Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn 48 giống ngô địa phương bằng chỉ thị SSR

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Vũ Văn Hiến

Lớp: Công nghệ sinh học k13

LỜI CẢM ƠN
Hoàn thành chương trình thực tập tốt nghiệp này, em xin gửi lời cảm ơn trân
trọng đến thầy, TS. Nguyễn Văn Huấn, trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện
Sinh – Nông, Trường Đại học Hải Phòng và cô, TS. Lê Thị Bích Thủy, Trưởng
phòng Di truyền tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học
và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy em trong suốt thời gian
thực tập, làm thí nghiệm, phân tích số liệu và viết Báo cáo này;
Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các thầy, các cô Viện Sinh – Nông, Trường
Đại học Hải Phòng đã dạy dỗ, truyền đạt cho em những kiến thức cơ bản, chuyên
môn sâu rộng thuộc lĩnh vực công nghệ sinh học;
Xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến các anh, các chị công tác tại Phòng
Di truyền tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và
Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn, chỉ dạy, tạo điều kiện cho em thực tập, làm thí
nghiệm, giúp em có được kết quả tốt cho Báo cáo này;
Xin gửi lời cảm ơn đến các bạn lớp CNSH K13, Viện Sinh – Nông, Trường
Đại học Hải Phòng đã tích cực trao đổi, giúp đỡ tôi trong cuộc sống và học tập
suốt thời gian qua dưới mái trường Đại học Hải Phòng;
Cuối cùng, con xin ghi lòng, tạc dạ, đời đời nhớ ơn bố mẹ và gia đình không
chỉ có công sinh thành, dưỡng dục mà đã luôn quan tâm, động viên, lo lắng, trợ
giúp con đầy đủ cả về tinh thần và vật chất để con có thể hoàn thành tốt chương
trình học đại học.

Hải Phòng, tháng 4 năm 2016
VŨ VĂN HIẾN

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Vũ Văn Hiến

Lớp: Công nghệ sinh học k13

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AFLP

: Amplified fragment length polymorphism

cM

: Centimorgan

CTAB

: Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

DNA

: Deoxyribonucleic Acid

dNTP

: Deoxynucleoside triphosphate

EDTA

: Ethylenediaminetetraacetic acid

PCR

: Polymerase Chain Reaction

RAPD

: Random Amplified Polymorphism DNA

RFLP

: Restriction Flagment Polymorphism DNA

SSR

: Simple Sequence Repeats

TBE

: Tris- Boric acid- EDTA

EthBr

: Ethidium bromide

TE

: Tris – EDTA

Tris

: Trioxymetylaminometan


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Vũ Văn Hiến

Lớp: Công nghệ sinh học k13

MỤC LỤC
........................................................................................................................................... 2
MỤC LỤC........................................................................................................................... 3
PHẦN I: MỞ ĐẦU............................................................................................................... 8
1. 1 ĐẶT VẤN ĐỀ...............................................................................................................8
1.2. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU...........................................................................................9
1.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU.........................................................................................10
1.4. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU.................................................................10
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................................................11
2.1. NGUỒN GỐC, XUẤT XỨ VÀ PHÂN LOẠI CÂY NGÔ................................................11
2.2. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC CÂY NGÔ....................................................................11
2.3. ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở
NGÔ................................................................................................................................. 13
2.3.1. Chỉ thị phân tử........................................................................................................13
2.3.2. Nghiên cứu đa dạng di truyền của ngô...................................................................15
2.4. ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ ĐA DẠNG NGUỒN GEN CÂY NGÔ..............................16
2.5. VAI TRÒ CỦA CHỌN CẶP LAI TRONG CHỌN TẠO GIỐNG....................................17
PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................21
3.1. VẬT LIỆU................................................................................................................... 21

3.1.1 Mẫu ngô nghiên cứu và mồi SSR............................................................................21
Bảng 3.1. Các giống ngô sử dụng trong nghiên cứu........................................................21
Bảng 3.2. Các mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu..........................................................22
3.1.2. Hóa chất và thiết bị.................................................................................................22
3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................................23
3.2.1. Phương pháp tách chiết DNA genome...................................................................23
3.2.2. Phương pháp chạy PCR với các mồi SSR.............................................................25
Bảng 3.3. Hỗn hợp phản ứng PCR với các mồi SSR.......................................................25


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Vũ Văn Hiến

Lớp: Công nghệ sinh học k13

3.2.3. Phương pháp điện di trên gel agarose...................................................................26
3.2.4. Phương pháp kiểm tra sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide.............................27
2.2.3. Phương pháp phân tích số liệu...............................................................................29
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...............................................................................30
4.1. KẾT QUẢ TÁCH DNA GENOME...............................................................................30
Hình 4.1. Điện di DNA genome của đại diện một số mẫu ngô..........................................31
4.2. PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DNA BẰNG KỸ THUẬT SSR..................................................31
Hình 4.2. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Phi333597 với 24 giống
ngô, M: marker 100 bp (Biolabs).......................................................................................31
Tên giống: Số 51-giống 09N03, 52-09N05, 53- CML161, 54-DF18,.................................31
55- DF18C, 56- H02, 57- H042, 58- H1, 59-H12, 60- H14, 61- H31, 62- H35, 63-H46, 64H53, 65-H56, 66- H63, 67- H71, 68- H76, 69- H81, 70- H82,...........................................31
71- H84, 72- H99, 73- H145.............................................................................................31
Hình 4.3. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Umc1562 với 24 giống
ngô, M: marker 100 bp (Biolabs).......................................................................................32

Tên giống: Số 51- giống 09N03, 52- 09N05, 53- CML161, 54- DF18,..............................32
55- DF18C, 56- H02, 57- H042, 58- H1, 59- H12, 60- H14, 61- H31,..............................32
62- H35, 63- H46, 64- H53, 65- H56, 66- H63, 67- H71, 68- H76, 69- H81, 70-H82, 71H84, 72- H99, 73-H145, 35-Cây kháng, 36- Cây mẫn cảm...............................................32
Hình 4.4. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Umc 1249 với 24 giống
ngô, M: marker 100 bp (Biolabs).......................................................................................32
Tên giống : Số 51 -giống 09N03, 52- 09N05, 53- CML161, 54- DF18, 55- DF18C, 56H02, 57- H042, 58- H1, 59- H12, 60-H14, 61- H31, 62- H35, 63- H46, 64- H53, 65- H56,
66- H63, 67- H71, 68- H76, 69- H81, 70- H82, 71- H84, 72- H99, 73- H145, 35- Cây
kháng, 36-Cây mẫn cảm...................................................................................................32
Hình 4.5. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Umc1196 với 24 giống
ngô, M: marker 100 bp (Biolabs).......................................................................................33
Tên giống: Số 51-giống 09N03, 52- 09N05, 53- CML161, 54-DF18, 55-DF18C, 56-H02,
57- H042, 58-H1, 59- H12, 60- H14, 61- H31, 62- H35, 63- H46, 64- H53, 65- H56, 66H63, 67- H71, 68- H76, 69- H81, 70- H82, 71- H84, 72- H99, 73- H145, 35- Cây kháng,
36- Cây mẫn cảm............................................................................................................. 33
Hình 4.7. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Umc1908 với 24 giống
ngô, M: marker 100 bp (Biolabs).......................................................................................34


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Vũ Văn Hiến

Lớp: Công nghệ sinh học k13

Tên giống: Số 51-giống 09N03, 52- 09N05, 53- CML161, 54-DF18, 55- DF18C, 56- H02,
57- H042, 58- H1, 59- H12, 60- H14, 61- H31, 62 H35, 63- H46, 64- H53, 65- H56, 66H63, 67- H71, 68- H76, 69- H81, 70- H82, 71- H84, 72- H99, 73- H145, 35- Cây kháng,
36- Cây mẫn cảm............................................................................................................. 34
4.3. HỆ SỐ PIC TRÊN CÁC MỒI NGHIÊN CỨU..............................................................34
Bảng 4.1. Mức độ đa hình của 10 mồi SSR khi phân tích 48 giống ngô...........................35
4.4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÁC GIỐNG NGÔ...............36
Hình 4.8. Biểu đồ quan hệ di truyền giữa 48 giống ngô nghiên cứu.................................37

4.5. LỰA CHỌN CẶP LAI PHỤC VỤ CHO VIỆC CHỌN TẠO GIỐNG NGÔ KHÁNG BỆNH
MỐC HỒNG..................................................................................................................... 39
Bảng 4.2. Hệ số tương đồng di truyền giữa các giống ngô trong tổ hợp lai......................40
V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...........................................................................................41
5.1 KẾT LUẬN.................................................................................................................. 41
5.2 KIẾN NGHỊ................................................................................................................. 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................................42
......................................................................................................................................... 44


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Vũ Văn Hiến

Lớp: Công nghệ sinh học k13

DANH MỤC BẢNG BIỂU HÌNH VẼ

Bảng 3.1. Các giống ngô sử dụng trong nghiên cứu....Error: Reference source
not found
Bảng 3.2. 10 mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu..Error: Reference source not
found
Bảng 3.3. Hỗn hợp phản ứng PCR với các mồi SSR...Error: Reference source
not found
Bảng 4.1. Mức độ đa hình của 10 mồi SSR khi phân tích 48 giống ngô..Error:
Reference source not found
Bảng 4.2. Hệ số tương đồng di truyền giữa các giống ngô trong tổ hợp lai
......................................................................Error: Reference source not found

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Vũ Văn Hiến

Lớp: Công nghệ sinh học k13

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 4.1. Điện di DNA genome của đại diện một số mẫu ngô Error: Reference
source not found
Hình 4.2. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Phi333597
với 24 giống ngô...........................................Error: Reference source not found
Hình 4.3. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Umc1562
với 24 giống ngô...........................................Error: Reference source not found
Hình 4.4. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Umc 1249
với 24 giống ngô...........................................Error: Reference source not found
Hình 4.5. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Umc1196
với 24 giống ngô...........................................Error: Reference source not found
Hình 4.7. Ảnh điện di gel polyacrylamide sản phẩm PCR cặp mồi Umc1908
với 24 giống ngô...........................................Error: Reference source not found
Hình 4.8. Biểu đồ quan hệ di truyền giữa 48 giống ngô nghiên cứu........Error:
Reference source not found


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Vũ Văn Hiến

Lớp: Công nghệ sinh học k13

PHẦN I: MỞ ĐẦU
1. 1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây ngô có tên khoa học là Zea mays L. Ngô được gieo trồng rộng khắp
thế giới với sản lượng hàng năm cao hơn bất kỳ cây lương thực nào. Hoa Kỳ
là nước có sản lượng ngô lớn nhất thế giới, tiếp đến là các nước như Trung
Quốc, Brasil, Mexico, Argentina, Ấn Độ, Pháp, Indonesia, Nam Phi và Italia.
Sản lượng toàn thế giới năm 2003 là trên 600 triệu tấn - hơn cả lúa và lúa mì.
Năm 2005, gần 33 triệu ha ngô đã được gieo trồng trên khắp thế giới, với sản
lượng 692 triệu tấn. Đến năm 2009, diện tích trồng ngô thế giới đạt khoảng
159,5 triệu ha, năng suất bình quân 51,3 tạ/ha, sản lượng 817,1 triệu tấn.
Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau cây lúa và là
cây màu quan trọng nhất được trồng ở nhiều vùng sinh thái khác nhau, đa
dạng về mùa vụ gieo trồng và hệ thống canh tác. Cây ngô không chỉ cung cấp
lương thực cho người, vật nuôi mà còn là cây trồng xóa đói giảm nghèo tại
các tỉnh có điều kiện kinh tế khó khăn. Sản xuất ngô cả nước qua các năm
không ngừng tăng về diện tích, năng suất, sản lượng: năm 2001 tổng diện tích
ngô là 730.000 ha, đến năm 2005 đã tăng trên 1 triệu ha; năm 2010, diện tích
ngô cả nước 1126,9 nghìn ha, năng suất 40,9 tạ/ha, sản lượng trên 4,6 triệu
tấn. Song sản lượng ngô trong nước vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu trong nước,
9 tháng đầu năm 2009, nước ta đã nhập hơn 0,8 triệu tấn ngô (Cục Trồng
Trọt, 2009). Vì vậy, việc nghiên cứu tạo ra những giống ngô có năng suất cao
là một nhiệm vụ quan trọng và cấp bách.
Hiện nay, với sự phát triển nhanh chóng của các chỉ thị phân tử cung cấp
công cụ hữu ích cho việc đánh giá đa dạng di truyền ở mức ADN trên đối
tượng thực vật (Melcihnger and Gumber, 1988). Các chỉ thị RFLP, AFLP,


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Vũ Văn Hiến

Lớp: Công nghệ sinh học k13

SSR, STS, SCAR, RAPD,... là những chỉ thị được sử dụng rộng rãi trong
nghiên cứu di truyền các giống cây trồng nói chung và cây ngô nói riêng. Các
phương pháp này khắc phục được nhược điểm của phương pháp chọn giống
truyền thống bởi đánh giá được hệ gen của cây trồng. các chỉ thị dựa trên cơ
sở kỹ thuật PCR như RAPD, SCAR, SSR, STS hiệu quả và thuận lợi hơn so
với RFLP vì đơn giản và chỉ cần một lượng nhỏ ADN tách từ mẫu mô sử
dụng cho phân tích. Do vậy, việc chọn lọc có thể được tiến hành ngay từ giai
đoạn sớm. Trong đó, SSR được xem như dấu vân tay ADN của các kiểu gen
ngô vì mức độ đa hình cao đã được tìm thấy (Smith et al, 1997).
Ngoài việc đánh giá phân loại tập đoàn dựa trên đặc tính hình thái gần đây
người ta sử dụng một số kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng
di truyền của tập đoàn ngô và cho kết quả tốt, có nhiều hứa hẹn: SSR, AFLP,
đa hình nucleotide đơn (SNP- single nucleotide polymorphisms), nhân bản đa
hình vùng quan tâm (TRAP- target region amplification polymorphism), trình
tự gen mục tiêu (EST- expressed sequence tags).
Để khai thác nguồn tài nguyên di truyền cây ngô có hiệu quả, trước hết
phải nghiên cứu đánh giá sự đa dạng và mối quan hệ di truyền của các dòng
giống trong tập đoàn. Trên cơ sở đó có thể xác định được nguồn thực hiện
làm bố mẹ phục vụ tốt cho chương trình lai tạo giống. Chính vì vậy, chúng tôi
thực hiện đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn 48 giống ngô địa
phương bằng chỉ thị SSR” nhằm mục đích lựa chọn cặp lai bố mẹ phục vụ
cho việc chọn tạo giống ngô lai kháng bệnh mốc hồng.
1.2. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU
Đánh giá mức độ đa dạng di truyền của 48 giống ngô bằng chỉ thị SSR
nhằm lựa chọn cặp lai bố mẹ phục vụ cho việc chọn tạo giống ngô lai kháng
bệnh mốc hồng.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Vũ Văn Hiến

Lớp: Công nghệ sinh học k13

1.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Phân tích tập đoàn ngô địa phương Việt Nam với 10 chỉ thị SSR.
- Đánh giá đa dạng di truyền của tập đoàn 48 giống ngô địa phương
Việt Nam.
1.4. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
- Thời gian: từ tháng 12/2015 - tháng 5/2016.
- Địa điểm: Đề tài được thực hiện tại phòng Di truyền tế bào thực vật Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học công nghệ Việt Nam.


Vũ Văn Hiến

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Lớp: Công nghệ sinh học k13

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. NGUỒN GỐC, XUẤT XỨ VÀ PHÂN LOẠI CÂY NGÔ
Những nghiên cứu về nguồn gốc cây trồng của Vavilov (1926) đã cho
rằng Mexico và Peru là trung tâm phát sinh và đa dạng di truyền của ngô.
Mexico là trung tâm thứ nhất, vùng Andet (Peru) là trung tâm thứ 2 - tại đây
cây ngô đã trải qua quá trình tiến hóa nhanh chóng. Nhận định này của
Vavilov được nhiều nhà khoa học chia sẻ (Galinat, 1977; Wilkes, 1980; Kato,
1984, 1988). Năm 1893 Harshberger (theo Wilkes, 1988) đã kết luận ngô bắt

nguồn từ một cây hoang dại ở miền Trung Mexico trên độ cao 1500m của
vùng hạn hán có mưa mùa hè khoảng 350mm. Các nhà khảo cổ học đã tìm
thấy hóa thạch hạt phấn ngô ở Bellas Artes và mẫu hạt phấn ngô cổ nhất được
tìm thấy ở độ sâu 70m và xác định vào niên đại công băng, ít nhất cách đây
khoảng 60.000 năm. Cây ngô đã gắn bó chặt chẽ với đời sống của người dân
bản xứ Trung Mỹ; ngô được suy tôn như bậc thần thánh, được cúng tế lúc
gieo trồng và khi thu hoạch (Ngô Hữu Tình, 1977).
Từ loài Zea mays L., dựa vào cấu trúc nội nhũ của hạt được phân thành
các loài phụ. Những loài phụ chính gồm có (theo Ngô Hữu Tình, 1997):
Zea mays

subsp. indurata

sturt

- ngô đá

Zea mays

subsp. indentata

sturt

- ngô răng ngựa

Zea mays

subsp. ceratina

kulesh - ngô nếp

Zea mays

subsp. saccharata sturt

- ngô đường

Zea mays

subsp. everta

sturt

- ngô nổ

Zea mays

subsp. amylacea

sturt

- ngô bột

Zea mays

subsp. tunecata

sturt

- ngô bọc

2.2. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC CÂY NGÔ
Ngô có thân khá chắc, có đường kính từ 2-4cm tùy thuộc vào giống,
điều kiện sinh thái và chăm sóc. Thân có chiều cao khoảng 1,5-4m. Thân


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Vũ Văn Hiến

Lớp: Công nghệ sinh học k13

chính của cây ngô bắt nguồn từ chồi mầm, từ thân chính phát sinh ra nhánh
hay thân phụ từ các đốt dưới đất. Số nhánh dao động từ 1-10. Thân ngô
trưởng thành gồm nhiều lóng nằm giữa các đốt và kết thúc bằng bông cờ. Số
lóng và chiều dài lóng là chỉ tiêu quan trọng trong việc phân loại các giống
ngô. Lóng mang bắp có một rãnh dọc cho phép bắp bám và phát triển bình
thường.
Lá ngô thường có hình dải, gồm có bẹ lá ôm lấy thân, phiến lá dạng bản
(dải) và thìa lìa nằm giữa bẹ và phiến. Các giống khác nhau có sự thay đổi về
số, chiều dài, chiều rộng, độ dày, lông tơ, mà sắc, góc lá và gân lá. Số lá - một
đặc điểm khá ổn định có quan hệ chặt chẽ với số đốt và thời gian sinh trưởng.
Ngô có hệ rễ chùm tiêu biểu cho bộ rễ các cây họ Hòa thảo. Ngô có ba
loại rễ: rễ mầm, rễ đốt và rễ chân kiềng.
Ngô là loại cây có hoa đơn tính cùng gốc. Cơ quan sinh sản đực là bông
cờ nằm ở đỉnh cây, cơ quan sinh sản cái (bắp ngô) phát sinh từ chồi nách,
nhưng chỉ có 1-3 chồi khoảng giữa thân tạo thành bắp. Hoa đực xếp theo hoa
chùm gồm một trục chính và nhiều nhánh. Hoa đực mọc thành bông nhỏ
(bông chét hay gié). Mỗi bông nhỏ mang hai hoa, đôi khi một hoặc ba hoa.
Mỗi hoa có 3 nhị, mỗi nhị mang một bao phấn hai ô, mỗi ô phấn chứa

khoảng 1000 - 2500 hạt phấn. Mỗi bông cờ cho khoảng 10-30 triệu hạt phấn.
Hoa tung phấn rộ vào khoảng 8-10 giờ sáng và 14-16 giờ chiều. Bắp ngô là
cụm hoa cái hình bông, được bao bọc trong một số lớp lá, và được các lá này
bao chặt vào thân đến mức chúng không lộ ra cho đến khi xuất hiện các râu
ngô màu hung vàng từ vòng lá vào cuối của bắp ngô. Trên trục (lõi ngô) đính
hoa cái, hoa mọc từn đôi bông nhỏ. Mỗi bông nhỏ có hai hoa nhưng một hoa
thoái hóa, chỉ một hoa phát triển thành hạt. Chính giữa hoa cái là bầu hoa,
trên bầu hoa có vòi nhụy và núm nhụy vươn dài thành râu. Trên râu có nhiều
lông tơ và chất tiết làm cho hạt phấn bám vào và dễ nẩy mầm. Thời gian phun
râu thường sau tung phấn 1-5 ngày thùy thuộc vào giống và điều kiện tự
nhiên. Hiện tương tung phấn trước râu thường gặp nhiều ở điều kiện Việt
Nam, gọi là tính nhị chín trước. Ngược lại phun râu trước tung phấn gọi là


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Vũ Văn Hiến

Lớp: Công nghệ sinh học k13

tính nhụy chín trước. Ở điều kiện nước ta râu phun trong khoảng thời gian 512 ngày. Trên một bắp, hoa cái gần cuống phun râu trước rồi tiến dần lên đỉnh
bắp. Trên một cây ngô, bắp trên thường phun râu trước bắp dưới 2-3 ngày.
Các hạt ngô là các dạng quả thóc (dĩnh) gồm năm phần chính: vỏ, lớp
alơron, phôi, nội nhũ và chân hạt. Vỏ là một lớp màng mỏng bao xung quanh
hạt. Lớp alơron nằm dưới vỏ hạt, bao lấy nội và phôi. Nội nhũ là phần chính
của hạt chứa các tế bào dự trữ chất dinh dưỡng. Phôi ngô chiếm gần 1/3 thể
tích của hạt và gồm các phần: ngù - phần ngăn cách giữa nội nhũ và phôi; lá
mầm, trụ dưới lá mầm, rễ mầm và chồi mầm. Các hạt ngô có kích thước cỡ
hạt đậu Hà Lan, và bám chặt thành các hàng tương đối đều xung quanh một
lõi trắng để tạo ra bắp ngô. Mỗi bắp ngô dài khoảng 10 - 25 cm, chứa khoảng

200 - 400 hạt. Các hạt có màu như ánh đen, xám xanh, đỏ, trắng và vàng.
2.3. ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU ĐA
DẠNG DI TRUYỀN Ở NGÔ
2.3.1. Chỉ thị phân tử
Khi nghiên cứu đa dạng di truyền của thực vật thường sử dụng một số
chỉ thị phân tử như: RAPD (random ampilified polymorphic DNA), AFLP
(amplified fragment length polymorphism), SSR (simple sequence repeat) ...
2.3.1.1. Đa hình các đoạn DNA được nhân lên ngẫu nhiên (RAPD)
Kỹ thuật RAPD sử dụng mồi đơn, có trình tự ngẫu nhiên. Mồi là những
oligonucleotide có độ dài từ 9 đến 12 nucleotide, thường có hơn 60 % G+C để
đạt liên kết đủ mạnh. Các mồi ngẫu nhiên này ngắn cho nên khả năng tìm
được điểm gắn là không quá khó khăn. Kết quả của phản ứng RAPD sẽ tạo ra
nhiều đoạn DNA khác nhau về độ dài và trình tự. Ưu điểm của phương pháp
RAPD là nhanh, không đòi hỏi việc phân lập và đọc trình tự, có thể phát hiện
nhiều locus cùng một lúc, giá thành thấp, đơn giản. Mỗi mồi cung cấp số liệu
từ nhiều vị trí trong hệ gen, vì vậy, những đa hình hiếm giữa các mẫu có quan
hệ gần gũi có thể được phát hiện nhanh hơn với phân tích locus đơn. Tuy


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Vũ Văn Hiến

Lớp: Công nghệ sinh học k13

nhiên RAPD là chỉ thị trội nên không phân biệt được cá thể đồng hợp và dị
hợp. Bên cạnh đó, sự phát sinh đa hình giả ảnh hưởng lên sự thể hiện của các
đoạn RAPD do không chắc chắn các đoạn cùng kích thước từ hai mẫu DNA
khác nhau có thực sự được tạo ra từ cùng một vị trí trên hệ gen hay không. Kỹ
thuật này đòi hỏi phải nhác lại nhiều lần để kiểm tra độ tin cậy.

2.3.1.2. Đa hình các đoạn DNA nhân chọn lọc (AFLP)
Đây là một kỹ thuật chỉ thị phân tử dựa vào nguyên lý của PCR để nhân
các đoạn cắt hạn chế. Kỹ thuật này bao gồm nhiều bước, trước tiên DNA của
bộ gen được cắt bằng enzyme hạn chế endonuclease thành những đoạn DNA
khác nhau. Các đoạn DNA mang các đầu mút như nhau sẽ gắn vào các đoạn
nối (adaptor) cùng loại và một hay một số nucleotide chọn lọc. Đây là các
oligonucleotide đã biết trình tự, dùng để đánh dấu các đoạn DNA và có vai trò
khuôn đối với các cặp mồi PCR, chúng cho phép ta có thể nhân đồng thời tất
cả các đoạn DNA có đoạn nối giống nhau. Sự nhân chọn lọc được thực hiện
khi sử dụng các mồi có chứa một hay nhiều hơn các nucleotide chọn lọc.
Những nucleotide này giúp cho các mồi nhận ra các đoạn phân cắt đặc hiệu
mà có trình tự tương xứng hoàn toàn. Trình tự của mồi bổ sung với trình tự
của đoạn nối cộng thêm các nucleotide chọn lọc ở đầu 3’. Bằng cách làm
giảm số băng tách rời đủ để nghiên cứu đa hình. Ưu điểm của AFLP là có độ
đa hình cao, nhận dạng tới cá thể. Thông qua đó có thể tìm được những chỉ thị
liên kết rất chặt.
2.3.1.3. Các đoạn DNA lặp lại đơn giản (SSR)
Simple sequence repeat (SSR) là một chỉ thị phân tử quan trọng trong
nghiên cứu đa dạng di truyền ở lúa. Trong genome của Eukaryota tồn tại rất
nhiều các trình tự lặp lại rải rác như satellite, minisatellites, microsatellites.
Các đoạn lặp lại đơn giản (SSR) hay còn gọi là vi vệ tinh (microsatellites) là
những đoạn DNA ngắn gồm một số cặp nu liên tiếp, mỗi đơn vị có chiều dài
từ 4 đến 6 cặp base, số lượng đơn vị lặp lại thay đổi từ 1 đến 40 đơn vị.


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Vũ Văn Hiến

Lớp: Công nghệ sinh học k13

Những đoạn SSR phân bố ở đầu và cuối tâm động nhiễm sắc thể (NST) có tác
dụng bảo vệ và liên quan đến sự di truyền của NST.
Kỹ thuật SSR dựa trên nguyên lý PCR dùng các cặp mồi đặc hiệu để
nhân các đoạn trình tự SSR. Sự khác nhau trong cấu trúc đơn vị lặp lại dẫn
đến sự thay đổi độ dài đoạn lặp lại được nhân lên và xác định khi chạy điện di
trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide. Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi
trong nghiên cứu đa dạng di truyền trên nhiều đối tượng khác nhau. SSR phát
triển và được sử dụng rộng rãi do nó có khả năng phát hiện số lượng lớn các
đoạn trình tự lặp lại ở tất cả các cơ thể bậc cao, nó có tiềm năng cho đa hình
cao hơn và đơn giản hơn so với các chỉ thị phân tử khác. SSR là chỉ thị đồng
trội vì vậy nó chứa đựng thông tin cao. Tuy nhiên, nhược điểm của phương
pháp này là quá trình thiết kế mồi rất tốn kém do phải thiết kế mồi đặc hiệu
cho từng locus SSR khác nhau, có bao nhiêu locus SSR thì cần bấy nhiêu mồi
mà mỗi loại mồi lại chỉ đặc trưng cho một loài. Việc đọc trình tự SSR cũng
gặp nhiều khó khăn. Vì vậy, chỉ có một số loài được quan tâm như người, lúa,
ngô... được thiết kế mồi SSR.
Kỹ thuật này được ứng dụng trong chuẩn đoán những quần thể cách ly,
chọn lọc gen trong những gen biến nạp, trong lập bản đồ gen, nhận dạng các
giống cây trồng, đánh giá quan hệ di truyền và đa dạng ở nhiều loài cây.
Vì những ưu điểm trên, chúng tôi sử dụng chỉ thị SSR để nghiên cứu đa
dạng di truyền nhằm xây dựng cặp lai ngô kháng bệnh mốc hồng.
2.3.2. Nghiên cứu đa dạng di truyền của ngô
2.3.2.1 Nghiên cứu trên thế giới
Hiện nay có nhiều phương pháp để đánh giá đa dạng di truyền như
SSR, RAPD, AFLP, SLP… Trong đó kỹ thuật SSR được sử dụng phổ biến và
có hiệu quả cho đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen.
Yao và đồng tác giả (2007) đã nghiên cứu đa dạng nguồn gen của 54
giống ngô ở phía bắc của Trung Quốc sử dụng 42 chỉ thị SSR đã tìm ra được

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Vũ Văn Hiến

Lớp: Công nghệ sinh học k13

256 alen. Mỗi một chỉ thị cho dao động từ 2 đến 9 alen, số alen trung bình là
6,1 alen.
Legesse và đồng tác giả (2007) tiến hành đánh giá đa dạng của các
giống ngô Châu Phi. Số lượng giống đánh giá là 56 giống với 27 chỉ thị SSR.
Kết quả thu được 104 alen với mức độ trung bình 3,85 alen trên một locus, hệ
số PIC trung bình là 0,58.
Sharma và đồng tác giả (2007) đã tiến hành nghiên cứu đánh giá đa
dạng di truyền của 48 giống ngô ở phía đông bắc dãy Himalayan sử dụng 42
chỉ thị SSR. Nghiên cứu cho thấy có chỉ thị cho 13 alen, hệ số PIC là 0,6.
Bracco và đồng tác giả (2009) sử dụng 10 chỉ thị phân tử để đánh giá
các giống ngô ở phía đông bắc Argentina. Nghiên cứu tìm ra tổng số 65 alen,
trung bình là 7,22 alen trên 1 locus, hệ số PIC là 0,37
2.3.2.2 Nghiên cứu ở Việt Nam
Ở Việt Nam việc đánh giá đa dạng các nguồn gen cây ngô cũng được
các nhà khoa học quan tâm.
Lê Thị Minh Thảo và đồng tác giả (2014) đánh giá đa dạng di truyền
trên 24 giống ngô nếp tự phối sử dụng 19 chỉ thị SSR thu được 75 alen. Hệ số
PIC dao động trong phạm vi từ 0,36 đến 0,81. Số alen trung bình là 4
alen/locus.
Phan Xuân Hào (2013) đánh giá đa dạng di truyền trên 70 dòng ngô
mới dựa trên 35 chỉ thị phân tử SSR. Kết quả nghiên cứu chỉ ra hệ số tương
đồng di truyền dao động từ 0,23 đến 1,00. Khoảng cách di truyền giữa các
dòng tương đối lớn cho thấy sự khác biệt nhau về vật chất di truyền.

2.4. ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ ĐA DẠNG NGUỒN GEN CÂY NGÔ
Về mặt di truyền, bộ gen của cây ngô có 2n = 20 (n=10). Chiều dài tổng
cộng của các nhiễm sắc thể là 1.500 cM. Một số nhiễm sắc thể của ngô có cái
mà người ta gọi là "bướu nhiễm sắc thể": các vùng tạp sắc lặp đi lặp lại cao
với vết màu sẫm. Mỗi bướu riêng biệt là đa hình trong số các giống của cả
ngô lẫn cỏ ngô. Barbara McClintock đã sử dụng các bướu này để chứng minh
thuyết transposon của bà về các "gen thay đổi đột ngột", và với công trình này
bà đã đoạt giải Nobel năm 1983 trong lĩnh vực sinh lý học và y học. Ngô vẫn


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Vũ Văn Hiến

Lớp: Công nghệ sinh học k13

còn là sinh vật mẫu quan trọng cho di truyền học và sinh học phát triển ngày
nay.
Tại Hoa Kỳ có một kho trung tâm các đột biến ở ngô, The Maize Genetics
Cooperation - Stock Center, do Cục Nghiên cứu Nông nghiệp của Bộ Nông
nghiệp Hoa Kỳ (USDA) thành lập và nằm tại Khoa các khoa học cây trồng
của Đại học Illinois tại Urbana-Champaign. Tổng cộng bộ sưu tập có gần
80.000 mẫu. Bộ sưu tập này bao gồm vài trăm gen đã đặt tên, cộng với các tổ
hợp gen bổ sung và các biến thể có thể di truyền khác. Ở đây có khoảng 1.000
sai lệch nhiễm sắc thể (chẳng hạn các hoán vị hay nghịch đảo) và các nguồn
với số nhiễm sắc thể bất thường (như các dạng tứ bội). Dữ liệu di truyền miêu
tả các nguồn đột biến ở ngô cũng như vô số các dữ liệu khác về di truyền học
của ngô có thể truy cập tại MaizeGDB (Maize Genetics and Genomics
Database: Cơ sở dữ liệu di truyền học và bộ gen ngô).
Năm 2005, Quỹ Khoa học Quốc gia Hoa Kỳ (NSF), Bộ Nông nghiệp Hoa

Kỳ và Bộ Năng lượng Hoa Kỳ (DOE) đã xác định trình tự của ngô. Việc giải
mã trình tự bộ gen ngô là khá khó khăn do kích thước lớn và cách sắp xếp
phức tạp. Bộ gen ngô có 50.000-60.000 gen nằm rải rác trong 2,5 tỷ bazơ (các
phân tử tạo ra ADN) trên 10 nhiễm sắc thể (Jeff Bennetzen et al, 2009)
2.5. VAI TRÒ CỦA CHỌN CẶP LAI TRONG CHỌN TẠO GIỐNG
Chọn cặp lai bố mẹ có vai trò rất quan trọng trong tạo giống cây trồng,
nó quyết định sự thành công của công tác lai. Cặp bố mẹ được chọn phải đảm
bảo có khả năng kết hợp, khả năng tạo ra thế hệ con lai tốt, khả năng truyền
đạt tính trạng tốt của bố mẹ vào con lai.
Việc chọn cặp lai bố mẹ cần theo những nguyên tắc sau:
Nguyên tắc khác nhau về kiểu sinh thái địa lý: do kiểu hình của một
dạng thực vật là kết quả tương tác giữa kiểu gen và môi trường. Các giống và
các dạng thực vật trong quá trình chọn lọc tự nhiên hay chọn lọc nhân tạo


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Vũ Văn Hiến

Lớp: Công nghệ sinh học k13

được hình thành, thích nghi với một điều kiện khí hậu, đất đai nhất định. Bất
cứ cây trồng nào trên trái đất cũng có nhiều giống và dạng được hình thành
trong các điều kiện sinh thái, địa lý khác nhau. Khi chọn không nên chỉ dựa
vào loại hình sinh thái vì có khi xa nhau về điều kiện địa lý nhưng lại cùng
loại hình sinh thái. Khi chọn loại hình sinh thái nên chọn giống địa phương vì
nó có khả năng thích nghi cao, ổn định năng suất và khả năng truyền đạt di
truyền mạnh. Điều kiện sinh thái càng phức tạp, càng khắc nghiệt thì khi sử
dụng giống địa phương làm mẹ sẽ dễ dàng tạo ra các giống có tính thích ứng
cao. Muốn thành công trong chọn bố mẹ về loại hình sinh thái cần: nguồn vật

liệu sinh thái phong phú, bố mẹ cần được xác định chính xác, số lượng tổ hợp
lai lớn và sử dụng phương pháp chọn lọc cá thể chuẩn xác.
Nguyên tắc khác nhau về các yếu tố cấu thành năng suất: nếu xét năng
suất của một cây trồng thì năng suất trên một đơn vị diện tích do năng suất
từng cá thể và số cá thể trên đơn vị diện tích đó quyết định. Năng suất cá thể
cao và trồng được nhiều cá thể trên đơn vị diện tích là mục tiêu phấn đấu của
các nhà chọn giống. Năng suất cá thể được tạo nên bởi các yếu tố cấu thành
năng suất. Khi chọn bố mẹ nhằm nâng cao năng suất ở các thế hệ lai thì bố và
mẹ phải có sự khác nhau về các yếu tố cấu thành năng suất. Sự khác nhau trên
cần có khả năng bổ sung lẫn nhau, phối hợp với nhau để tạo ra giống mới
hoàn chỉnh hơn.
Chọn cặp lai bố mẹ căn cứ vào giai đoạn phát dục: do nhu cầu của sản
xuất mà đòi hỏi phải tạo ra các giống có thời gian sinh trưởng khác nhau từ
ngắn, trung bình đến dài. Để tăng vụ, tránh các điều kiện thời tiết bất lợi gây
thiệt hại cho mùa màng, cần có các giống ngắn đến cực ngắn, song năng suất
cần đạt yêu cầu. Để phát huy tối đa tự do tổ hợp của các kiểu gen quyết định
các pha sinh trưởng của cây nhằm tạo ra giống mới có thời gian sinh trưởng
theo ý muốn thì bố và mẹ dùng trong phép lai cần có cấu trúc, thời gian các
giai đoạn sinh trưởng khác nhau. Tương tự như nguyên tắc khác nhau về các


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Vũ Văn Hiến

Lớp: Công nghệ sinh học k13

yếu tố cấu thành năng suất, người ta có thể tạo ra các giống có thời gian sinh
trưởng ngắn hơn từ hai dạng bố mẹ có cùng thời gian sinh trưởng nếu các giai
đoạn sinh trưởng làm nên thời gian sinh trưởng của bố mẹ khác nhau.

Nguyên tắc khác nhau về tính chống chịu: các giống khác nhau có phổ
chống chịu khác nhau. Bố mẹ khác nhau sẽ bổ khuyết cho nhau về khả năng
chống chịu. Cây trồng vốn có tính chống chịu sâu bệnh nhờ thừa hưởng tính
di truyền của tổ tiên chúng, song tính chống chịu này đã yếu đi nhiều do có sự
bảo vệ của con người trong quá trình canh tác. Chọn tạo ra các giống vừa cho
năng suất cao, vừa chống chịu tốt với các loài sâu bệnh gây hại là mục tiêu
của bất kì chương trình chọn tạo giống nào. Mặt khác, ở mỗi vùng sinh thái
đặc thù thì tuy cùng là một loại bệnh nhưng ở mỗi vùng có các giống khác
nhau. Vì thế một giống có thể hoàn toàn kháng bệnh ở vùng này nhưng khi
chuyển sang vùng khác lại bị nhiễm bệnh. Một số cây có phổ kháng sâu bệnh
rộng, cùng lúc có thể chống được nhiều nòi sinh lý khác nhau. Khi chọn các
dạng bố mẹ cần chú ý sự khác nhau về tính kháng bệnh ngang để tổ hợp được
phổ kháng sâu bệnh rộng vào giống tương lai.
Chọn cặp bố mẹ cần phải bổ sung cho nhau những tính trạng cần thiết,
đặc biệt là tính trạng năng suất, chất lượng và khả năng chống chịu. Giống
cây trồng là sản phẩm của toàn thể loài người. Một giống cây trồng tốt sẽ
được con người nhân rộng ra nhiều vùng địa lý khác nhau. Nhờ đặc điểm này
mà một số giống tốt được tạo ra không có bó hẹp trong một khu vực. Nhập
nội giống cây trồng các tính trạng tốt là phương pháp nhanh đưa giống vào
sản xuất. Tuy nhiên, các giống cây mới tạo ra khi di chuyển từ vùng này sang
vùng khác tỏ ra còn khiếm khuyết ở một số sinh trạng quan trọng nào đó như
kém chịu rét, chống đổ không tốt, chất lượng chưa cao. Nói chung, các giống
mới được tạo ra theo các phương pháp tạo giống hiện đại đều là các kiểu gen
tốt, nhưng chúng chỉ còn thiếu một số tính trạng mà nếu được bổ sung thì sẽ
là một giống hoàn chỉnh.


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Vũ Văn Hiến

Lớp: Công nghệ sinh học k13

Khi lai xa, cần lưu ý chọn cặp lai bố mẹ thường là cây dại chiếm ưu thế
nên chọn cây trồng làm mẹ.
Trong chọn cặp lai bố mẹ đối với cây có củ, cần quan tâm đến động thái
sinh trưởng thân lá, động thái khác nhau cho kết quả khác nhau.
Như vậy, để xây dựng cặp lai bố mẹ cần tuân thủ nguyên tắc khác nhau
về sinh thái - địa lý, năng suất, khả năng chống chịu, giai đoạn ra hoa...là
những đặc điểm nông học của giống. Bản chất sự khác nhau này chính là khác
nhau về kiểu gen. Những giống có hệ số tương đồng di truyền càng thấp thì
sự khác nhau về hình thái cũng như đặc điểm sinh lý càng khác nhau. Nghiên
cứu đa dạng di truyền là một phương pháp cho kết quả chính xác trong thời
gian ngắn và kết quả có thể kết hợp với đặc điểm nông học của các giống lúa
để xây dựng cặp lai phù hợp.


Vũ Văn Hiến

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Lớp: Công nghệ sinh học k13

PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. VẬT LIỆU
3.1.1 Mẫu ngô nghiên cứu và mồi SSR
Nguyên liệu thực vật: 48 giống ngô của tập đoàn nghiên cứu do Viện
nghiên cứu Ngô cung câp.
Bảng 3.1. Các giống ngô sử dụng trong nghiên cứu
TT

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16

Tên giống
09N03
09N05
CML161
DF18
DF18C
H02
H042
H1
H12
H14
H31
H35

H46
H54
H56
H63

TT
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32

Tên giống
H71
H76
H81
H82
H84
H99

H145
H159
H162
H171
H245
H259
H262
H306
H411
H665

TT
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48

Tên giống

H675
H822
H901
H3A1
A3A2
IN1
T60M
TQ1
TQ2
TQ3
TQM
X122
X124
X126
X127
X128

Trình tự 10 cặp mồi SSR sử dụng để phân tích được thể hiện trên bảng
3.2 (Robertson - Hoyt et al., 2006; Chen et al., 2012).


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Vũ Văn Hiến

Lớp: Công nghệ sinh học k13

Bảng 3.2. Các mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu
TT

Tên

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Umc1594
Umc1524
Umc1562
Umc1935
Phi333597
Umc1908
Umc 1060
Umc1511
Umc1489
Umc1085

Left

Right

CACGCAACCCACTCATCACTC

CTCACCGCTCTGCTCTGCTATC

GCCGTCAACGGGCTTAAACT
TAGCTGCCCCTCTTCCGTCT
ATTGGAAGGATCTGCGTGAC
CAACGGAAGTGGCTGTAGAGTTTT
GAAAGTCGATCGAGAGACCCTG
CAGGAAAACGAAAACCCAGA
TCAGTGCTTTCATTGTAACGA
TTAATAGCTACCCGCAACCAAGAA
TACTGTGATGTGGCGGTGCT

GCCTCCAGCTCTCTCGTCTCTT
GTCGTGGCGTAGAGACTAGGGAT
CAGCTGGTGGACTGCATCTA
ACAGAGCATGTCAGGTATTTGCAG
CCCTCTCTTCACCCCTTCCTT
CTACGCGGGTCTCATCTCAT
ATAAACATCTTGCCAGCAAA
CTGAGCCACAGTACCTTGCTGTT
GCCACCTCTCACAGGTCTCAC

3.1.2. Hóa chất và thiết bị
Hóa chất
Bao gồm các hóa chất phục vụ cho tách chiết DNA tổng số, chạy phản
ứng SSR, điện di gel agarose và gel polyacrylamide.
Hoá chất tách chiết DNA bao gồm các loại sau: Nitơ lỏng, Tris-HCl,
EDTA, SDS, NaCl, CTAB, Chloroform, isopropanol, isoamyl alcohol,
ethanol, phenol, RNase của các hãng Sigma, Merck, Labscan.
Hóa chất thực hiện phản ứng PCR bao gồm buffer PCR 1X của Quiagen

hoặc Invitrogen; dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) của Fermentas; mồi,
Taq polymerase của Fermentas, H2O được khử ion.
Hóa chất điện di bao gồm các loại như: Bromophenol blue, ethidium
bromide, agarose, polyacrylamide, methylene bis-acrylamide, APS, TEMED,
urea, Tris base, boric acid, EDTA, HCl, marker 1 kb; marker 100 bp của hãng
Fermentas.
Thiết bị
Máy điện di gel agarose Msmidi (Cleaver Scientific, Mỹ)
Máy điện di gel polyacrylamide (Bio - Rad, Mỹ)
Máy PCR PTC-100 (MJ Research Inc, Mỹ)
Máy ly tâm thường và lạnh


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Vũ Văn Hiến

Lớp: Công nghệ sinh học k13

Máy chụp ảnh gel agarose CLS Microdoc (Cleaver Scientific, Mỹ)
Cân phân tích
Tủ lạnh thường và tủ lạnh sâu
Máy đo quang phổ UV-1601 (UV-Visble Spectrophotometer, Shimadzu)
Máy lắc, máy khuấy trộn
Bể ổn nhiệt
Nồi khử trùng
Các loại pipetman và ống eppendorf các loại
3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1. Phương pháp tách chiết DNA genome
DNA genome được tách từ các mẫu lá theo phương pháp CTAB (Cetyl

Trimethyl Ammonium Bromide) của Saghai Maroof và cộng sự (1984) có cải
tiến cho phù hợp với việc tách chiết DNA tổng số của các mẫu lúa. Quy trình
thực hiện như sau:
Lá của các giống ngô được cắt làm mẫu. Nghiền mẫu lá trong Nitơ
lỏng bằng cối chày sứ. Bột đã nghiền cho vào ống eppendorf 1,5 ml. Thêm
0,7 ml đệm CTAB đã làm ấm ở 650C trong 10 phút.
Để các ống trong bể ổn nhiệt ở điều kiện 65 0C trong 90 phút, lắc nhẹ
nhàng nhưng dứt khoát 15 phút một lần để việc tách có hiệu quả.
Chuyển các ống ở bể ổn nhiệt ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút. Thêm 0,7
ml dung dịch Chloroform/ Isoamyl alcohol (24: 1), lắc ống nhẹ nhàng 10
phút. Ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.

Dùng pipetman hút lớp trên cùng sang ống eppendorf 1,5 ml mới. Bổ sung
hỗn hợp Phenol/ Chloroform/ Isoamyl alcohol (25: 24: 1) theo tỉ lệ 1: 1, lắc
nhẹ trong 10 phút. Ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/ phút.


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Vũ Văn Hiến

Lớp: Công nghệ sinh học k13

Hút phần dịch trên sang ống eppendorf 1,5 ml mới, thêm 0,5 ml dung dịch
Chloroform/ Isoamyl alcohol (24: 1), lắc ống nhẹ nhàng 10 phút. Ly tâm với
tốc độ 10.000 vòng/ phút trong 10 phút.
Hút dịch nổi sang ống mới. Thêm Isopropanol theo tỉ lệ 1: 1. Sau đó xoay ống
nhẹ nhàng vài phút. Để mẫu ở tủ - 20 0C trong 1 giờ. Ly tâm tốc độ 10.000
vòng/ phút trong 10 phút.
Bỏ phần dịch phía trên thu lấy tủa. Rửa rủa bằng cồn 70 % lạnh. Sau đó, thổi

khô và hoà tan tủa bằng 0,5 ml TE pH 8,0.
Bổ sung RNase đã được đun cách thuỷ trong 20 phút, sau đó ủ ở 37 0C trong
180 phút.
Thêm cồn tuyệt đối lạnh theo tỉ lệ cồn: mẫu (2: 1), bổ sung 15 μl NaCl 5 M
sau đó lắc nhẹ. Ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 10 phút. Bỏ phần dịch nổi
phía trên, thu tủa và rửa tủa bằng cồn 70 % lạnh. Thổi khô tủa trong 20 phút ở
Laminar. Sau đó hoà tan tủa bằng TE. Giữ mẫu trong tủ 40C.
DNA genome sau khi tách chiết sẽ xác định hàm lượng và độ tinh sạch
bằng quang phổ hấp phụ. Phương pháp này được tiến hành như sau: đo OD ở
bước sóng 260 nm và 280 nm trên máy quang phổ kế UV-1601. Dựa vào sự
hấp thụ mạnh ở bước sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine của
phân tử DNA mạch kép và mạch đơn, người ta sẽ đo được giá trị mật độ
quang ở bước sóng 260 nm (OD 260 nm - Optical Density 260 nm) của các mẫu.
Ở bước sóng 280 nm, các protein có mức hấp thụ cao nhất, đồng thời cũng
hấp thụ ở bước sóng 260 nm như các axit nucleic và gây nên sự sai lệch giá trị
thật khi tính nồng độ acid nucleic.
Nồng độ DNA được tính theo công thức sau
CDNA (µg/µl) = OD260 x 50 x hệ số pha loãng.
Độ sạch DNA = OD260 /OD280 (OD260, OD280 là chỉ số đo được ở bước
sóng 260 nm và 280 nm)


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Vũ Văn Hiến

Lớp: Công nghệ sinh học k13

Một dung dịch acid nucleic được coi là sạch (không lẫn protein) khi tỉ số
OD260 nm /OD280 nm nằm trong khoảng 1,8 - 2,0.

Các bước tiến hành
Lấy 1 ml dung môi hoà tan DNA (TE pH 8,0 hoặc nước khử ion vô
trùng) cho vào cuvette đo làm đối chứng. Cho 5 μl dung dịch DNA cần đo
nồng độ vào 995 μl dung môi hoà tan DNA (pha loãng 200 lần). Sau đó cho
vào cuvette và đo OD ở bước sóng 260 nm và 280 nm. Từ kết quả đo được,
tính nồng độ DNA theo công thức trên.
Dựa vào nồng độ để pha loãng DNA ra nồng độ 25 ng/ μl bằng nước để
chuẩn bị chạy PCR với các mồi SSR theo công thức
N1 × V1 = N2 × V2
Trong đó N1: Nồng độ DNA ban đầu
V1: Thể tích cần lấy để pha
N2: Nồng độ DNA cần pha
V2: Thể tích cần pha
Kiểm tra DNA tách chiết đã được pha loãng bằng cách điện di trên gel
agarose 1 %. Gel agarose được nhuộm trong ethidium bromide và chụp ảnh
dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 - 260 nm trên máy chụp ảnh gel CLS
- Microdoc (Cleaver Scientific Ltd, Mỹ).

3.2.2. Phương pháp chạy PCR với các mồi SSR
* Hỗn hợp phản ứng PCR 20 μl (Bảng 3.3)
Bảng 3.3. Hỗn hợp phản ứng PCR với các mồi SSR
STT
1

Thành phần
H2O

Thể tích (µl)
13,4 µl