NGHIÊN cứu sơ bộ một số TÍNH CHẤT hóa SINH của một số ENZYME từ VI SINH vật có HOẠT TÍNH PHÂN GIẢI cục máu ĐÔNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU SƠ BỘ MỘT SỐ TÍNH CHẤT HÓA SINH
CỦA MỘT SỐ ENZYME TỪ VI SINH VẬT CÓ HOẠT TÍNH
PHÂN GIẢI CỤC MÁU ĐÔNG

Giáo viên hướng dẫn: TS Nguyễn Quỳnh Uyển
Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Mến
Lớp

: HC1101

Hà Nội - 2012


LỜI CẢM ƠN.
Lời cảm ơn đầu tiên và sâu sắc, tôi muốn gửi đến TS Nguyễn Quỳnh
Uyển. Cô đã nhiệt tình giúp đỡ, chỉ bảo tôi trong suất quá trình thực tập, để
tôi có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến CN. Nguyễn Anh Đào,
CN. Nguyễn Thị Kim Quy cùng toàn thể các cán bộ, nhân viên trong Viện
Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà nội đã tạo điều
kiện, giúp đỡ tôi trong suất quá trình nghiên cứu.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô trong khoa Công nghệ
Sinh học Viện đại học Mở Hà Nội đã tận tình giảng dạy, truyền đạt cho tôi
những kiến thức bổ ích trong suất thời gian tôi theo học tại khoa.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến cha mẹ
của tôi - người đã luôn che chở , bảo vệ và yêu thương tôi. Và tôi cũng xin
gửi lời cảm ơn đến các bạn của tôi - những người luôn sát cánh bên tôi ,
động viên và giúp đỡ tôi rất nhiều.
Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2012
Sinh viên
Nguyễn Thị Mến


BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN
ADN

Deoxyribonucleic Acid

ARN

Ribonucleotide Acid

Asp

Aspartic

Da

Dalton

DFP

Diizopropyl Flouro Phophate

DMSO

Dimethyl Sulfoxide

DNME

Diazoaxetilnorleuxin Methyl Este

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

His

Histidin

TTHĐ

Trung tâm hoạt động

Ser

Xerin


DANH MỤC CÁC BẢNG DÙNG TRONG KHÓA LUẬN
Bảng 1.Bảng nồng độ các chất thử nghiệm
Bảng 2: Kết quả tuyển chọn các chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh tổng hợp
protease có khả năng phân giải casein
Bảng 3: Kết quả tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp

enzyme phân giải thạch máu
Bảng 4: Kết quả hoạt tính của các enzyme khi nuôi cấy ở các nhiệt độ 30 0C và
370C
Bảng 5: Kết quả hoạt tính của các enzyme được vi sinh vật sinh tổng hợp ở
các thời gian nuôi cấy khác nhau
Bảng 6: Độ bền nhiệt của các enzyme có họt tính phân giải cục máu đông
Bảng 7: Kết quả ảnh hưởng của pH đến hoạt tính phân giải cục máu đông của
các enzyme được sinh tổng hợp từ bẩy chủng.
Bảng 8: Kết quả hoạt tính phân giải cục máu đông của các enzyme sinh tổng
hợp từ vi sinh vật trên thạch máu dưới ảnh hưởng của các kim loại nặng,
DMSO, EDTA


DANH MỤC CÁC HÌNH DÙNG TRONG KHÓA LUẬN
Hình 1: Mô hình trung tâm hoạt động của enzyme protease
Hình 2: Cấu trúc không gian của enzyme protease
Hình 3: Cấu trúc tinh thể của subtilisin
Hình 4: Cấu hình không gian của enzyme nattokinase
Hình 5: Hình ảnh Nattokinase làm tan các cục máu đông
Hình 6: Ảnh minh họa khả năng phân giải cục máu đông của các enzyme
được sinh tổng hợp từ bẩy chủng trên.
Hình 7: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính phân giải cục máu đông của các
enzyme được sinh tổng hợp từ chủng VTCCB-858
Hình 8: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính phân giải cục máu đông của các
enzyme được sinh tổng hợp từ chủng VTCCB-510
Hình 9: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính phân giải cục máu đông của các
enzyme được sinh tổng hợp từ chủng VTCCB-488
Hình 10: Ảnh hưởng của một số chất và kim loại thử nghiệm đến hoạt tính
phân giải cục máu đông của các enzyme được sinh tổng hợp từ chủng
VTCCB-487

Hình 11: Ảnh hưởng của một số chất và kim loại thử nghiệm đến hoạt tính
phân giải cục máu đông của các enzyme được sinh tổng hợp từ Chủng
VTCCB-510
Hình 12: Ảnh hưởng của một số chất và kim loại thử nghiệm đến hoạt tính
phân giải cục máu đông của các enzyme được sinh tổng hợp từ chủng
VTCCB-274


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU................................................................................................................................1
PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................................................2
1.1. Tình hình nghiên cứu enzyme.............................................................................................2
'1.1.1. Tình hình nghiên cứu enzyme ở Việt nam......................................................................................2

1.2. Tổng quan về enzyme protease............................................................................................4
1.2.1. Giới thiệu chung về protease............................................................................................................4
1.2.2. Phân loại protease............................................................................................................................6
1.2.2.1. Exopeptidase.................................................................................................................................6
1.2.2.1.1. Aminopeptidase.........................................................................................................................6
1.2.2.1.2. Carboxypeptidase.......................................................................................................................7
1.2.2.2. Endopeptidase...............................................................................................................................7
1.2.2.2.1. Serine protease...........................................................................................................................7
1.2.2.2.2. Cystein protease.........................................................................................................................8
1.2.2.2.3. Aspartic protease........................................................................................................................8
1.2.2.2.4. Metallo protease.........................................................................................................................9
1.2.3. Nguồn thu protease vi sinh vật.........................................................................................................9
1.2.3.1. Vi khuẩn........................................................................................................................................9
1.2.3.2. Nấm mốc.....................................................................................................................................10
1.2.3.3. Xạ khuẩn.....................................................................................................................................10
1.2.4. Chức năng và ứng dụng của protease............................................................................................11

1.2.4.1. Chức năng...................................................................................................................................11
1.2.4.1.1. Hoạt hóa zymogen ..................................................................................................................11
1.2.4.1.2. Kích thích quá trình đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu đông..............................12
1.2.4.2. Ứng dụng của enzyme protease vào trong công nghiệp [24]......................................................13
1.2.4.2.1. Trong công nghiệp chế biến thịt..............................................................................................13
1.2.4.2.2. Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm:..................................................................................14
1.2.4.2.3. Trong chế biến thủy sản...........................................................................................................14
1.2.4.2.4. Trong một số ngành công nghiệp khác....................................................................................14

1.3. Subtilisin.............................................................................................................................16
1.3.1. Giới thiệu chung về subtilisin........................................................................................................16
1.3.2. Phân loại subtilisin.........................................................................................................................17
1.3.2.1. Subtilisin Carlsberg.....................................................................................................................17
1.3.2.2. Subtilisin BPN.............................................................................................................................18
1.3.2.3. Nattokinase (subtilisin NAT)......................................................................................................18
1.3.2.4. Một số subtilisin khác.................................................................................................................20
1.3.3. Cơ chế xúc tác của subtilisin..........................................................................................................20
1.3.4. Ứng dụng của subtilisin.................................................................................................................21
1.3.4.1. Chất tẩy rửa.................................................................................................................................21
1.3.4.2. Công nghiệp thuộc da.................................................................................................................21
1.3.4.3. Ứng dụng làm tan cục máu đông................................................................................................22

PHẦN II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP............................................................24
NGHIÊN CỨU....................................................................................................................24
2.1. Đối tượng nghiên cứu.........................................................................................................24
2.2. Vật liệu nghiên cứu.............................................................................................................24
2.2.1. Hóa chất.........................................................................................................................................24
2.2.2. Dụng cụ và máy móc.....................................................................................................................25
2.2.3. Môi trường dùng trong nghiên cứu................................................................................................26

2.3. Phương pháp nghiên cứu...................................................................................................27
2.3.1. Phương pháp sàng lọc và tuyển chọn các chủng sinh tổng hợp enzyme.......................................27
2.3.1.1. Phương pháp cấy gạt...................................................................................................................27
2.3.1.2. Nuôi cấy lắc trong NA dịch thể..................................................................................................27


2.3.1.4. Xác đinh hoạt tính trên môi trường thạch máu (máu thỏ)...........................................................28
2.3.3. Phương pháp tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy...................................................................................29
2.3.3.1. Tối ưu nhiệt độ nuôi cấy.............................................................................................................29
2.3.3.2. Tối ưu thời gian nuôi cấy............................................................................................................29
2.3.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến tính chất hóa sinh của các enzyme..29
2.3.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ..............................................................................................................29
2.3.4.2. Ảnh hưởng của pH......................................................................................................................30
2.3.4.3. Ảnh hưởng của các kim loại nặng, DMSO và EDTA.................................................................30

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...........................................................................32
3.1. Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme có hoạt tính phân giải
cục máu đông.............................................................................................................................32
....................................................................................................................................................38
Hình 6: Khả năng phân giải cục máu đông của các enzyme được sinh tổng hợp từ các
chủng vi sinh vật........................................................................................................................38
3.2. Tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy.....................................................................................38
3.2.1. Tối ưu hóa nhiệt độ nuôi cấy ở 300C và 370C..............................................................................38
3.2.2. Tối ưu hóa thời gian nuôi cấy ở 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ.................................................................39

3.3. Tính chất hóa sinh..............................................................................................................40
3.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ.................................................................................................................40
3.3.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của các enzyme.........................................................................42
3.3.3. Xác định sự ảnh hưởng của các kim loại nặng, DMSO, EDTA đến hoạt tính phân giải cục máu
đông của các enzyme được sinh tổng hợp từ các chủng vi sinh vật........................................................44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................................................49
Kết luận......................................................................................................................................49
Kiến nghị....................................................................................................................................50

TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................................52


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chế phẩm
enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong
các lĩnh vực kinh tế. Sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống là một vấn
đề được các nhà khoa học chú ý từ lâu. Enzyme là chất xúc tác sinh học do tế
bào và vi tế bào sản sinh ra. Enzyme có bản chất là protein, có cấu trúc phân
tử rất phức tạp, do đó enzyme có hoạt tính xúc tác mạnh và có tính chọn lọc
rất cao. Enzyme đã dần từng bước làm thay đổi và nâng cao một số các quá
trình công nghệ trong chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế... để
phục vụ cho việc phát triển kinh tế, đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của xã
hội. Hàng năm, lượng enzyme được sản xuất ra trên thế giới đạt khoảng trên
300000 tấn với trị giá trên 500 triệu USD được phân bố trong các lĩnh vực
khác nhau [2].
Việc sử dụng vi sinh vật qua nhiều năm như một nguồn cung cấp
enzyme protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo
ra nhiều hơn. Nattokinase và subtilisin có thể được sinh tổng hợp từ các
chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, các loại nấm... Nattokinase và subtilisin là những
enzyme thuộc nhóm serine protease. Đặc biệt trong thời gian gần đây các nhà

nghiên cứu phát hiện ra một chức năng mới của subtilisin (đại diện là
nattokinase) là có khả năng phân giải cục máu đông. Rất nhiều các sản phẩm
thương mại của nattokinase và subtilisin đã xuất hiện trên thịt rường và có
những ứng dụng quan trọng trong công nghiệp các chất tẩy rửa, thuộc da, y
dược.... Để góp phần làm rõ thêm những tính chất của enzyme có khả năng
phân giải cục máu đông được sinh tổng hợp từ một số chủng vi sinh vật được
lưu giữ và bảo quản tại Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật - Viện Vi sinh vật và
Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội, chúng tôi thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu sơ bộ một số tính chất hóa sinh của một số enzyme từ vi sinh
vật có hoạt tính phân giải cục máu đông”.
GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển
CNSH

1

SV: Nguyễn Thị Mến -


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nghiên cứu enzyme
'1.1.1. Tình hình nghiên cứu enzyme ở Việt nam
Hầu như mọi phản ứng hoá học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò
xúc tác của enzyme - chất xúc tác sinh học. Chính vì vậy, các nghiên cứu về
enzyme đã thu hút sự quan tâm của các nhà hoá sinh học, nhà sinh học thực
nghiệm và nhiều nhà nghiên cứu ở các lĩnh vực liên quan khác [7]. Để mở
rộng các ứng dụng thực tế của các enzyme ở nước ta và đáp ứng yêu cầu của

một số cơ sở sản xuất trong những năm qua, các nhà khoa học đã đi sâu
nghiên cứu tách chiết và chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính enzyme cao,
nghiên cứu các điều kiện thích hợp để tổng hợp mạnh enzyme và thu nhận
chế phẩm enzyme của chúng [24].
Protease là một trong những enzyme đã được sử dụng rộng rãi và lâu
nhất. Các protease khá phổ biến ở động vật (rennet, pepsin, lipase…), thực vật
(bromelin, papain…) và vi sinh vật (subtilisin, nattokinase…). Tuy nhiên sự
phân bố của chúng không đồng đều ở các loài, các mô và các cơ quan khác
nhau. Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này
có thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc được tiết vào môi trường nuôi
cấy (protease ngoại bào). Cho đến nay, các protease ngoại bào được nghiên
cứu kỹ hơn so với protease nội bào [24].
Trong lĩnh vực y dược, việc nghiên cứu sâu về cơ chế tác dụng của một
số enzyme đã kiến tạo một số thuốc điều trị một số bệnh, đặc biệt là tạo ra
một số thuốc chống suy dinh dưỡng ở trẻ em. Đây là một đóng góp rất thiết
thực và kịp thời trong việc phòng chống suy dinh dưỡng trẻ em ở nước ta [2].
1.1.2. Công nghệ sản xuất enzyme trên thế giới
Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme công
nghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó các enzyme thủy
GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển
CNSH

2

SV: Nguyễn Thị Mến -


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

phân chủ yếu chiếm tới 70% tổng giá trị và protease là một trong ba nhóm
enzyme lớn nhất được sử dụng trong công nghiệp (60%) [5].
Trong các protease, các enzyme của hệ tiêu hóa được nghiên cứu sớm
hơn cả. Năm 1857, Corvisart tách được tripsin từ dịch tụy và đó là protease
đầu tiên nhận được ở dạng chế phẩm. Năm 1861, Brucke cũng đã tách được
pepsin từ dịch dạ dày chó ở dạng tương đối tinh khiết. Ngoài các enzyme của
hệ tiêu hóa, người ta cũng đã có những quan sát đầu tiên về các protease trong
máu [9].
Các protease thực vật được phát hiện muộn hơn. Năm 1879, Wurtz được
xem là người đầu tiên tách được protease thực vật. Đến nay người ta đã
nghiên cứu được khá đầy đủ về cấu trúc phân tử của nhiều protease từ thực
vật như papain, subtilisin…[9].
Các protease của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu nhiều từ năm
1950, mặc dù từ năm 1918 - 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng phân
giải protein của xạ khuẩn. Trong hơn 10 năm nay số công trình nghiên cứu
protease vi sinh vật tăng nhiều hơn đáng kể các nghiên cứu về protease của
động vật và thực vật. Những kết quả đạt được trong lĩnh vực này đã góp phần
mở rộng quy mô sản xuất chế phẩm enzyme và ứng dụng enzyme từ vi sinh
vật trong thực tế [9].
Từ năm 1950 trở lại đây, đã có hàng loạt các nghiên cứu tách chiết
protease từ động vật, thực vật và vi sinh vật. Thời gian gần đây các nhà khoa
học trên thế giới tập trung nghiên cứu về protease vi sinh vật và đã đạt nhiều
thành tựu to lớn trong lĩnh vực này (protease từ vi sinh vật chiếm tới 40%
tổng doanh thu của enzyme toàn thế giới [10]). Hiện nay, số lượng các
enzyme được sản xuất hàng năm trên thế giới ở các nước phát triển, nhất là
châu Âu, Mỹ và Nhật Bản, vào khoảng 300000 tấn với doanh thu từ sản xuất
enzyme này ước tính khoảng 500 triệu USD. Trong đó, khoảng 600 tấn
protease tinh khiết được sản xuất từ vi sinh vật, bao gồm khoảng 500 tấn từ vi
GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển

CNSH

3

SV: Nguyễn Thị Mến -


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

khuẩn và 100 tấn từ nấm mốc [5]. Những nước có công nghệ sản xuất và ứng
dụng protease tiên tiến trên thế giới là: Đan Mạch, Nhật Bản, Mỹ, Anh, Pháp,
Hà Lan, Trung Quốc, Đức, Áo. Các nước này đã đầu tư thích đáng cho việc
nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng protease từ vi sinh vật. Chính vì thế nhịp độ
sản xuất protease ở quy mô công nghiệp tại các nước phát triển hàng năm
tăng vào khoảng 5% - 10%. Ngày nay người ta có thể sản xuất các enzyme cố
định trên các chất mang không tan cho phép có thể tái sử dụng enzyme nhiều
lần. Vì vậy mà việc ứng dụng protease ngày càng gia tăng [5], [6].

1.2. Tổng quan về enzyme protease
1.2.1. Giới thiệu chung về protease
Nhóm enzyme protease (peptidase) thuộc lớp 3 (lớp thủy phân), nhóm 4
(nhóm enzyme thủy phân liên kết peptide) - tên hệ thống là EC.3.4 [16].
Enzyme protease là nhóm enzyme xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptit
(-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit và một số cơ chất khác tương tự
thành các amino acid tự do hoặc các peptide phân tử thấp. Ngoài ra, nhiều
protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển amino acid.
* Cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) của Protease [4]
Trong TTHĐ của protease vi sinh vật ngoài gốc amino acid đặc trưng

cho từng nhóm còn có một số gốc amino acid khác. Các kết quả nghiên cứu
chung về TTHĐ của một số protease vi sinh vật cho phép rút ra một số nhận
xét chung như sau [4]:
- TTHĐ của protease đủ lớn và bao gồm một số gốc axit amin và trong
một số trường hợp còn có cả cofactor kim loại.
+ Các protease kim loại có TTHĐ lớn hơn (vào khoảng 21 0A), có thể
phân biệt thành sáu phần dưới TTHĐ (subsite), mỗi phần dưới TTHĐ tương
ứng với mỗi gốc amino acid trong phân tử cơ chất.

GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển
CNSH

4

SV: Nguyễn Thị Mến -


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

+ Đối với các protease acid, nhiều nghiên cứu cấu trúc TTHĐ của các
tinh thể protease acid của Phizopus chinenis và Endothia parasilica đã cho
thấy phân tử các protease này gồm có hai hạt, giữa chúng có khe hở vào
khoảng 200A. Khe hở này là phần xúc tác của các enzyme, các gốc Asp-35 và
Asp-215 xếp đối diện nhau trong khe đó.
- Đối với các protease không chứa cysteine, TTHĐ của chúng có tính
mềm dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các
cầu disulphide.

Hình 1: Mô hình trung tâm hoạt động của enzyme protease

Protease cần thiết cho các sinh vật sống. Nó rất đa dạng về chức năng tại
mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều
đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...)
và động vật (gan lợn, dạ dày bê...). So với protease động vật và thực vật,
protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi
sinh vật là một hệ phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc,
khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng
GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển
CNSH

5

SV: Nguyễn Thị Mến -


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh
vật thường có tính đặc hiệu rộng tạo ra sản phẩm thủy phân hoàn toàn và đa
dạng [4].

Hình 2: Cấu trúc không gian của enzyme protease
1.2.2. Phân loại protease
Protease được phân chia thành hai nhóm chính dựa vào khả năng cắt
peptide ở đầu C hay đầu N (exopeptidase) hay peptide nội phân tử
(endopeptidase) [16].

1.2.2.1. Exopeptidase
-Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân
chia thành hai loại:
1.2.2.1.1. Aminopeptidase
Amonipeptidase xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một
tripeptide. Các aminopeptidase được tìm thấy ở nhiều vi sinh vật như vi
GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển
CNSH

6

SV: Nguyễn Thị Mến -


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

khuẩn và nấm. Các aminopeptidase do các sinh vật khác nhau sinh ra có
những khác biệt về trọng lượng phân tử, sản phẩm thủy phân, ion hoạt hóa.
Aminopeptidase được sinh tổng hợp bởi Escherichia coli là một loại protease
lớn (400000 Da), dải pH hoạt động 7,5 - 10.5 và cần ion Mg 2+ hoặc Mn2+ để
hoạt động tối ưu [16]. Aminopeptidase do Bacillus licheniformis sinh tổng
hợp có trọng lượng phân tử 34000 Da và cần ion Co 2+ để nâng cao hoạt độ.
Aminopeptidase do Bacillus stearothermophilus sinh tổng hợp là một dimer
có trọng lượng phân tử khoảng 80000 - 100000 Da và được hoạt hóa bởi các
ion Zn2+, Mn2+ hoặc Co2+ [16].
1.2.2.1.2. Carboxypeptidase
Carboxypeptidase xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi

polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide. Dựa vào các
đặc điểm của các amino acid có mặt trong trung tâm hoạt động của enzyme,
các carboxypeptidase được chia thành 3 nhóm lớn: carboxypeptidase serine,
carboxypeptidase

kim

loại,

và

carboxypeptidase

cysteine.

Các

carboxypeptidase serine thu được từ Penicillium sp, Saccharomyces sp, và
Aspergillus sp giống nhau về cơ chất thủy phân, nhưng có những khác biệt về
pH thích hợp, trọng lượng phân tử, và ảnh hưởng của các chất ức chế. Các
carboxypeptidase kim loại do Saccharomyces sp và Pseudomonas sp sinh
tổng hợp cần Zn2+ hoặc Co2+ cho hoạt động của chúng [16].
1.2.2.2. Endopeptidase
-Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành
bốn nhóm:
1.2.2.2.1. Serine protease
Là những protease chứa nhóm -OH của gốc serine trong trung tâm hoạt
động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme.
Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm
7

GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển
SV: Nguyễn Thị Mến CNSH


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin,
elatase... Trypsin, chymotrypsin bị ức chế mạnh dưới tác dụng của
diizopropylflourophophate (DFP) và nhiều protein đặc hiệu khác như chất ức
chế trypsin đậu tương [14], [16]. Các serine protease thường hoạt động mạnh
ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. Tính đặc
hiệu của chúng thể hiện ở gốc amino acid có chứa nhóm -CO- của liên kết bị
phân giải. Ví dụ, trypsin thủy phân các liên kết peptide có chứa nhóm -COcủa các amino acid kiềm (Lys, Arg), chymotrypsin xúc tác phản ứng thủy
phân liên kết peptide có nhóm -CO- của amino acid thơm [16].
1.2.2.2.2. Cystein protease
Cystein protease là các protease chứa nhóm -SH trong trung tâm hoạt
động. Nhóm -SH có vị trí đặc biệt trong chức năng của phân tử enzyme vì nó
có khả năng phản ứng cao, tham gia nhiều loại biến đổi hóa học: phosphoryl
hóa, oxy hóa, alkryl hóa. Vai trò của nhóm -SH thể hiện ở nhiều mặt: tạo
thành phức chất trung gian enzyme - cơ chất, kết hợp cơ chất với cofactor,
duy trì các cấu hình hoạt động của enzyme... Cystein protease bao gồm các
protease thực vật như papain, bromelin, một vài protease động vật và protease
ký sinh trùng... [16]. Các cystein protease thường hoạt động ở vùng pH trung
tính và có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
1.2.2.2.3. Aspartic protease
Là các protease có chứa nhóm cacboxy trong trung tâm hoạt động. Các
nhóm carboxyl này thuộc mạch R của Asp, Glu hoặc cũng có thể là nhóm
carboxyl đầu C của chuỗi polypeptide. Chúng đóng vai trò xúc tác trong trung

tâm hoạt động của enzyme. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như:
pepsin, chymosin, cathepsin, renin. Các aspartic protease thường hoạt động
mạnh ở vùng pH acid. Chúng bị ức chế bởi diazoaxetilnorleuxin methyl este
(DNME) [14].
GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển
CNSH

8

SV: Nguyễn Thị Mến -


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

1.2.2.2.4. Metallo protease
Metallo protease là nhóm protease được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc,
cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo protease thường hoạt động
ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA.
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba
nhóm:
- Protease acid: hoạt động ở pH 2-4.
- Protease trung tính: hoạt động ở pH 7-8.
- Protease kiềm tính: hoạt động ở pH 9-11.
1.2.3. Nguồn thu protease vi sinh vật
Trong công nghiệp protease có thể thu từ nhiều nguồn chủ yếu từ vi
sinh vật như: vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn.
1.2.3.1. Vi khuẩn
Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn,

chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng.
Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại
endopeptidase hoặc exopeptidase. Protease của vi khuẩn có khả năng sinh ra
cả hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao.
Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử
protein.
Các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus
subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus thermorpoteoliticus và một số giống
thuộc chi Clostridium. Trong đó, Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp
protease mạnh nhất. Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động
thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu [1].
GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển
CNSH

9

SV: Nguyễn Thị Mến -


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

1.2.3.2. Nấm mốc
Các loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được
ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm như các chủng: Aspergillus oryzae,
Aspergillus terricola, Aspergillus fumigatus, Aspergillus saitoi, Penicillium
chysogenum… Các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại
protease: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các
protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5 – 3 [1]. Một số nấm

mốc khác như: Aspergillus candidatus, Penicillium cameberti, Penicillium
roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử
dụng trong sản xuất fomat [1]
1.2.3.3. Xạ khuẩn
Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi
khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có
khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, Streptomyces
fradiae, Streptomyces trerimosus... [1].
Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật)
được tách chiết từ Streptomyces grieus. Enzyme này có đặc tính đặc hiệu
rộng, có khả năng thủy phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành
amino acid. Ở Liên Xô (cũ), người ta cũng tách được chế phẩm tương tự từ
Streptomyces grieus có tên là protelin [1].
Từ Streptomyces fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy
phân karetin. Ở Mỹ, chế phẩm được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản
xuất da [1]. Protease từ Streptomyces fradiae cũng có hoạt tính elastase cao,
do đó chúng được dùng trong công nghiệp chế biến thịt [1].

GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển
CNSH

10

SV: Nguyễn Thị Mến -


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

1.2.4. Chức năng và ứng dụng của protease
1.2.4.1. Chức năng
1.2.4.1.1. Hoạt hóa zymogen
Phần lớn các enzyme được tổng hợp trong cơ thể như những phân tử
enzyme có hoạt tính, nhưng có những enzyme như các protease của tụy tạng,
dạ dày cũng như các protease xúc tác cho quá trình đông máu thường được
tổng hợp qua một dạng trung gian chưa có hoạt tính xúc tác gọi là zymogen
(proenzyme). Đó là những tiền chất để tạo thành enzyme, không phải là
enzyme thực sự. Những chất này không có hoạt tính và chúng phải trải qua
một quá trình biến đổi, sắp xếp lại cấu trúc phân tử mới trở thành enzyme
hoạt tính. Quá trình chuyển hóa pro-enzyme thành enzyme gọi là quá trình
hoạt hóa và được thực hiện nhờ sự tự xúc tác hoặc do các enzyme khác xúc
tác [21].
Quá trình hoạt hóa zymogen có một số đặc điểm chung như sau [21]:
_ Là quá trình thủy phân giới hạn của protein (limited proteolysis), cắt
đứt một số liên kết peptide ở gần đầu N của phân tử zymogen. Đoạn peptide
được tạo thành có thể bị loại ra hoặc vẫn gắn với phần còn lại của phân tử nhờ
các cầu disulfide.
_ Liên kết peptide bị cắt đứt thường làm thay đổi cấu hình không gian
của phân tử theo hướng có lợi cho hoạt động xúc tác, tạo thành phân tử
enzyme.
_ Hiệu suất hoạt hóa zymogen phụ thuộc vào điều kiện hoạt hóa, nồng
độ zymogen, bản chất và nồng độ của enzyme xúc tác cho quá trình hoạt hóa,
nhiệt độ, pH và một số yếu tố khác.
Hiện tượng tổng hợp ra các zymogen có một ý nghĩa sinh học quan
trọng. Có thể nói rằng, các protease trong ống tiêu hóa được tổng hợp qua giai
đoạn trung gian như vậy chính là một cơ chế tự bảo vệ của cơ thể. Lý do là
GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển
CNSH

11

SV: Nguyễn Thị Mến -


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

nếu không xảy ra như vậy thì các tuyến đã tổng hợp nên các loại enzyme này
sẽ bị tiêu hủy bởi chính những enzyme do chúng tổng hợp nên.
1.2.4.1.2. Kích thích quá trình đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục
máu đông
Quá trình đông máu được chia làm 2 con đường: con đường yếu tố mô
(con đường ngoại sinh) và con đường hoạt hóa qua tiếp xúc (con đường nội
sinh). Cả hai cùng kích hoạt con đường chung của yếu tố X, thrombin và
fibrin dẫn tới sự hình thành sợi huyết. Vai trò hàng đầu của nó là chuyển
fibrinogen thành fibrin, là chất liệu chính của cục máu đông [21].
Thực ra, con đường chủ yếu khởi phát sự đông máu là con đường yếu tố
mô. Các con đường đều là một chuỗi các phản ứng, trong đó một zymogen
của một serine protease và đồng yếu tố glycoprotein của nó được hoạt hóa để
trở thành các thành phần hoạt động và xúc tác cho phản ứng tiếp theo trong
chuỗi phản ứng liên tiếp, cuối cùng hình thành các sợi huyết liên kết chéo với
nhau [21]:
Cuối cùng, các cục máu đông được tổ chức lại và tái hấp thu bằng một
quá trình gọi là sự tan fibrin. Enzyme nattokinase được điều hòa bởi một số
chất kích thích và ức chế [21].
1.2.4.1.3. Protease hoạt động như các yếu tố phát triển của các tế bào ác
tính và tế bào bình thường
Khi so sánh tế bào bình thường và tế bào ác tính, người ta nhận thấy các

tế bào ác tính chứa nhiều protease hơn tế bào bình thường. Sự tăng các enzym
protease đã được phát hiện thấy ở các tế bào ác tính cũng như ở máu của
nhiều loại động vật mang khối u ác tính [21]. Tế bào các khối u nuôi cấy tiết
một protease đặc hiệu (chất hoạt hóa plasminogen) mà có hoạt tính tăng từ 10
- 100 lần so với tế bào bình thường. Protease này nằm ở bề mặt màng tế bào,
được tiết và xuất hiện rất sớm trong các tế bào khi tế bào chuyển dạng ác tính
[21].
GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển
CNSH

12

SV: Nguyễn Thị Mến -


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

Sự tăng hoạt tính các loại protease ở khối u được giải thích trên cơ sở
tác dụng sinh học của chúng. Các protease được tiết bởi các tế bào khối u có
khả năng phá hủy sự gắn của tế bào vào những bề mặt rắn. Các protease như
collagenase, cathepsin B, chất hoạt hóa plasminogen có vai trò phá hủy rào
chắn (màng tế bào bao quanh các tế bào khối u). Tế bào khối u phá hủy màng
nền và khuôn ngoại bào. Điều này chứng minh rằng nó là nguyên nhân dẫn
đến khả năng di căn của các khối u [21].
Ngoài ra protease còn có một số chức năng khác như
-Giải phóng hormon và các peptide có hoạt tính sinh học từ các tiền chất
-Vận chuyển protein qua màng
-Tăng sự phân chia tế bào, sinh tổng hợp ADN

1.2.4.2. Ứng dụng của enzyme protease vào trong công nghiệp [24]
Protease được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp như công
nghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược phẩm và nông
nghiệp...
1.2.4.2.1. Trong công nghiệp chế biến thịt
Protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần protein
trong thịt, kết quả làm cho thịt có độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn. Protease
dược sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương vị của thịt [23].
- Ngâm thịt vào môi trường dinh dưỡng chứa protease ở pH và nhiệt độ
xác định (phương pháp này phổ biến và thuận lợi nhất).
- Tẩm hỗn hợp làm mềm thịt (enzyme, muối, bột ngọt).
- Tiêm dung dịch enzyme vào thịt, tiêm dung dịch enzyme vào con vật
trước khi giết mổ.

GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển
CNSH

13

SV: Nguyễn Thị Mến -


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

1.2.4.2.2. Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm:
Streptomyces fradiae dùng để tách chế phẩm keratineza (chế phẩm này
thủy phân được keratin rất có giá trị để sản xuất dịch đạm từ da, lông vũ). Nếu
dùng acid để thủy phân sẽ mất đi hoàn toàn các amino acid chứa lưu huỳnh;

nếu dùng kiềm để thủy phân sẽ bị raxemic hóa (chuyển từ dạng L sang dạng
D, làm giảm giá trị của amino acid). Để thủy phân hoàn toàn protein (trong
nghiên cứu, chế tạo dịch truyền đạm y tế) cần dùng các protease có tính đặc
hiệu cao và tác dụng rộng, vì vậy người ta thường dùng phối hợp cả 3 loại
protease của vi khuẩn, nấm mốc, thực vật với tỷ lệ tổng cộng khoảng 1 - 2%
khối lượng protein cần thủy phân. Ưu điểm của việc thủy phân protein bởi
enzyme là bảo toàn được vitamin của nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm
phụ, không làm sẫm màu dịch thủy phân [23].
1.2.4.2.3. Trong chế biến thủy sản
Khi sản xuất nước mắm (một số loại mắm) thời gian chế biến thường là
rất dài, hiệu suất thủy phân (độ đạm) lại phụ thuộc rất nhiều vào phương pháp
gài nén, nguyên liệu cá... Vì vậy, hiện nay quy trình sản xuất nước mắm ngắn
ngày đã được hoàn thiện, trong đó có sử dụng chế phẩm enzyme thực vật
(bromelin và papain) và vi sinh vật để rút ngắn thời gian làm và cải thiện
hương vị của nước mắm. Tuy nhiên vẫn còn một số tồn tại cần phải hoàn
thiện thêm về công nghệ [23].
1.2.4.2.4. Trong một số ngành công nghiệp khác
Trong công nghiệp sữa, potease được dùng trong sản xuất phomat nhờ
hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng. Protease từ một số vi sinh vật như
Aspergillus candidus, Bacillus mesentericus... được dùng trong sản xuất
phomat [6].
Trong công nghiệp sản xuất bánh mỳ, bánh quy... protease làm giảm thời
gian trộn, làm tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn [23].
GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển
CNSH

14

SV: Nguyễn Thị Mến -

Viện Đại học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

Trong sản xuất bia, chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc
làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của Aspergillus
oryase được dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý
bia tốt hơn [8].
Trong công nghiệp thuộc da, protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự
thủy phân một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm
cho da bị cứng. Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt, làm cho da có độ
mềm dẻo nhất định và tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da.
Trước đây, để làm mềm da người ta dùng protease được phân lập từ cơ quan
tiêu hóa của động vật. Hiện nay, việc đưa việc đưa các protease từ vi khuẩn
(Bacillus mesentericus, Bacillus subtilis), nấm mốc (Aspergillus ozyrae,
Aspergillus flavus), xạ khuẩn (S.fradiae, S. grieus, S. rimosus...) vào công
nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và dần dần chiếm một vịt trí quan
trọng [1].
Trong công nghiệp dệt: Protease vi sinh vật được sử dụng để làm sạch tơ
tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo được tẩy bằng dung dịch cazein,
gelatin) để sợi được bóng, dễ nhuộm. Protease có tác dụng thủy phân lớp
protein serisin đã làm dính bết các sợi tự nhiên, làm bong và tách rời các loại
tơ tằm, do đó làm giảm lượng hóa chất tẩy trắng [23].
Ngoài ra protease còn được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành khác
như [23]:
- Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị
trong thực phẩm và sản xuất một số loại thức ăn kiêng.
- Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn
hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong

chăn nuôi gia súc và gia cầm.

GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển
CNSH

15

SV: Nguyễn Thị Mến -


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

- Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine,
kháng sinh,...
- Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy các chất bẩn
protein, sản xuất mỹ phẩm,...

1.3. Subtilisin
1.3.1. Giới thiệu chung về subtilisin
Subtilisin là một enzyme công nghiệp quan trọng.Trong hệ thống danh
pháp MEROPS phân loại protease, enzyme subtilisin thuộc phân nhánh SB
của nhóm serine proteinase.Nhóm serine proteinase là nhóm peptidase lớn
nhất có chứa nhóm -OH ở trung tâm hoạt động và được phát hiện ở mọi giới
sinh vật như eukaryotes, prokaryotes, archaea và vius. Ngoài subtilisin, trong
phân nhánh SB còn có các protease liên quan đến quá trình xử lý tiền
hormone như KEX2 protease, furin và PC2. Subtilisin là một proteinase kiềm.
Nó hoạt động mạnh trong môi trường kiềm và có tính đặc hiệu cơ chất tương
đối rộng [25].

Subtilisin thường có trọng lượng phân tử khoảng từ 20.000 đến 45.000
Dalton. Cho đến nay người ta đã xác định được 97 loại subtilisin từ 1659 trình
tự trong đó có 16 subtilisin đã được xây dựng cấu trúc không gian [25].
Enzyme này có phổ tồn tại rất rộng, và được tìm thấy trong eubacteria,
archaebacteria, sinh vật nhân chuẩn và virus. Nhưng nó thường được thu nhận
từ các vi khuẩn, đặc biệt là các vi khuẩn sống trong đất, ví dụ như Bacillus
amolyquuefaciens. Subtilisin được tiết ra với số lượng lớn từ chủng Bacillus
subtilis (chủng này đã được nghiên cứu tương đối đầy đủ về đặc tính sinh lý,
sinh hóa, và di truyền với toàn bộ genome đã được xác định). Bacillus sutilis
có ưu điểm là không gây bệnh và không chứa độc tố. Tuy nhiên nhược điểm
của chúng là plasmid tái tổ hợp chứa DNA ngoại lai thiếu bền vững nên việc

GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển
CNSH

16

SV: Nguyễn Thị Mến -


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

biểu hiện trên Bacillus subtilis thường yêu cầu tái tổ hợp vào nhiễm sắc thể
của chúng [25].

Hình 3: Cấu trúc tinh thể của subtilisin
1.3.2. Phân loại subtilisin.
Subtilisin là một nhóm enzyme protease kiềm với hai đại diện được

nghiên cứu nhiều nhất là subtilisin Carlsberg và subtilisin BPN [25]. Bên
cạnh hai đại diện này, những năm gần đây nattokinase (sutilisin NAT) với tác
dụng phân giải cục máu đông cũng đang được các nhà nghiên cứu quan tâm
[17].
1.3.2.1. Subtilisin Carlsberg
Enzyme Carlsberg là enzym được tìm thấy khi nuôi cấy Bacillus
licheniformis vào năm 1947 bởi Leinderstrom, Lang và Ottesen tại phòng thí
nghiệm Carlsberg. Nó được thu lần đầu tiên ở dạng kết tinh vào năm 1952 và
từ đó đến nay, subtilisin là protease vi sinh vật công nghiệp quan trọng nhất,
được sử dụng nhiều trong sản xuất các chất tẩy rửa.
Subtilisin Carlsberg có tính đặc hiệu rộng, thủy phân nhiều loại liên kết
peptide cũng như các liên kết este, nhất là những liên kết được tạo thành từ
GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển
CNSH

17

SV: Nguyễn Thị Mến -


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khóa luận tốt nghiệp

các axit amin thơm. Dưới tác dụng của enzym này, một số triglyceride cũng
có thể bị thủy phân như tripronin và tributyrin. Subtilisin Carlsberg thủy phân
từ 30%-40% liên kết peptide của casein. Giống như các serine protease khác,
Ca2+ không ảnh hưởng đến độ bền của enzym này, nó có pH tối ưu là 8,0-9,0
và bền trong phạm vi pH rộng (từ 5,0-11,0) [25].
1.3.2.2. Subtilisin BPN

Subtilisin BPN là enzym được làm sạch và thu ở trạng thái kết tinh từ
chế phẩm công nghiệp BPN (bacterial protease Nagase). Từ chế phẩm BP
Novo (bacterial protease Novo) đã tách được enzym có thành phần amino
acid tương tự subtilisin Novo. Subtilisin BPN được tổng hợp từ các loài
Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis và Bacillus stearothermophilus.
Subtilisin Carlsberg và subtilisin BPN khác nhau ở 58 amino acid nhưng
chúng hoạt động tối ưu ở cùng một điều kiện là 60 0C và pH 10. Khác với
subtilisin Carlsberg độ bền của subtilisin BPN lại phụ thuộc vào Ca 2+.
Subtilisin BPN còn là một enzym ngoại bào nên có thể dễ dàng thu hồi và
tinh sạch hơn các enzym nội bào, do vậy việc ứng dụng enzym này ngày một
phổ biến [25].
Subtilisin BPN là một serine protease ngoại bào và là một lớp enzym đại
diện lớn nhất của serine protease. Nó có cấu trúc trung tâm hoạt động gồm
Ser221, His64, Asp32. Cấu trúc không gian ba chiều của chúng bền vững
trong khoảng pH rộng và ngay cả khi có mặt của dung môi hữu cơ. Phân tử
subtilisin hoàn chỉnh gồm 275 amino acid và có khối lượng phân tử là 27,5
kDa [25].
1.3.2.3. Nattokinase (subtilisin NAT)
Nattokinase là một thành viên của các họ subtilisin. Nó thuộc nhóm serin
protease được chiết xuất từ Bacillus subtilis. Nattokinase là một enzyme được
chiết xuất từ đậu tương có tên Nato, lên men theo phương pháp dùng vi khuẩn
GVHD: Nguyễn Quỳnh Uyển
CNSH

18

SV: Nguyễn Thị Mến -