Pseudomonas fluorescens và sắc màu gây độc

ĐỀ TÀI

GVHD: Ks Phạm Minh Nhựt

Nhóm 13_07DSH02
Lê Tuấn Tú
Nguyễn Thanh Xuân
Nguyễn Thị Hồng Nhƣ
Nguyễn Thị Xuân Kiều

- 2010 -


MỤC LỤC
Phần I: Tổng quan về Pseudomonas fluorescens
1.1.Lịch sử phát hiện
1.2.Phân loại
1.2.1. Giới thiệu chung về Pseudomonas fluorescens
1.2.2. Pseudomonas fluorescens
1.3.Đặc điểm
1.3.1. Đặc điểm chung
1.3.2. Đặc điểm sinh hóa
1.4.Cấu trúc tế bào
1.5.Cơ chế hoạt động của Pseudomonas fluorescens
1.5.1. Đối với thực vật
1.5.1.1.

Vi sinh vật đối kháng

1.5.1.2.

Gây hại cây trồng

1.5.2. Đối với động vật
1.5.2.1.

Dấu hiệu bệnh

1.5.2.2.

Phòng trị

1.5.3. Đối với thực phẩm
1.5.3.1. Pseudomonas fluorescens gây hư hỏng trên
bề mặt thịt
1.5.3.2.
Pseudomonas fluorescens gây hư hỏng trên
nhiều loại thực phẩm
1.5.4. Pseudomonas ảnh hưởng đến vi khuẩn Listeria
1.5.5. Bệnh học
1.6.Bệnh và các triệu chứng
1.7.Ứng dụng của Pseudomonas fluorescens
1.7.1. Sản xúât thuốc bảo vệ thực vật
1.7.2. Sản xuất thuốc kháng sinh


1.7.3. Sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp 2,4-DAPG
1.7.4. Kiểm soát mầm bệnh
1.7.5. Làm sạch nước thải công nghiệp

Phần II: Các phƣơng pháp xác định Pseudomonas fluorescens

2.1. Phương pháp truyền thống
2.1.2. Định tính Pseudomonas fluorescens
2.1.2.1. Tiến hành
2.1.2.2. Kết quả
2.1.2.3. Quy trình thử nghiệm sinh hóa
2.1.3. Thử nghiệm amôn hóa
2.2. Phương pháp hiện đại
2.2.1. Phương pháp PCR
2.2.2. Phương pháp HPLC

Phần III: Kết luận và đề nghị
Phụ lục
Tài liệu tham khảo chính


LỜI MỞ ĐẦU
Ngộ độc thực phẩm hiện là vấn đề được thế giới quan tâm nhiều vì nó có thể xúât hiện
mọi nơi, mọi lúc trên diện hẹp hay diện rộng. Các chủng vi khuẩn, nấm có khả năng gây
nhiễm khuẩn ở thực phẩm được nghiên cứu một cách tỉ mỉ từ hình thái, cơ chế đến triệu
chứng gây bệnh.
Điều dễ thấy nhất ở thực phẩm bắt đầu quá trình hư hỏng là màu sắc. Vậy cái gì đã gây
nên những vệt màu trên thực phẩm? Nó có ảnh hưởng nhiều đến sức khoẻ không nếu ta
bị nhiễm? Và bạn có thắc mắc rằng tại sao nó có thể làm nên những màu sắc đó không và
ngoài trừ thực phẩm ra nó có ảnh hưởng đến những thứ khác có liên quan đến cuộc sống
của ta không?


PHẦN I:
TỔNG QUAN VỀ PSEUDOMONAS FLUORESCENS

1.1.

Pseudomonas sp

Các chi Pseudomonas được nhà thực vật học người Đức đặt tên năm 1894 và ông đã mô
tả các loài của Pseudomonas năm 1895. Pseudomonas là vi khuẩn gram âm, hiếu khí,
hình que có tiên mao. Pseudomonas tồ tại trong đất, nước và cũng được tìm thấy trên các
bề mặt thực vật và động vật. Vi khuẩn Pseudomonas được biết đến như là một loài
chuyển hóa linh hoạt và có thể phát triển dưới nhiều điều kiện tăng trưởng. Pseudomonas
là tác nhân gây bệnh cây trồnng tuy nhiên một số loài có thể gây bệnh cho người
Pseudomonas fluorescens có khả năng phát triển ở 4ºC gây hư hỏng các thực phẩm đông
lạnh. Nó hiếm khi gây bệnh cho người do không phát triển ở nhiệt độ cơ thể. Một số
chủng Pseudomonas fluorescens ức chế mầm bệnh nông nghiệp như nhiễm trùng nấm…
1.2.

Phân lọai
1.2.1. Giới thiệu chung về Pseudomonas fluorescens

Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gamma Proteobacteria
Bộ: Pseudomonadales
Familia: Pseudomonadaceae
Chi: Pseudomonas
Loài: Pseudomonas fluorescens

Hình 1. Vi khuẩn Pseudomonas
fluorescens

Tên: Pseudomonas fluorescens
1.2.2. Pseudomonas fluorescens


1.3.

Đặc điểm
1.3.1. Đặc điểm chung

Pseudomonas fluorescens là trực khuẩn hiếu
khí không nha bào gram âm 16S rRNA, hình
que sống trong đất, thực vật và nước bề mặt.
Di chuyển linh hoạt nhờ có nhiều roi
(flagella), phát triển tối ưu ở nhệt độ 77ºF 86º (25º-30ºC). Pseudomonas fluorescens là
thành viên của nhóm vi khuẩn huỳnh quang
pseudomonas và là một nguyên nhân không
thường xuyên của các bệnh về nhiễm trùng
máu.

Hình 2. Vi khuẩn Pseudomonas
fluorescens sử dụng flagella của nó để
đẩy bản thân thông qua các lớp đất
nƣớc
Một số chủng Pseudomonas ngăn chặn dịch bệnh bằng cách bảo vệ hạt và rễ tránh nhiễm
nấm. Tuy nhiên chủng Pseudomonas fluorescens lại là nguyên nhân gây hư hỏng thực
phẩm và gây bệnh ở các loài thủy sản.
1.3.2. Đặc điểm sinh hóa
Pseudomonas fluorescens sản xuất sắc
tố hòa tan pyoverdine là sắc tố phát
huỳnh quang màu xanh vàng khi được

kích thích bởi bước sóng thấp hơn
260nm. Sắc tố này được tạo ra trong
môi trường có nồng độ sắt thấp, dễ
khuếch tán và có chức năng trong cơ
chế trao đổi sắt của vi khuẩn

H
ì
Hình 3. Pseudomonas fluorescens –
agar: môi trƣờng dinh dƣỡng


Pseudomonas là một vi khuẩn hiếu khí bắt buộc nhưng một số chủng có khả năng sử
dụng nitrat thay vì oxi như là một chất nhận điện tử cuối cùng trong hô hấp tế bào.
Pseudomonas fluorescens cùng với các pseudomonas tương tự khác cho lipase nhiệt ổn
định và proteases. Tạo các enzyme gây hư hỏng sữa, hư hỏng casein, và làm kém chất
lượng thực phẩm do tạo chất nhớt, ngoài ra cũng gây hiện tượng đông máu.
Pseudomonas fluorescens không phát triển ở điều kiện yếm khí và là vi khuẩn quang hợp
không thải oxi nên có vai trò làm sạch nguồn nước.
Loài này tăng trưởng được trên môi trường nghèo dinh dưỡng chỉ gồm khoáng và carbon.
Một số đặc điểm sinh hóa chính của Pseudomonas fluorescens là: không lên men
glucose, có khả năng thủy giải gelatin, tinh bột, oxidase (+), khử nitrate (+).
1.4.

Cấu trúc tế bào

Bộ gen Pseudomonas fluorescens PF-5 chứa 1 NST tròn với 7.1Mbp và 63.3% hàm
lượng GC, nó chứa 87 RNAs và 6137 protein, 5.7% của chuỗi gen này góp phần vào sự
trao đổi chất thứ cấp (lớn nhất trong Pseudomonas).
Bộ gen của Pseudomonas fluorescens PfO-1 là một NST với 6.43841 Mbp và 60.5% hàm

lượng GC, chúng gồm 95 RNAs và 5736 protein.
1.5.

Cơ chế họat động của Pseudomonas fluorescens
1.5.1. Đối với thực vật:
1.5.1.1. Vi sinh vật đối kháng

Nhiều công trình nghiên cứu về các tác nhân phòng trừ sinh học đã công bố từ đầu thế kỉ
20 cho rằng vi khuẩn là một tác nhân phòng trừ sinh học, nhóm vi khuẩn hoại sinh mà
phổ biên nhất là Pseudomonas spp. Nhóm vi khuẩn này sản xuất ra chất kích thích tăng
trưởng cây, các chất ức chế hoặc làm suy yếu các tác nhân gây bệnh hoặc cả hai (Baker1988). Cơ chế ban đầu ức chế tác nhân gây bệnh là tiết ra các chất kháng sinh (Fravell1988). Các yếu tố như việc tiết ra chất siderophore, HCN, sự cạnh tranh dinh dưỡng cũng
có vai trò trong việc ức chế tác nhân gây bệnh.
Pseudomonas fluorescens có khả năng đối kháng với 10 loại nấm bệnh lưu tồn trong đất,
kích thích sự phát triển của cây trồng bằng cách sử lý hạt có hay không có chất mang hoạt
chủng vào đất cùng với giá thể làm thức ăn nền đã làm giảm mức độ trầm trọng của bệnh
đồng thời gia tăng sự phát triển và tăng năng suất cho cây trồng.
Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ký sinh trong phần vỏ rễ cây trồng, giúp cho cây phát
triển nhanh và chống lại vi sinh vật gây hại, dẫn đến tăng năng suất (Lazarovits-1997).
Pseudomonas fluorescens sản sinh nhiều hợp chất hóa học có cấu trúc từ đơn giản đến
phức tạp với đặc tính như những chất kháng sinh.


Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens P217 có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn
Ralstonia solanacearum và Pseudomonas solanacearum gây bệnh héo xanh cho một số
cây trồng có giá trị kinh tế cao như cà chua, khoai tây, cà tím, ớt…Dòng PF AIR2 phân
lập được trên than bùn kìm hãm sự phát triển của nấm Rhizotina solani gây bệnh khô vằn,
lỡ cổ rễ. Vi khuẩn Pf 2-79 rất dễ phát triển và có thể định cư ở một vài lòai thực phẩm.
Do nó có thể sống trong nhiệt độ của máy lạnh nên nó có thể là một tác nhân kiểm soát
hữu hiệu đối với các mầm bệnh có tính chịu lạnh như mầm bệnh Listeria monocytogenes
và Yersinia enterocolitica.

1.5.1.2. Gây hại cây trồng:
Là vi sinh vật phụ sinh, thành viên của hệ vi sinh vật hạt-củ-rễ. Trực tiếp phá hoại tế bào
ký chủ, hút những vật chất sống trong tế bào ký chủ.
Chủng Pseudomonas fluorescens Pf-5 enzym hủy hoại bức tường tế bào thực vật và các
thành phần như xenlulaza, pectinase, hoặc lyase pectin. Tuy nhiên nó có thể loại bỏ một
số nguồn carbohydrate, axit béo, và các loại dầu và hydrolyze protein trong thực vật có
thể gây hư hỏng sữa, thịt và cá.
1.5.2. Đối với động vật: gây bệnh nhiễm khuẩn (bệnh đốm đỏ)
trên các lòai thủy sản, đặc biệt là các loài cá nuôi.
Vi khuẩn là một trong những tác nhân gây bệnh khá quan trọng, là trở lực chủ yếu kìm
hãm sự phát triển của cá. Hầu hết vi khuẩn gây bệnh là một phần của hệ vi sinh vật bình
thường trong môi trường (nước biển, ao, hồ, sông rạch) và nói chung các vi khuẩn này
được xem là tác nhân gây bệnh thứ cấp hoặc tác nhân gây bệnh cơ hội. Tuy nhiên cũng
có một số ít các loài vi khuẩn là tác nhân khởi phát, bệnh xảy ra thường là do biến động
các yếu tố môi trường hoặc do stress nhưng cũng có thể gây chết cao. Tỷ lệ chết do
nhiễm khuẩn có thể lên đến 100%, bệnh có thể xảy ra dưới dạng mãn tính, bán cấp tính
và cấp tính.
1.5.2.1. Dấu hiệu bệnh:
Xuất huyết từng đốm nhỏ trên da, xung
quanh miệng và nắp mang, phía mặt
bụng, bề mặt cơ thể có thể bị chảy máu,
tuột nhớt nhưng không xuất huyết vây và
hậu môn. Pseudomonas fluorescens gây
nhiễm khuẩn huyết thường xâm nhập
vào cơ thể cá qua các thương tổn ở
mang, da, vẩy do các tác nhân cơ học,
nuôi với mật độ cao, dinh dưỡng kém,
hàm lượng oxi giảm…

Hình 4. Xuất huyết ở cá

1.5.2.2. Phòng trị
Giảm mật độ nuôi, cung cấp nguồn nước tốt.
Dùng vaccine phòng bệnh.
Tắm KMnO4 với lượng là 0.4g/100ml không quy định thời gian.
1.5.3. Đối với thực phẩm
Vi khuẩn là tác nhân của các hiện tượng biến thoái và hư hại ở thực phẩm. Thức ăn, thức
uống, sữa tươi, fromage, rau quả…đều có thể bị chua nhớt, đóng ván, hôi thối, có bọt, có
gaz hoặc có những màu khác thường.
1.5.3.1. Pseudomonas fluorescens gây hƣ hỏng trên bề mặt
thịt
- Thịt bị hóa nhầy: thường có ở bề mặt thịt ướp lạnh khi độ ẩm không khí cao hơn 90%
(giai đọan đầu của quá trình hư hỏng). Trên bề mặt thịt hình thành một lớp dày đặc các vi
khuẩn gây hại thực phẩm khác như Micrococcus aureus, Micrococcus candidus và nấm
men. Thịt được bảo quản ở nhiệt độ từ 0 đến 2ºC với độ ẩm tương đối từ 85% đến 90% là
tốt nhất (có thể bảo quản trong 2 tuần lễ mà thịt vẫn không hóa nhầy).
- Chủng Pseudomonas fluorescens hình thành
vết màu xanh lục trên bề mặt thịt: dưới tác
động của vi khuẩn hô hấp hiếu khí trên bề mặt
thịt xuất hiện những vết màu. Khi mỡ bị ôi
thiu và xuất hiện perocid thì màu vàng sẽ biến
thành màu xám tối và sau đó trở nên xanh.
Nếu thịt có mùi bình thường và không phát
hiện thấy có độc tố thì sau khi tẩy sạch các vết
màu vẫn có thể sử dụng bình thường.
- Khuẩn Pseudomonas phân giải mỡ thúc đẩy
quá trình oxy hóa mỡ, mỡ bị oxy hóa do tác
động đồng thời của ánh sáng và không khí.
Hình 5.

Gây vết màu xanh lục
trên bề mặt thịt

1.5.3.2. Pseudomonas fluorescens gây hƣ hỏng trên nhiều
loại thực phẩm
- Trên thịt gia cầm khuẩn Pseudomonas gây ra mùi hôi, gây mùi khó chịu trong lòng
trắng trứng.
- Chủng Pseudomonas fluorescens gây cho sữa có màu xanh lá cây, làm cho vỏ trứng có
màu xanh trắng và cũng gây vết màu xanh lá trên cá ướp lạnh.


- Khuẩn Pseudomonas gây nên sự biến đỏ ở tôm do astaxanthin bị tách ra và bị oxi hóa
khi tôm để ở nhiệt độ 30-40ºC sau từ 8-12h sau khi đánh bắt.
- Hiện tượng thối nhũng ở rau tươi cũng là do Pseudomonas fluorescens gây nên.
1.5.4.

Pseudomonas fluorescens ảnh hƣởng đến vi khuẩn

Listeria
Vi khuẩn Listeria phân bố rộng rãi trên môi trường đất, nước, phân gia súc nên dễ lây
nhiễm qua thực phẩm chế biến, không những gây ngộ độc thực phẩm mà lọai vi khuẩn
này còn gây nên một số bệnh nguy hiểm như sẩy thai, viêm não, nhiễm trùng huyết. Sau
giai đọan ủ bệnh (có khi đến 2 tháng) dấu hiệu khởi phát là sốt, khó chịu, đau lưng. Nếu
độc tố mạnh sẽ gây ra ngộ độc thực phẩm cấp tính đến 12h với chịu chứng nôn mửa, tiêu
chảy, đau quặng bụng, nhức đầu.Gây ngộ độc trong bánh nhân thịt, cá sốt cà, thịt đông
lạnh, sữa, phômai, rau cải tươi sống…Vi khuẩn Listeria được tổ chức y tế thế giới xếp
vào nhóm tác nhân sinh học có nguy cơ cao trong lĩnh vực an tòan thực phẩm.

Hình 6. Vi khuẩn Listeria monocytogenes

Vi khuẩn Listeria dính bám vào bề mặt máy móc rồi từ đó xâm nhập vào các sản phẩm
thức ăn. Tuy nhiên Listeria không giỏi bám lên các bề mặt bằng thép không gỉ khi cạnh
tranh với các vi khuẩn khác. Nhưng khi Pseudomonas fluorescens bám vào bề mặt thì
Listeria có khả năng bám vào bề mặt đó một cách hiệu quả hơn. Vậy theo nghiên cứu này
thì Pseudomonas fluorescens có ảnh hưởng trực tiếp đến cơ chế gây độc của Listeria lên
thực phẩm một cách gián tiếp.
1.5.4. Bệnh học
Ngoài trừ gây ngộ độc thực phẩm ảnh hưởng đến sức khỏe con người thì Pseudomonas
fluorescens còn là một nguyên nhân gây bệnh cơ hội ở người, và thường ảnh hưởng đến
các bệnh nhân có hệ miễn dịch kém (như là bệnh nhân điều trị ung thư). Khoảng năm
2004-2006 đã có một ổ dịch của Pseudomonas fluorescens tại Hoa Kỳ, nó ảnh hưởng đến
khoảng 80 bệnh nhân trên 6 tiểu bang.


Ngoài ra còn có thể tìm thấy Pseudomonas fluorescens trong các bệnh về nhiễm khuẩn
đường tiểu. Tuy nhiên ta có thể điều trị dễ dàng bằng các dược lực.
1.6.

Bệnh và các triệu chứng

Sự nhiễm bệnh bắt đầu từ khi có những biến đổi làm suy yếu hệ bảo vệ của tế bào chủ.
Pseudomonas fluorescens có thể gây ra: nhiễm trùng huyết, đường tiết niệu,tác động lên
hệ tiêu hóa.
Triệu chứng bệnh khi bị nhiễm khuẩn Pseudomonas fluorescens thường là ớn lạnh, sốt và
lạnh trong vài giờ.
1.7.

Ứng dụng của Pseudomonas fluorescens
1.7.1. Sản xuất thuốc bảo vệ thực vật

Chế phẩm thuốc bảo vệ thực vật sinh học được ứng dụng rộng rãi tăng năng suất, bảo vệ
cây trồng. Vi khuẩn huỳnh quang Pseudomonas fluorescens được sử dụng để tạo chế
phẩm phòng trừ bệnh hại rễ cà phê, vải thiều, đậu phộng.
Chế phẩm BioGro dùng để sử lý môi trường nuôi tôm, phân hủy rác thải trong ao nuôi
tôm, giảm được lượng khí độc trong ao, tạo màu nước dẫn đến ổn định môi trường nuôi
tôm.
1.7.2. Sản xuất thuốc kháng sinh
Các dạng thuốc kháng sinh bôi tại chỗ trên da thường được dùng khi các nhiễm khuẩn
ngoài da vừa và nhẹ, các trường hợp nhiễm khuẩn nặng hơn thường phải dùng kháng sinh
tòan thân bằng đường uống, tiêm kết hợp thuốc bôi. Hiện nay có nhiều loại kháng sinh
bôi tại chỗ tuy nhiên khi sử dụng cần chú ý đến cơ chế tác dụng, phổ tác dụng, tác dụng
không mong muốn của thuốc để nâng cao hiệu quả điều trị, giảm kháng thuốc và các
phản ứng có hại khác. Mặt khác nhiều loại thuốc kháng sinh còn được bào chế kết hợp
với 1, thậm chí 2 nhóm thuốc kháng sinh hoặc corticoid, kháng nấm, kháng
histamine…càng làm cho vấn đề lựa chọn điều trị cần được chú ý.
Pseudomonas fluorescens được sử dụng để điều
chế một loại kháng sinh Mupirocin có ích trong
điều trị cho da, tai và các rối loạn mắt. Nó có
tác dụng diệt khuẩn do ức chế RNA vận
chuyển. Thuốc có tác dụng tốt với các nhiễm
khuẩn da do vi khuẩn gram (+). Tụ cầu thường
rất nhạy cảm với kháng sinh này tuy nhiên dễ
xảy ra hiện tượng kháng thuốc của các vi khuẩn
khác nếu sử dụng tràn lan. Thường chỉ dùng
trong khoảng 10 ngày rồi ngưng để tránh kháng
thuốc.
Hình 7. Kháng sinh Mupirocin


1.7.3. Sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp 2,4-DAPG

Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ký sinh trong phần vỏ rễ cây trồng, giúp cho cây phát
triển nhanh và chống lại vi sinh vật gây hại, dẫn đến tăng năng suất (Lazarovits-1997).
Pseudomonas fluorescens sản sinh nhiều hợp chất hóa học có cấu trúc từ đơn giản đến
phức tạp với đặc tính như những chất kháng sinh, trong đó 2,4-DAPG là hợp chất được
xem có vai trò xác lập tính đối kháng. Gen mã hóa 2,4-DAPG được gọi là PhlD, đã được
phân lập và tìm hiểu cấu trúc trình tự cũng như quá trình sinh tổng hợp. Bằng cách tác
động vào cấu trúc gen mã hóa, một số dòng vi khuẩn đột biến có khả năng gia tăng lượng
kháng sinh sinh học vào môi trường tăng khả năng ức chế sự phát triển của nấm, vi
khuẩn, tuyến trùng gây hại định cư trong vùng rễ cây trồng.
Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng cao áp để phát hiện và định lượng hợp chất kháng sinh
2,4-DAPG và dùng PCR với các primer chuyên biệt để phát hiện gen Phl mã hóa 2,4DAPG trong vi khuẩn Pseudomonas fluorescens, cũng như đánh giá tính đối kháng của
các dòng chọn lọc với một số nấm gây hại cây trồng. Giúp loại bỏ khoảng 40% dòng vi
khuẩn huỳnh quang đối kháng nhưng có khả năng gây độc cho cây trồng, và giúp chọn
chính xác những dòng vi khuẩn chứa gen kháng sinh hiện diện trong rễ cây.
1.7.4. Kiểm sóat mầm bệnh
Có thể dùng Pseudomonas fluorescens
như là một vi khuẩn có lợi để chống lại
những vi khuẩn tiềm ẩn có hại, kìm
hãm sự phát triển của các mầm bệnh.
Theo một nghiên cứu của Sở Nông
Nghiệp Mỹ (ARS) khi ngâm ớt kiểng
trong dung dịch nước có chứa vi khuẩn
đối kháng Pseudomonas fluorescens 279 khoảng 2 phút thì việc sinh sôi mầm
bệnh hầu như bị ức chế hoàn toàn.

Hình 8: Ớt chuông tƣơi vì chứa ít mầm bệnh
Kết quả cho thấy ở những quả ớt chuông chưa được xử lý con số mầm bệnh nhân lên
100.000 lần ở nhiệt độ 68ºF trong khoảng thời gian cất trữ là 2 ngày. Nhưng ở những quả
ớt chuông đã qua xử lý với vi khuẩn Pf2-79 lại kìm hãm được sự phát triển của mầm
bệnh. Cách xử lý này có thể làm tiềm năng ngăn chặn mầm bệnh sinh sôi nhiều đến số

lượng có thể gây bệnh cho con người.
1.7.5. Làm sạch nƣớc thải công nghiệp
Công nghệ làm sạch nước thải công nghiệp từ hydrocacbon nhũ tương hóa sử dụng chất
phân hủy vi khuẩn Pseudomonas fluorescens bất hoạt trên chất mang sinh học phức của
phần ban đầu. Quá trình làm sạch diễn ra trong thiết bị phản ứng sinh học “mikos” hoặc


trong thiết bị lọc sau khi xử lý cơ học hoặc sinh hóa. Công nghệ khả thi về sinh thái và
kinh tế, giống với các quá trình tự nhiên.

Hình 9. Nƣớc thải công nghiệp


PHẦN II
PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH PSEUDOMONAS FLUORESCENS


2.1.

Các phƣơng pháp truyền thống
2.1.1. Định tính Pseudomonas fluorescens
2.1.1.1. Tiến hành

- chuẩn bị và pha loãng mẫu trong dung dịch đệm pepton
- cân 25g mẫu hoặc 25ml cho vào bình tam giác đã có 225ml dung dịch
muối đệm pepton và lắc đều (dung dịch có độ pha loãng là 10-1
- tiếp tục pha loãng đến nồng độ cần thiết để số lượng khuẩn lạc mọc trên
đĩa petri không vượt quá 300.
- lấy 0.1ml mẫu các dịch đã pha loãng cấy trên đĩa Petri có chứa môi trường
thạch Pseudomonas.

- nuôi cấy ở nhiệt độ 42ºC trong thời gian 24-48h (mỗi độ pha loãng cấy ít
nhất 2 đĩa Petri và chọn 2 nồng độ pha loãng liên tiếp nhau).
- quan sát và đếm những khuẩn lạc có sắc tố màu xanh, tròn đều, mặt nhẵn.
2.1.1.2. Kết quả
Sau 48h, đếm số khuẩn lạc trên đĩa Petri .
Để khẳng định các khuẩn lạc nghi ngờ chắc chắn là Pseudomonas fluorescens thì cần lấy
các khuẩn lạc nghi ngờ cho nuôi cấy trong môi trường lỏng BHI (Brain Heart Infusion) ở
37ºC trong 24h để thu được canh trường thuần nhất. Từ canh trường thuần nhất này xác
định hình thể và các tính chất sinh hóa.
2.1.1.3. Quy trình thử nghiệm sinh hóa
Dùng que cấy vòng tiến hành ria mẫu lên một trong các môi trường chọn lọc như EMB
agar, Endo agar, Deoxycholate agar, MacConkey agar, Hektoen Enteric agar và XLD
agar để phân lập họ Enterobacteriaceae và giống Pseudomonas, ủ ở 37ºC trong vòng 24h.
Trên môi trường XLD Pseudomonas cho khuẩn lạc màu đỏ không có tâm đen. Các khuẩn
lạc có hình thái đặc trưng cho Pseudomonas được dùng để nhuộm gram, trước tiên được
thử nghiệm TSI, oxidase, sau đó sẽ được thử nghiệm các đặc trưng sinh hóa khác:
 Nhuộm gram: cấy ria các khuẩn lạc sang ống thạch dinh dưỡng, ủ ở 30ºC trong
24h.Tiến hành nhuộm gram, quan sát dưới kính hiển vi (có thể nhuộm gram bằng phương
pháp Jensen hay Hucker):
- tạo vệt bôi vi sinh vật trên phiến kính,chọn một phiến kính sạch, dùng bút
ghi trên kính vẽ 1 vòng tròn đường kính 2cm ở mặt dưới của phiến kính. Đặt tại vị trí
tương ứng với vòng đánh dấu ở mặt trên của phiến kính vài giọt nước cất thành một giọt
lớn.
- dùng que cấy vòng chuyển một ít sinh khối khuẩn lạc vào giọt nước trên
phiến kính, khuấy nhẹ bằng đầu que cấy để được huyền phù đồng nhất và bôi đều trong
khu vực của vòng tròn


- để yên cho vệt bôi khô
- đưa phiến kính qua lại vài lần trên ngọn lửa đèn cồn

- thực hiện tương tự để tạo một vệt bôi chung 2 chủng vi sinh vật đối chứng
trong cùng một phiến kính khác (dùng E.coli làm chủng đối chứng gram (-) và
Staphylococcus aureus làm chủng đối chứng cho gram (+)).
- theo phương pháp Jensen: nhỏ vài giọt dung dịch Methyl violet lên vệt
bôi, giữ yên 20 giây. Dùng bình xịt bơm nước lên vệt bôi để rửa sạch phẩm nhuộm. Nhỏ
vài giọt KI/I2 lên vệt bôi, để yên 1 phút. Xịt cồn 95% lên vệt bôi rửa phẩm nhuộm đến
vừa mất màu. Để yên vài giây rồi rửa lại với nước. Nhuộm bằng dung dịch safranin 30
giây, rửa lại với nước, thấm nước dư bằng giấy lọc.
- quan sát màu nhuộm của tế bào bằng vật kính 100X. Tế bào nhuộm gram
(-) có màu đỏ hồng
 Thử nghiệm oxidase:
- cắt 1 miếng giấy lọc thành những dải nhỏ dài 10-40 mm
- nhúng vào hóa chất (dung dịch 1% tetramethyl-p-phenylenediamine
dihydrochloride hoặc oxalate)
- thấm bớt dịch hóa chất thừa bằng giấy thấm
- để khô ở 35ºC và giữ trong chai tối màu ở nhiệt độ phòng
- dùng que cấy vòng bằng bạch kim chuyển sinh khối lên một phần giấy lọc
- sau 10 giây đọc kết quả (không được vượt quá thời gian này)
- pseudomonas spp có phản ứng oxidase (+): khi giấy lọc có màu đỏ tía
đậm sau 10 giây
 Thử nghiệm nitratase:
- cấy ria khuẩn lạc thử ngnhiệm trên bề mặt và đâm sâu xuống thạch Nitrate
Motility Agar trong ống thạch sâu.
- ủ ở 35ºC trong 24h
- nhỏ vài giọt sulfanilic acid và naphthylamine: màu hồng đậm hay màu đỏ
chứng tỏ có sự biến đổi nitrate thành nitrite. Nếu môi trường không đổi màu nhưng có sự
tạo thành bọt khí hoặc rạn nứt môi trường cũng được xem là phản ứng (+)
- Pseudomonas fluorescens cho kết quả (+) do khả năng khử nitrate thành
nitrite giải phóng nitơ
 Thử nghiệm tạo sắc tố pyoverdine:

- cấy ria khuẩn lạc thử nghiệm lên môi trường thạch Pseudomonas Agar F
- ủ ở 25ºC ít nhất là 3 ngày


- soi đĩa dưới tia UV (260nm)
- Pseudomonas fluorescens tiết sắc tố pyoverdine phát hùynh quang khuếch
tán trong agar dọc theo đường cấy.

Hình 10
A. P.fluorescens phát triển trên môi trường
thạch dinh dưỡng, ánh sáng bao quanh.
B. P.fluorescens phát triển trên môi trường
thạch dinh dưỡng, ánh sáng cực tím.
C. P.fluorescens phát triển trên môi trường
Pseudomonas Agar F, ánh sáng bao quanh.
D. P.fluorescens phát triển trên môi trường
Pseudomonas Agar F, ánh sáng cực tím.

2.1.2. Thử nghiệm amon hóa protein
Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có khả năng amon hóa protein (gây hiện tượng thối
rửa): tạo thành NH3 từ các hợp chất nitơ hữu cơ
Thí nghiệm: - lấy 3-5g thịt hoặc cá cắt nhỏ cho vào bình tam giác
- để trên miệng bình các giấy chỉ thị để xác định sản phẩm phân hủy (giấy
quỳ hồng xác định sự có mặt NH3, giấy lọc tẩm dung dịch 10% chì axetat xác định sự có
mặt của H2S, giấy lọc tẩm dung dịch nóng của oxalic axit bão hòa để xác định sự có mặt
của indon).
- đậy nút bông để ở nhiệt độ từ 28-35ºC
Sau 1 ngày quá trình phân hủy prôtêin đã xảy ra tạo mùi hôi thối đặc trưng. Sau 57 ngày các miếng thịt nát vụn, môi trường lên men đổi màu, sau đó thịt dần bị vô cơ hóa
thành dịch lỏng.
Kiểm tra kết quả: lấy 1 giọt dịch phân hủy làm tiêu bản nhuộm màu cố định để quan sát

vi sinh vật xem có phải là chủng Pseudomonas fluorescens không.


2.2.

Các phƣơng pháp hiện đại
2.2.1. Phƣơng pháp PCR

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp in vitro để tổng hợp
DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản
sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ họat động của enzyme polymerase và
một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đọan DNA này.
Hỗn hợp phản ứng nhân bản gen có thể tích 25µl với thành phần:
16,7 µl nước
2,5 µl đệm Taq (10x)
2,5 µl dung dịch dNTP (10mM)
1 µl dịch mồi Prf (10mM)
1 µl dịch mồi Prr (10mM)
1 µl dịch DNA khuôn
0,3 µl Taq Polymerase
Phản ứng được thực hiện với chu trình nhiệt như sau:
Giai đọan đầu: ADN biến tính ở 95ºC trong 1 phút 30 giây, tiếp tục biến
tính ở 94ºC trong 1 phút, kế tiếp mồi được gắn ở nhiệt độ 52ºC và phản ứng kéo dài chuỗi
ở 72ºC trong 1 phút 20 giây.
Giai đọan chính: được lặp lại 30 lần chu kỳ nhiệt cơ bản giống giai đọan
đầu, chỉ khác ở chỗ ADN được biến tính một lần ngay ở nhiệt độ 94ºC trong 1 phút, tiếp
sau pha cuối cùng phản ứng kéo dài chuỗi được duy trì ở 72ºC trong 10 phút và sản phẩm
được bảo quản ở 4ºC
Kết quả được kiểm tra bằng điện di agarose 0.8%, nhuộm EtBr và hiện hình
trên thiết bị hiện hình UV.

745 bp
Hình 11. Kết quả PCR dựa vào DNA
khuôn mẫu trích từ các dòng
Pseudomonas fluorescens với các
primer chuyên biệt trên các gen mã
hóa các chất kháng sinh khác nhau


Hình 12: Kết quả chạy gel DNA của Pseudomonas fluorescens từ PCR
2.2.2.
Phƣơng pháp HPLC (High – Performance Liquid
Chromatography) dùng để phát hiện khả năng tạo 2,4-DAPG của Pseudomonas
fluorescens
2.2.2.1. Phƣơng pháp HPLC
Phương pháp này còn được gọi là phương pháp sắc kí lỏng cao áp: khả năng phân tách và
tốc độ phân tách cao hơn nhiều so với phương pháp cổ điển, cột HPLC có thể dễ dàng tái
sử dụng không cần phải nhồi cột lại hoặc tái sinh cột, độ lặp lại lớn hơn vì kiểm sóat
được các thông số gây ảnh hưởng, máy được tự động hóa cao và HPLC dễ dàng sử dụng
ở mức độ lớn hoặc mức độ thu mẫu.
- HPLC định được kết quả phân tách rất cao nhờ sử dụng các hạt hấp phụ rất mịn
< 20 μm, có diện tích bề mặt rất lớn
- HPLC sử dụng ít dung môi, nhưng đòi hỏi dung môi phải rất sạch và không chứa
bọt khí

- HPLC sử dụng cột sắc ký bằng thép không rỉ hoặc ống thủy tinh
đường kiń h là 2,1;3,2 và 4,5 mm

-teflon với

Hình 13: Hệ thống phƣơng pháp HPLC
2.2.2.2. Tiến hành
- Chuẩn bị mẫu: chọn lọc vi khuẩn Pseudomonas fluorescens dựa vào khả năng
phát hùynh quang và trữ mẫu ở -80ºC trong dung dịch glycerol.
- Các dòng Pseudomonas fluorescens được nhân sinh khối trong môi trường KB
lỏng ở 28ºC trong 36h.
pH = 2
-

Ly tâm thu dung dịch, tiến hành acid hóa với trifluoroacetic 10% cho tới khi
Chiết rút 2 lần dung dịch đã được acid hóa với ethyl acetate

- Thu dung dịch chiết rút và làm khô bằng hệ thống BUCHI rotavapor R-114,
hòa tan trong 1ml methanol.
- Phân tích trên hệ sắc ký dùng Columm 100-5 C18AB Ser. No. 8075636, máy
HEWLETT PACKARD với lượng mẫu phân tích mỗi lần là 20µl trong dung môi 35%


- acetonitrile chứa 0,1% H3PO4, tốc độ dòng dung môi là 0,5ml/phút, bước song
270nm, thời điểm ghi nhận là 11,6 phút.
- Sử dụng mẫu chuẩn 2,4-diacetylphlorogluinol (TRC) để thiết lập phương pháp
chuẩn và thiết lập đường tương quan dùng quy đổi nồng độ có trong dung dịch phân tích.

Hình 14: Sắc kí đồ HPLC phát hiện hợp chất kháng sinh sinh học 2,4-DAPG
trong dung dịch lỏng của các dòng vi khuẩn đối kháng Pseudomonas fluorescens
A. Mẫu chuẩn với thời gian phát hiện ứng với 2,4-DAPG là 11,6p với nồng độ
0,2ppm.
B. Dung dịch chiết xúât từ vi khuẩn PBV1 phân lập từ bông vải.
C. Sắc kí đồ của mẫu chuẩn cộng với mẫu chiết suất PBV1.

D. Sắc kí đồ của vi khuẩn PMT51 phân lập từ rễ cây mồng tơi có nồng độ
2,4-DAPG là 26,1µg/ml dung dịch chiết xuất.


III. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens là dòng vi khuẩn thông thường hiện diện trong thực
phẩm, nồng độ gây ngộ độc thực phẩm của nó đến con người là không cao tuy nhiên nó
là tác nhân gây bệnh đối với các loài thủy sản nuôi trong ao hồ. Mặt khác chủng
Pseudomonas fluorescens có lợi cho cây trồng, sản xuất ra các lọai thuốc bảo vệ thực vật,
kháng sinh nên nó được chú trọng nghiên cứu trong thực vật.
Tuy vậy khả năng gây độc của nó không phải là không có, nó vẫn có khả năng gây bệnh
trên diện rộng đối với con người nên chúng ta cần phải nghiên cứu chuyên sâu hơn về tác
nhân, triệu chứng gây bệnh của nó giống như trường hợp nhiễm xác Pseudomonas
fluorescens ở Mỹ 2004-2006. Những ứng dụng của Pseudomonas fluorescens trong nông
nghiệp cần được nghiên cứu và phát triển hơn nữa để có thể sử dụng dòng vi khuẩn này
một cách hiệu quả nhất.


PHỤ LỤC:

một số môi trường và thuốc thử dùng cho việc xác định

Pseudomonas fluorescens
1. King’s B
Proteose peptone No.3

20g

Glycerol

10ml

K2HPO4

1,5g

MgSO4

1,5g

Agar

15g

Nước cất

1 lít

Cho vào tất cả các thành phần trừ MgSO4. Làm nóng và lắc để hòa tan agar. Chỉnh pH
đến 7,2 ± 0,2. Thêm MgSO4 từ từ và trộn. Phân phối 4ml vào các ống nghiệm 13 x
100mm. Hấp ở 121ºC trong 15 phút, để nghiêng ống nghiệm.

Hình 15: A- Pseudomonas fluorescens trên King’s B
B- Pseudomonas fluorescens trên King’s B đƣợc quan sát dƣới đèn UV
2. Pseudomonas Agar F
Proteose peptone No.3 (Difco)

20g

Tryptone (Difco)

10g

Dipotassium phosphate

1,5g

Magnesium sulfate

0,73g

Glycerol (Difco)

10g

Agar

15g

Nước cất

1 lít


Cho các thành phần môi trường vào nước, trộn. Đun sôi để hòa tan các thành phần. Hấp ở
121ºC trong 15 phút, pH cuối là 7.
3. Brain Heart Infusion (BHI) Broth và Agar
Dịch não dê

200g

Dịch tim bò

250g

Proteose peptone

10g

NaCl

5g

Na2HPO4

2,5g

Dextrose

2g

Nước cất

1 lít

Hòa tan các thành phần của môi trường trong nước cất bằng cách lắc có gia nhiệt nhẹ.
4. Thuốc thử nhuộm Gram
Phƣơng pháp Jensen
-

dung dịch 0,25% methyl violet
trong nước cất

- dung dịch iodine – potassium
iodide: hòa tan 2g KI trong 20ml nước cất.
Bổ sung 1g iodine đã nghiền nhuyễn, để
qua đêm. Thêm nước cất cho đủ 300ml.
- dung dịch safranin: 1% safranin
(hoặc 1% neutral red) trong nước cất.
Phƣơng pháp Hucker
- dung dịch crystal violet: hòa tan
2g crystal violet vào 20ml ethanol 95%.
Hòa tan 0,8g ammonium oxalate trong
80ml nước cất. Trộn chung hai hỗn hợp
này với nhau, để yên 24h, lọc.
- dung dịch iodine – potassium
iodide: hòa tan 2g KI trong 20ml nước cất.
Bổ sung 1g iodine đã nghiền nhuyễn, để
qua đêm. Thêm nước cất cho đủ 300ml.
- dung dịch safranin: nghiền
0,25g safranin trong cối sứ với 10ml
ethanol 95%. Chuyển vào ống đong, rửa
bằng nước cất và thu gộp nước rửa vào
ống đong. Bổ sung nước cất cho đủ 100m Hình 16. Các bƣớc tiến hành nhuộm gram