TỐI ưu điều KIỆN SINH TỔNG hợp NATTOKINASE THEO PHƯƠNG PHÁP lên MEN CHÌM ở QUY mô PHÒNG THÍ NGHIỆM
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (4.16 MB, 43 trang )
Luận văn tốt nghiệp
PHẠM THỊ QUỲNH
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
=======* & *======
PHẠM THỊ QUỲNH
CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP
NATTOKINASE THEO PHƯƠNG PHÁP LÊN
MEN CHÌM Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM
LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
KHOÁ 2012B
Hà Nội – 2014
Phạm Thị Quỳnh
i
Luận văn tốt nghiệp
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận
được sự ủng hộ, giúp đỡ tận tình của thầy cô giáo, gia đình và bạn bè.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Lan Hương - Viện Công
nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tận tình chỉ
bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.
và tôi xin cảm ơn TS. Phạm Tuấn Anh đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong
suốt thời gian thí nghiệm tại Phòng Kỹ thuật lên men, trung tâm Nghiên cứu và Phát triển
Công nghệ Sinh học (TTCNSH), thuộc Viện Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực phẩm,
trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và
nghiên cứu tại phòng.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học &
Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã giảng dạy và giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đã tạo điều kiện, quan tâm, động viên
và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Hà Nội, ngày 26 tháng 08 năm 2014
Học viên
Phạm Thị Quỳnh
Phạm Thị Quỳnh
ii
Luận văn tốt nghiệp
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học mà bản thân tôi đã trực tiếp
thực hiện. Tất cả các số liệu và kết quả thu được trình bày trong khóa luận là hoàn toàn khách
quan trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Các tài liệu
đã trích dẫn của các tác giả đều được liệt kê đầy đủ, không sao chép bất cứ tài liệu nào mà
không có trích dẫn.
Hà Nội, ngày 26 tháng 08 năm 2014
Học viên
Phạm Thị Quỳnh
Phạm Thị Quỳnh
iii
Luận văn tốt nghiệp
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU--------------------------------------------------------------------------------1.1. Khô đậu tương.................................................................................................................................
1.2. Enzym nattokinase...........................................................................................................................
1.2.1. Lịch sử......................................................................................................................................
1.2.2. Tính chất..................................................................................................................................
1.2.2.1. Cấu trúc...........................................................................................................................
1.2.2.2. Cơ chất của Nattokinase..................................................................................................
1.2.2.3. Quá trình đông máu và hòa tan cục máu........................................................................
1.2.2.4. Cơ chế tác dụng của nattokinase....................................................................................
1.2.3. Vi sinh vật tổng hợp nattokinase.............................................................................................
1.3. Các phương pháp lên men sinh tổng hợp nattokinase...................................................................
1.3.1. Phương pháp lên men bề mặt.................................................................................................
1.3.2. Phương pháp lên men chìm....................................................................................................
1.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men chìm sinh tổng hợp nattokinase........................
1.4.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon.................................................................................................
1.4.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ......................................................................................................
1.4.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống.......................................................................................................
1.4.4. Ảnh hưởng của pH ban đầu.....................................................................................................
1.4.5. Ảnh hưởng của thời gian lên men...........................................................................................
1.5. Kỹ thuật lên men có bổ sung cơ chất (fed-batch) trong sinh tổng hợp nattokinase......................
1.6. Tình hình nghiên cứu và sản xuất nattokinase ở trong nước..........................................................
PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP---------------------------------------2.1. Vật liệu, đối tượng nghiên cứu........................................................................................................
2.1.1. Vật liệu.....................................................................................................................................
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu..............................................................................................................
2.1.3. Hóa chất và thiết bị..................................................................................................................
2.1.3.1. Các loại hóa chất chính dùng trong nghiên cứu..............................................................
2.1.3.2. Các thiết bị được sử dụng...............................................................................................
2.2. Phương pháp nghiên cứu................................................................................................................
2.2.1. Phương pháp vi sinh................................................................................................................
2.2.2. Phương pháp hóa sinh............................................................................................................
2.2.2.1. Phương pháp xác định hoạt lực nattokinase..................................................................
2.2.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử...............................................................
2.3. Nội dung nghiên cứu.......................................................................................................................
Phạm Thị Quỳnh
iv
Luận văn tốt nghiệp
2.3.1. Hoạt hóa giống........................................................................................................................
2.3.2. Khảo sát một số điều kiện lên men.........................................................................................
2.3.3. Tối ưu hóa điều kiện lên men bằng quy hoạch thực nghiệm.................................................
2.3.4. Lên men sinh tổng hợp nattokinase của chủng B. subtilis D trong thiết bị lên men quy
mô PTN..........................................................................................................................................................
3.1. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp nattokinase từ khô
đậu tương..........................................................................................................................................................
3.1.1 Nồng độ khô đậu tương...........................................................................................................
3.1.2. Nồng độ glucose bổ sung........................................................................................................
3.1.3. Nồng độ pepton bổ sung.........................................................................................................
3.1.4. pH ban đầu..............................................................................................................................
3.1.5. Thời gian lên men....................................................................................................................
3.2. Tối ưu điều kiện lên men sinh tổng hợp nattokinase.......................................................................
3.3. Nghiên cứu kỹ thuật lên men phù hợp sinh tổng hợp nattokinase của chủng B. subtilis...............
3.3.1. Lên men theo mẻ.....................................................................................................................
3.3.2. Lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất (fed-batch)...................................................................
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ-------------------------------------------------------TÀI LIỆU THAM KHẢO------------------------------------------------------------Tài liệu tiếng Việt....................................................................................................................................
Tài liệu tiếng Anh....................................................................................................................................
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Số lượng tiêu thụ khô đậu tương của Việt Nam [42]-----------------Hình 1.2. Cấu trúc của enzym nattokinase-----------------------------------------Hình 1.3. Cơ chế tác dụng của nattokinase----------------------------------------Hình 1.4. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng tổng hợp
nattokinase------------------------------------------------------------------------------Hình 1.5. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng tổng hợp
nattokinase------------------------------------------------------------------------------Hình 1.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng tổng hợp nattokinase-----Hình 1.7. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng tổng hợp nattokinase-----Phạm Thị Quỳnh
v
Luận văn tốt nghiệp
Hình 1.8. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống đến hoạt lực enzym------------------------Hình 1.9. Ảnh hưởng của pH đến khả năng tổng hợp nattokinase--------------Hình 1.10. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hoạt lực nattokinase--------Hình 1.11. Động học của quá trình lên men fed-batch---------------------------Hình 2.1. Hệ thống lên men 2L (Biostat B, Sartorius, Đức)---------------------Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ khô đậu tương đến hoạt lực nattokinase
--------------------------------------------------------------------------------------------Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ glucose bổ sung đến hoạt lực
nattokinase------------------------------------------------------------------------------Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ pepton bổ sung đến hoạt lực nattokinase
--------------------------------------------------------------------------------------------Hình 3.4. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt lực nattokinase----------------Hình 3.5. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hoạt lực nattokinase---------Hình 3.6a. Ảnh hưởng của các yếu tố đến hoạt lực nattokinase-----------------Hình 3.6b. Bề mặt đáp ứng của hoạt lực nattokinase và mối quan hệ giữa
nồng độ glucose (A) và nồng độ peptone (B)---------------------------------------Hình 3.6c. Bề mặt đáp ứng của hoạt lực nattokinase và mối quan hệ giữa
nồng độ glucose (A) và pH (C)-------------------------------------------------------Hình 3.6d. Bề mặt đáp ứng của hoạt lực nattokinase và mối quan hệ giữa
nồng độ pepton (B) và pH (C)--------------------------------------------------------Hình 3.7. Diễn biến của các thông số trong quá trình lên men theo mẻ--------Hình 3.8. Hoạt lực nattokinase trong canh trường theo thời gian lên men-----Hình 3.9. Hàm lượng đường khử trong canh trường theo thời gian lên men
--------------------------------------------------------------------------------------------Hình 3.10. Hoạt lực nattokinase trong canh trường lên men fed-batch---------Hình 3.11. Diễn biến của các thông số trong quá trình lên men fed-batch------
Phạm Thị Quỳnh
vi
Luận văn tốt nghiệp
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần hoá học của khô đậu tương--------------------------------Bảng 2.1. Miền biến thiên của các yếu tố------------------------------------------Bảng 3.1. Giá trị mã hóa các biến---------------------------------------------------Bảng 3.2. Ma trận thực nghiệm và hoạt lực nattokinase của canh trường-----Bảng 3.3. Kết quả phân tích hồi quy------------------------------------------------Bảng 3.4. Một số điểm tối ưu xung quanh điểm trung tâm-----------------------
Phạm Thị Quỳnh
vii
Luận văn tốt nghiệp
GIẢI THÍCH CHỮ VIẾT TẮT
NK
Nattokinase
pI
Point isoelectric
t-PA
tissue Plasminogen Activator
FU
Fibrin degradation unit
Tris–HCl
Tris (hydroxymethyl) aminomethane
TCA
Trichloacetic acid
Fed–batch
Fed–batch fermentation
Phạm Thị Quỳnh
viii
Luận văn tốt nghiệp
MỞ ĐẦU
Đột quy hay còn gọi là tai biến mạch máu não (TBMMN) là tình trạng bệnh lý biểu
hiện bởi các triệu chứng thần kinh xảy ra đột ngột, vì một lý do nào đó, mạch máu não bị bít
tắc lại, lập tức phía sau của vùng bị bít tắc, các tế bào thần kinh bị hủy hoại một cách nhanh
chóng, chỉ trong khoảng 1 phút có thể sẽ mất đi 2 triệu tế bào [20, 41]. Điều đó tương ứng
với tổn thương cục bộ hệ thần kinh trung ương do rối loạn tuần hoàn não.
Hàng năm, thế giới có khoảng 5 triệu người bị TBMMN, Việt Nam có khoảng
200.000 người mắc mới – là nguyên nhân gây tàn phế hàng đầu và là cấp cứu thường
gặp nhất trong chuyên khoa thần kinh. Tỉ lệ tử vong của đột quỵ đứng hàng thứ 3 sau tai biến
tim mạch và ung thư . Một bệnh nhân bị đột quỵ dù không tử vong nhưng có thể bị tàn phế
suốt đời và trở thành gánh nặng cho gia đình và xã hội. Những dấu hiệu của bệnh này thường
được ít người biết đến và chúng khó để nhận biết hoặc không có biểu biện rõ rệt. Chính vì lẽ
đó, việc ngăn ngừa phòng bệnh này sẽ giúp mỗi chúng ta và những người thân tránh gặp
những trường hợp và hậu quả đáng tiếc.
Quá trình nghiên cứu, sản xuất các loại thuốc và thực phẩm chức năng có tác dụng
phòng ngừa TBMMN đã được tiến hành trong nhiều thập niên qua. Nattokinase là enzym
được sử dụng nhiều trong các chế phẩm sinh học, các loại thực phẩm chức năng phòng ngừa
TBMMN. Đây là một loại enzym có tính an toàn cao, được tìm thấy trong lên men đậu
tương, có tác dụng làm tan các cục máu đông giúp ngăn ngừa bệnh TBMMN.
Nattokinase được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Bacillus subtilis khi lên men đậu tương
– một loại hình lên men có truyền thống lâu đời. Đậu tương từ xa xưa đã được biết đến là
một thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, giàu protein, lipid và các vitamin. Từ đậu tương có
thể chế biến nhiều sản phẩm giàu dinh dưỡng và có lợi cho sức khỏe. Khô đậu tương là một
phụ phẩm của quá trình ép đậu tương thu dầu thường được sử dụng làm thức ăn gia súc, tuy
nhiên, với hàm lượng protein cao và giá thành rẻ hơn so với đậu tương, khô đậu tương là một
phụ phẩm có triển vọng trong lên men sinh tổng hợp nattokinase.
Quá trình lên men sinh tổng hợp nattokinase từ B. subtilis ngày càng được nghiên cứu
và hoàn thiện. Hiện có 2 phương pháp lên men sinh tổng hợp nattokinase được sử dụng.
Phương pháp lên men bề mặt có ưu điểm là đơn giản, không đòi hỏi chi phí đầu tư thiết bị
cao nhưng có nhược điểm là khó khống chế điều kiện vô trùng tuyệt đối trong phòng lên men
khi triển khai ở quy mô sản xuất. Bên cạnh phương pháp lên men bề mặt, lên men chìm đã
được tiến hành nghiên cứu. Ưu điểm nổi bật của công nghệ này là có thể dễ dàng tự động hóa
điều khiển được quá trình lên men và có thể triển khai ở quy mô công nghiệp. Công nghệ này
cũng cho phép quá trình thu hồi enzym được dễ dàng hơn so với lên men bề mặt.
Với định hướng có thể tận dụng và nâng cao giá trị của khô đậu tương chúng tôi đã sử
dụng nguyên liệu này làm nguồn cơ chất cho lên men sinh tổng hợp nattokinase theo phương
pháp lên men chìm. Để có thể làm chủ được quá trình lên men ở quy mô phòng thí nghiệm
tôi đã tham gia nghiên cứu đề tài: “Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp nattokinase theo phương
pháp lên men chìm ở quy mô phòng thí nghiệm”
Nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm:
1. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp nattokinase từ khô đậu
tương
2. Tối ưu điều kiện lên men chìm ở quy mô phòng thí nghiệm
3. Lựa chọn kỹ thuật lên men phù hợp sinh tổng hợp nattokinase của chủng B. subtilis
9
Phạm Thị Quỳnh
Luận văn tốt nghiệp
PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1. Khô đậu tương
Khô đậu tương, phụ phẩm của quá trình ép dầu từ đậu tương. Hầu hết khô đậu tương được
sản xuất trong nước cũng như nhập khẩu đều được sử dụng trong ngành công nghiệp thức ăn
chăn nuôi và thủy sản. Năm 2013, lượng tiêu thụ khô đậu tương được ước tính là 3,8 triệu
tấn, tăng 7% so với vụ trước [42].
Hình 1.1. Số lượng tiêu thụ khô đậu tương của Việt Nam [42]
Dù đã bắt đầu sản xuất khô đậu tương trên quy mô công nghiệp từ năm 2011, nhưng lượng
khô đậu tương sử dụng ở nước ta vẫn phải nhập khẩu. Ba triệu tấn khô đậu tương đã được
nhập khẩu trong năm 2012-2013, tăng 13% so với cùng kì năm trước. Theo ước tính thì
lượng khô đậu tương tiêu thụ ở nước ta vẫn tiếp tục tăng trong những năm tiếp theo [42].
Hiện nay khô đậu tương được sản xuất bằng 2 phương pháp. Phương pháp thứ nhất chiết rút
chất béo bằng dung môi hexane. Hạt đậu tương thường được bỏ vỏ, hấp chín bằng hơi nước
nóng rồi cán thành các mảnh dẹt, sau đó ngâm trong dung môi hexane để chiết rút dầu đậu
tương. Sau đó bã đậu tương được ép và xử lý nhiệt để loại bỏ hexane và goi là khô đậu
tương. Phương pháp này được coi là phương pháp hiện đại và được sử dụng rộng rãi ở các
nước tiên tiến. Khô đậu tương sản xuất theo phương pháp này có hàm lượng protein rất cao
(46-48%) và hàm lượng chất béo còn lại rất thấp (1%). Phương pháp thứ 2 là ép dầu bằng
phương pháp cơ học. Đậu tương được hấp chín, nghiền nhỏ và ép dầu bằng thiết bị cơ học.
Nhưng phương pháp ép dầu bằng cơ học tỷ lệ dầu thu được thường không cao, lượng chất
béo còn lại trong khô dầu tới 7-10%. Từ năm 2011, hai nhà máy nghiền công nghiệp bắt đầu
hoạt động đã làm thay đổi mạnh mẽ ngành hạt có dầu và chăn nuôi gia súc tại Việt Nam. Sản
lượng khô đậu tương trong nước tiếp tục thay thế một lượng đáng kể khô đậu tương nhập
khẩu, ước tính đạt 732 nghìn tấn năm 2013, giảm 6% so với năm 2012 [42].
Thành phần hóa học của khô đậu tương được chỉ ra ở bảng 1.1 cho thấy hàm lượng protein
của khô đậu tương khá cao, trong khi hàm lượng chất béo khá thấp, bên cạnh đó giá thành
chỉ bằng 1/3 -1/2 lần so với giá thành của đậu tương. Chính vì vậy khô đậu tương có thể thay
thế cho đậu tương trong một số ứng dụng trong công nghiệp, đặc biệt thay thế đậu tương sử
dụng làm môi trường lên men cho vi sinh vật.
Bảng 1.1. Thành phần hoá học của khô đậu tương
10
Phạm Thị Quỳnh
Luận văn tốt nghiệp
Thành phần hóa học
% khối lượng
Protein
43,5 - 48,1
Chất béo
1,24 - 1,70
Chất xơ
2,88 - 5,89
Độ ẩm
12
1.2. Enzym nattokinase
1.2.1. Lịch sử
Natto đã trở thành một đề tài nóng khi tiến sĩ Sumi Hiroyuki tung ra những kết quả bất
ngờ về hiệu quả của natto trong việc làm tan các huyết khối trong động mạch. Vào năm
1980, trong bữa cơm tại nhà ăn của trường đại học Y khoa Chicago, tiến sĩ Sumi Hiroyuki
lấy một mẫu natto – một món ăn quen thuộc của ông, đặt vào khay thủy tinh có cục máu
đông thì 18 giờ sau, cục máu đông này tan rã dễ dàng, điều đó gợi ý rằng natto có thể có một
(hay nhiều) hoạt chất fibrinolytic enzym, có thể phân hủy huyết khối nhờ thủy phân sợi fibrin
.
Năm 1986, Sumi Hiroyuki công bố toàn bộ kết quả nghiên cứu về tác dụng của
nattokinase (NK) sau khi thử nghiệm gần 200 loại thực phẩm khác nhau để so sánh, xác định
NK là một loại enzym có khả năng phân hủy huyết khối một cách hữu hiệu và mạnh mẽ nhất
trong các loại enzym, gấp 4 lần plasmin – enzym nội sinh làm tan máu đông, đồng thời tuyệt
đối an toàn cho cơ thể khi hấp thụ qua đường tiêu hóa .
1.2.2. Tính chất
1.2.2.1. Cấu trúc
Nattokinase (E.C.3.4.21.62) thuộc vào họ protease serine subtilisin với 275 axit amin
và có khối lượng phân tử 27,27 kDa , enzym này bền trong dải pH từ 4 đến 11, tối ưu ở pH
= 8, hoạt động tốt trong dải nhiệt độ từ 300C đến 500C, tối ưu ở 400C .
Hình 1.2. Cấu trúc của enzym nattokinase
1.2.2.2. Cơ chất của Nattokinase
Fibrin là một protein dạng sợi được polyme hóa để tạo thành dạng lưới bao quanh vết thương
và có tác dụng cầm máu. Fibrin được tạo thành từ chất tạo tơ huyết hay còn gọi là fibrinogen
11
Phạm Thị Quỳnh
Luận văn tốt nghiệp
nhờ sự hoạt động của thrombin. Khi đó, fibrin được tạo thành sẽ liên kết với nhau bởi nhân
tố VIII (yếu tố chống bệnh hemophilia – bệnh rối loạn đông máu) để tạo thành cục máu.
Ngoài ra, fibrin còn tham gia vào một số quá trình sinh học trong cơ thể như: truyền tín hiệu,
đông tụ máu trong mạch máu và polyme hóa protein .
Fibrinogen là một loại glycoprotein 340–HD được sinh tổng hợp ở gan và có nồng độ khoảng
1,5 ÷ 4,0 g/l trong huyết tương. Do đó, đối với những người bệnh suy gan hoặc mắc các bệnh
về di truyền liên quan đến gen ở nhiễm sắc thể số 4 có thể dẫn đến việc giảm nồng độ và chất
lượng fibrinogen gây ra bệnh nguy hiểm về máu. Fibrinogen đóng vai trò chính trong việc
tạo cầu nối các sợi tơ huyết bằng việc kết hợp các protein bề mặt GbIIb/IIa của chúng lại với
nhau và hình thành fibrin để cầm máu .
Fibrinogen có cấu trúc đối xứng 6 cặp chuỗi polypeptit (chuỗi alpha, beta và gramma). Trên
chuỗi alpha và beta có một trình tự peptid ngắn được gọi là fibrinopeptid, chính các chuỗi
peptid ngắn này cản trở việc fibrinogen bị polyme hóa bởi chính nó một cách tùy tiện .
Thrombin cắt các fibrinogen của chuỗi alpha và để lộ ra một mặt của vùng domain E, vùng
này có thể được kết hợp với đầu cacbon cuối của chuỗi gamma. Việc cắt chuỗi beta diễn ra từ
từ hơn và tạo ra các sợi của fibrinogen. Đây chính là quá trình chuyển hóa fibrinogen thành
fibrin .
1.2.2.3. Quá trình đông máu và hòa tan cục máu
Quá trình đông máu và hòa tan cục máu đông là hai quá trình tồn tại song song đồng thời
trong cơ thể người. Khi một cục máu đông bắt đầu được hình thành thì một loạt các bước sau
diễn ra nhằm ngăn cản sự hoàn thành việc hình thành các cục máu đông. Điều này giúp bảo
vệ cơ thể, ngăn chặn các cuộc tấn công tim và các sự cố tim mạch. Nhưng một khi hai quá
trình này bị rối loạn thì sẽ dẫn đến toàn bộ các quá trình khác cũng bị rối loạn. Ví dụ, khi mà
các cục máu đông hình thành và chưa được làm tan hết, chúng sẽ bám vào thành mạch máu
và tích tụ dần dần gây ra nghẽn mạch; điều đó là rất nguy hiểm khi không có thuốc điều trị
kịp thời .
Quá trình đông máu
Khi cơ thể con người bị tổn thương hoặc do những biến đổi trong cơ thể, sẽ dẫn đến việc
hình thành các tiền thrombin rất phức tạp, rồi sau đó sẽ hình thành các thrombin, thrombin sẽ
tác dụng với các fibrinogen để tạo thành fibrin.
Trong quá trình đông máu, ion Ca2+ có ảnh hưởng lớn đến quá trình hình thành tiền thrombin
và thrombin. Do đó, khi cơ thể thiếu Ca2+ rất nguy hiểm bởi nó dẫn đến sự rối loạn trong hệ
cân bằng, kéo theo nhiều nguy cơ mắc bệnh về máu và tim mạch.
Quá trình hòa tan máu đông
Trong huyết tương có một euglobulin gọi là plasminogen hoặc fibrinnolysin, khi được hoạt
hóa sẽ chuyển thành plasmin. Plasmin là một enzym phân hủy protein, chúng có tác dụng
làm tan các sợi fibrin và làm tan các chất khác trong máu ở xung quanh như fibrinogen,
prothrombin. Do đó, khi plasmin được hình thành bên trong cục máu đông, nó có thể làm tan
cục máu đông, đồng thời làm giảm khả năng đông máu. Vì vậy, quá trình này cho phép làm
sạch những cục máu đông hình thành ở các mô trong ngày. Tuy nhiên, cũng làm cho các vết
thương của mạch máu đã được bịt bằng máu đông lại mở miệng .
Trong cơ thể người có hơn 20 loại enzym gây đông máu, nhưng chỉ có một loại duy nhất có
khả năng phá vỡ các cục máu đông này là plasmin. Ngoài ra, với sự có mặt của vi khuẩn,
virus, nấm mốc và các độc tố trong máu cũng tạo ra những liên kết chồng chéo fibrin, gây ra
sự quá tải cho hệ thống plasmin. Khi không có những hiện tượng mất máu hoặc là vết thương
hở, các sợi fibrin liên kết chéo này sẽ luân chuyển trong máu và dính vào thành mạch máu.
Điều này góp phần tạo nên các cục máu đông, làm giảm sự vận chuyển lưu thông máu, đồng
12
Phạm Thị Quỳnh
Luận văn tốt nghiệp
thời làm tăng độ nhớt của máu, gây ra huyết áp cao. Các cục máu đông trong tim người làm
cản trở sự vận chuyển máu tới các mô cơ tim, nếu dòng máu bị chặn lại, khả năng cung cấp
oxy tới các mô này sẽ giảm một cách cục bộ gây ra hiện tượng thiếu máu cục bộ, dẫn tới các
cơn đau thắt tim hoặc nhồi máu cơ tim. Nếu hiện tượng này kéo dài có thể dẫn tới tử vong .
Như vậy, quá trình chuyển đổi fibrin trong cơ thể người thành các sản phẩm phân hủy fibrin
phụ thuộc rất nhiều vào khả năng tạo ra các chất kích thích như t-PA và u-PA trong gan. Do
những chất này làm nhân tố chính kích thích sự tạo nên enzym plasmin. Tuy nhiên, sự có mặt
của plasmin chưa đảm bảo cho việc phân giải fibrin cũng như các cục máu đông đạt hiệu quả
bởi có rất nhiều các chất kìm hãm, chất ức chế xung quanh nó. Đặc biệt, đối với những người
nhiều tuổi, khi các chất kích thích cho quá trình chuyển hóa tạo plasmin thì ít mà các chất ức
chế hoạt động của plasmin thì nhiều, điều này cũng giải thích vì sao bệnh tim mạch thường
gặp ở người lớn tuổi .
1.2.2.4. Cơ chế tác dụng của nattokinase
Nattokinase có tác dụng làm tan fibrin theo 3 con đường:
Theo con đường 1, NK trực tiếp thủy phân fibrin tạo ra các sản phẩm thủy phân có thể
hòa tan trong máu.
Ở con đường 2, nó kích thích quá trình tạo enzym urokinase từ tiền tố pro-urokinase, từ
đó hình thành các phân tử plasminogen và hình thành nên plasmin.
Đối với con đường 3, NK có tác dụng kích thích các tiền tố t - PA là tác nhân hoạt hóa
plasmin.
Hình 1.3. Cơ chế tác dụng của nattokinase
1.2.3. Vi sinh vật tổng hợp nattokinase
Vi sinh vật là những tác nhân quan trọng trong việc hình thành các enzym làm tan cục máu
đông. Streptokinase từ Streptocuoccus hemolyticus và staphylokinase từ Streptococcus
aureus đã được phát hiện từ sớm trong việc điều trị các chứng bệnh về huyết khối . Trong
nhiều năm qua, các loại enzym thủy phân fibrin cho hiệu quả cao hơn từ nhiều loại vi sinh
13
Phạm Thị Quỳnh
Luận văn tốt nghiệp
vật khác nhau đã tiếp tục được phát hiện như nattokinase từ Bacillus natto và subtilisin DJ-4
từ Bacillus amyloliquefaciens ].
Bacillus là loài được tìm thấy trong nhiều loại thức ăn lên men từ đậu tương và có khả năng
sinh NK. Chúng có hình que, đứng đơn lẻ, ít khi xếp chuỗi, kích thước: chiều rộng 0,7 ÷ 0,8
µm, chiều dài 2 ÷ 3 µm, là vi khuẩn gram dương, catalase dương tính, nhóm vi khuẩn này
thường được tìm thấy trong môi trường có độ pH biến động cao, sinh trưởng dưới điều kiện
hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc. Chúng có khả năng tạo bào tử khi gặp điều kiện khắc
nghiệt như thiếu chất dinh dưỡng, nhiệt độ cao,… Bào tử hình oval có khuynh hướng phình
ra ở một đầu. Thường thì người ta quan sát thấy quần thể của giống sinh vật này rất rộng lớn,
có hình dạng bất định và đang phát triển lan rộng .
1.3. Các phương pháp lên men sinh tổng hợp nattokinase
Để thu nhận được nattokinase, người ta thường sử dụng hai phương pháp lên men chính là
lên men bề mặt và lên men chìm, mỗi phương pháp có những ưu, nhược điểm khác nhau.
1.3.1. Phương pháp lên men bề mặt
Samruan và công sự (2012) lên men rắn đậu tương. Đậu tương được rửa sạch và làm ẩm
bằng cách ngâm trong nước 250C trong 12h. Sau đó, đậu tương được vớt ra, để ráo nước và
được chia nhỏ vào các túi, mỗi túi chứa 500g đậu, thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Sau khi
được làm nguội, mỗi túi được bổ sung 1ml canh trường có chứa bào tử B. subtilis SB-MYP-1
và lên men ở 370C trong 72h. Đậu tương sau lên men được sấy đông khô, đóng gói bằng cách
hút chân không và bảo quản ở 40C, phương pháp lên men này hướng tới sản phẩm có thể
dùng trực tiếp như một loại thực phẩm .
Chang và cộng sự (2012) khi tiến hành lên men rắn để thu nhận enzym chế phẩm, đậu tương
được làm ẩm đến 60 ÷ 70%, thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Được làm nguội sau đó được
trải ra các khay với độ dày lớp đậu khoảng 2 ÷ 3 cm và cấy giống với tỉ lệ 1:10 (v/wt), lên
men 370C trong 24h .
Ưu điểm
-
Đơn giản, dễ tiến hành
-
Dễ xử lý khi bị nhiễm cục bộ
Nhược điểm
-
Tốn nhân công
-
Tốn diện tích
-
Khó tự động hóa
-
Quy mô sản xuất nhỏ
1.3.2. Phương pháp lên men chìm
Saxena và cộng sự (2010) khi tiến hành lên men chìm thu nhận NK sử dụng môi trường với
thành phần (wt/v): glucose 10,0%, bột đậu tương 10,0%, K2HPO4 5,0%, MgSO4.7H2O 0,5%,
NaCl 0,5% và CaCl2 0,5%. Lên men bởi chủng Bacillus sp. trong 24h ở 370C với tốc độ lắc
120rpm sau đó li tâm thu dịch và xác định hoạt lực được 330 U/ml .
Zhou và cộng sự (2008) lên men chìm nhằm lựa chọn điều kiện thích hợp thu nhận NK sử
dụng môi trường với thành phần (wt/v): bột đậu tương 6%, dextrose 2%, CaCl2 0,06%,
MgSO4 0,07%. Lên men trong 48h ở 380C cho hoạt lực NK đạt 306,46 IU/ml .
Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu nhằm tối ưu hóa thành phần môi trường lên men lỏng để
14
Phạm Thị Quỳnh
Luận văn tốt nghiệp
thu được enzym có hoạt lực cao nhất như Kwon và cộng sự (2011) , Li và cộng sự (2011) và
còn nhiều nghiên cứu khác .
Ưu điểm
- Dễ tự động hóa và sản xuất ở quy mô công nghiệp
- Tốn ít diện tích xây dựng và lắp đặt dây chuyền
Nhược điểm
- Chi phí ban đầu cao
- Dễ nhiễm trùng toàn bộ
- Đòi hỏi công nhân phải có trình độ cao
1.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men chìm sinh tổng hợp
nattokinase
1.4.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Trong nghiên cứu của Liu và cộng sự (2005), khi tối ưu hóa điều kiện dinh dưỡng để sinh
tổng hợp NK bởi Bacillus natto NLSSE, đã sử dụng 5 nguồn cacbon là: glucose, saccarose,
maltose, xylose, glycerol với hàm lượng 20 g/l . Kết quả được thể hiện ở hình 1.4.
Hình 1.4. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng tổng hợp nattokinase
Hình 1.4.1a cho ta thấy, B. subtilis NLSSE sinh tổng hợp NK có hoạt lực cao trên môi
trường sử dụng nguồn cacbon là maltose, saccarose và glucose. Xylose và glycerol không
thích hợp và hầu như không có hoạt tính.
Một nghiên cứu khác về tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy nhằm tăng hoạt lực NK sinh
tổng hợp bởi Bacillus natto được tiến hành bởi tác giả Wang và cộng sự (2009) khi sử dụng 6
nguồn cacbon khác nhau là: crystal sugar, maltose, saccarose, glycerol, bột đậu tương và
glucose với hàm lượng 20g/l. Kết quả được thể hiện ở hình 1.5 .
15
Phạm Thị Quỳnh
Luận văn tốt nghiệp
Hình 1.5. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng tổng hợp nattokinase
Hình 1.5 cho ta biết maltose là nguồn cacbon thích hợp nhất để Bacillus natto sinh tổng hợp
NK, tiếp đến là glucose, glycerol, saccarose, crytal sugar và bột đậu tương.
Qua những nghiên cứu điển hình trên, ta nhận thấy rằng nguồn cacbon tốt nhất để vi khuẩn
Bacillus sử dụng là maltose, sau đó đến glucose. Trong điều kiện phòng thí nghiệm, đã lựa
chọn nguồn cacbon bổ sung là glucose để tiến hành các nghiên cứu.
1.4.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp NK của B. natto NLSSE,
Liu và cộng sự (2005) sử dụng môi trường có glucose 10 g/l, bổ sung K2HPO4.3H2O 1,0 g/l
và MgSO4.7H2O 0,5 g/l, với nguồn nitơ dùng để khảo sát là: (NH4)2SO4 3,5 g/l, NaNO3 10
g/l, sodium glutamate 21 g/l, casein 10 g/l, bột đậu tương 20 g/l, peptone đậu tương10 g/l.
Kết quả được thể hiện ở hình 1.6.
Hình 1.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng tổng hợp nattokinase
Hình 1.6 cho thấy, nguồn nitơ thích hợp để B. natto NLSSE sinh tổng hợp NK là pepton đậu
tương cho hoạt lực enzym 208,3U/ml, sau đó đến casein, sodium glutamate, bột đậu tương.
Khi sử dụng nguồn nitơ vô cơ, hoạt lực enzym thu được rất thấp so với nguồn nitơ hữu cơ .
16
Phạm Thị Quỳnh
Luận văn tốt nghiệp
Khi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp NK của
Bacillus lichniformis B4, AI-Juamily và cộng sự (2012) cũng đã chỉ ra kết quả tương tự như
trên hình 1.7.
Hình 1.7. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng tổng hợp nattokinase
Hình 1.7 cho thấy, pepton đậu tương, pepton và casein là 3 nguồn nitơ ảnh hưởng nhiều nhất
đến khả năng tổng hợp NK của Bacillus lichniformis B4 với hoạt lực enzym sau lên men
khoảng 50 U/ml, tiếp đến là các muối vô cơ có chứa nitơ: NH4Cl, NH3PO4, KNO3.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng nguồn nitơ là pepton để khảo sát ảnh hưởng của
hàm lượng nitơ bổ sung vào môi trường lên men đến khả năng tổng hợp NK của B. subtilis.
1.4.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống
Theo nghiên cứu của AI-Juamily và cộng sự (2012) tỉ lệ giống ảnh hưởng đến khả năng sinh
enzym của Bacillus lichniformis B4 trong điều kiện lên men lỏng sử dụng môi trường có
thành phần: nitơ và cacbon là 10 g/l, bổ sung thêm K2HPO4.3H2O 1 g/l, MgSO4.7H2O 0,5 g/l,
lên men 24h, 370C, nuôi lắc 180rpm. Kết quả được thể hiện ở hình 1.8.
Hình 1.8. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống đến hoạt lực enzym
17
Phạm Thị Quỳnh
Luận văn tốt nghiệp
Hình 1.8 cho thấy ở mật độ tế bào là 105 CFU/ml thì hoạt lực NK thu được cao nhất đạt
19,185 U/ml .
1.4.4. Ảnh hưởng của pH ban đầu
Bacillus sinh trưởng thích hợp trong khoảng trung tính (pH = 7).
Điểm đẳng điện của enzym NK là 8,6 và enzym này bền ở pH 7÷8 .
Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng pH ban đầu đến quá trình lên men lỏng với chủng Bacillus
lichniformis B4 tác giả AI-Juamily và cộng sự (2012) đã đưa ra kết quả hình 1.9.
Hình 1.9. Ảnh hưởng của pH đến khả năng tổng hợp nattokinase
Hình 1.9 đã chỉ ra rằng, pH thích hợp nhất để vi khuẩn Bacillus lichniformis B4 tổng hợp NK
cho hoạt lực cao là pH = 7,2 .
1.4.5. Ảnh hưởng của thời gian lên men
Al-Juamily và cộng sự (2012) cũng đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men
đến hoạt lực NK. Kết quả được thể hiện ở hình 1.10.
Hình 1.10. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hoạt lực nattokinase
Hình 1.10 cho thấy, hoạt lực NK sau lên men đạt 10,819 U/ml sau ngày thứ nhất và cao nhất
tại tời điểm 2 ngày là 15,766 U/ml, rồi giảm dần ở các ngày tiếp theo .
1.5. Kỹ thuật lên men có bổ sung cơ chất (fed-batch) trong sinh tổng hợp
nattokinase
18
Phạm Thị Quỳnh
Luận văn tốt nghiệp
Bên cạnh những phương pháp tối ưu điều kiện môi trường theo quy hoạch thực nghiệm,
một số nghiên cứu đã đi theo hướng lựa chọn kỹ thuật lên men. Lên men theo mẻ có bổ sung
cơ chất (fed-batch) là phương thức lên men trung gian giữa lên men theo mẻ và lên men liên
tục. Trong quá trình lên men cơ chất được bổ sung liên tục vào trong thiết bị lên men, nhưng
không có quá trình tháo dịch lên men ra. Lên men fed-batch được bắt đầu tương tự lên men
theo mẻ, đến một thời điểm nhất định cơ chất được bổ sung vào môi trường bắt đầu quá trình
fed-batch (hình 1.11). Tùy theo cách thức bổ sung cơ chất vào môi trường mà lên men fedbatch được chia thành một số loại sau:
- Substrate stat: cơ chất được cấp vào môi trường với tốc độ hoặc hàm lượng ổn định trong
một khoảng thời gian
- pH stat: sử dụng tín hiệu pH để cấp cơ chất vào môi trường sao cho pH luôn ổn định
- DOT stat: sử dụng hàm lượng oxi hòa tan trong dịch lên men làm tín hiệu để bổ sung cơ
chất vào môi trường
Hình 1.11. Động học của quá trình lên men fed-batch
Ưu điểm của phương pháp lên men này là thích hợp với các quá trình lên men sử dụng
mật độ tế bào cao, cơ chất được bổ sung dần dần trong quá trình lên men nên không ức chế vi
sinh vật, trong quá trình lên men có thể điều khiển tốc độ phát triển của vi sinh vật, do đó lên
men fed-batch thường cho hiệu suất tạo sản phẩm cao hơn so với lên men gián đoạn.
Trong các nghiên cứu đã được công bố về sản xuất nattokinase, các tác giả tập trung
nhiều trong các nghiên cứu tối ưu hóa thành phần lên men sử dụng kỹ thuật lên men trong
bình tam giác hoặc lên men theo mẻ trong các thiết bị lên men. Các công trình nghiên cứu về
kỹ thuật lên men fed-batch nhằm tăng cường khả năng sinh tổng hợp nattokinase không
nhiều.
Cho và cộng sự, 2010 đã sử dụng phương pháp pH stat để lên men fed-batch, chủng B.
subtillus trong quá trình lên men có mật độ tế bào tăng 2,5 lần so với lên men theo mẻ và hoạt
lực nattokinase thu được cũng tăng 2,1 [12].
Kwon và cộng sự, 2011 sử dụng cùng phương pháp pH stat fed-batch, glucose và pepton
được đồng thời đưa vào môi trường lên men với tỉ lệ thay đổi từ 0,2 đến 5 g glucose / g
pepton. Tác giả đã nhận thấy ở tỉ lệ 0,33 giữa glucose và pepton được cung cấp vào môi
trường lên men theo tín hiệu pH hoạt lực nattokinase tăng 4,3 lần so với quá trình lên men
19
Phạm Thị Quỳnh
Luận văn tốt nghiệp
theo mẻ [19]. Theo Unrean và cộng sự (2012), khi lên men fed-batch đối với chủng B. subtilis
K-C3 hoạt lực nattokinase tăng 20 lần so với lên men theo mẻ [38].
1.6. Tình hình nghiên cứu và sản xuất nattokinase ở trong nước
Nguyễn La Anh và Đặng Thu Hương (2006) đã tách chiết enzym nattokinase từ B. subtilis
NT5, trọng lượng phân tử khoảng 27kDa, pI 7,04, nhiệt độ tối ưu 600C và pH tối ưu 7,5; các
điều kiện ổn định enzym là Ca2+ và Mg2+ với nồng độ 5-10mM, pH 7-7,8; fibrinase đã được
áp dụng làm thực phẩm chức năng làm tan tơ huyết bệnh lý thử nghiệm trên 24 đối tượng và
cho kết quả khả quan [1].
Nguyễn Lan Hương và cộng sự (2011) cũng đã lựa chọn được chủng B. subtilis M1 và D
sinh tổng hợp natokinase cao từ các sản phẩm lên men truyền thống từ đậu tương [2], tìm ra
môi trường tối ưu cho phương pháp lên men chìm thu nhận nattokinase. Môi trường lên men
có hàm lượng bột đậu tương 4%, 0,5% pepton, 0,01% CaCl2 bổ sung giống 4% trong điều
kiện không điều chỉnh pH, lên men trong 22h ở 37oC, lắc 170 vòng/phút thì cho hoạt lực
enzym sau lên men cao nhất là 242 FU/ml [3]. Với mong muốn nâng cao hoạt lực sinh tổng
hợp nattokinase nhóm nghiên cứu đã sử dụng phương pháp lên men fed-batch. Kết quả cho
thấy hoạt lực nattokinase trong canh trường fed-batch gấp 7 lần so với hoạt lực trong canh
trường lên men theo mẻ [4].
Trong nghiên cứu của Lê Thị Bích Phượng và cộng sự (2012), đã lên men bề mặt trên môi
trường hạt đậu tương với quy mô 5 kg/mẻ thu được chế phẩm có hoạt lực nattokinase khoảng
470 FU/g [6].
Nguyễn Lan Hương và cộng sự (2014) đã thực hiện các nghiên cứu lựa chọn điều kiện lên
men bề mặt thích hợp ở quy mô pilot (100 kg nguyên liệu/mẻ), đồng thời quy trình công
nghệ sản xuất nattokinse theo phương pháp lên men bề mặt đã được hoàn thiện. Công ty CP
Sao Thái Dương đã phối hợp thực hiện dự án sản xuất thử nghiệm sản xuất chế phẩm
nattokinase ở quy mô 200 kg/tháng theo công nghệ này và đã xây dựng một phân xưởng sản
xuất chế phẩm nattokinase tại nhà máy của công ty chi nhánh Hà Nam. Hiện tại nhà máy đã
sản xuất thử 700 kg chế phẩm với hoạt lực đạt 7000-10.000 FU/g. Tuy nhiên sản phẩm còn
có hạn chế là mùi sản phẩm (mùi đặc trưng của sản phẩm lên men) chưa được ưa thích và giá
thành sản phẩm chưa có tính cạnh tranh do hoạt lực của chủng còn thấp [5]. Cho đến nay
trong nghiên cứu cũng như sản xuất nattokinase đều sử dụng nguyên liệu là đậu tương, đây là
nguyên liệu truyền thống lý tưởng cho lên men sinh tổng hợp nattokinase. Khô đậu tương
được sử dụng thay thế cho đậu tương là nghiên cứu đầu tiên được công bố ở nước ta.
Như đã nói ở trên, hàng năm nước ta vẫn nhập nattokinase về làm nguyên liệu cho sản xuất
thuốc và thực phẩm chức năng. Theo ước tính hàng năm của 5 doanh nghiệp sản xuất Dược
phẩm trong nước nhập khoảng 5-10 tấn chế phẩm nattokinase từ Mỹ, Nhật bản, Đài loan và
Trung quốc với giá từ 2,5 – 6 triệu đồng/kg. Các chế phẩm nattokinase nhập khẩu có hoạt lực
khoảng 10,000 FU/g, được bổ sung tá dược và đóng viên nang với hoạt lực khoảng 300 – 500
FU/viên. Hiện nay trên thị trường dòng sản phẩm chức năng chứa nattokinase được biết đến
như Nattospec (công ty Dược Á Âu), Nattotech (công ty DETECHBio), Tuần hoàn Não Thái
Dương, Vai Gái, Tamado (công ty CP Sao Thái Dương), An Thọ Minh (công ty Nata- Hoa
Linh), Phylcatol Extra (công ty CP SPM), Cardiospes (công ty Thiên Niên Kiện)... và nhiều
sản phẩm nhập khẩu từ Đài Loan, Hàn Quốc, Nhật Bản.
20
Phạm Thị Quỳnh
Luận văn tốt nghiệp
PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu, đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu
Khô đậu từ nhà máy sản xuất thức ăn gia súc Nam Thành – ga Tía - xã Văn Tự - huyện
Thường Tín – Hà Nội, được rang đến mầu vàng nâu và xay nhỏ thành bột mịn, được gọi là
bột khô đậu.
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu
Chủng B. subtilis D được nuôi cấy và bảo quản tại phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ Sinh
học, Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách khoa Hà Nội.
2.1.3. Hóa chất và thiết bị
2.1.3.1. Các loại hóa chất chính dùng trong nghiên cứu
•
Cao nấm men (Merk, Đức)
•
Trypton (MP Biomedical, Pháp)
•
Fibrin (MP Biomedical, Pháp)
•
Tris-HCl (Merk, Đức)
•
TCA (Merk, Đức)
•
Glucose, Peptone, NaOH; HCl; K2HPO4.3H2O; MgSO4.7H2O (Trung Quốc)
2.1.3.2. Các thiết bị được sử dụng
21
Cân điện tử Scaltex 10-2 (Đức)
Nồi hấp thanh trùng (Liên Xô)
Đo quang Nanodrop (Thermo, Mỹ)
Máy ly tâm Sorval Legend X1R (Soval, Đức)
Tủ nuôi cấy lắc ổn nhiệt – dung tích lớn (Taitec corporation, Nhật)
Máy lắc (Vision VS – 8480SF, Hàn Quốc)
Máy đo pH (Hanna, Ý)
Hệ thống lên men 2 lít và 10 lít (Sartorius, Đức)
Phạm Thị Quỳnh
Luận văn tốt nghiệp
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp vi sinh
Mật độ tế bào của canh trường hoạt hóa bằng phương pháp đo quang
Canh trường hoạt hóa được pha loãng đến nồng độ tế bào thích hợp (OD 600nm trong
khoảng 0.1 đến 1) và tiến hành định lượng mật độ tế bào vi sinh vật bằng phương pháp đo
mật độ quang ở bước sóng 600 nm.
2.2.2. Phương pháp hóa sinh
2.2.2.1. Phương pháp xác định hoạt lực nattokinase
Nguyên tắc: enzym nattokinase trong điều kiện thích hợp về nhiệt độ 370C và pH 7 sẽ
phân cắt các phân tử fibrin không tan tạo thành các phân tử peptid ngắn hơn, có khả năng hòa
tan trong dung dịch. Các peptid ngắn này hấp thụ quang tại bước sóng 275nm.
Định nghĩa: một đơn vị hoạt lực nattokinase được định nghĩa là lượng enzyme thủy
phân fibrin tạo sản phẩm tương đương với 1 µg tyrosine trong 1 phút ở nhiệt độ 370C.
Tiến hành:
Mẫu thí nghiệm
Mẫu kiểm chứng
500 µl Fibrin + 1300 µl Tris-HCl 0.1M 500 µl Fibrin + 1300 µl Tris-HCl 0.1M
10 phút/370C
10 phút/370C
200 µl enzyme
1000 µl TCA 1.5M
0
1giờ/37 C, thỉnh thoảng lắc
10 phút/370C, thỉnh thoảng lắc
1000 µl TCA 1,5M
10 phút/370C, thỉnh thoảng lắc
200 µl enzyme
10 phút/370C, thỉnh thoảng lắc
Ly tâm 10000 vòng/ 15 phút/ 40C
Đo quang 275 nm (ATN)
Ly tâm 10000 vòng/ 15 phút/ 40C
Đo quang 275 nm (AKC)
Cách tính hoạt lực
( Atn − Akc ) * D
(FU/ml)
a *t * m
Trong đó:
Atn - giá trị đo OD của mẫu thí nghiệm
Akc - giá trị đo OD của mẫu kiểm chứng
t - thời gian phản ứng (phút)
D - hệ số pha loãng enzym
m - lượng enzym cho phản ứng (ml)
a - hệ số quy đổi, xác định bằng đường chuẩn tyrosine
U=
2.2.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử
Nguyên tắc: phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử
22
Phạm Thị Quỳnh
Luận văn tốt nghiệp
với thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ
thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. So màu tiến hành ở bước
sóng 540nm. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS
sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.
Cách tiến hành:
Dịch lên men được ly tâm 10000 v/p, trong 10 phút ở 4oC, thu dịch trong. Lấy 200µl
dịch trong cho vào ống Eppendort, thêm 600 µl DNS (dinitrocalicylic axít) vào, trộn đều và
tiến hành phản ứng ở 95oC, trong 5 phút. Sau đó được làm mát trong đá 5 phút. Tiến hành đo
OD ở bước sóng 540 nm. Đường chuẩn được xây dựng với glucose là chất chuẩn. Dựa trên đồ
thị đường chuẩn sẽ xác định được hàm lượng đường khử trong dịch lên men.
2.3. Nội dung nghiên cứu
2.3.1. Hoạt hóa giống
Chủng B. subtisis D được hoạt hóa trong bình tam giác 250 mL chứa 50 mL môi trường NB
[2] ở nhiệt độ 370C, lắc 150rpm thời gian từ 18h.
2.3.2. Khảo sát một số điều kiện lên men
• Nồng độ bột khô đậu tương: môi trường lên men % (wt/v): glucose 0,5%, pepton
0,5%, hàm lượng bột khô đậu tương thay đổi từ 5 đến 20%.
• Ảnh hưởng của glucose bổ sung: thành phần môi trường % (wt/v): khô đậu tương
15%, pepton 0,5%, bổ sung thêm glucose từ 0 đến 2%.
• Ảnh hưởng của pepton bổ sung: thành phần môi trường % (wt/v): khô đậu tương
15%, glucose 1,5%, bổ sung thêm pepton trong khoảng từ 0 đến 2%
• Ảnh hưởng của pH ban đầu: thành phần môi trường % (wt/v): glucose 1,5%,
pepton 1,5%, khô đậu tương 15%, pH ban đầu được điều chỉnh ở 6 đến 9.
• Tỷ lệ giống: môi trường lên men % (wt/v): nguyên liệu 15%, glucose 1,5%, pepton
1,5%, hàm lượng giống bổ sung để lên men từ 2,5 đến 15% (v/v).
• Thời gian lên men: môi trường lên men % (wt/v): khô đậu tương 15%, glucose
1,5%, pepton 1,5%, giống được cấp vào 10%, lên men từ 1 đến 4 ngày.
Dich sau lên men được ly tâm 6000 v/p, 15 phút, ở 4oC, thu dịch trong để xác định
hoạt lực nattokinase.
2.3.3. Tối ưu hóa điều kiện lên men bằng quy hoạch thực nghiệm
Các yếu tố được đưa ra để xây dựng mô hình tối ưu là: hàm lượng glucose bổ sung, hàm
lượng peptone bổ sung và pH ban đầu. Hàm mục tiêu là hoạt lực nattokinase trong dịch sau lên
men. Quá trình tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp nattokinase được tiến
hành theo phương pháp bề mặt đáp ứng kiểu tâm xoay. Kết quả được xử lý bằng chương
trình Design-Expert 7.1.5 (State-Ease, Inc., Minneapolis, Mỹ), để phân tích các hệ số hồi quy,
23
Phạm Thị Quỳnh
Luận văn tốt nghiệp
sự có nghĩa của mô hình và bề mặt đáp ứng.
Bảng 2.1. Miền biến thiên của các yếu tố
Các yếu tố
Hàm lượng glucose bổ sung %(wt/v)
Hàm lượng pepton bổ sung %(wt/v)
pH ban đầu
Miền biến thiên
1÷2
1÷2
6÷9
2.3.4. Lên men sinh tổng hợp nattokinase của chủng B. subtilis D trong thiết bị lên
men quy mô PTN
Lên men theo mẻ trên thiết bị lên men 2L
Quá trình lên men theo mẻ được thực hiện trong hệ thống lên men 2L (hình
2.1) với 1L môi trường lên men. Giống được cấp 10% so với thể tích dịch lên men.
Hình 2.1. Hệ thống lên men 2L (Biostat B, Sartorius, Đức)
Các thông số được điều kiển như sau: nhiệt độ lên men 37 0C, pH 7,5 được điều
chỉnh tự động bằng bơm axit HCl 2N hoặc NaOH 2N vào thiết bị lên men, khuấy trộn
(200-800 rpm) và lưu lượng khí để khống chế hàm lượng oxi dư trong dịch 30 %.
Trong suốt quá trình lên men, dịch lên men được định kỳ lấy mẫu xác định hoạt lực
nattokinase và hàm lượng đường khử.
Lên men có bổ sung cơ chất (fed-batch) trên thiết bị 2L
600 ml môi trường lên men được đưa vào thiết bị lên men, giống cấp vào 100 ml.
Sau khoảng 7 h lên men, khi pH của dịch lên men hơn 7,5, bơn định lượng sẽ tự động
bơm dịch đường (glucose 15%) vào thiết bị lên men, dể duy trì pH của dich lên mên
ổn định là 7,5. Quá trình lên men diễn ra trong 36h, tổng thể tích kết thúc lên men đạt
khoảng 1 lít. Trong suốt quá trình lên men, dịch lên men được định kỳ lấy mẫu xác
định hoạt lực nattokinase và hàm lượng đường khử.
24
Phạm Thị Quỳnh
Luận văn tốt nghiệp
Lên men có bổ sung cơ chất (fed-batch) trên thiết bị 10L
Quá trình lên men được thực hiện tương tự như lên men fed-batch trên thiết bị lên
men 2L. Môi trường ban đầu lên men là 3,6 lít, kết thúc quá trình lên men tổng thể
tích đạt 6 lít. Dịch lên men được định kỳ lấy mẫu xác định hoạt lực nattokinase và
hàm lượng đường khử.
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp
nattokinase từ khô đậu tương
3.1.1 Nồng độ khô đậu tương
Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ khô đậu tương đến quá trình sinh tổng hợp nattokinase
theo phương pháp lên men chìm bằng chủng B. subtilis D được thực hiện với nồng độ khô
đậu tương thay đổi từ 5 đến 20% (wt/v). Kết quả hoạt lực nattokinase trong canh trường lên
men được biểu diễn ở hình 3.1.
Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ khô đậu tương đến hoạt lực nattokinase
Theo hình 3.1 khi tăng nồng độ khô đậu tương từ 5 đến 10% thì hoạt lực nattokinase tăng từ
30 đến 45 FU/ml nhưng khi tăng nồng độ khô đậu tương từ 10 đến 15% thì hoạt lực
nattokinase tăng từ 45 FU/ml đến 62,5 FU/ml, tăng tiếp nồng độ khô đậu lên 20% thì hoạt
lực nattokinase giảm xuống 54,5 FU/ml. Như vậy, nồng độ khô đậu tương 15% cho hoạt lực
nattokinase trong canh trường đạt được là cao nhất. Đã lựa chọn nồng độ khô đậu tương là
15% cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2. Nồng độ glucose bổ sung
25
Phạm Thị Quỳnh
