Công nghệ sản xuất Insulin bằng DNA tái tổ hợp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

SẢN XUẤT INSULIN BẰNG CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ
HỢP

GVPT: TS. TRẦN THỊ NGỌC YÊN

NHÓM 4


NỘI DUNG

LỜI MỞ ĐẦU

VÀI NÉT VỀ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG

SƠ LƯỢT VỀ INSULIN

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT INSULIN TỪ VI SINH VẬT


LỜI MỞ ĐẦU

•

Bệnh tiểu đường là một trong những căn bệnh đe dọa nghiêm
trọng tới sức khoẻ con người.Trên thế giới số người mắc bệnh tiểu
đường ngày càng tăng, sự gia tăng số người mắc bệnh tiểu đường
sẽ kéo theo sự gia tăng các biến chứng của căn bệnh này như thần
kinh, xơ vữa động mạch… Số người tử vong trên thế giới do bệnh

tiểu đường liên tục gia tăng trong những năm gần đây. Điều đó
đòi hỏi phải tìm ra những hướng tiếp cận mới cho việc ngăn ngừa
và điều trị căn bệnh này.


Best và Banting- những người đầu tiên đã chiết suất được insulin
năm 1921

Collip và MacLeod- những người đầu tiên dùng insulin chiết suất đó để
điều trị bệnh tiểu đường type 1 cho Leonard Thomson

Vậy bạn biết gì về bệnh tiểu đường ?


VÀI NÉT VỀ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG

KHÁI NIỆM

•

Bệnh đái tháo đường, còn gọi là Bệnh tiểu đường, là một bệnh do rối loạn chuyển
hóa cacbohydrat khi hoóc môn insulin của tụy bị thiếu hay giảm tác động trong cơ
thể, biểu hiện bằng mức đường trong máu luôn cao

•

Bệnh tiểu đường là một trong những nguyên nhân chính của nhiều bệnh hiểm
nghèo, điển hình là bệnh tim mạch vành, tai biến mạch máu não, mù mắt, suy thận,
liệt dương, hoại thư, v.v

PHÂN LOẠI BỆNH TIỂU ĐƯỜNG

TIỂU ĐƯỜNG LOẠI 1

TIỂU ĐƯỜNG LOẠI 2

Tiểu đường không phụ thuộc insulin hay tiểu

Tiểu đường phụ thuộc insulin hay tiểu

đường ở người trưởng thành, chiếm khoảng 90-95%

đường ở người trẻ, chiếm khoảng 5-10%

trong tổng số bệnh nhân bệnh tiểu đường, thường

tổng số bệnh nhân

gặp ở lứa tuổi trên 40, nhưng gần đây xuất hiện
ngày càng nhiều ở lứa tuổi 30, thậm chí cả lứa tuổi
thanh thiếu niên


SƠ LƯỢT VỀ INSULIN

o
o

Insulin người là một polypeptide

Bao gồm:

•
•
•

Chuỗi A 21 acid amin
Chuỗi B 30 acid amin
Có một cầu nối disulfur trong chuỗi A và 2 cầu nối
disufur nối giữa hai chuỗi A và B.

o

Công thức hóa học:
C257H383N65O77S6

o

CẤU TRÚC PHÂN TỬ INSULIN

Trọng lượng phân tử: 5808


TỔNG HỢP INSULIN TRONG CƠ THỂ

•

Preproinsulin: là chuỗi peptid dài 110 acid amine, tổng hợp trong các
tế bào β của đảo Langerhans của tuyến tụy.

•

Proinsulin: Khi Preproinsulin tiến tới lưới nội chất, một protease
chuyên biệt sẽ cắt bỏ đoạn peptide tín hiệu tạo proinsulin. Proinsulin
hình thành cầu nối disulfur trong lưới nội chất, hình thành cấu trúc bậc
ba.

•

Insulin: Hình thành qua quá trình phân cắt nhờ enzyme PC1/3 tại liên
kết giữa chuỗi B và C và enzyme PC2 ngay vị trí liên kết giữa chuỗi A
và

C.


VAI TRÒ SINH HỌC CỦA INSULIN

Gia tăng tuần hoàn insulin

Tế bào hấp thu glucose

Năng lượng trao đổi chất
Tổng hợp chất béo
Tổng hợp Glycogen

Kích thích tuyến tụy tiết ra insulin

Tăng lượng Glucose
trong máu

Lượng Glucose còn lại

Glucose trong máu
Giảm lượng Glucose trong máu

Hấp thu Glucose vào máu

Kích thích tuyến tụy tiết ra Glucagon

Glycogen chuyển thành Glucose ở gan

Gia tăng tuần hoàn Glucagon

Sơ đồ biểu hiện sự điều hòa hàm lượng glucose máu


NHỮNG TÁC ĐỘNG KHÁC CỦA INSULIN

- Insulin làm tăng tính hấp thụ của các
axitamin.
- Insulin làm tăng tính thấm các ion kali,
magie và photphat vô cơ tạo điều kiện cho
quá trình photphoryl hoá và sử dụng
glucoz.

Insulin làm tăng tính thấm các ion kali,
magie và photphat vô cơ

MỘT SỐ LOẠI INSULIN TRÊN THỊ TRƯỜNG

Loại insulin

Màu sắc

Tác dụng nhanh
- Insulin Actrapid HM.

Nguồn gốc

Người
trong

- Insulinum maxirapid.

Lợn

Tác dụng bán chậm

Người

- Insulatard HM.

đục

- Insulin Lente.

Loại pha trộn
- Mixtard HM 30/70.

Tác dụng rất chậm
- Utra - Lente

Thời gian bắt đầu có tác
dụng

30 phút
(tiêm dưới da)

1 giờ
Lợn

Thời gian hết tác dụng

8 giờ

20 giờ
18 giờ

đục

Người

30 phút

20 giờ

đục

Bò

4 giờ

30 giờ


QUY TRÌNH SẢN XUẤT INSULIN TỪ VI
SINH VẬT

•

Hiện nay, có nhiều phương pháp sản xuất insulin tái tổ hợp dựa trên các chủng vi sinh vật biến đổi
gen, chủ yếu là vi khuẩn (E.coli, Bacillus brevis…) hoặc nấm men (Saccharomyces cerevisiae , Pichia
pastoris…)

•

Có 2 nhóm phương pháp sản xuất Insulin tái tổ hợp trong các chủng VSV biến đổi gen là : nhóm
phương pháp 2 chuỗi và nhóm phương pháp miniproinsulin.


KHÁI QUÁT VỀ CÔNG NGHỆ
AND TÁI TỔ HỢP

•

Kỹ thuật AND tái tổ hợp là tập hợp nhiều kỹ thuật để tạo ra một gen hoặc cả hệ gen ; cải biến
cấu trúc của gen, nhằm tạo ra các gen mới rồi chuyển chúng vào trong tế bào, cơ thể chủ nhằm
mục đích sản xuất các sản phẩm ( protein, enzym,…), các tế bào, cơ thể có tính trạng mới theo

mong muốn

•

Những hiểu biết sâu sắc về các đại phân tử sinh học là cơ sở khoa học của kỹ thuật gen( kỹ
thuật di truyền) mà khởi đầu là kỹ thuật AND tái tổ hợp



PHƯƠNG PHÁP 1: Sinh tổng hợp Insulin tái tổ hợp theo phương pháp
miniproinsulin (MPI)

•

Tách mARN của gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ của người. Dùng
phản ứng RT-PCR với mồi đặc hiệu để khuếch đại gen, loại bỏ protein. Do hầu
hết các mARN của người đều có đuôi polyA nên sử dụng chuỗi polyT để bắt cặp

BƯỚC1:
Tách được gen mã
hoá proinsulin người
trên nhiễm sắc thể số
11.

với đuôi polyA đó.

•

Sử dụng sắc kí ái lực với polyT giữ lại mARN cần thiết cho quá trình dịch mã; còn
lại loại bỏ ADN và các ARN khác.

•

Cắt bỏ cầu nối A - T thu được mARN


Tách mARN của gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ của người



BƯỚC 3: Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào E.coli nhờ phương pháp
trộn với dung dịch ion Ca hoặc tạo lỗ xung điện.

Tách và biến nạp Plasmic tái tổ hợp vào E.Coli


BƯỚC 4: Lên men bằng phương pháp nuôi cấy liên tục thu sinh khối

Các vi khuẩn chuyển gen sau đó được đưa vào nồi lên
men. Nuôi chúng trong các nồi lên men với các điều kiện
tối ưu. Sử dụng các phương pháp nuôi cấy liên tục, theo
đó các chất dinh dưỡng liên tục được bổ sung để đảm bảo
sự tăng trưởng của vi khuẩn theo hàm mũ. Cứ 20 phút lại
có hàng triệu vi khuẩ được nhân lên qua nguyên phân.
Như vậy, chỉ sau một thời gian ngắn, sinh khối sẽ tăng


BƯỚC 5: Tiền tinh sạch

BƯƠC 6: Hoạt hóa

Hoạt hoá proinsulin invitro bằng
cách xử lý dung dịch đệm, giúp nó
đạt cấu trúc bậc 4, sau đó dùng
enzym đặc hiệu trypsin để phân
cắt proinsulin. Khi đó sản phẩm
thu được mới có hoạt tính cần thiết

Hoạt hoá proinsulin thành insulin hoàn chỉnh


BƯỚC 7: Hổn hợp tinh sạch chỉ còn có insulin

•

Bằng phương pháp sắc ký, tách và
phương pháp miễn dịch gắn enzym.

•

Độ tinh sạch của insulin được đánh giá
qua mỗi giai đoạn trung gian của quá
trình sản xuất nhờ phòng thí nghiệm
chuyên hoá. Cuối cùng insulin được tinh
thể hoá.


PHƯƠNG PHÁP 2: Tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A và B

Phương pháp này sẽ tránh được việc sản xuất enzim đặc
hiệu cần thiết để biến proinsulin thành insulin.
Nhà sản xuất cần hai gen nhỏ đẻ sản xuất hai chuỗi A và
B. Xác định trình tự ADN để qua đó tổng hợp và tách hai
dòng gen này.
Mỗi ADN được chèn vào plasmit. Sau đó sản xuất tương
tự như sản xuất proinsulin.
Cuối cùng hai chuỗi A và B được trộn với nhau và hình
thành cầu nối đisulfua qua phản ứng tái oxi hoá khử nhờ một
chất oxi hoá nhất định.

Sản xuất insulin tái tổ hợp với chuỗi A và chuỗi B riêng
biệt


Tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A và B


CẢM ƠN CÔ VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG
NGHE