................................... 23
1.5 CELLULOSE ....................................................................................................... 23
1.5.1 Cấu tạo ....................................................................................................... 23
1.5.2 Tính chất ................................................................................................... 24
1.5.3 Ứng dụng .................................................................................................... 25
1.5.4 Cellulose ở trái cà phê ................................................................................ 25
1.6 GIỚI THIỆU CHUNG ENZYME PECTINASE VÀ CELLULASE ................. 25


III

1.6.1 Pectinase ....................................................................................................... 26
1.6.1.1 Phân loại và cơ chế tác động .................................................................. 26
1.6.1.2 Ứng dụng ................................................................................................. 27
1.6.1.3 Hệ vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme pectinase .......................... 27

1.6.2 Cellulase ......................................................................................................... 27
1.6.2.1 Phân loại và cơ chế tác dụng ................................................................. 27
1.6.2.2 Ứng dụng ................................................................................................. 29
1.6.2.3 Hệ vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme cellulase........................... 30
1.7 GIỚI THIỆU VI SINH VẬT SINH PECTINASE VÀ CELLULASE ĐƢỢC NGHIÊN
CỨU TRONG LUẬN ÁN VÀ PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH DANH VSV ...................... 30
1.7.1 Tổng quan chung về vi sinh vật ..................................................................... 30
1.7.2 Phƣơng pháp định danh vi sinh vật................................................................ 31
1.8 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA VIỆC TÁCH VỎ VÀ LÊN MEN CÀ PHÊ ................. 32
1.8.1 Giới thiệu về tách vỏ cà phê ........................................................................... 32
1.8.1.1 Sơ lược nghiên cứu tách vỏ cà phê trên thế giới ...................................... 32
1.8.1.2 Sơ lược nghiên cứu tách vỏ cà phê trong nước ........................................ 32
1.8.2 Giới thiệu về lên men cà phê .......................................................................... 33
1.8.2.1 Sơ lược lên men cà phê trên thế giới ......................................................... 34
1.8.2.2 Sơ lược lên men cà phê trong nước.......................................................... 38
1.8.3 Tăng năng suất tách vỏ và lớp nhớt của cà phê tƣơi ........................................ 39
1.8.4 Nâng cao hiệu suất trích ly cà phê bột ............................................................ 39
1.8.5 Cải thiện chất lƣợng cảm quan cà phê ............................................................ 39

CHƢƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........41
2.1. VẬT LIỆU ........................................................................................................... 41
2.1.1 Nhân cà phê ................................................................................................... 41
2.1.1.1 Giống ....................................................................................................... 41
2.1.1.2 Nguồn gốc ............................................................................................... 41
2.1.2 Nguồn vi sinh vật nghiên cứu ........................................................................ 41
2.1.2.1. Nấm sợi .................................................................................................. 41
2.1.2.2. Nấm men ................................................................................................ 41
2.1.2.3. Vi khuẩn ................................................................................................. 41
2.1.3 Môi trƣờng sử dụng ....................................................................................... 41
2.1.3.1 Môi trường phân lập và nuôi cấy nấm sợi, nấm men và vi khuẩn .......... 41

2.1.3.1 Môi trường phân lập và nuôi cấy nấm sợi, nấm men và vi khuẩn .......... 41
2.1.3.2 Môi trường nhân giống ........................................................................... 42
2.1.3.3 Môi trường giữ giống .............................................................................. 42
2.1.4 Hóa chất ........................................................................................................ 42
2.1.4.1 Hóa chất sử dụng cho môi trường .......................................................... 42
2.1.4.2 Hóa chất sử dụng cho phương pháp xác định hoạt tính enzyme ............ 42
2.1.4.3 Hóa chất sử dụng cho các phương pháp xác định thành phần .............. 43
2.1.5 Thiết bị - dụng cụ ........................................................................................... 43
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................... 44
2.2.1 Phƣơng pháp vi sinh vật ................................................................................ 44


IV

2.2.1.1 Phương pháp phân lập giống vi sinh vật từ nhân cà phê ....................... 44
2.2.1.2 Phương pháp cấy chuyền và giữ giống (trong điều kiện vô trùng) ........ 44
2.2.1.3 Phương pháp nhân giống ........................................................................ 44
2.2.1.4 Phương pháp lên men ............................................................................. 44
2.2.1.5 Phương pháp đếm tế bào vi sinh vật trong chế phẩm ............................. 45
2.2.2 Phƣơng pháp hóa lý ....................................................................................... 45
2.2.2.1 Phương pháp xác định độ ẩm ................................................................. 45
2.2.2.2 Phương pháp trích chất hòa tan ............................................................. 46
2.2.2.3 Phương pháp nghiền ............................................................................... 46
2.2.2.4 Phương pháp rây..................................................................................... 46
2.2.2.5 Phương pháp ngâm ................................................................................. 46
2.2.3 Phƣơng pháp hóa sinh .................................................................................... 47
2.2.3.1 Các phương pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase, pectinase......... 47
2.2.3.2 Các phương pháp xác định thành phần chủ yếu trong cà phê ............... 52
2.2.4 Phƣơng pháp định danh vi sinh vật................................................................ 60
2.2.4.1 Phương pháp định danh nấm sợi ............................................................ 60

2.2.4.2 Phương pháp định danh vi khuẩn và nấm men ....................................... 61
2.2.5 Cách bố trí thí nghiệm ................................................................................... 62
Thí nghiệm 1: Khảo sát thành phần pectin và cellulose trong lớp nhớt
và thành phần hóa học chủ yếu trong nhân cà phê .................... 65
Thí nghiệm 2: Phân lập và định danh các chủng vi sinh vật từ vỏ,
nhân cà phê .................................................................................. 65
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh vật có hoạt tính
pectinase và cellulase .................................................................. 66
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu quá trình tách vỏ cà phê........................................... 71
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm trong lên men nhằm nâng
cao hiệu suất trích chất hòa tan và chất lượng cà phê ............... 73
Thí nghiệm 6: Lên men cà phê theo cách kết hợp chế phẩm .............................. 75
Thí nghiệm 7: Kiểm tra độc tố aflatoxin, hàm lượng caffeine phẩm .................. 75
Thí nghiệm 8: Đánh giá cảm quan ..................................................................... 76
Thí nghiệm 9: Thử nghiệm lên men kết hợp các chế phẩm tốt nhất từ
nấm sợi, nấm men và vi khuẩn ..................................................... 76
2.2.6 Phƣơng pháp đánh giá cảm quan ............................................................... 76
2.2.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu ............................................................................. 79

CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...............................................80
3.1 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHỦ YẾU CÓ TRONG CÀ PHÊ ........................ 80
3.1.1 Thành phần pectin và cellulose trong lớp nhớt .............................................. 80
3.1.2 Thành phần hóa học chủ yếu có trong nhân cà phê ....................................... 80
3.2 PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI SINH VẬT ........................... 82
3.2.1 Phân lập và định danh các chủng nấm sợi trên vỏ, nhân cà phê .................... 82
3.2.2 Phân lập và định danh các chủng nấm men và vi khuẩn trên vỏ,
nhân cà phê ..................................................................................................... 86
3.3 NGHIÊN CỨU TẠO CÁC CHẾ PHẨM VSV .................................................... 89

V

3.3.1 Nghiên cứu điều kiện tạo chế phẩm có hoạt tính pectinase cao .................... 89
3.3.1.1 Xác định môi trường tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme pectinase .......... 89
3.3.1.2 Xác định độ ẩm tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme pectinase .................. 94
3.3.1.3 Xác định thời gian tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme pectinase
của các chủng nấm sợi ............................................................................ 96
3.3.1.4 Xác định nồng độ đường ( oBrix ) của dung dịch malt đến
sự sinh tổng hợp enzyme pectinase ....................................................... 101
3.3.1.5 Xác định pH ban đầu dung dịch malt đến khả năng sinh tổng hợp
enzyme pectinase .................................................................................... 103
43.3.1.6 Ảnh hưởng của lượng muối (NH4)2SO4 bổ sung đến khả năng
sinh tổng hợp enzyme pectinase ........................................................... 105
3.3.1.7 Xác định nhiệt độ nuôi đến khả năng sinh tổng hợp
enzyme pectinase .................................................................................... 107
3.3.1.8 Tổng kết quy trình tạo chế phẩm có hoạt tính pectinase cao .............. 109
3.3.2 Nghiên cứu điều kiện tạo chế phẩm có hoạt tính cellulase cao ................... 110
3.3.2.1 Xác định môi trường tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme cellulase ........ 110
3.3.2.2 Xác định độ ẩm tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme cellulase ................ 114
3.3.2.3 Xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi đến quá trình sinh tổng hợp
cellulase của các chủng vi sinh vật ........................................................ 116
3.3.2.4 Tổng kết quy trình tạo chế phẩm có hoạt tính cellulase cao ................... 120
3.4 KHẢO SÁT CHẤT LƢỢNG CHẾ PHẨM THEO THỜI GIAN BẢO QUẢN .... 121
3.4.1 Số lƣợng tế bào vsv thay đổi theo thời gian bảo quản ................................. 122
3.4.2 Khảo sát hoạt tính enzyme pectinase thay đổi theo thời gian bảo quản ...... 123
3.4.3 Khảo sát hoạt tính enzyme cellulase thay đổi theo thời gian bảo quản ...... 124
3.4.4 Tổng kết khảo sát chất lƣợng chế phẩm theo thời gian bảo quản
và sơ bộ hạch toán kinh tế ........................................................................... 125
3.5 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TÁCH VỎ CÀ PHÊ ......................................... 125
3.5.1 Khảo sát ảnh hƣởng lƣợng chế phẩm vsv đến khả năng tách vỏ

cà phê tƣơi ..................................................................................................... 126
3.5.2 Khảo sát ảnh hƣởng thời gian xử lý đến khả năng tách vỏ cà phê tƣơi ....... 128
3.5.3 Tổng kết nghiên cứu quá trình tách vỏ cà phê và công nghệ tách vỏ cà phê ... 129
3.6 KẾT QUẢ QUÁ TRÌNH LÊN MEN. ................................................................ 129
3.6.1 Ảnh hƣởng của thời gian ngâm và độ ẩm cà phê. ....................................... 130
3.6.2 Ảnh hƣởng của độ ẩm cà phê đến khả năng chiết chất hòa tan
trong nhân cà phê ........................................................................................... 130
3.6.2.1 Ảnh hưởng của độ ẩm cà phê đến khả năng chiết chất hòa tan
trong Coffea arabica ............................................................................... 131
3.6.2.2 Ảnh hưởng của độ ẩm cà phê đến khả năng chiết chất hòa tan
trong Coffea robusta ................................................................................. 131
3.6.2.3 Ảnh hưởng của độ ẩm cà phê đến khả năng chiết chất hòa tan
trong Coffea chari .................................................................................... 132
3.6.3 Ảnh hƣởng của lƣợng chế phẩm vsv đến khả năng chiết chất hòa tan
trong nhân cà phê ......................................................................................... 133


VI

3.6.3.1 Ảnh hưởng của lượng chế phẩm vsv đến khả năng chiết chất
hòa tan trong Coffea arabica ................................................................ 133
3.6.3.2 Ảnh hưởng của lượng chế phẩm vsv đến khả năng chiết chất
hòa tan trong Coffea robusta ................................................................ 135
3.6.3.3 Ảnh hưởng của lượng chế phẩm vsv đến khả năng chiết chất
hòa tan trong Coffea chari ..................................................................... 137
3.6.4 Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến khả năng chiết chất hòa tan
trong nhân cà phê ......................................................................................... 139
3.6.4.1 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng chiết chất hòa tan
trong Coffea C. arabica của các CPVSV từ nấm sợi ................................ 139
3.6.4.2 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng chiết chất hòa tan

trong Coffea C. C. robusta của các CPVSV từ nấm sợi ............................. 141
3.6.4.3 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng chiết chất hòa tan
trong Coffea chari của các CPVSV từ nấm sợi ......................................... 143
3.6.5 Tổng kết nghiên cứu lên men nhân cà phê và quy trình lên men .................... 145
3.6.6 Nghiên cứu đánh giá cảm quan cà phê ........................................................ 145
3.6.6.1 Đánh giá cảm quan cà phê C. arabica ................................................. 146
3.6.6.2 Đánh giá cảm quan cà phê C. robusta ................................................. 147
3.6.6.3 Đánh giá cảm quan cà phê C. chari ..................................................... 147
3.6.7 Thử nghiệm lên men kết hợp các chế phẩm tốt nhất từ nấm sợi, nấm men
và vi khuẩn ....................................................................................................... 148
3.6.7.1 Khảo sát nồng độ chất tan bởi lên men kết hợp ...................................... 149
3.6.7.2 Khảo sát hàm lượng caffeine giải phóng bởi lên men kết hợp ................. 151
3.6.8 Quy trình tách vỏ và lên men cà phê bởi chế phẩm ........................................ 153
3.6.8.1 Quy trình tách vỏ bởi chế phẩm vsv ........................................................ 153
3.6.8.2 Quy trình lên men cà phê bởi chế phẩm vsv ............................................ 154

CHƢƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .........................................157
DANH MỤC CÔNG TRÌNH .....................................................................159
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................161
PHỤ LỤC ....................................................................................................170


VII

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ tắt

Chữ nguyên

Ý nghĩa

C. arabica
C. chari
C. robusta
CMC

Coffea arabica
Coffea chari
Coffea robusta
Carboxymethylcellulose
Chế phẩm vi sinh vật
Caffeoxyl quinic acid

Cà phê chè
Cà phê mít
Cà phê vối
Một dẫn xuất cellulose

CPVSV
CQA
CT
DNS
ĐC
MT
NL
PGA
PTN
TCVN
TN
vsv

Chế phẩm vi sinh vật
Hợp chất thơm trong cà
phê
Canh trƣờng
Canh trƣờng
3,5 - dinitrosalicylic acid Một chất thử cho xác định
đƣờng khử
Đối chứng
Đối chứng
Môi trƣờng
Môi trƣờng
Nguyên liệu
Nguyên liệu
Potato glucose agar
Môi trƣờng giữ giống gồm
khoai tây, glucose và thạch
Phòng thí nghiệm
Phòng thí nghiệm
Tiêu chuẩn Việt Nam
Tiêu chuẩn Việt Nam
Thí nghiệm
Thí nghiệm
Vi sinh vật
Vi sinh vật