Nghiên cứu mức độ biểu hiện gen survivin ở giai đoạn phiên mã trên một số dòng tế bào ung thư

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ HÀ PHƯƠNG
MÃ SINH VIÊN: 1101397

NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ
BIỂU HIỆN GEN SURVIVIN
Ở GIAI ĐOẠN PHIÊN MÃ TRÊN
MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ HÀ PHƯƠNG
MÃ SINH VIÊN: 1101397

NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ
BIỂU HIỆN GEN SURVIVIN
Ở GIAI ĐOẠN PHIÊN MÃ TRÊN
MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn: TS. Đỗ Hồng Quảng
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Hóa Sinh

Trường Đại học Dược Hà Nội
2. Viện Công nghệ sinh học
Viện hàn lâm Khoa học – Công nghệ

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được đề tài này, trước hết, em xin được gửi lời cảm ơn đến
toàn thể thầy cô Trường Đại học Dược đã dạy dỗ và truyền đạt những tri thức
quý báu cho em trong suốt thời gian em học tập và rèn luyện tại trường. Em
xin chân thành cảm ơn các thầy cô, anh chị và bạn bè cùng nghiên cứu khoa
học ở bộ môn Hóa Sinh, cũng như các anh chị đang công tác tại phòng Công
nghệ tế bào động vật thuộc Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã
tạo điều kiện thuận lợi và chỉ bảo cho em trong quá trình nghiên cứu.
Với tất cả sự kính trọng, em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới
TS. Đỗ Hồng Quảng – giảng viên Bộ môn Hóa sinh trường Đại học Dược Hà
Nội. Thầy là người đã truyền đạt cho em những kiến thức, phương pháp và tác
phong làm việc nghiêm túc, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và động viên
em, tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Lê Quang Huấn - trưởng
phòng Công nghệ tế bào động vật Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là người đã hỗ trợ rất nhiều về mặt chuyên
môn trong thời gian em nghiên cứu.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã quan tâm, động viên và
giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.
Hà Nội, ngày 11 tháng 5 năm 2016
Sinh viên
Lê Hà Phương

MỤC LỤC

Trang
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 3
1.1. Tổng quan về survivin ......................................................................... 3
1.1.1. Cấu trúc phân tử ........................................................................... 3
1.1.2. Chức năng sinh học của survivin ................................................. 5
1.1.2.1. Survivin trong phân chia tế bào ............................................... 6
1.1.2.2. Survivin trong apoposis ........................................................... 6
1.1.2.3. Survivin trong sự hình thành mạch .......................................... 8
1.1.3. Vai trò của survivin trong ung thư .............................................. 8
1.1.3.1. Biểu hiện của survivin trong ung thư ....................................... 8
1.1.3.2. Cơ chế phân tử của survivin trong ung thư .............................. 9
1.1.3.3. Ứng dụng survivin trong chẩn đoán và điều trị ung thư ........ 10
1.2. Tổng quan phương pháp đánh giá biểu hiện gen survivin ............ 11
1.2.1. Quá trình biểu hiện gen .............................................................. 11
1.2.2. Các phương pháp đánh giá mức độ biểu hiện gen survivin ... 12
1.2.2.1. RT-PCR .................................................................................. 13


1.2.2.2. Real-time RT-PCR ................................................................. 15
1.2.2.3. Western blot .......................................................................... 16
1.3. Tổng quan về Glycyl funtumin ......................................................... 16
1.3.1. Nguồn gốc ..................................................................................... 16
1.3.2. Tác dụng dược lý........................................................................... 17

1.3.3. Tác dụng của Glycyl funtumin trên ung thư ................................. 17
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU/ ............ 19
2.1. Đối tượng nghiên cứu, trang thiết bị nghiên cứu ............................ 19
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu.................................................................. 19
2.1.2. Trang thiết bị nghiên cứu ........................................................... 19
2.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................... 20
2.3. Phương pháp nghiên cứu................................................................... 21
2.3.1. Nuôi cấy tế bào ............................................................................ 21
2.3.2. Tách chiết ARN ........................................................................... 22
2.3.3. Xác định nồng độ và độ tinh sạch của mẫu ARN .................... 23
2.3.4. Phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện gen survivin ............. 23
2.3.5. Điện di trên gel agarose .............................................................. 25
2.3.6. Giải trình tự ADN ....................................................................... 25
2.2.7. Xây dựng đường chuẩn real-time RT-PCR.............................. 25
2.3.8. Phản ứng real-time RT-PCR đánh giá biểu hiện gen survivin
................................................................................................................. 26
2.3.9. Xử lý thống kê.............................................................................. 26
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................. 27


3.1. Kết quả ................................................................................................ 27
3.1.1. Kết quả xây dựng quy trình đánh giá biểu hiện gen survivin 27
3.1.1.1. Tách chiết ARN tổng số ......................................................... 27
3.1.1.2. Kết quả phát hiện gen survivin .............................................. 28
3.1.1.3. Xây dựng đường chuẩn định lượng real-time PCR ............... 29
3.1.1.4. Kết quả định lượng biểu hiện gen survivin ............................ 31
3.1.2. Kết quả ứng dụng mô hình đã xây dựng để đánh giá sơ bộ tác
dụng Glycyl funtumin ........................................................................... 31
3.1.2.1. Tách chiết ARN tổng số ......................................................... 32
3.1.2.2. Kết quả định lượng real-time RT-PCR .................................. 33

3.2. Bàn luận .............................................................................................. 34
3.2.1. Về kết quả xây dựng quy trình đánh giá biểu hiện gen trên dòng
tế bào....................................................................................................... 34
3.2.1.1. Nuôi cấy tế bào ...................................................................... 35
3.2.1.2. Tách chiết ARN tổng số ......................................................... 35
3.2.1.3. Kỹ thuật real-time RT-PCR đánh giá mức độ biểu hiện gen. 36
3.2.1.4. Kết quả đánh giá biểu hiện gen trên hai dòng tế bào BT474 và
A549 .................................................................................................... 37
3.2.2. Về kết quả ứng dụng quy trình đã xây dựng để đánh giá sơ bộ
tác dụng của thuốc Glycyl funtumin ................................................. 377
KẾT LUẬN .................................................................................................... 39
KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 39


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt

Tên đầy đủ tiếng Anh

Tên tiếng Việt

ADN

Acid deoxyribonucleic

ARN

Acid ribonucleic

BIRC5

Baculoviral IAP repeat containing protein 5

BIR

Baculoviral IAP repeat

Chuỗi lặp lại IAP
baculovirus

Bps

Base pairs

Cặp bazơ nitơ
Carbon

C
cADN

Complementary DNA

ADN bổ sung

DMEM

Dulbecco's Modified Eagle

Môi trường cơ bản nuôi cấy

Medium

tế bào
Deoxynucleosid

dNTP

triphosphate
EDTA

Ethylendiamin Tetraacetic Acid

Axit Ethylendiamin
Tetraacetic

F

Forward primer

Mồi xuôi

FBS

Fetal bovine serum

Huyết thanh bào thai bò

IAP

Inhibitors of Apoptosis

Chất ức chế sự chết theo
chương trình của tế bào
Thực nghiệm

in-vitro
mARN
N

Message RNA

ARN thông tin
Nitơ


Nhiễm sắc thể

NST
NTC

Non – template control

Mẫu đối chứng

OD

Optical Density

Mật độ quang

PAGE

Polyacrylamide gel

Điện di trên gel

electrophoresis

polyacrylamid

P/S

Penicillin/Streptomycin

PBS

Phosphate buffer saline

Dung dịch đệm phosphate

PCR

Polymer chain reaction

Phản ứng khuếch đại gen

qRT-PCR Quantitative Reverse
transcription Polymerase chain

Phản ứng khuếch đại gen có

phiên mã ngược định lượng

reaction
R

Reverse primer

Mồi ngược

rARN

Ribosom RNA

ARN ribosom

RT

Reverse transcription

Phiên mã ngược

RT-PCR

Reverse transcription

Phản ứng khuếch đại gen có

Polymerase chain reaction

phiên mã ngược

SDS

Sodium dodecyl sulfat

tARN

Transfer RNA

TAE

ARN vận chuyển
Đệm Tris - Acetate – EDTA


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT

Tên bảng

Bảng 3.1 Kết quả nồng độ và độ tinh sạch của các mẫu ARN

Trang
28

tổng số
Bảng 3.2 Kết quả định lượng real-time PCR mARN survivin

30

xác định đường chuẩn trên dòng tế bào ung thư vú
BT474
Bảng 3.3 Số lượng bản sao đoạn gen survivin khuếch đại từ

31

100ng ARN tổng số ở dòng tế bào BT 474 và A549
sau 45 chu kỳ
Bảng 3.4 Nồng độ và độ tinh sạch của ARN tổng số ở các mẫu

32

thử thuốc
Bảng 3.5 Kết quả định lượng biểu hiện gen survivin hai nhóm
chứng và thử

33


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Tên hình vẽ, đồ thị

STT

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử protein survivin

3

Hình 1.2 Sơ đồ NST 17 và vị trí của gen survivin

4

Hình 1.3 Mô hình mARN tiền thân tạo thành mARN trưởng

5

thành với 5 đồng dạng ghép nối
Hình 1.4 Cơ chế ức chế apoptosis của survivin

7

Hình 1.5 Các chất ức chế survivin

11

Hình 1.6 Quá trình biểu hiện gen

12

Hình 1.7 Nguyên lý phản ứng PCR

15

Hình 1.8 Funtumin và N-Glycyl funtumin

17

Hình 3.1 Phổ hấp thụ UV của các mẫu ARN chiết từ hai dòng

27

tế bào BT474 và A549
Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm real-time RT-PCR với cặp

28

mồi survivin ở hai dòng tế bào ung thư.
Hình 3.3 Kết quả so sánh kết quả giải trình tự gen với trình tự

29

gen survivin đã đăng ký trên Genbank
Hình 3.4 Đường chuẩn định lượng mARN/cADN survivin

30

Hình 3.5 Phổ hấp thụ UV của ARN chiết từ các mẫu nghiên

32

cứu
Hình 3.6 Đường phản ứng real-time RT-PCR với mồi survivin
ở các mẫu nghiên cứu

33


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Survivin là một protein gồm 142 axit amin có trọng lượng phân tử khoảng
16,5 kDa thuộc họ những protein có khả năng ức chế sự chết theo chương trình
của tế bào (IAP). Survivin được phát hiện năm 1997 từ thư viện bộ gen người
[7, 8, 20, 23].
Gen Survivin có chiều dài 15 kb nằm ở vị trí NST 17q25. ADN survivin
có cấu trúc mở gồm 426 nucleotid. Quá trình trưởng thành của mARN nguyên
sơ của gen survivin tạo ra năm loại survivin khác nhau: survivin, survivinEx3, survivin-2, survivin-3 và survivin-2α [11, 27]. Trong đó survivin
được biểu hiện mạnh nhất, các dạng survivin khác biểu hiện ít hơn và cũng có
những chức năng riêng, ví dụ dạng Ex3 và 3β có vai trò bảo vệ tế bào trong
khi dạng 2α và 2β có tính apoptosis. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng survivin
được tăng cường biểu hiện trên hầu hết các tế bào u nhưng chỉ biểu hiện rất ít
ở các tế bào lành đã biệt hóa. Survivin đóng vai trò quan trọng trong cả quá
trình apoptosis và điều khiển chu trình tế bào vì vậy biểu hiện của survivin ở tế
bào u liên quan chặt chẽ tới tiên lượng và mức độ kháng trị liệu của khối u [7,
23, 41]. Hiện nay đã có những nghiên cứu ức chế biểu hiện của survivin, một
số phương pháp trị liệu theo hướng này đang được thử nghiệm trên người.
Ở nước ta, việc nghiên cứu về survivin cũng đã được bắt đầu với nghiên
cứu về mức độ phiên mã của mARN survivin trong tế bào tại mô ung thư vú và
tại tế bào ung thư vú lưu hành trong máu của tác giả Nguyễn Minh Hiền 2014.
Việc đánh giá mức độ phiên mã của gen survivin giúp dự đoán tốc độ phát
triển của khối u, tiên lượng về mức độ đáp ứng với điều trị của khối u nên rất
có ý nghĩa trong lâm sàng. Hơn nữa còn giúp xây dựng một phương pháp invitro nhằm sàng lọc các thuốc có tác dụng chống ung thư theo cơ chế ức chế
survivin, rất có ích cho các nghiên cứu sau này.


2

Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu mức độ biểu hiện gen

survivin trên một số dòng tế bào ung thư” với các mục tiêu sau:
1. Triển khai mô hình đánh giá mức độ biểu hiện gen survivin trên hai
dòng tế bào BT474 và A549.
2. Đánh giá sơ bộ tác dụng Glycyl funtumin đối với biểu hiện gen survivin
trên dòng tế bào ung thư vú BT474.


3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về survivin
IAPs là nhóm các protein ức chế sự chết theo chương trình của tế bào
(apoptosis). Hai thập kỷ trước, IAP đầu tiên được tìm thấy trong các tế bào côn
trùng bị nhiễm baculovirus [21]. Cho đến nay, đã có 8 protein thuộc nhóm này
được tìm thấy và xác định ở người, đó là: XIAP, NAIP, c-IAP1, c-IAP2, livin,
ILP2, BRUCE và survivin. Survivin được phát hiện năm 1997 từ bộ gen người.
Nó được mã hóa bởi gen BIRC5 (baculoviral IAP repeat-containing protein 5)
gọi tắt là gen survivin [10]. Nhiều nghiên cứu cho thấy, survivin biểu hiện ở tế
bào ung thư trong hầu hết loại ung thư phổ biến nhưng hiếm khi biểu hiện ở
các mô bình thường tương ứng [49]. Điều này đã khiến survivin trở thành chỉ
dấu ung thư và mục tiêu điều trị ung thư hấp dẫn [7, 12, 20, 23].
1.1.1. Cấu trúc phân tử
Hầu hết các thành viên IAPs đều có 1-3 bản sao vùng mới gồm 70-80
amino acid được gọi là chuỗi lặp lại IAP baculovirus (BIR) ở đầu tận N, cho
thấy một liên kết chặt với kẽm có thể bám vào bề mặt các caspase, làm mất khả
năng xúc tác của các enzym này. Vài IAPs không những có vùng BIR mà còn
có một cấu trúc dạng vòng ở đầu tận C liên quan đến hoạt động của ubiquitin ligase [22].

Hình 1.1. Cấu trúc phân tử protein survivin [4]

4

Survivin là thành viên nhỏ nhất trong nhóm các protein ức chế apoptosis
(IAPs). Không giống các IAP khác thường có nhiều miền BIR, survivin là một
protein nhỏ, chỉ chứa một miền BIR duy nhất ở đầu tận N (BIRC5) và một cấu
trúc dạng xoắn α-helix ở đầu C tận và có dạng dimer ổn định trong dung dịch.
Miền BIR bao gồm 70 amino acid được bảo tồn trong quá trình tiến hóa. Miền
BIR rất quan trọng đối với chức năng ức chế apoptosis, trong khi miền cuộn
xoắn có thể tương tác với các cấu trúc tubulin [11].
Gen survivin dài 14.7 kb, nằm ở vị trí NST 17q25, có cấu trúc mở gồm
426 nucleotide, có 4 exon và 3 intron, mã hóa cho protein gồm 142 axit amin
với trọng lượng phân tử vào khoảng 16,5 kDa [11, 23, 41].

Hình 1.2. Sơ đồ NST 17 và vị trí của gen survivin [4]
Gen survivin còn có thêm các loại đồng dạng ghép nối. Với việc chèn và
xóa một số chuỗi mã hóa và không mã hoá trên gần như toàn bộ chiều dài gen
survivin hình thành nên 5 đồng dạng mARN survivin: survivin, survivin-2β,
survivin-2α, survivin-∆Ex3 và survivin-3β [16, 34].
Gen survivin độ dài đầy đủ bao gồm một cấu trúc ba intron, bốn exon.
Survivin-2α là đồng dạng ghép nối được phát hiện gần đây nhất, được tạo ra do
sự chấm dứt sớm khung đọc mã ở intron 2, bao gồm exon 1, exon 2 và 197 cặp
base ở intron 2 [16]. Survivin-2β là kết quả chèn 23 amino acid bắt nguồn từ
intron 2 (tạo thành exon 2B) vào khung đọc mã. Ở survivin-∆Ex3 có sự loại bỏ
exon 3. Survivin-3β gồm 5 exon trong đó exon 3B có nguồn gốc từ một phần
dài 165 cặp base của intron 3 được chèn vào giữa exon 3 và exon 4 trong khung
đọc mã [9].


5

Hình 1.3. Mô hình mARN tiền thân tạo thành
mARN trưởng thành với 5 đồng dạng ghép nối [4]
Những thay đổi thứ tự phiên mã làm thay đổi rõ rệt cấu trúc của các đồng
dạng và sau đó tạo ra sự khác biệt trong khả năng ức chế apoptosis của các đồng
dạng. Chèn exon 2B trong survivin-2β trong miền BIR có thể dẫn đến tăng khả
năng ức chế apoptosis. Việc loại bỏ các exon 3 trong survivin-∆Ex3 làm ngắt
miền BIR và giữ lại khả năng ức chế apoptosis [11].
Survivin và survivin-2β chủ yếu ở tế bào chất trong khi survivin-∆Ex3 chủ
yếu ở trong nhân [26, 28, 31]. Survivin-2α phân bố đồng đều trong nhân và tế
bào chất [9]. Sự khác nhau giữa các đồng dạng ghép nối survivin và vị trí trong
tế bào điều hòa cân bằng giữa apoptosis và ức chế apoptosis.
1.1.2. Chức năng sinh học của survivin
Survivin có ba chức năng chính: là một protein vận chuyển nhiễm sắc thể
trong phân bào, ức chế apoptosis và đóng vai trò trong sự hình thành mạch.
Survivin có vai trò rất quan trọng trong sự phát triển phôi thai, trong khi lại biểu


6

hiện rất hạn chế ở các mô đã biệt hóa. Với một lượng nhất định survivin có thể
điều chỉnh sự phát triển và sinh tồn của tế bào. Protein survivin hầu như không
xuất hiện trong hầu hết các mô bình thường nhưng lại biểu hiện trong một số
vùng có tăng sinh trong các mô bình thường. Có nhiều bằng chứng cho thấy
rằng survivin được thể hiện trong các tế bào trưởng thành bình thường, tế bào
tạo máu đặc biệt là tế bào máu nguyên thủy, tế bào lympho T, bạch cầu đa nhân
trung tính, tế bào gan, niêm mạc đường tiêu hóa và các tế bào nội mô mạch
máu. Tế bào CD34 có sự biểu hiện của survivin trong tất cả các giai đoạn của
chu kỳ tế bào [17].
1.1.2.1. Survivin trong phân chia tế bào

Survivin được xem là protein nằm trong nhóm protein vận chuyển nhiễm
sắc thể, có nhiệm vụ vận chuyển nhiễm sắc thể đến trung tâm của tế bào ở kỳ
giữa và có vai trò quan trọng trong quá trình giảm phân và sự chuyển động của
nhiễm sắc thể trong phân bào nguyên phân [8]. Survivin biểu hiện cao nhất
trong pha G2/M của chu kỳ tế bào, sau đó nhanh chóng giảm trong pha G1[61].
Survivin phân bố ở các vùng khác nhau của nhiễm sắc thể trong chu kỳ tế bào.
Trong nguyên phân, survivin khu trú ở trục chính phân bào, tại đó nó tương tác
với các vi ống của thoi phân bào [37].
1.1.2.2. Survivin trong apoposis
Các tế bào trong cơ thể chết theo hai cách: hoại tử (necrosis) và chết theo
chương trình (apoptosis). Hoại tử là quá trình các tế bào chết sớm hơn chu trình
sống bình thường do các tác nhân bên ngoài gây ra. Apoptosis là quá trình tế
bào chết theo chương trình đã được lập trình trong gen. Apoptosis là một phần
trong hoạt động sống của tế bào, là một quá trình sinh lý đảm bảo sự sinh trưởng
và phát triển hài hòa trong thời gian phát triển phôi thai và bảo vệ cơ thể, thay
thế mô ở những cơ thể trưởng thành [10].


7

Apoptosis là một quá trình được thực hiện bởi một nhóm các protease
cystein - được gọi là caspase. Hiện nay, có hai cơ chế kích hoạt apoptosis đã
được biết đến đó là kích hoạt các thụ thể chết trên bề mặt tế bào (con đường tín
hiệu bên ngoài) thông qua caspase-8 và tác động của ty thể (con đường tín hiệu
bên trong) thông qua caspase-9 [35, 59]. Quá trình apoptosis được khởi xướng
bởi cytochrome c có khả năng liên kết với cardiolipin ở màng trong ty thể làm
kích hoạt caspase-9. Sau đó, caspase-9 tiếp tục kích hoạt caspase-3 và caspase7 làm nhiệm vụ tiêu diệt tế bào bằng cách phá hủy những enzym nhân đôi và
enzym sửa chữa ADN, hoạt hóa những enzym cắt ADN thành những mảnh nhỏ,
phá vỡ cấu trúc protein trong nhân [15]. Survivin gắn trực tiếp gây ức chế
caspase-9 [18], gián tiếp ức chế sự hoạt hóa caspase 3 và 7 [57], từ đó dẫn đến

ức chế apoptosis .

Hình 1.4. Cơ chế ức chế apoptosis của survivin [59]
Khi quá trình apoptosis không xảy ra hoặc bị ức chế, tế bào sẽ không bị
phá hủy bởi sự chết theo chương trình và tế bào sẽ phân chia, tạo thành các tế
bào con với ADN bị tổn thương. Đây là một cơ chế dẫn đến sự phát sinh ung


8

thư [38]. Sự ức chế apoptosis đã được tìm thấy trong một số bệnh ung thư như
ung thu vú, ung thư gan và ung thư phổi [56].
1.1.2.3. Survivin trong sự hình thành mạch
Sự hình thành mạch được kích hoạt bởi các yếu tố thúc đẩy quá trình tạo
mạch trong đó có VEGF. Tình trạng thiếu oxy thường xảy ra ở các khối u làm
tạo ra HIF-1. Biểu hiện quá mức của survivin làm tăng tổng hợp VEGF thông
qua cơ chế phức tạp phụ thuộc HIF-1 trong điều kiện thiếu oxy [46].
Cơ chế tăng sinh mạch của survivin đóng góp vào việc bảo tồn tính toàn
vẹn của vi cấu trúc hình ống và ức chế apoptosis ở tế bào nội mạc, làm cho tế
bào này có khả năng tồn tại và chức năng bảo vệ tế bào ung thư [12, 46].
1.1.3. Vai trò của survivin trong ung thư
1.1.3.1. Biểu hiện của survivin trong ung thư
Một trong những đặc điểm đặc trưng trên lâm sàng của survivin là mức độ
biểu hiện khác biệt của nó trong nhiều bệnh ung thư trong khi lại biểu hiện hạn
chế trong các mô đã biệt hóa bình thường. Một số ung thư đã được chứng minh
có sự biểu hiện cao của survivin như ung thư phổi, dạ dày, thực quản, tuyến
tụy, bàng quang, tử cung, buồng trứng, gan, miệng và ung thư da không ác tính
[11]. Survivin được thể hiện trong tất cả 60 dòng khối u của con người, với
mức độ biểu hiện cao nhất trong ung thư vú và ung thư phổi, mức độ biểu hiện
thấp nhất trong ung thư thận [32].

Biểu hiện quá mức của survivin luôn gắn với các loại khối u ác tính và các
chẩn đoán các khối u lành tính hay không ung thư đều có xét nghiệm survivin
âm tính. Xét nghiệm ở tế bào niêm mạc và tế bào da bình thường cho kết quả
âm tính với survivin; ngược lại, một nghiên cứu cho thấy 56% ung thư miệng
và 64% ung thư biểu mô tế bào vảy là dương tính với survivin [39]. Phát hiện
survivin trong nước tiểu cũng có thể chứng minh là một chỉ điểm chẩn đoán


9

ung thư bàng quang [31]. Tương tự, biểu hiện của survivin cũng tương quan
với mức độ ung thư, kể cả ung thư đã di căn đến các hạch bạch huyết.
Tuy nhiên, sự biểu hiện của các đồng dạng mARN survivin trong ung thư
khác nhau thì không giống nhau. Một nghiên cứu gần đây về biểu hiện của
survivin trên các tế bào tuyến giáp cho thấy survivin-2α biểu hiện cao nhất
trong các mô phẫu thuật không ung thư và thấp nhất trong các mô bệnh ác
tính. Như vậy, có thể kết luận rằng: protein survivin-2α có thể có một tác dụng
bảo vệ quan trọng đối với các tế bào tuyến giáp [16, 33]. Trong khi đó, mức độ
biểu hiện của survivin-∆Ex3 trong các tế bào ung thư lành tính và các tế bào
thường không có sự khác biệt nhưng lại rất cao trong các tế bào ung thư tuyến
giáp ác tính. Từ đó cho thấy biểu hiện quá mức của survivin-∆Ex3 là một dấu
hiệu đặc trưng cho ung thư tuyến giáp ác tính [52].
Survivin biểu hiện ở mức cao có liên quan đến sự kháng hóa trị liệu, tăng
tái phát khối u và giảm thời gian sống của bệnh nhân [7, 23, 41]. Các nghiên
cứu đã chứng minh rằng survivin có thể tham gia vào quá trình tăng sinh tế bào
ung thư và sự tăng sinh này là rất mạnh, do đó làm mất hiệu quả điều trị bằng
hoá trị liệu. Một nghiên cứu trên các tế bào ung thư tuyến giáp còn sống sau 48
giờ tiếp xúc với cisplatin, doxorubicin, taxol cho thấy các tế bào kháng cisplatin
có sự gia tăng biểu hiện của survivin [47].
1.1.3.2. Cơ chế phân tử của survivin trong ung thư

Các cơ chế survivin phát triển tế bào ung thư chưa được hiểu rõ, tuy nhiên
survivin có thể điều chỉnh quá trình apoptosis, chu kỳ tế bào và tham gia một
loạt các con đường như p53, Wnt, TGF... [20].
Survivin biểu hiện cao nhất trong pha G2/M của chu kỳ tế bào, sau đó
nhanh chóng giảm trong pha G1 [61]. Survivin phân bố ở các vùng khác nhau
của nhiễm sắc thể trong chu kỳ tế bào. Trong nguyên phân, survivin khu trú ở
trục chính phân bào, tại đó nó tương tác với các vi ống của thoi phân bào [37].


10

Sự gián đoạn tương tác survivin và các vi ống tế bào dẫn đến mất chức năng
chống apoptosis của survivin và tăng hoạt động của caspase-3 trong quá trình
phân bào. Biểu hiện quá mức của survivin làm rối loạn các kiểm soát sự chết
theo chương trình của tế bào và cho phép sự tiến triển bất thường của tế bào
qua quá trình nguyên phân. Điều này cho thấy survivin có thể đóng vai trò quan
trọng trong việc tăng sinh tế bào ung thư [18]. Trong ung thư vú và trong nhiều
loại ung thư thường gặp, ức chế apoptosis có thể là một cơ chế chung. Biểu
hiện của riêng survivin hoặc sự kết hợp của survivin và gen chống apoptosis
khác như bcl-2 có thể gây ra rõ tác dụng chống apoptosis rõ rệt hơn [20].
Nhiều nghiên cứu cho thấy có sự liên kết chức năng giữa survivin và p53
- một protein có vai trò ức chế khối u. Gen p53 có khả năng ức chế biểu hiện
của survivin ở giai đoạn phiên mã. Hai vị trí gắn với p53 đã được tìm thấy trong
promoter của survivin [36]. Ngoài ra, survivin cũng quy định biểu hiện của p53.
Survivin ức chế sự tách phức hợp MDM2 làm tăng phân hủy p53, từ đó dẫn
đến sự suy giảm mức protein p53 trong các tế bào có survivin biểu hiện quá
mức [54]. Một con đường khác có liên quan đến biểu hiện của survivin trong
ung thư đó là tình trạng thiếu oxy ở khối u. Tình trạng thiếu oxy có thể đóng
góp vào nhiều quá trình sinh học như sự hình thành mạch khối u, xâm lấn, di
căn và kháng trị liệu. Để đối phó với tình trạng thiếu oxy, HIF-1 - một phức

hợp protein cấu trúc dime bao gồm HIF -1α và HIF-1β tăng biểu hiện làm kích
hoạt phiên mã nhiều gen quan trọng đảm nhiệm chức năng của tế bào trong
điều kiện thiếu oxy [63]. HIF -1α làm tăng biểu hiện gen survivin đã được tìm
thấy trong các ung thư vú, ung thư phổi và các tế bào ung thư tuyến tụy [53].
1.1.3.3. Ứng dụng survivin trong chẩn đoán và điều trị ung thư
Do có mức độ biểu hiện cao rõ rệt trong nhiều bệnh ung thư và đóng vai
trò như nguyên nhân tiến triển ung thư, survivin đang được nghiên cứu rất nhiều
và được xem xét như một chỉ dấu ung thư (tumor marker) [23]. Các kết quả


11

nghiên cứu cho thấy, việc phát hiện và đánh giá biểu hiện gen survivin có thể
đóng vai trò trong chẩn đoán ung thư, đánh giá tiên lượng, phát hiện di căn, dự
đoán khả năng đáp ứng với các liệu pháp điều trị [23].

Hình 1.5. Các chất ức chế survivin
Ngoài ra, trong những năm gần đây, survivin còn được xác nhận như một
mục tiêu mới trong điều trị ung thư [7, 12, 38, 41]. Từ đó, rất nhiều các phương
pháp tiếp cận khác nhau để nhằm mục tiêu kháng survivin đã được đề xuất với
mục đích ức chế khả năng phát triển của khối u và tăng cường đáp ứng của tế
bào ung thư với các chất kháng ung thư [41].
1.2. Tổng quan phương pháp đánh giá biểu hiện gen survivin
1.2.1. Quá trình biểu hiện gen
Trong tế bào sống, biểu hiện gen được hiểu là quá trình sinh tổng hợp
protein trong mối liên hệ: ADN → ARN → protein và protein là sản phẩm biểu
hiện gen [1]. Tuy nhiên, một số gen không mã hóa cho protein, các gen này lưu
trữ các thông tin di truyền để tổng hợp các sản phẩm có chức năng ARN như
ARN ribosom (rARN) và ARN vận chuyển (tARN).

12

Quá trình biểu hiện gen gồm 2
giai đoạn chính là phiên mã và dịch
mã. Phiên mã là quá trình sử dụng
mạch mã hóa của gen để tổng hợp
ARN ở dạng mạch đơn. Đối với
gen mã hóa cho protein, sản phẩm
của giai đoạn này là ARN thông tin
(mARN)

gồm

một

trình

tự

nucleotid mã hóa cho protein. Dịch
mã là quá trình chuyển đổi mARN
thành chuỗi axit amin (hay protein). Ở sinh vật nhân chuẩn, ngoài hai giai đoạn
trên còn có giai đoạn xử lý ARN được tạo ra sau phiên mã [40].
Hầu hết các tế bào trong cơ thể đều có một bộ nhiễm sắc thể giống nhau,
số lượng gen là cố định và như nhau. Tuy nhiên, sự biểu hiện của gen được
điều khiển rất chặt chẽ. Không phải tất cả các gen có trong ADN của tế bào đều
được biểu hiện đồng thời. Những gen khác nhau được hoạt hoá biểu hiện vào
những thời điểm và ở những tế bào khác nhau do cơ chế điều hòa phức tạp ở
mỗi loại tế bào. Việc đánh giá mức độ biểu hiện của một gen cụ thể được thực

hiện thông qua việc phát hiện và đo lường các sản phẩm của gen đó ở hai giai
đoạn phiên mã (ARN) và dịch mã (protein).
1.2.2. Các phương pháp đánh giá mức độ biểu hiện gen survivin
Trên thế giới biểu hiện gen survivin trong ung thư được nghiên cứu ở cả
hai giai đoạn phiên mã và dịch mã. Một nghiên cứu năm 2015 ở Trung Quốc,
đánh giá tác dụng hiệp đồng ức chế survivin của miR-494 và survivin shRNA
làm giảm sự phát triển của ung thư tuyến tiền liệt. Trong nghiên cứu này, để
đánh giá biểu hiện gen survivin trên dòng tế bào biểu mô tuyến tiền liệt sau khi


13

sử dụng liệu pháp gen, các tác giả đã sử dụng kỹ thuật qRT-PCR 2 bước để
định lượng mARN survivin và kỹ thuật Western blot để đánh giá biểu hiện của
protein survivin. Kết quả định lượng PCR cho thấy sự kết hợp liệu pháp gen
miR-494 và survivin shRNA không làm giảm mức mARN survivin, tuy nhiên
kết quả phân tích Western blot đã cho thấy tác dụng làm giảm biểu hiện của
protein survivin [62]. Trong một nghiên cứu phân tích mức độ biểu hiện của
survivin mắc bệnh bạch cầu cấp, kỹ thuật qRT-PCR 1 bước và Western blot
được sử dụng để đánh giá mức độ biểu hiện của gen survivin ở các bệnh nhân
[58].
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu về survivin cũng đã được bắt đầu với nghiên
cứu về mức độ phiên mã của mARN survivin trong tế bào tại mô ung thư vú và
tại tế bào ung thư vú lưu hành trong máu của tác giả Nguyễn Minh Hiền 2014.
Trong nghiên cứu này, tác giả đã xây dựng mô hình đánh giá biểu hiện gen
survivin sử dụng kỹ thuật real-time RT-PCR với 2 bước phản ứng tổng hợp
cADN và phản ứng RT-PCR khuếch đại gen [4].
Nói chung, phần lớn nghiên cứu biểu hiện gen survivin đều dựa trên kỹ
thuật RT-PCR, real-time RT-PCR để định lượng mức độ phiên mã survivin và
kỹ thuật Western blot để phân tích protein survivin.

1.2.2.1. RT-PCR
Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) là một trong
nhiều biến thể của phản ứng khuếch đại ADN (PCR). Đây là một kỹ thuật gồm
có 2 giai đoạn: Tổng hợp cADN (complementary ADN) từ ARN bằng phải ứng
RT và sau đó nhân bản gen quan tâm từ cADN bằng PCR với các mồi đặc hiệu.
Giai đoạn 1: Phản ứng RT
Phản ứng biến đổi ARN hệ gen thành sợi ADN thứ nhất phải nhờ đến một
enzym phiên mã ngược (reverse transcriptase), sau đó quá trình tổng hợp sợi
ADN thứ hai lại nhờ một enzym khác là ADN polymerase I (thường dùng đoạn


14

Klenow). Khi đã có ADN sợi đôi từ khuôn mẫu ARN thì phản ứng tiếp theo sẽ
là khuếch đại gen nhờ kỹ thuật PCR.
Giai đoạn 2: Phản ứng PCR
PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử, nhằm khuếch đại
một đoạn ADN thành nhiều bản sao bằng các chu trình nhiệt. Các máy tạo chu
kỳ nhiệt được lập trình để tăng, giảm nhiệt độ tự động. Ban đầu, hỗn hợp phản
ứng được đun nóng để tách ADN sợi đôi thành hai sợi đơn. Sau đó, hạ nhiệt độ
xuống để mồi bắt cặp khuôn. Tiếp theo, đưa nhiệt độ lên nhiệt độ phản ứng tối
ưu, ADN polymerase bắt đầu tổng hợp sợi ADN mới từ điểm mồi bắt cặp trên
khuôn. Kết quả vào cuối mỗi chu kỳ, mỗi phân tử ADN sợi kép bao gồm sợi
ADN cũ và sợi ADN mới. Các ADN mới tổng hợp là khuôn cho các chu kỳ
sau, cho phép khuếch đại các ADN đích lên gấp hàng triệu lần [45].

RT-PCR là kỹ thuật kinh điển được sử dụng nhiều trong đánh giá sự biểu
biện gen. Nhờ có phản ứng RT, ARN thay vì vẫn ở dạng nhạy cảm, dễ bị phân
hủy, được chuyển thành cADN bền hơn, thuận lợi cho bảo quản và thực hiện
các phép phân tích. Số lượng ARN/cADN trong tế bào không nhiều, nhưng

được khuếch đại lên hàng triệu lần, có thể dễ dàng phát hiện và định lượng
chúng hơn so với các phương pháp khác. Trong nghiên cứu biểu hiện gen,


15

người ta so sánh sự biểu hiện của gen đích với một gen luôn được biểu hiện ở
mức độ ổn định ở trong tế bào, còn gọi là gen housekeeping [43]. Chính vì vậy,
RT-PCR đánh giá một cách tương đối sự biểu hiện gen, được sử dụng để nghiên
cứu sàng lọc sơ bộ ban đầu cho sự biểu hiện gen bệnh lý, tìm ra cơ chế phân tử
và đích tác dụng của thuốc.
Có hai phương pháp thực hiện kỹ thuật RT-PCR. Một phương pháp được
thực hiện qua 2 quá trình riêng biệt: tạo cADN từ ARN bằng phản ứng phiên
mã ngược và sử dụng cADN để thực hiện phản ứng PCR (RT-PCR 2 bước).
Phương pháp còn lại sử dụng enzym phiên mã ngược ngay trong ống phản ứng
PCR, gộp 2 giai đoạn RT-PCR vào 1 bước duy nhất. Cả hai phương pháp này
đều đang được sử dụng trong các nghiên cứu về biểu hiện gen [51].
1.2.2.2. Real-time RT-PCR
qRT-PCR (quantitative RT-PCR hay real-time RT-PCR) là biến thể của
RT-PCR, trong đó kết quả khuếch đại ADN đích trong ống nghiệm được hiển
thị được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng. Vì vậy, người làm thí nghiệm
không cần thiết phải làm tiếp các thao tác sau đó để phát hiện sản phẩm (điện
di sản phẩm PCR trên gel agarose). Để làm được điều này, thành phần của phản
ứng PCR sẽ được bổ sung các tác nhân phát huỳnh quang và máy chu kỳ nhiệt
cũng phải được trang bị các bộ phận phát hiện tín hiệu huỳnh quang [48]. Trong
real-time PCR, người ta thường sử dụng các loại thuốc nhuộm liên kết ADN
sợi đôi (SYBR Green) để phát huỳnh quang, và các probe hoặc primer đặc hiệu
chuỗi (trình tự) được đánh dấu huỳnh quang (TaqMan PCR). Thiết bị ổn nhiệt
chu kỳ (máy PCR) đặc biệt được gắn với một module phát hiện tín hiệu huỳnh
quang để theo dõi tiến trình phản ứng khi sự khuếch đại xảy ra. Tín hiệu huỳnh

quang đo được phản ánh số lượng sản phẩm được khuếch đại trong mỗi chu kỳ
[30, 51].