Các phương pháp định danh và định lượng vi khuẩn Staphylococcus aureus

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH VÀ ĐỊNH LƯỢNG
STAPHYLOCOCCUS AUREUS

GVHD: TS.Trần Thị Ngọc Yên
HVTT: Nhóm 1
Nguyễn Hồng Phương Thảo
Nguyễn Thị Bích Liên
Nguyễn Thị Nhân Bằng
Lưu Hồ Yến Ngọc


MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Khuẩn lạc đặc trưng của S.aureus trên môi trường Bair-Paker và Chapman
Hình 2: Quy trình thử nghiệm sinh hóa để xác định Staphylococcus aureus
Hình 3: S.aureus bắt màu gram dương quan sát dưới kính hiển vi
Hình 4: Kết quả thử nghiệm Oxidase dương tính và âm tính9
Hình 5: Kết quả thử nghiệm Coagulase
Hình 6: Vòng vô khuẩn khi thử nghiệm kháng sinh11
Hình 7: Đĩa giếng plastic sử dụng trong kĩ thuật ELISA

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Các môi trường thường dùng để chọn lọc Staphylococcus aureus

Bảng 2: Kháng sinh đồ của Staphylococcus aureus ATCC 25923

2


Chương 1. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH STAPHYLOCOCCUS AUREUS

1.1.Đặc tính hình thái và sinh hóa của Staphylococcus aureus
 Hình thái:
S. aureus là những vi khuẩn hình cầu, đường kính 0.5-1.5 µm, tế bào xếp thành
hình chùm nho, không di động, không tạo bào tử.
 Sinh hóa:
• Gram ( +)
• Catalase ( +)
• Oxidase (-)
• Enzyme Coagulase (+)
• Thermonuclease (+)
• DNAse (+)
• Phosphatase (+)
• Sử dụng: glucose (+), manitol (+), trehalose (+), sucrose (+)
• Kháng polymycin B (+)
• Nhạy vancomycin (+)
• Có khả năng sinh trưởng trong môi trường chứa đến 15% muối NaCl

3


1.2.Các môi trường chọn lọc Staphylococcus aureus
Có nhiều môi trường chọn lọc để phát hiện Staphylococci, đặc biệt là S.aureus.
Môi trường chọn lọc S.aureus sử dụng một số hoá chất độc hại để tăng khả năng chọn

lọc. Thành phần môi trường gồm có NaCl, tellurite, lithium chloride và nhiều kháng sinh
khác nhau. Một số môi trường dùng để phân lập và xác định mức nhiễm S.aureus >100 vi
khuẩn/g thực phẩm là : môi trường Staphylococcal 110, thạch Vogel-Johnson, thạch Egg
yolk-sodium azide, thạch tellurite-polymixin-egg yolk và Baird-Parker.

Bảng 1: Các môi trường thường dùng để chọn lọc Staphylococcus aureus
STT
Môi trường
Tác nhân chọn lọc
Tác nhân chẩn đoán
Manitol
1
Staphylococcus 110
Sodium chloride
Gelatin
Lithium chloride
Manitol
2
Vogel-Johson
Potassium tellurite
Tellurite
Glycin
Phenol red
Lithium chloride
Egg yolk
3
Egg yolk-sodium azide
Potassium tellurite
Tellurite
Polymixin B sulfate

4

Baird-Parker

Lithium chloride
Potassium tellurite

Egg yolk
Tellurite

Phần lớn những môi trường chọn lọc thích hợp cho S.aureus bình thường, chưa
bị tác động. Tuy nhiên do sự tác động của quá trình chế biến, bảo quản, điều kiện bất lợi,
khi vi khuẩn bị tác động đến ngưỡng gần chết thì việc tăng sinh S.aureus cần sử dụng
môi trường Baird-Parker, là môi trường thích hợp nhất cho việc tăng sinh những tế bào bị
tổn thương.

4


1.3. Các phương pháp truyền thống định danh Staphylococcus aureus
1.3.1. Phương pháp nuôi cấy
Trước khi nuôi cấy phải tiến hành nhuộm gram để đánh giá. Sau đó tiến hành nuôi
cấy và xác định khuẩn lạc đặc trưng. Trên môi trường BP (Baird Parker), khuẩn lạc đặc
trưng của S. aureus có màu đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1-1,5 mm, quanh khuẩn lạc
có vòng sáng rộng 2-5 mm (do khả năng khử potassium tellurite (K 2TeO3 )và khả năng
thủy phân lòng đỏ trứng của lethinase của S.aureus) (Rosamund M B. và cs, 1995; Mary
K. S. và cs, 2002).
Trên môi trường MSA (Manitol salt agar) hay còn gọi là môi trường Chapman,
khuẩn lạc tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm và làm vàng môi trường xung
quanh khuẩn lạc (do S.aureus có khả năng lên men mannitol, sinh acid sẽ làm đổi màu

chất chỉ thị đỏ phenol trong môi trường Chapman từ đỏ sang vàng ) (Mary K. S. và cs,
2002).

5


Hình 1: Khuẩn lạc đặc trưng của S.aureus trên môi trường Bair-Paker và Chapman

1.3.2 Phương pháp thử nghiệm sinh hóa
Các bước thử nghiệm sinh hóa để xác định S.aureus ở sơ đồ hình 2.

Nhuộm Gram

(+)

(S)

S.saprophyticus
S.epidermidis

6


Hình 2: Quy trình thử nghiệm sinh hóa để xác định Staphylococcus aureus
•

Bước 1: Quan sát hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi, ta sẽ xác định vi khuẩn có

dạng cầu khuần.
• Bước 2: Tiến hành nhuộm gram để phân biệt Staphylococci và Streptococci.

Staphylococci sẽ bắt màu gram (+) có màu xanh tím khi quan sát dưới kính hiển
vi.

Hình 3: S.aureus bắt màu gram dương quan sát dưới kính hiển vi

•

Bước 3: thử nghiệm Oxidase: phân biệt Staphylococcus (âm tính) với
Micrococcus (dương tính). Phản ứng Oxidase dương tính có hiện tượng đổi màu
thuốc thử sang màu xanh tím, âm tính không đổi màu.

7


Hình 4: Kết quả thử nghiệm Oxidase dương tính và âm tính
•

Bước 4: Thử nghiệm Coagulase: dùng để phân biệt tụ cầu vàng với các tụ cầu
khác. Tụ cầu vàng S.aureus do có enzyme coagulase nên gây đông huyết .Những
tụ khác không có coagulase không gây đông huyết tương.

Hình 5: Kết quả thử nghiệm Coagulase

8


•

Bước 5: thử nghiệm tính kháng kháng sinh polymycin B. Đặt polymycin trên môi
trường Mueller Hinton Agar (MHA): đo vòng vô khuẩn R<=10 mm là

Staphylococcus aureus.

1.3.3.Phương pháp xác định S.aureus bằng kháng sinh đồ
Phương pháp này thường được dùng trong y học để xác định S.aureus. Kỹ thuật
kháng sinh đồ thực hiện theo phương pháp của Kirby Bauer, còn gọi là phương pháp định
tính khuếch tán kháng sinh trong thạch. Nguyên tắc của phương pháp này là mỗi loại vi
khuẩn sẽ có mức độ nhạy với khác nhau với các loại kháng sinh, mức độ này thể hiện
mức độ khuếch tán của kháng sinh trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn và nó được xác
định bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn (không có vi khuẩn mọc trong vòng vô
khuẩn). Sau đó sẽ so sánh kết quả thử nghiệm với các bảng chuẩn về vòng vô khuẩn đã
được xây dựng cho mỗi loài. Các bước tiến hành như sau:
•

Pha dịch khuẩn thử nghiệm (Staphylococcus aureus) trong NaCl 0.85%, so với

ống đục chuẩn 0.5Mac Farland có mật độ tương đương 108 vi khuẩn/ml.
• Trải dịch khuẩn lên thạch Mueller Hinton Agar (MHA).
• Thử nghiệm với 2 kháng sinh : Clindamycin (2 µg/ml), Cefoxitin (30 µg/ml)
• Đặt khoanh giấy chứa kháng sinh lên mặt thạch MHA đã trải vi khuẩn (2 khoanh
giấy kháng sinh/ 1 đĩa môi trường), sau đó mang ủ 37 0C/18-24h.
• Kết quả: sau khi ủ 18 giờ, đo được đường kính các vòng vô khuẩn và so sánh với
bảng chuẩn (bảng 2), đường kính được tính ra milimet. Đường kính này đựơc chia
thành các mức độ nhạy cảm, trung gian, đề kháng dựa vào bảng chuấn theo hướng
•

dẫn của tài liệu CLSI.
Trong điều trị thường thử nghiệm nhiều loại kháng sinh cùng lúc kết quả kháng
sinh đồ được chia thành các loại A, B, C, U, O để ưu tiên chọn lọc trong điều trị.

9

Hình 6: Vòng vô khuẩn khi thử nghiệm kháng sinh

Bảng 2: Kháng sinh đồ của Staphylococcus aureus ATCC 25923

10


1.4.Các phương pháp hiện đại để định danh S.aureus
1.4.1.Phương pháp ELISA:
(Enzyme – Linked ImmunoSorbent Assay ) là 1 kỹ thuật sinh hóa để phát hiện
kháng thể (KT) hay kháng nguyên (KN) trong mẫu xét nghiệm. Hiện nay, Elisa
được sử dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp đặc biệt là trong
kiểm tra an toàn trong các sản phẩm sinh học. Xét nghiệm ELISA được thực hiện trong
đĩa plastic kích thước 8cm x 12cm, chứa 8x12 giếng. Mỗi giếng có chiều cao khoảng
1cm và đường kính là 0,7cm.

Hình 7: Đĩa giếng plastic sử dụng trong kĩ thuật ELISA
 Có 2 loại phương pháp Elisa:
11


•

Phương pháp Elisa trực tiếp (direct Elisa): dùng để phát hiện kháng nguyên

trong mẫu xét nghiệm.
• Phương pháp Elisa gián tiếp (indirect Elisa): dùng dể phát hiện kháng
thể chuyên biệt trong huyết thanh

 Nguyên tắc kỹ thuật Elisa:
Sử dụng KT đơn dòng (Mabs) phủ bề mặt những đĩa giếng và sẽ được phát
hiện bằng cách sử dụng các kháng thể thứ cấp như: horeseradich perosidase hay
alkaline phosphatase. Nếu có sự hiện diện của KN trong mẫu, KN sẽ tạo phức hợp với
KT cố định trên giếng và KT tự do có gắn enzyme tạo thành một phức hợp kép
(sandwich). Khi bổ sung cơ chất đặc hiệu của enzyme vào giếng, enzyme xúc tác phản
ứng thuỷ phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có màu hay phát sáng. Bằng cách theo dõi
sự đổi màu có thể phát hiện sự hiện diện của KN. Cần tăng sinh chọn lọc trước khi thực
hiện phản ứng. Kỹ thuật này có độ nhạy phát hiện khoảng 106 CFU/ml.

Hình 8: Nguyên tắc của phương pháp ELISA
12


 Qui trình ELISA trực tiếp dùng để xác định Staphylococcus Aureus:

Chuẩn bị vật liệu:
•

Chuẩn bị các KN: S. aureus được nuôi cấy trên môi trường Staphylococal 110
ủ ở 370C trong 24h. Thu chủng vi khuẩn với dung dịch muối đệm phosphate (pH

6.8) có chứa formalin0.3% và đun nóng ở 1000C trong 1h.
• Sản xuất KT: ba con thỏ được tiêm dịch vi khuẩn dưới da với lượng 0.5; 1;
1.5 và 2ml trong khoảng 4 ngày. Sau 7 ngày tiếp tục tiêm 1ml S.aureus
được nuôi cấy trong môi trường canh thịt vào thỏ. Sau đó 14 ngày tiêm môi
•

trường giống như trên, thu nhận máu và huyết thanh khi giết.
Tinh sạch và ước lượng Protein: KT thỏ được phân lập và tinh sạch

một phần thông qua phương pháp kết tủa ammonium sulfate và hàm lượng
protein đã được ước tính bằng phương pháp Biuret sau khi tiêu bản theo đường

chuẩn của huyết thanh bò albumin.
• Sự tiếp hợp KT-enzyme: Enzyme peroxidase từ đậu tương (10mg) đã được tiếp
•

hợp với một phần KT tinh khiết của thỏ.
Lớp vỏ KT: 100µl KT thỏ (pha loãng 1/10 trong dung dịch đệm phosphate)
được đổ vào từng giếng ủ ở 4 0C trong 24h. Sau đó, các giếng được rửa năm lần
với dung dịch đệm rửa. Các KT được giữ cố định bởi 100µl dung dịch đệm
phosphate (PBS) đổ vào từng giếng và ủ ở 37 0C trong 24h. Sau khi ủ, các giếng

đã được rửa sạch bằng đệm rửa.
Phương pháp thực hiện:
•

Elisa trực tiếp được thực hiện để phát hiện KT tiếp hợp enzyme. Các tiếp hợp
enzyme này pha loãng trong PBS ở các nồng độ là 1:100; 1:200; 1:400 và 1:

800. 100µl PBS được thêm vào mỗi giếng
• Các đĩa được ủ ở 370C trong 2h. Sau đó rửa lại 5 lần bằng dung dịch rửa. Tiếp
tục pha loãng 100µl PBS ở mỗi hàng, đầu tiên pha loãng A+B, thứ 2 là pha
loãng C+D, thứ 3 là pha loãng E+F, thứ 4 là Pha loãng G+H trên tấm
microtitration. Ủ ở 370C trong 2h. Sau khi ủ rửa lại 5 lần bằng dung dịch rữa.
Sau đó thêm 100µl guaiaclo (guaicol + H 2O2) và ủ ở 370C trong 20 phút. Tiếp
13


tục thêm 50µl H2SO4 1M (thuốc dừng) vào mỗi giếng, O.D đã được ghi lại ngay

lập tức trong cùng vi đĩa đọc Elisa, đọc ở bướcsóng 450nm.

1.4.2.Kỹ thuật PCR:
PCR là phương pháp dùng tổng hợp nhân tạo một đoạn DNA chọn lọc. Phản ứng
được thực hiện với enzyme DNA polymerase chịu nhiệt, hai mồi tổng hợp và 4 loại
deoxyribonucleic (dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Mỗi chu kỳ phản ứng gồm 3 chu kỳ:
Biến tính DNA có tác dụng tách 2 sợi đơn từ sợi khuôn khép, nhiệt độ biến tính
khoảng 950C trong 30-60 giây.
Bắt cặp hai mồi và hai sợi đơn của khuôn, nhiệt độ khoảng 40-70 0C, kéo dài 30-60
giây.
Bước tổng hợp, kéo dài chuỗi nhiệt độ 72 0C giúp cho enzyme DNA polymerase
hoạt động tổng hợp tốt nhất.
Đầu dò oligonucleotide:
Mồi được lựa chọn trên cơ sở trình tự nucleotide được công bố của các gen nuc
966-bp có nguồn gốc từ chủng S. aureus Foggi. Hai mồi đã được lựa chọn sau khi kiểm
tra trình tự bổ sung là:
5'-GCGATTGATGGTGATACGGTI-3' (primer 1)
5'-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3 '(primer 2).
Các mồi đã nằm trong 447-bp nuc gen A, mã hóa các nuclease A; mồi là 1 đoạn
giữa nucleotide 48 và 70. Các mồi được sử dụng mà không cần tinh chế thêm. Đối với
nghiên cứu lai tạo, một đầu thăm dò 33-mer với chuỗi
5'-GGTGTAGAGAAATATGGTCCTGAAGCAAGTGCA-3 'đã được sử dụng; trình tự
tương ứng với các nucleotide giữa các vị trí + 147 và 181 + của gen nuc A (23).
Chuẩn bị các vi khuẩn cho PCR:

14


Canh trường của vi khuẩn được pha loãng trong dung dịch muối thanh trùng trước
khi ly giải và khuếch đại bằng PCR. Vi khuẩn được xoáy trộn và ly giải trong 100 µl của

(20 mM Tris-HCl [pH 8.3], 50 mM KCI, 1.5 mM MgCl2, 0.50% [v/v] Tween 20, 0.45%
[v/v] Nonidet P-40, 0.01% [w/v] gelatin, và 60 µg của proteinase K mỗi ml) ở 55 0C
trong 1 giờ. Các mẫu sau đó được gia nhiệt ở 95 ° C trong 5 phút.
Khuếch đại PCR được thực hiện sau khi S.aureus (10 tế bào/ml) tiếp xúc với
cloxacillin (2.5 µg /ml), gentamicin (10 µg / ml), hoặc 0.5% (v / v) formaldehyde ở mức
22 ° C trong 120 phút hoặc sau khi tiếp xúc với bức xạ tia cực tím dưới một đơn vị
photopolymerization trong 15 phút.
Khuếch đại PCR:
Khuếch đại PCR được thực hiện trong một chu trình nhiệt, bằng cách sử dụng một
Taq DNA polymerase tái tổ hợp. Hỗn hợp phản ứng gồm 50 µl của lysate, 10 µl dung
dịch PCR đệm khuếch đại (200 mM Tris-HCl [pH 8,3], 500 mM KCI, 15 mM MgCl2,
0,1% [wt / vol] gelatin, 0,5% Tween 20), 2.0 µl của các đoạn mồi, 10µl của triphosphate
deoxynucleoside, 0.4 µl của AmpliTaq và 25.6 µl nước cất 2 lần. Dầu khoáng (50 µl)
được thêm vào hỗn hợp để ức chế sự bay hơi. Có tổng cộng 37 Chu kỳ PCR được chạy
theo các điều kiện sau đây: DNA biến tính ở 94 °C trong 1 phút, ủ mồi ở 55 °C trong 0.5
phút, và kéo dài DNA ở 72 °C trong 1.5 phút. Sau chu kỳ cuối cùng, các phản ứng đã
được chấm dứt bằng cách giữ nó ở 72 ° C trong 3,5 phút. Sản phẩm PCR được lưu trữ tại
4 °C cho đến khi chúng được thu thập.
Điện di trên gel Agarose:
Các mẫu PCR khuếch đại được phân tích bằng điện di agarose gel 1.3% (w/v)
trong đệm điện di 1x TBE (pH 8,3; 0,09 M Tris, 0,09 M axit boric, 2.0 mM EDTA) và
với 0.003% (w/v) ethidium bromide để nhuộm DNA. Sản phẩm PCR không pha loãng
(30µl) đã được pha trộn với một đệm mẫu (10 µl) của 0.4x TBE, 50% (v/v) glycerol, và
0.025% (w/v) bromphenol xanh; và 25 µ1 mẫu được áp dụng cho từng giếng. Gel được
chạy trong 1 x TBE đệm tại 150 V cho 2 h. Một enzyme cắt giới hạn pBR322 HaeIII
DNA đã được sử dụng như một điểm đánh dấu DNA.
Phân tích Southern blot:
15

Sản phẩm PCR được tách ra trên gel agarose và chuyển qua một màng Blotting
Zeta Probe (Bio-Rad). Các màng đã được cố định dưới ánh sáng tia cực tím trên máy soi
UV (5 phut), ủ trong 1 giờ ở 51°C trong 40 ml dung dịch lai (6x SSC [0.9 M NaCl, 0.09
M sodium citrate, pH=7.0], 0.5% [w/v] sodium dodecyl sulfate [SDS], và 10 x dung dịch
Denhardt [0.25% Ficoll 400, 0.25% polyvinylpyrrolidone, 0.25% albumin huyết thanh
bò]), và lai trong 3 giờ ở 52°C trong dung dịch lai với 10 pmol của 33-mer mẫu dò DNA.
Các mẫu dò DNA đã đánh dấu với [γ-32P] ATP bằng cách sử dụng T4 polynucleotide
kinase. Màng được rửa trong 0.1x SSC-0.1% SDS cho 2 giờ ở 45°C và tiếp xúc với
Hyperfilm-MP (Amersham) cho 1 h ở -80 ° C để phát hiện lai.
Chương 2. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS
2.1.Đếm khuẩn lạc
2.1.1.Đồng nhất mẫu và pha loãng
Cân chính xác 10 ± 0.1 g mẫu trong túi PE vô trùng, thêm 90ml dung dịch pha loãng,
đồng nhất bằng máy dập mẫu 30 giây. Chuẩn bị dãy pha loãng thập phân thích hợp tùy
theo mức nhiễm của từng loại mẫu sao cho khi cấy một thể tích xác định lên đĩa thạch
Baird Parker sẽ xuất hiện khoảng 10 – 100 khuẩn lạc / đĩa.
2.1.2.Phân lập trên môi trường chọn lọc
Cấy 0.1 ml mẫu nguyên hoặc đã pha loãng vào đĩa môi trường thạch Baird Parker.
Dùng que cấy tam giác thủy tinh (thanh gạt thủy tinh) trải đều mẫu lên bề mặt môi trường
cho đến khi khô. Thực hiện lập lại 3 đĩa môi trường thạch Baird Parker cho mỗi loại pha
loãng. Thực hiện tương tự với môi trường thạch máu. Lật ngược đĩa, ủ ở 37 ± 1 oC trong
24 – 48 giờ đối với môi trường Baird Parker và 24 giờ đối với môi trường thạch máu.
Sau 24 giờ, khuẩn lạc S. aureus trên môi trường thạch Baird Parker có đường kính 0.5
– 1 mm, lồi, đen bóng, có vòng sáng rộng khoảng 1 – 2mm bao quanh.
16


Đánh dấu trên mặt đáy của đĩa các khuẩn lạc có đặc điểm như trên và tiếp tục ủ 48
giờ. Sau 48 giờ khuẩn lạc S. aureus có đường kính khoảng 1 – 1.5mm, có màu đen bóng,
lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng khoảng 2 – 4mm quanh khuẩn lạc. Khuẩn

lạc một số dòng S. aureus có thể không tạo các vòng sáng quanh khuẩn lạc như trên. Cần
đến và đánh dấu cả hai loại khuẩn lạc.
Trên môi trường thạch máu sau 24 giờ ủ S. aureus cho khuẩn lạc bóng loáng, đục,
lồi, có màu xám hay vàng nhạt, đường kính khoảng 1 – 2µm. Hầu hết S. aureus có vùng
tan máu, tuy nhiên một số dòng không tạo vùng tan máu này.
2.1.3.Khẳng định
Dùng que cấy vòng cấy 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc không đặc trưng từ
môi trường Baird Parker lên môi trường thạch TSA, ủ ở 37 ± 1oC trong 24 giờ.
Cấy sinh khối vi khuẩn từ môi trường Tryptic soy agar (TSA) vào các ống nghiệm
chứa huyết tương, ủ ở 37 ± 1oC. Theo dõi kết quả phản ứng đông huyết tương sau các
khoảng thời gian 2, 4, 6, 8 và 24 giờ. Tính tỉ lệ khẳng định dựa trên số khuẩn lạc đặc
trưng và không đặc trưng. Thực hiện tương tự với các khuẩn lạc đặc trưng trên môi
trường thạch máu. Kết quả thử nghiệm là (+) khi có khối đông huyết tương hình thành
(mọi mức độ đông kết đều được xem là (+)). Kết quả là (-) khi không có hình thành khối
đông, hỗn dịch vẫn đồng nhất như ống không cấy.
2.1.4.Kết quả
Mật độ S.Aureus trong mẫu được tính như sau :
Mật độ (CFU/g hay CFU/ml) = 10.(NtHt + NaHa)/( F1+F2)
Trong đó:

F - là độ pha loãng
Nt - tổng số khuẩn lạc đặc trưng
Na - tổng số khuẩn lạc không đặc trưng
Ht - tỷ số giữa số khuẩn lạc đặc trưng cho thử nghiệm khẳng
định (+) so với khuẩn lạc đặc trưng
17


Ha - tỷ số giữa số khuẩn lạc không đặc trưng thử nghiệm
khẳng định (+) so với số khuẩn lạc không đặc trưng.

2.2.Phương pháp MPN
Phương pháp này được dùng để định lượng S.aureus trong mẫu có mật độ S.aureus
thấp nhưng mật độ vi sinh vật cạnh tranh cao, khó có thể xác định bằng phương pháp
đếm khuẩn lạc. Dung dịch mẫu được pha loãng thập phân với 3 độ pha loãng thập phân
liên tiếp (ví dụ: 10-1, 10-2, 10-3,…). Tùy theo yêu cầu về độ chính xác của kết quả phân
tích, có thể sử dụng phương pháp MPN với hệ thống 9 ống nghiệm (3 độ pha loãng với 3
lần lặp lại ở mỗi độ pha loãng) hay hệ thống 15 ống nghiệm (3 độ pha loãng với 5 lần lặp
lại ở mỗi độ pha loãng).
Môi trường được sử dụng là Mannitol Salt Broth (MSB) hay Tryptose Soy Broth
(TSB) chứa 10% muối NaCl. Cấy 1ml dịch mẫu có độ pha loãng khác nhau vào ống 10ml
môi trường, ủ ở 37oC trong 48 giờ. Chọn các ống (+), có vi sinh vật phát triển làm đục
môi trường để tiến hành phân lập khuẩn lạc đơn trên môi trường thạch Baird Parker, ủ
37oC trong 48 giờ. Chọn các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường Baird Parker để thực
hiện thử nghiệm khẳng định S.aureus tương tự trường hợp phương pháp đếm khuẩn lạc.
Các đĩa cho kết quả khẳng định S.aureus (+) được đối chiếu với các ống nghiệm trong hệ
thống các dãy ống nghiệm ban đầu và ghi lại số ống nghiệm (+) ứng với mỗi độ pha
loãng. Tra bảng MPN để suy ra mật độ S.aureus trong mẫu (số MPN/g hay MPN/ml).

18


Quy trình định lượng S. aureus
Đồng nhất mẫu và pha loãng mẫu thành các dãy nồng độ
thập phân 10-1,10-2,10-3…
Chuyển 1ml dung dịch 101
,10-2,10-3,… vào ống 10ml
canh MSB ,mỗi nồng độ 3
ống lặp lại, ủ ở 37oC, 48 giờ

Trãi lên đĩa thạch BPA, ủ ở 37oC, 24-48 giờ, trải
trên đĩa thạch máu, ủ 37oC, 24 giờ

Chọn ống (+) đục ở mỗi độ
)
pha loãng

Đếm số khuẩn lạc đặc
trưng

Đếm số khuẩn lạc không
đặc trưng.

Ria lên đĩa thạch BPA, ủ 37oC,
48 giờ

Lấy 5 khuẩn lạc đặc
trưng cấy vào TSA, ủ ở
37±1oC, 24 giờ

Lấy 5 khuẩn lạc
khôngđặc trưng cấy vào
TSA, ủ ở 37±1oC, 24 giờ

Chọn khuẩn lạc đặc trưng
Thử nghiệm ngưng kết coagulase.
o

Cấy vào TSA, ủ 37±1 C, 24 giờ
Thử nghiệm ngưng kết

coagulase
Ghi nhận số coagulase (+) ở
mỗi độ pha loãng
Tra bảng MPN

Tỷ lệ khuẩn lạc đặc
trưng, coagulase (+)

Tỷ lệ khuẩn lạc không
đặc trưng, coagulase (+)

Mật độ S.aureus(CFU/g hoặc CFU/ml)

19


Mật độ S. aureus (MPN/g hoặc
MPN/ml)

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.Odd G. Brakstad, Kjetill Aasbakk, Johan A. maeland, 1992. detection of
staphylococcus aureus by polymerase chain reaction amplification of the nuc gene.
journal of clinical microbiology, vol 30, no 7, p.1654-1660.
2. />3. />4. />5. />6. />
20