Nghiên cứu mức độ biểu hiện LncRNA GAS5 trong bệnh ung thư biểu mô dạ dày

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư dạ dày là bệnh lý tiêu hóa thường gặp, là nguyên nhân thứ 3
gây tử vong trong các bệnh ung thư, tăng 7% ca ung thư mới mắc và 10% ca
tử vong do ung thư mỗi năm [2]. Trước những năm 1930, hầu hết các nước
trên thế giới, bao gồm cả các nước châu Âu, ung thư dạ dày là nguyên nhân
gây nên tử vong chính do ung thư. Dần dần sau đó, tỷ lệ này được giảm xuống ở
nhiều vùng. Tuy nhiên, ở khu vực châu Á, châu Phi – nơi có chất lượng đời sống
còn thấp – thì tỉ lệ mới mắc và tỷ lệ tử vong vẫn còn ở mức cao. Trong đó, theo
thống kê của Tổ chức ghi nhận ung thư toàn cầu (IARC), mỗi năm, ở nước ta, có
từ 11.000 – 12.000 người mắc mới ung thư dạ dày và hơn 8.000 người tử vong
[5]. Con số này được đánh giá là khá cao, vì thế sự hiểu biết về căn bệnh này để
có các biện pháp phòng tránh, chữa trị kịp thời là rất cần thiết.
Sinh học phân tử là môn khoa học về giới sinh vật ở cấp độ phân tử,
chủ yếu tập trung nghiên cứu mối tương tác giữa các hệ thống cấu trúc khác
nhau trong tế bào, bao gồm mối quan hệ qua lại giữa quá trình tổng hợp của
DNA, RNA và protein; và tìm hiểu cách thức điều hòa các mối tương tác này.
Trên thế giới, sinh học phân tử đã có những bước nghiên cứu phát triển vượt
bậc và áp dụng rỗng rãi không chỉ trong nghiên cứu mà còn cả trong điều trị
lâm sàng. Ở Việt Nam, các đề cương, chính sách, đề án nghiên cứu về sinh
học phân tử trong y tế đã và đang được xây dựng và triển khai thực hiện. Bên
cạnh đó, cơ sở hạ tầng phục vụ cho nghiên cứu và đào tạo nguồn nhân lực về
sinh học phân tử cũng nhận được nhiều ưu tiên. Trình độ nghiên cứu và ứng
dụng công nghệ sinh học phân tử được đẩy mạnh, góp phần đáng kể trong
việc điều trị và tiên lượng nhiều chứng bệnh khác nhau, đặc biệt là ung thư. Ở
Việt Nam, trong những năm gần đây, nhiều công trình nghiên cứu khoa học


2

về sinh học phân tử đã được công bố với nhiều kỹ thuật sinh học phân tử khác
nhau được áp dụng. Nhưng các nghiên cứu về mức độ biểu hiện của các gen
điều hòa thì chưa nhiều.
Một số nghiên cứu trên thế giới đã đề cập đến vai trò điều hòa, biểu
hiện của một số loại gen đối với ung thư người; giúp cho việc điều trị và tiên
lượng bệnh được tốt hơn. Một trong số đó là LncRNA GAS5 (Long
noncoding RNA). LncRNA GAS5 là một RNA được cho là không mã hóa
protein nhưng nó có khả năng điều hòa sự sinh trưởng và phát triển của tế
bào. Những nghiên cứu này đã chỉ ra rằng: mức độ biểu hiện LncRNA GAS5
có sự thay đổi ở các tế bào ung thư của một số bệnh ung thư như ung thư vú,
ung thư gan, ung thư thận, ung thư cổ tử cung… và cả ung thư dạ dày.
Xuất phát từ ý tưởng đó chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu mức
độ biểu hiện LncRNA GAS5 trong bệnh ung thư biểu mô dạ dày”, với mục
tiêu chính là:
Đánh giá mức độ biểu hiện gen GAS5 trong bệnh ung thư biểu mô dạ dày.


3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ BIỂU MÔ DẠ DÀY

Dạ dày là phần phình to nhất của ống tiêu hóa và có hình chữ J, nằm ở
vị trí giữa đoạn bụng của thực quản và ruột non. Với chức năng chính là co
bóp và nghiền trộn thức ăn, dạ dày được cấu tạo bởi 3 lớp cơ: cơ dọc, cơ vòng
và cơ chéo.
Ung thư dạ dày là một khối u ác tính và có thể phát triển bất cứ phần
nào của dạ dày. Trong đó, vào khoảng 90% trường hợp ung thư dạ dày là ung
thư biểu mô tuyến (adenocarcinoma) [28].Trong 10% còn lại được phân loại

về mô bệnh học bao gồm: ung thư tế bào tuyến vẩy, các u nội tiết, u mô đệm
đường tiêu hóa và lymphoma [3].
1.1.1. Dịch tễ học
Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO), năm 2012, trên thế giới có 950.000
người mắc ung thư dạ dày và gây ra 723.000 ca tử vong [2]. Trong các loại ung
thư theo giới, ung thư dạ dày đứng thứ 3 ở nam và xếp thứ 5 đối với nữ [4].
Các nước có tỷ lệ mắc ung thư dạ dày cao thuộc vùng Đông Á (Nhật
Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc), Liên Xô cũ, Nam Mỹ, châu Phi, vùng Caribe
và Nam Âu. Các nước có tỷ lệ mắc bệnh thấp thuộc vùng Nam Á (Ấn Độ,
Pakistan, Thái Lan), Bắc Mỹ, Úc[4].
Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc ung thư dạ dày khá cao, đứng thứ 2 sau ung thư
phổi ở nam giới và ung thư vú ở nữ [5]. Theo Bùi Xuân Trường và cs, ghi
nhận ung thư dạ dày có sự khác nhau giữa hai giới và hai miền Nam Bắc [3].


4

Bảng 1.1. Tỷ lệ mắc ung thư dạ dày theo giới ở một số tỉnh ở Việt Nam
Nguồn: Ung thư dạ dày, Trần Thiện Trung (2014)
Hà Nội
Tỷ lệ mắc chuẩn theo
tuổi (ASR)/100.000 dân Nam Nữ
Giai đoạn 2001-2004
30,3 15,0
Giai đoạn 2005-2008
30,1 14,9

Hải Phòng
Nam Nữ
16,0 8,1

16,6 6,9

Thái Nguyên

Nam
15,4
13,7

Nữ
6,7
6,6

Huế
Nam Nữ
14,4 7,3
14,5 7,9

Cần Thơ
Nam Nữ
19,4 6,8
15,2 5,6

1.1.2. Các yếu tố nguy cơ
•

Tuổi và giới: ung thư dạ dày thường gặp ở lứa tuổi trên 40. Tỷ lệ
ung thư dạ dày tăng theo tuổi. Cao ở 50-65 tuổi, tỷ lệ cao nhất ở
nhóm tuổi >75. Nam giới hay gặp hơn nữ giới tỷ lệ báo cáo là 2/1,

•

có báo cáo đến 4/1 [3].
Yếu tố gia đình hoặc di truyền là các yếu tố nguy cơ cao có thể mắc
ung thư dạ dày. Một số báo cáo cho rằng, tỷ lệ bệnh nhân có nhóm
máu A gặp nhiều hơn nhóm máu khác đến 15-20% và khi bố mẹ
hoặc anh chị em ruột bị ung thư dạ dày thì nguy cơ bị ung thư dạ

•

dày cũng cao hơn hẳn [2],[3].
Chế độ ăn có nhiều nitrate ở trong các thức ăn như thịt hun khói, thịt
cá ướp muối, thịt nướng cháy, dầu mỡ rán lại nhiều lần làm tăng

•

nguy cơ bị mắc ung thư dạ dày.
Người có bệnh viêm dạ dày mạn tính, viêm dạ dày kèm dị sản ruột,
loạn sản hoặc có hiện tượng trào ngược tá tràng dạ dày có thể được

•

coi là thương tổn tiền ung thư dạ dày.
Loét dạ dày không làm tăng nguy cơ mắc ung thư dạ dày. Tuy
nhiên, Helicobacter Pylory, nguyên nhân hàng đầu của viêm và loét
dạ dày lại là một yếu tố nguy cơ quan trọng đối với ung thư dạ dày.


5

1.1.3. Chẩn đoán lâm sàng

Triệu chứng lâm sàng của ung thư dạ dày diễn biến rất âm thầm, lặng lẽ
kéo dài trong nhiều năm và không điển hình. Khi các triệu chứng lâm sàng rõ
ràng thì đã muộn. Do đó, việc chẩn đoán ung thư dạ dày sớm gần như chỉ dựa
vào việc khám định kỳ.
Các triệu chứng này bao gồm: đau thượng vị, sút cân nhanh, đầy bụng
chậm tiêu, chán ăn, nôn và buồn nôn [6]. Những triệu chứng này dễ nhầm lẫn
với các triệu chứng của các bệnh lí lành tính khác. Khi ở giai đoạn muộn thì
có thể tự sờ thấy khối u ở vùng dạ dày.
Bên cạnh đó, biểu hiện lâm sàng còn tùy thuộc vào vị trí của ung thư,
ví dụ ung thư ở tiền môn vị thường gây biến chừng hẹp môn vị và triệu chứng
nôn ói sớm giúp bệnh nhân đi khám và phát hiện bệnh sớm hơn.
Các triệu chứng nêu trên chỉ là gợi ý. Để chẩn đoán chính xác cần cho
bệnh nhân tiến hành các xét nghiệm chẩn đoán cận lâm sàng phù hợp để chẩn
đoán chính xác và đánh giá giai đoạn của ung thư.
1.1.4.Chẩn đoán cận lâm sàng
1.1.4.1. Nội soi:
Nội soi là thăm dò cận lâm sàng phổ biến nhất hiện nay để chẩn đoán
ung thư dạ dày. Nhờ đó, ta biết được vị trí tổn thương và thể bệnh. Ung thư dạ
dày được chẩn đoán xác định nhờ sinh thiết trong nội soi.
1.1.4.2. X-quang dạ dày
Trong nhiều năm trước, X-quang là phương pháp chủ yếu chẩn đoán
ung thư dạ dày với độ nhạy 40-80% [5]. Phim chụp X-quang chẩn đoán được:
vị trí ung thư, mức độ tổn thương và lan rộng của ung thư, hình thái và các
dạng của tổn thương. Tuy nhiên, X-quang vẫn bỏ sót 15% trường hợp ung thư
dạ dày [5]. Để giúp chẩn đoán chính xác hơn, có thể dùng phương pháp đối
quang kép, với độ chính xác khoảng 90% [2].


6

1.1.4.3. Các xét nghiệm khác
•

Siêu âm ổ bụng: là phương tiện chẩn đoán hình ảnh được sử dụng
thường quy trong kiểm soát và chẩn đoán các bệnh khác trong ổ
bụng. Do đó, nó giúp tìm di căn và đánh giá giai đoạn ung thư dạ

•

dày.
Chụp cắt lớp vi tính CT: với độ chính xác về vị trí cao, chụp cắt lớp

•

CT giúp phát hiện chính xác vị trí của khối u và tình trạng di căn.
Các xét nghiệm cơ bản: các dấu ấn ung thư tăng cao như CEA, CA
19-9, CA 72-4. Tuy nhiên, các dấu ấn này chỉ tăng cao rõ rệt khi
ung thư dạ dày ở giai đoạn muộn và có giá trị cao trong điều trị,
theo dõi ung thư dạ dày [6],[7].

1.2. TỔNG QUAN VỀ LncRNA GAS5

1.2.1. Cấu trúc và chức năng của gen
Năm 1953, Watson – Crick phát hiện ra cấu trúc xoắn kép của DNA
đánh dấu bước phát triển của sinh học phân tử vào giai đoạn mới [8]. Đỉnh
cao nghiên cứu gần đây là vào năm 2003, công bố phiên bản thô của bộ gen
người hoàn chỉnh [8]. Gen là một đoạn phân tử DNA mang thông tin mã hóa
một sản phẩm xác định (một chuỗi polypeptid hay một phân tử RNA) [9].

Hình 1.1. Cấu trúc chung của gen

(Nguồn:)


7

Về cơ bản thì cấu trúc của gen gồm 3 vùng: vùng điều khiển, vùng
mang thông tin di truyền và vùng kết thúc. Vùng mang thông tin di truyền hay
còn gọi là vùng mã hóa bao gồm các vùng mã hóa (exon) nằm xen kẽ với các
vùng không mã hóa (intron).
Mặc dù mang thông tin di truyền, nhưng phân tử DNA không phải là
chất làm khuôn để tổng hợp protein mà cần phải có một chất trung gian làm
nhiệm vụ chuyển thông tin di truyền từ DNA và làm khuôn cho quá trình tổng
hợp protein. Đó chính là RNA. Quá trình sao chép thông tin di truyền từ DNA
thành RNA gọi là sự phiên mã. Sau khi phiên mã, các mRNA loại bỏ các
intron, tham gia quá trình dịch mã tạo thành protein và biểu hiện ra tính trạng
bên ngoài.
Quá trình biểu hiện của gen ngoài sự tham gia của các yếu tố phiên mã,
còn có sự tham gia của các yếu tố protein, các RNA, trong đó có piRNA,
small nucler RNA, siRNA,… và có cả LncRNA.
1.3.2. Sơ lược về Long noncoding RNA (LncRNA)
Trong 50 năm, thuật ngữ gen được hiểu đồng nghĩa với những vùng
RNA thông tin (mRNA) mã hóa cho bộ gen. Tuy nhiên, các nghiên cứu gần
đây đã chỉ ra rằng: 90% bộ gen của sinh vật nhân thật được sao mã, trong
đó chỉ một lượng rất nhỏ (khoảng 2-3%) các gen mã hóa protein, còn lại là
các RNA không mã hòa protein (noncoding RNA - ncRNA) [10]. Các
ncRNA này đã được chứng minh có liên quan đến nhiều cơ chế kiểm soát
sự biểu hiện của gen ở mọi cấp độ truyền thông tin di truyền từ DNA đến
protein [10]. Chúng bao gồm sửa đổi các cấu trúc nhiễm sắc thể (methyl
hóa và sửa đổi histone), điều hòa phiên mã bằng cách điều chế các hoạt
động của RNA polymerase và các yếu tố phiên mã, sửa đổi RNA, ổn định

mRNA và dịch mã [11].
LncRNA là nhóm ncRNA lớn nhất và đang được các nhà khoa học trên
thế giới hết sức quan tâm. Chúng là các RNA không mã hóa protein và có


8

chiều dài tối thiểu là 200 nucleotid, cũng có thể là các mRNA giống ncRNA.
Từ năm 1961, Jacob và Monod đã bắt đầu suy luận về sự tồn tại của mRNA
và giảng giải về mô hình điều hòa gen, và họ suy đoán rằng sự ức chế có thể
là do một phân tử RNA [13]. Nhưng mãi đến tận năm đầu thập kỉ 90 của thế
kỉ trước, các nhà khoa học mới tìm ra được LncRNA đầu tiên – đó là Xist
[14]. Sau đó, làng loạt LncRNA đã được báo cáo là phát hiện ra ở các động
vật có vú khác.
1.2.3. GAS5 (Growtharrest-specific5)
GAS5 là một LncRNA, được Smith và Steits thuộc đại học Yale Hoa
Kỳ phát hiện năm 1998 và được định danh bởi Ủy ban danh mục gen HUGO
– HGNC (HUGO Gene Nomenclature Committee) [18]. GAS5 thuộc họ 5’Terminal Oligopyrimidine (5’ TOP), gen gồm 12 exon, các exon này kết hợp
lại tạo thành hai LncRNA là GAS5a và GAS5b khi có sự thay đổi vị trí 5’ tại
exon 7 [18],[19]. Người ta cho rằng, một phần cấu trúc của GAS5 giống với
các yếu tố phản ứng glucocorticoid. Do đó, nó có thể gắn vào DNA ở vị trí
của vùng liên kết receptor glucocorticoid. Từ đó, ngăn chặn sự hoạt động của
receptor glucocorticoid và điều hòa quá trình phiên mã.
Trong các nghiên cứu gần đây cho thấy, LncRNA GAS5 có mức độ
biểu hiện thấp trong các tế bào ung thư, như ung thư cổ tử cung, ung thư tế
bào biểu mô gan, ung thư tế bào biểu mô thận và nhiều loại ung thư khác
[15],[20],[21]. Mức độ biểu hiện này có liên quan đến đặc điểm bệnh lí, giai
đoạn bệnh và có giá trị trong tiên lượng [18].
Năm 2014, Ming Sun và cộng sự đã nghiên cứu trên 89 bệnh nhân ung
thư dạ dày nhận thấy sự biểu hiện của GAS5 trong mô ung thư dạ dày là thấp.

Mức độ biểu hiện thấp của GAS5 liên quan với kích thước u, giai đoạn ung
thư và tiên lượng bệnh. Thực nghiệm trên chuột, khi tiêm GAS5 khối u sẽ nhỏ
lại [18].


9

1.3. CÁC KỸ THUẬT ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN LncRNA

1.3.1. PCR (Polymerase Chain Reaction)
Năm 1971, Khorana và cộng sự đã mô tả phương pháp tiếp cận để
khếch đại một vùng trong chuỗi đôi DNA. Nhưng mãi tận 14 năm tiếp sau đó,
năm 1985, Kary Mullis và cộng sự mới đề xuất kỹ thuật PCR và triển khai kỹ
thuật tại Cetus Corporation, nơi ông và các cộng sự làm việc [8],[17]. Mục
đích chính của PCR là sao chép và khuếch đại một phân đoạn ngắn DNA
trong ống nghiệm.
Vì vậy, trong ống nghiệm làm PCR cần có đầy đủ nguyên vật liệu cần
thiết để việc sao chép gen và khuếch đại gen được đảm bảo.
- Dung dịch đệm có Tris-HCl, KCl, MgCl 2 theo tỉ lệ nhất định. Trong
đó, MgCl2 là một trong những thành phần quan trọng nhất của PCR do nồng
độ của chất này ảnh hưởng đến sự đặc hiệu và hiệu suất của phản ứng.
Thường nồng độ tối ưu để DNA polymerase hoạt động tốt là 1,2-1,3 mM
Mg2+ tự do [17].
- dNTPs gồm 4 loại dNTP là A, T, G, C. Dung dịch này đã được pha
sẵn với nồng độ phân tử bằng nhau. Nồng độ của các dNTP được duy trì
trong khoảng 50-200 µM [17]. Đây là nồng độ tối ưu cho việc DNA
polymerase hoạt động đạt hiệu quả tốt nhất.
- Mồi: gồm 2 loại là mồi xuôi và mồi ngược. Phức hợp mồi này là cái
khuôn để việc tổng hợp chính xác đoạn gen cần khuếch đại lên. Do đó, mồi
này đảm bảo một số nguyên tắc:

+ Chiều dài: 20-30 nucleotid
+ Có số lượng tương đương nucleotid
+ Tránh lặp lại trình tự nucleotid
+ Tránh có 3 G hoặc C ở đầu 3’
+ Tránh hình thành cấu trúc bậc 2


10

+ Trình tự nucleotid ở đầu 3’ không được liên kết bổ sung với nhau
hoặc với các mồi khác để hình thành nên phức hợp 2 mồi.
- DNA polymerase: là enzym kéo dài chuỗi theo nguyên tắc bổ sung.
Khi cân nhắc lựa chọn DNA polymerase cho PCR, người ta thường cân nhắc
tới 2 yếu tố: sự chính xác và hiệu suất phản ứng. Để đảm bảo được 2 điều
trên, DNA polymerase phải chịu được nhiệt độ cao, cho phép việc lặp lại
nhiều lần chu kỳ của PCR mà chỉ cần bổ sung một lần duy nhất enzym này
vào thời điểm bắt đầu phản ứng. Ngày nay, người ta thường sử dụng Taq
DNA polymerase. Enzym này có nhiệt độ tối ưu vào khoảng 72-75ºC [17].
Tuy nhiên, Taq DNA polymerase không có hoạt tính sửa chữa nên các sai sót
trong quá trình kéo dài sẽ không được khắc phục.
- Acid nucleic khuôn là DNA, RNA hoặc cDNA được tách chiết, tổng
hợp từ máu, mô hoặc dịch cơ thể,…
Dung dịch được trộn đều và cho vào chu trình nhiệt thích hợp để bắt
đầu quá trình sao chép, khếch đại gen. Quá trình PCR gồm 3 giai đoạn chính
khác nhau và được điều hòa bởi nhiệt độ:
Giai đoạn 1 (biến tính): DNA khuôn sẽ được biến tính ở nhiệt độ cao
mà tại đó cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA bị phá vỡ. Phân tử DNA từ dạng
sợi kép tách thành 2 sợi đơn (ở 94ºC - 95ºC trong vòng 30-60 giây). Trước
chu kỳ 1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo
mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn.

Giai đoạn 2 (gắn mồi): Nhiệt độ hạ thấp dưới nhiệt độ nóng chảy Tm
(temperature melting) của các mồi (khoảng 40ºC - 72ºC tùy thuộc mồi sử
dụng) cho phép các mồi bắt cặp với các sợi đơn DNA khuôn theo nguyên tắc
bổ sung. Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi
không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện dẫn đến sai
lệch kết quả. Thời gian cho giai đoạn này khoảng 30-60 giây.


11

Giai đoạn 3 (kéo dài): Nhiệt độ tăng lên 72ºC là nhiệt độ thích hợp nhất
cho enzym Taq polymerase hoạt động tổng hợp sợi DNA mới bằng cách kéo
dài sợi mồi từ 4 loại nucleotide (dATP, dTTP, dGTP, dCTP). Thời gian của
bước này phụ thuộc vào cả DNA-polymerase và chiều dài mảnh DNA cần
khuếch đại [17].

Hình 1.2. Các giai đoạn của quá trình PCR
(Nguồn: )
Kết quả:
Sau mỗi chu kỳ, các đoạn DNA tổng hợp được dùng làm khuôn cho sự
tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Một phản ứng PCR thông
thường từ 30 - 40 chu kỳ và sau một chu kỳ thì số lượng DNA lại tăng lên gấp
đôi. Vậy sau n chu kỳ số lượng DNA thu được là 2 n bản copy. Tuy nhiên, trên
thực tế như đa số các phản ứng sinh học khác, phản ứng PCR không thể đạt
được hiệu suất 100% mà chỉ trong khoảng 60-80% [17]. Sản phẩm cuối cùng
của phản ứng PCR là các đoạn DNA dạng sợi kép với chiều dài đặc hiệu đúng
bằng khoảng cách giữa 2 đoạn mồi.


12

1.3.2. Phương pháp điện di
Kỹ thuật điện di là kỹ thuật cơ bản nhất để kiểm tra kết quả của các phản
ứng sinh học phân tử. Điện di cho phép chúng ta quan sát được sự có mặt của
các phân tử DNA đã được nhân lên trong phản ứng PCR.
Sự điện di là sự chuyển động của các phân tử huyền phù hoặc keo, trong
điện trường [29]. Có nhiều phương pháp điện di: điện di dưới kính hiển vi,
điện di trong dung dịch tự do, điện di trên chất giá. Trong nghiên cứu này,
chúng tôi sử dụng phương pháp điện di trên chất giá, với chất giá là agarose
1,5%.
Bản chất của sự điện di là sự di chuyển của các hạt mang điện tích từ cực
này đến cực kia của dòng điện. DNA có bản chất là 1 acid, do đó, DNA mang
điện tích âm. Khi có dòng điện 1 chiều chạy qua thì DNA có xu hướng chạy
từ cực dương về cực âm của dòng điện.
Tốc độ chạy của DNA phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Yếu tố ảnh hưởng
đầu tiên là bản chất của DNA. DNA có trọng lượng phân tử nhỏ hơn thì di
chuyển nhanh, và ngược lại, DNA có trọng lượng phân tử lớn thì di chuyển
chậm. Trong điện di, chất giá được coi như là tấm lưới lọc DNA. Tấm lưới
lọc quá dày (nồng độ chất giá quá lớn) thì làm giảm tốc độ hoặc có thể làm
cho DNA không thể chạy được; còn nếu tấm lưới lọc quá thưa (nồng độ chất
giá quá bé) thì làm tốc độ chạy DNA quá nhanh. Dòng điện tuy rằng không
ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình chạy của DNA. Nhưng nếu để hiệu điện thế
và cường độ dòng điện quá cao làm tăng nhiệt độ và làm bay hơi nước ở trong
dung dịch điện di. Điều này mới ảnh hưởng đến quá trình chạy của DNA.
1.3.3. Phương pháp RT-PCR (Reverser Transcription PCR)
RT-PCR là kỹ thuật sử dụng enzym phiên mã ngược để tổng hợp
cDNA từ đoạn RNA thu được sau khi tách chiết. Và cDNA mới tổng hợp
được này là nguyên liệu khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại.

13

Chu trình RT-PCR có thể được thực hiện theo chu trình RT-PCR một
bước (one-step RT-PCR) hoặc chu trình RT-PCR hai bước (two-step RTPCR) [23]. RT-PCR một bước là sự kết hợp cả 2 quá trình tổng hợp cDNA và
PCR vào cùng một ống nghiệm nên làm giảm khả năng lây nhiễm trong suốt
quá trình thực hiện. Còn RT-PCR hai bước được chia làm 2 bước rõ ràng:
tổng hợp cDNA và PCR, và làm ở 2 ống nghiệm khác nhau. Với phương pháp
này, các thành phần của phản ứng như mồi, enzym sao chép ngược, enzym
polymerase,… được lựa chọn một cách linh hoạt và phù hợp với từng điều
kiện phòng thí nghiệm và mục đích nghiên cứu.
Trong nghiên cứu này, để tổng hợp cDNA từ RNA, chúng tôi áp dụng
bước 1 của kỹ thuật RT-PCR hai bước. Trong kỹ thuật này, enzym phiên mã
ngược có vai trò rất quan trọng, quyết định sự thành công của cả phản ứng.
Enzym này có nhiệt độ hoạt động tốt nhất vào khoảng 40ºC-50ºC [17],[23].
1.3.4. Phương pháp Realtime PCR (qPCR)
Realtime PCR bản chất là phản ứng PCR có sử dụng thêm các chất phát
huỳnh quang cho phép theo dõi sự hình thành sản phẩm PCR theo từng chu
kỳ của phản ứng. Lượng tín hiệu huỳnh quang tỉ lệ thuận với lượng DNA
chuỗi đôi tạo ra trong mỗi phản ứng tại một thời điểm nhất định [17].
Máy Realtime PCR có buồng ủ nhiệt tương tự máy PCR và một thiết bị
quang học. Thiết bị quang học này có hai chức năng:
+ Có các nguồn sáng phát ra được các tia sáng kích thích có bước sóng
xác định lên các ống qPCR.
+ Có camera hay cảm biến quang ghi nhận được ánh sáng huỳnh quang
phát ra từ các ống qPCR khi các ống này được chiếu các tia sáng kích thích.
Realtime PCR là một ứng dụng được phát triển dựa trên nguyên tắc của
phản ứng PCR. Cho nên trong ống qPCR, ngoài những thành phần như ống
PCR bình thường thì có thêm một thành phần đặc biệt đó là mẫu dò (probe).

14

Có nhiều loại đầu dò như Taqman, SYBR Green, Molecular Beacon, Eclipse,
Ampliflour, Scorpion…
Taqman là loại đầu dò oligonucleotid có khả năng lai với một vị trí nội
phân tử của gen đích. Sự phát quang của đầu dò được điều hòa bởi 2 chất là chất
phát quang (gắn ở vị trí 5’) và chất dập tắt (gắn ở vị trí 3’). Ban đầu, khi đoạn
Oligonucleotid này được gắn vào gen thì chất huỳnh quang không thể phát tín
hiệu được do có chất dập tắt. Khi Taq polymerase di chuyển đến vị trí 5’ (vị trí
có chứa chất huỳnh quang), Taq polymerase thủy phân đầu 5’ của đầu dò và giải
phóng ra chất huỳnh quang làm xuất hiện tín hiệu huỳnh quang. Tín hiệu huỳnh
quang này được thu bởi bộ phẩn cảm biến của máy Realtime PCR.
Do đó, nồng độ chất huỳnh quang được phát ra chính là nồng độ bản sao
được khuếch đại lên trong quá trình Realtime PCR.
Taqman là loại đầu do có độ đặc hiệu và độ nhạy cao, tuy nhiên, trong
nghiên cứu này của chúng tôi chỉ đánh giá về mức độ biểu hiện gen và để tiết
kiệm chi phí nên chúng tôi sử dụng đầu dò SYBR Green.

Hình 1.3: Nguyên lý phát tín hiệu huỳnh quang của Taqman
trong phản ứng Realtime PCR
(Nguồn: )


15

SYBR Green là 1 loại chất đánh dấu được chèn vào sợi đôi DNA và có
khả năng phát ra ánh sáng huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích.
Khi không có sự hiện diện các sợi đôi DNA, chất huỳnh quang bị phân
tán trong dung dịch PCR mix, do vậy tín hiệu huỳnh quang phát ra yếu. gần
như không thu được. Nhưng khi có sự hiện diện sản phẩm khuếch đại của

PCR thì các đầu dò được chèn vào và tập trung ở các sợi đôi DNA. Do đó các
tín hiệu huỳnh quang được phát ra mạnh mẽ và máy Realtime PCR thu được
tín hiệu đấy. Chiều dài DNA càng dài thì tín hiệu huỳnh quang càng lớn.

Hình 1.4. Nguyên lý hoạt động của đầu dò SYBR Green trong một chu kỳ
của phản ứng Realtime PCR
Nguồn:
Kết quả: Dù sử dụng bất kỳ loại đầu dò nào thì kết quả của phản ứng
Realtime PCR vẫn là một đường cong biểu hiện mối quan hệ giữa số lượng
bản sao chép và số chu kỳ. Trong đó, trục tung là nồng độ bản sao, trục hoành
là số chu kỳ.
Đồ thị kết quả của Realtime PCR được chia làm 3 phần:
- Giai đoạn ủ: Khi những tín hiệu huỳnh quang đang được tích lũy và
chưa đạt được ngưỡng nhận biết của thiết bị. Khi đó, nồng độ chỉ ở mức 0 và
là một đường thẳng (đường nền).


16

- Giai đoạn lũy thừa: Tín hiệu huỳnh quang tăng vọt lên và vượt qua
đường ngưỡng do sự tăng lên nhanh của các bản sao. Thời điểm bản sao tăng
lên vượt ngưỡng này là chu kỳ ngưỡng (Ct). Chu kỳ ngưỡng là thông số để
đánh giá mức độ biểu hiện của gen chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này.

Hình 1.5: Đồ thị kết quả Realtime PCR
(Nguồn: www.vsmmb.com)
- Giai đoạn bình nguyên: Đồ thị đi theo đường ngang khi mà nồng độ
bản sao đã bão hòa, không tăng lên được nữa do enzym Taq polymerase
không còn hoạt động tốt được nữa và lượng dNTP cũng hết.
1.3.5. Phương pháp đánh giá mức độ biểu hiện gen

Biểu hiện gen là quá trình mà thông tin từ gen được sử dụng trong sự
tổng hợp của một sản phẩm gen chức năng. Những sản phẩm này thường là


17

các protein, nhưng trong các gen không mã hóa protein như tRNA, snRNA thì
sản phẩm ở đây là các chuồi polypeptid.
Để đánh giá mức độ biểu hiện gen, trong nghiên cứu này, chúng tôi sử
dụng phương pháp Delta delta Ct của Livak [25]. Công thức được tính như sau:
Mức độ biểu hiện của gen nghiên cứu trong mẫu mô bệnh so với mô
lành giảm 2ΔΔCt lần.
Trong đó:
ΔCt1 = Ct(gen nghiên cứu ở mô lành) – Ct(gen tham chiếu mô lành)
ΔCt2 = Ct(gen nghiên cứu ở mô bệnh) – Ct(gen tham chiếu ở mô bệnh)
=> ΔΔCt = ΔCt1 – ΔCt2


18

Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1. Thời gian và địa điểm
Đề tài nghiên cứu này được thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu GeneProtein trường đại học Y Hà Nội, trong thời gian từ 17/10/2015 đến
20/05/2016.
2.1.2. Lựa chọn đối tượng
Đối tượng của đề tài nghiên cứu này là bệnh nhân đã được chẩn đoán là
ung thư biểu mô dạ dày được nhập viện và điều trị tại khoa U bướu, Bệnh

viện Bạch Mai từ tháng 01/2016.
Tiêu chuẩn chọn lựa: bệnh nhân ung thư dạ dày được phẫu thuật tại Bệnh
viện Bạch Mai và có chẩn đoán giải phẫu bệnh là ung thư biểu mô tuyến.
Tiêu chuẩn loại trừ: ung thư dạ dày di căn từ cơ quan khác đến hoặc có
một ung thư khác phối hợp với ung thư dạ dày.
2.2. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU

2.2.1. Thiết bị và dụng cụ
- Tủ lạnh: 4ºC, -20ºC, -80ºC Sanyo
- Pipet định mức và đầu côn tương ứng các loại 1000µl, 200µl, 100µl,
20µl, 10µl, 2,5µl.
- Ống Eppendorf 1,5 ml, 0,2 ml, ống Eppendorf 0,2ml nắp trong.
- Găng tay, khẩu trang, giấy thấm vô trùng
- Bốc vô trùng Ascent Max
- Cối, chày sứ vô trùng
- Lưỡi lam, panh vô trùng
- Cột lọc (bộ kit Rneasy Minikit QIAGEN)


19

- Khay đổ gel
- Bình thủy tinh, cốc đong
- Cân điện tử Mettler Toledo
- Lò vi sóng Saiko
- Máy li tâm để bàn Eppendorf Centrifuge 5424
- Máy điện di Power station
- Máy soi gel và chụp ảnh tự động UVP EC3 Imaging System
- Máy đọc huỳnh quang
- Máy đo OD NanoDrop 2000c

- Máy PCR Eppendorf
- Máy Realtime PCR Eppendorf Realplex4
2.2.2. Hóa chất
- Hóa chất tách chiết RNA
Sử dụng kit tách RNA: RNeasy Minikit QIAGEN
+ β Mercaptoethanol (tránh ánh sáng)
+ RLT
+ RW1
+ RPE ( 1 thể tích RPE và 4 thể tích cồn tuyệt đối)
+ Water free-RNAase
Bảo quản ở nhiệt độ 22-25ºC
- Hóa chất tổng hợp cDNA: qScript cDNA Synthesis Kit của
QuantaBio
+ Nuclease-free water
+ qScript Reaction Mix (5X): dung dịch đệm, Mg2+, Oligo (dT),
mồi ngẫu nhiên và các dNTP.
+ qScript RT
Bảo quản ở nhiệt độ -20ºC


20

- Hóa chất chạy PCR
+ Go Taq: dNTPs, Taq Polymerase, dung dịch đệm.
+ Nước cất 2 lần dH2O
+ Primers: Mồi xuôi, mồi ngược của gen GAS5 và gen GADPH.
Bảng 2.1. Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu
Tên

Trình tự mồi

GAS xuôi

CCTGTGAGGTATGGTGCTGG

Kích thước sản
phẩm PCR

137 bp
GAS ngược

CTGTGTGCCAATGGCTTGAG

GAPDH xuôi

CTTCTTTTGCGTCGCCAGCCG
307 bp

GAPDH ng c

CTTCCCGTTCTCAGCCTTGAC

- Hóa chất chạy điện di
+ Dung dịch đệm TBE (Tris Borate EDTA) 1X gồm: Tris base,
boric acid và EDTA (pH 8.0). Khi sử dụng pha thành 10X.
+ Agarose (dạng bột)
+ Ethidium bromid
- Hóa chất làm xét nghiệm Realtime PCR
+ Dung dịch Master Mix: dNTPs, DNA Polymerase, dung dịch
đệm, đầu dò SYBR Green.

+ Primers: mồi xuôi và mồi ngược của gen GAS5 và GAPDH
+ Nước cất 2 lần
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu mô tả tiến cứu
2.4. QUY TRÌNH KỸ THUẬT


21

2.4.1. Cách tiến hành lấy bệnh phẩm
- Cách lấy bệnh phẩm: Bệnh phẩm được lấy bởi bác sĩ lâm sàng gồm 2
mảnh dạ dày gồm 1 mảnh ở vùng mô bệnh và 1 mảnh ở vùng mô lành cách
mô bệnh 5cm. Mảnh mô bệnh của bệnh nhân được Giải phẫu bệnh chuẩn
đoán xác định là mô ung thư biểu mô dạ dày.
- Bệnh phẩm lấy xong được cho vào ống nghiệm và được bảo quản
trong đá lạnh rồi chuyển về phòng xét nghiệm của Trung tâm nghiên cứu
Gen-Protein Trường Đại học Y Hà Nội. Sau đó, mẫu bệnh phẩm được bảo
quản ở tủ lạnh âm sâu -80ºC.
- Mã hóa mẫu bệnh phẩm: mẫu mô lành là A, mẫu mô bệnh là B.
2.4.2. Quy trình tách chiết RNA
Quy trình tách chiết RNA từ mô dạ dày được thực hiện theo kit Rneasy
Minikit QIAGEN. Quy trình cụ thể như sau:
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch
Thêm đủ 4 thể tích cồn tuyệt đối vào 1 thể tích RPE
Thêm 10µl β-ME vào 1ml RLT
Bước 2: Lấy 30mg mẫu mô dạ dày dùng cối và chày đã được hấp sấy
vô trùng nghiền nhỏ ra.

22

Hình 2.1: Quy trình tách chiết RNA bằng Rneasy Mini Kit QIAGEN
(Nguồn: )
Bước 3: Thêm 500µl RLT vào mô đã được nghiền nhỏ. Ly tâm 3 phút
với tốc độ cao nhất, ở 4ºC. Hút dịch nổi cẩn thận bằng pipet. Chuyển sang
ống Eppendorf 1.5ml.
Bước 4: Thêm 1 thể tích cồn 70º và trộn đều.
Bước 5: Chuyển 700µl mẫu vào cột RNA 2ml, ly tâm 8000 vòng/phút
trong 15 giây, ở 4ºC. Loại bỏ dịch chảy.
Bước 6: Thêm 700µl mẫu vào cột RNA, ly tâm 8000 vòng/phút trong
15 giây, ở 4ºC. Loại bỏ dịch chảy
Bước 7: Thêm 500µl RPE vào cột, ly tâm 8000 vòng/phút trong 15
giây, ở 4ºC. Loại bỏ dịch chảy.


23

Bước 8: Thêm 500µl RPE vào cột, ly tâm 8000 vòng/phút trong 2 phút,
ở 4ºC. Loại bỏ dịch chảy.
Bước 9: Đặt cột RNA vào ống Eppendorf 1,5ml. Thêm 50µl nước cất
không có enzym thủy phân RNA vào cột, ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút,
ở 4ºC. Dịch chảy ở ống Eppendorf chính là RNA. Có thể lặp lại bước này để
thu được RNA có nồng độ cao hơn.
2.4.3. Quy trình kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của RNA sau tách chiết
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp đo quang với
máy NanoDrop 2000c.
Bước 1: Khởi động máy và điều chỉnh về chế độ đo OD của RNA
(bước sóng 260nm).
Bước 2: Trừ trắng bằng dung dịch nước cất.

Bước 3: Lau sạch cuvet, nhỏ 1µl RNA vào cuvet và khởi động máy chạy.
2.4.4. Quy trình tổng hợp cDNA
Tổng hợp cDNA là chu trình sử dụng nguyên lý của bước 1 trong quá
trình RT-PCR hai bước. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng qScript
cDNA Synthesis Kit của QuantaBio.
Bước 1: Rã đông và trộn đều hóa chất trước khi sử dụng.
Bước 2: Trộn dung dịch vào ống Eppendorf 0.2ml trên đá lạnh. Dung
dịch bao gồm:
Bảng 2.2. Tỷ lệ mix trong tổng hợp cDNA
Nguyên liệu

Định lượng

RNA (10pg - 1µg)

2µl

Nước

13µl

qScript Reaction Mix (5X)

4µl

qScript RT

1µl

Tổng

20µl


24

Bước 3: Lắc trộn đều và li tâm nhanh 10 giây.
Bước 4: Đặt ống Eppendorf vào chu trình nhiệt của máy PCR như sau:
1 vòng: 22ºC, 5 phút
1 vòng: 42ºC, 30 phút
1 vòng: 85ºC, 5 phút
Giữ 15ºC
cDNA sau khi được tổng hợp bảo quản ở nhiệt độ -20ºC
2.4.5. Quy trình chạy PCR
Thực hiện PCR khuếch đại đoạn gen GAS5 và GAPDH với mục đích
xác định nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu của gen GAS5 và GAPDH và đánh giá
chất lượng mồi GAS5. Do đó, chúng tôi thử nghiệm nhiệt độ gắn mồi từ 55ºC
ở máy PCR Eppendorf.
Bước 1.Tỷ lệ pha của phản ứng PCR như sau:
Bảng 2.3. Tỷ lệ mix trong ống PCR
Nguyên liệu
Go Taq
cDNA
Mồi xuôi
Mồi ngược
Nước
Tổng

Định lượng
8µl

3µl
0,5µl
0,5µl
4µl
16µl

Bước 3: Đặt ống Eppendorf vào chu trình nhiệt như sau:
95ºC trong 2 phút
Biến tính: 95ºC trong 30 giây
Gắn mồi: 55ºC-60ºC trong 30 giây
Kéo dài: 72ºC trong 30 giây
72ºC trong 2 phút
Giữ 15ºC.
2.4.6. Quy trình kiểm tra kết quả PCR

lặp lại 35 chu kỳ


25

2.4.6.1. Đổ gel agarose
Nồng độ gel cần đổ 1,2-1,5% do chiều dài đoạn gen GAS5 cần
khuếch đại là 137 bp, của GAPDH là 307 bp.
Bước 1: Hòa tan 0,375g agarose bởi 25ml TBE 10X
Bước 2: Đun sôi trong lò vi sóng 1’30” (mở hé nắp bình đựng).
Bước 3: Rửa nước cho nguội bớt
Bước 4: Đổ ra khuôn và để 30-45 phút để thạch đông lại.
2.4.6.2. Điện di kiểm tra
Bản gel sau khi được đông lại thì chuyển vào máy điện di có chứa
sẵn dung dịch TBE 10X, xoay hướng giếng về phía cực âm của nguồn điện.

Bước 1: Tra 3µl sản phẩm PCR vào lần lượt các giếng.
Bước 2: Bật máy điện di, cài đặt thời gian 30 phút, hiệu điện thế
120V, cường độ dòng điện 2A.
Bước 3: Sau khi điện di xong, nhuộm Lithium Bromid 3 phút.
Bước 4: Rửa sạch Lithium bằng nước, chuyển sang máy chụp UV.
Bước 5: Điều chỉnh chế độ (độ sáng, độ sắc nét) phù hợp.
Bước 6: Bật đèn UV và chụp hình.
Chú ý: Tắt UV ngay sau khi chụp xong.
2.4.7. Quy trình chạy Realtime PCR
Quy trình thực hiện Realtime PCR khuếch đại đoạn gen GAS5 và
GAPDH như sau:
Bước 1: Pha dung dịch chạy Realtime PCR vào ống Eppendorf 0.2ml
nắp trong, ở trên đá lạnh. Mồi sử dụng là cặp mồi xuôi và mồi ngược của gen
GAS5 hoặc gen nội chuẩn GAPDH. Tỷ lệ mix như sau: