Nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp phục vụ điều trị bệnh đái tháo đường

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐH QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH
CHƢƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƢỚC KC.04/06-10
BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI/DỰ ÁN
NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT
INSULIN TÁI TỔ HỢP PHỤC VỤ ĐIỀU
TRỊ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƢỜNG
MÃ SỐ KC.04.09/06-10


Cơ quan chủ trì đề tài/dự án: Trƣờng ĐH Khoa học Tự Nhiên
Chủ nhiệm đề tài/dự án: PGS.TS. Phạm Thành Hổ











TP Hồ Chí Minh – 2010

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐH QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH
CHƢƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƢỚC KC.04/06-10
BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI/DỰ ÁN
NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT
INSULIN TÁI TỔ HỢP PHỤC VỤ ĐIỀU TRỊ

BỆNH ĐÁI THÁO ĐƢỜNG
MÃ SỐ KC.04.09/06-10

Chủ nhiệm đề tài/dự án: Cơ quan chủ trì đề tài/dự án:




PGS.TS. Phạm Thành Hổ PGS.TS. Trần Linh Thƣớc

Ban chủ nhiệm chương trình: Bộ Khoa học và Công nghệ:





GS.TSKH. Trần Duy Quý




TP Hồ Chí Minh - 2010


i
MỤC LỤC

Trang
Mục lục……………………………………………………………………… i
Quy trình tổng quát sản xuất insulin…… ……………………………….vii

Danh mục hình…………………………………………………………… xii
Danh mục bảng………………………………………………………… xxxi
Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt………………………………………. .xxxvi
Danh mục chủng E. coli đã sử dụng………………………………… xxxix
Danh mục vector đã sử dụng……………………………………………. xlii
BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI………………I
PHẦN I. MỞ ĐẦU…………………………………………………… 1
1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỘC
LĨNH VỰC CỦA ĐỀ TÀI 2
1.1. Tình hình bệnh ĐTĐ trên thế giới 2
1.2. Tình hình bệnh ĐTĐ ở Việt Nam 3
1.3. Thuốc điều trị bệnh ĐTĐ 4
1.4. Cấu trúc, sự hình thành và tác dụng của insulin 5
1.5. Sản xuất insulin điều trị bệnh ĐTĐ 7
2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 12
3. LUẬN GIẢI VỀ VIỆC ĐẶT RA MỤC TIÊU VÀ
NHỮNG NỘI DUNG CẦN NGHIÊN CỨU 14
3.1. Tạo dòng biểu hiện mini-proinsulin 14
3.2. Nghiên cứu công nghệ lên men, thu
sinh khối và đồng nhất sinh khối E. coli

ii
tái tổ hợp quy mô 100 lít dịch lên men 18
3.3. Nghiên cứu công nghệ tạo insulin
có hoạt tính từ MPI 19
3.4. Nghiên cứu công nghệ tinh chế
insulin người tái tổ hợp 22
3.5. Thử nghiệm hoạt tính insulin tái tổ hợp 23
3.6. Nghiên cứu đặc tính và kiểm soát
chất lượng insulin tái tổ hợp 23

3.7. Bước đầu nghiên cứu hiệu quả chế phẩm insulin điều trị ĐTĐ
thực nghiệm trên mô hình chuột 24
PHẦN II. NỘI DUNG KHOA HỌC CÔNG NGHỆ
ĐÃ THỰC HIỆN………………………………………… 25
CHƯƠNG 1. TẠO DÕNG BIỂU HIỆN MINI-PROINSULIN 26
1.1. Tạo dòng mang gen mã hóa MPI 26
1.2. Tạo dòng E. coli biểu hiện MPI
dạng thể vùi trong tế bào chất 67
1.2A. Tạo dòng E. coli biểu hiện 6xHis-MPI
dạng thể vùi trong tế bào chất 70
1.2B. Tạo dòng E. coli biểu hiện 10xHis-MPI
dạng thể vùi trong tế bào chất 92
1.3. Tạo dòng E. coli biểu hiện MPI dạng tan
trong tế bào chất 115
1.4. Tạo dòng E. coli biểu hiện MPI dạng tan
trong chu chất 150


iii
CHƯƠNG 2. NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ LÊN MEN, THU
SINH KHỐI, ĐỒNG NHẤT SINH KHỐI E. coli
TÁI TỔ HỢP QUY MÔ 100 LÍT DỊCH LÊN MEN 184
2.1. Nghiên cứu công nghệ lên men và cảm ứng
tổng hợp MPI 185
2.2. Khảo sát phương thức thu sinh khối tế bào
(Quy mô 1 lít – 100 lít lên men) 274
2.3. Khảo sát phương thức phá tế bào tạo dịch
đồng nhất hoặc phân đoạn chu chất 289
CHƯƠNG 3. NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ TẠO
INSULIN CÓ HOẠT TÍNH TỪ MPI 307

3.1. Nghiên cứu công nghệ tạo insulin có
hoạt tính từ MPI dạng thể vùi 309
3.1A. Nghiên cứu công nghệ tạo insulin có
hoạt tính từ 6xHis-MPI dạng thể vùi 316
3.1B. Nghiên cứu công nghệ tạo insulin có
hoạt tính từ 10xHis-MPI dạng thể vùi 337
3.2. Nghiên cứu công nghệ tạo insulin có
hoạt tính từ 6xHis-FTNh-MPI dạng tan 362
3.3. Nghiên cứu công nghệ tạo insulin có
hoạt tính từ DsbA-6xHis-MPI dạng tan 375
CHƯƠNG 4. NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ TINH CHẾ
MPI TÁI TỔ HỢP 387
4.1. Công nghệ tinh chế insulin tái tổ hợp từ
6xHis-MPI quy mô phòng thí nghiệm 387

iv
4.2. Công nghệ tinh chế insulin tái tổ hợp từ
6xHis-MPI quy mô pilot 407
4.3. Công nghệ tinh chế insulin tái tổ hợp từ
10xHis-MPI quy mô phòng thí nghiệm 420
4.4. Công nghệ tinh chế insulin tái tổ hợp từ
10xHis-MPI quy mô pilot 426
CHƯƠNG 5. THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH INSULIN
TÁI TỔ HỢP 432
5.1. Giới thiệu chung 432
5.2. Nội dung thực hiện 435
5.3. Vật liệu và phương pháp 435
5.4. Kết quả và biện luận 436
5.5. Kết luận 441
CHƯƠNG 6. NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH VÀ KIỂM SOÁT

CHẤT LƯỢNG INSULIN TÁI TỔ HỢP 442
6.1. Xác định trình tự axít amin của MPI
và insulin bằng phương pháp
khối phổ MS/MS, TOFMS 442
6.2. Xác định cấu hình lập thể của MPI và insulin
bằng ELISA và phương pháp phổ CD 454
6.3. Xác định hàm lượng insulin so với insulin
chuẩn bằng HPLC và RP-HPLC 461
6.4. Xác định hoạt tính riêng của insulin theo
Dược điển Hoa Kỳ USP 473

v
6.5. Xác định dư lượng của nội độc tố
vi khuẩn bằng phương pháp LAL 481
6.6. Thử nghiệm tính an toàn trên chuột 489
6.7. Đánh giá chất lượng insulin theo
tiêu chuẩn quốc tế 495
CHƯƠNG 7. BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ CHẾ PHẨM
INSULIN ĐIỀU TRỊ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG
THỰC NHGIỆM TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT……………514
7.1. Nghiên cứu tạo mô hình thực nghiệm
chuột bị đái tháo đường…………………………………………… 514
7.2. Nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính làm giảm đường huyết của
insulin trên mô hình chuột bị ĐTĐ thực nghiệm…………………….521
7.3. Đánh giá tồn lưu hoạt tính của chế phẩm insulin theo thời gian…… 531
PHẦN III. CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC, KẾT LUẬN
VÀ KIẾN NGHỊ 539
TÀI LIỆU THAM KHẢO 548
PHỤ LỤC 565
PHỤ LỤC 1. Vật liệu và phương pháp sử dụng cho

quy trình tạo dòng biểu hiện mini-proinsulin 566
PHỤ LỤC 2. Vật liệu và phương pháp sử dụng trong
nghiên cứu công nghệ lên men, thu sinh
khối và đồng nhất sinh khối E. coli
tái tổ hợp quy mô 100 lít dịch lên men 594

vi
PHỤ LỤC 3. Vật liệu và phương pháp sử dụng cho quy
trình công nghệ tạo insulin có hoạt tính từ MPI 629
PHỤ LỤC 4. Vật liệu và phương pháp sử dụng cho quy
trình tinh chế insulin tái tổ hợp từ MPI 642
PHỤ LỤC 5. Vật liệu và phương pháp sử dụng trong
thử nghiệm hoạt tính insulin tái tổ hợp 649
PHỤ LỤC 6. Vật liệu và phương pháp sử dụng trong
nghiên cứu đặc tính và kiểm soát
chất lượng insulin tái tổ hợp 653
PHỤ LỤC 7. Vật liệu và phương pháp sử dụng trong
nghiên cứu hiệu quả chế phẩm insulin
nguyên liệu điều trị bệnh ĐTĐ 655
PHỤ LỤC 8. Dược điển Anh 657
DANH MỤC SẢN PHẨM DẠNG 2 (Tập tài liệu đính kèm).
DANH MỤC SẢN PHẨM DẠNG 3 (Tập tài liệu đính kèm).
KẾT QUẢ ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC (Tập tài liệu đính kèm).

vii

QUY TRÌNH TỔNG QUÁT SẢN XUẤT INSULIN


viii



ix



x





xi



xii
DANH MỤC HÌNH
Trang

PHẨN 1. MỞ ĐẦU
Hình 1. Sơ đồ minh họa quá trình tạo insulin từ preproinsulin 7

Hình 2. Trình tự axít amin và các cầu nối S-S trong cấu trúc
proinsulin người 10
Hình 3. Đặc điểm của mini-proinsulin 11
Hình 4. Sơ đồ protein dung hợp 6xHis-MPI và 10xHis-MPI 16
Hình 5. Sơ đồ dung hợp MPI với DsbA-6xHis với vị trí cắt
TEV protease 17
Hình 6. Sơ đồ dung hợp MPI và FTNh với vị trí cắt trypsin
giữa FTNh và MPI 18
Hình 7. Sơ đồ công nghệ sau lên men để thu nhân insulin
có hoạt tính từ 3 loại MPI khác nhau 22
PHẨN 2. NỘI DUNG KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐÃ THỰC
HIỆN
Hình 1.1.1. Bảng mã di truyền và tần số sử dụng 28
Hình 1.1.2. Sơ đồ tổng hợp gen bằng phương pháp PCR tái tổ hợp 34
Hình 1.1.3. Sơ đồ các bước thiết kế gen mã hóa MPI thay đổi codon 43
Hình 1.1.4. Giao diện trang web của ngân hàng gen NCBI
xuất mã số trình tự gen mã hóa insulin người 44
Hình 1.1.5. Sơ đồ các bước tổng hợp đoạn DNA
mang gen mã hóa MPI bằng PCR tái tổ hợp 45
Hình 1.1.6. Sơ đồ cấu trúc chủng E. coli DH5α mang plasmid pBIns 48

xiii
Hình 1.1.7. Chương trình chạy PCR tổng hợp gen mã hóa MPI 49
Hình 1.1.8. Trình tự nucleotide của gen mã hóa insulin người 52
Hình 1.1.9. Trình tự nucleotide và axít amin của proinsulin người 53
Hình 1.1.10. Codon đã được tối ưu hóa bằng phần mềm GeneDesigner 54
Hình 1.1.11. Sự tương đồng giữa gen mã hóa MPI
và gen mã hóa proinsulin người 55
Hình 1.1.12. Độ phù hợp tương đối của các codon
của gen mã hóa MPI 55

Hình 1.1.13. Tần số sử dụng của các codon của gen mã hóa MPI 56
Hình 1.1.14. Trình tự đoạn DNA chứa gen mã hóa MPI 57
Hình 1.1.15. Vị trí và chiều dài của 4 oligonucleotide được
phân đoạn từ đoạn DNA mang gen mã hóa MPI 58
Hình 1.1.16. Giao diện của OligoCalc xuất các thông số
của hai oligonucleotide Ins1F/Ins2 60
Hình 1.1.17. Giao diện của OligoCalc xuất các thông số
của hai oligonucleotide Ins3F/Ins4R 60
Hình 1.1.18. Giao diện của OligoCalc xuất các thông số
của sản phẩm PCR1 61
Hình 1.1.19. Đoạn DNA mang gen mã hóa MPI
được tổng hợp bằng phương pháp PCR tái tổ hợp 62
Hình 1.1.20. Kết quả điện di sản phẩm PCR
được khuếch đại bởi cặp mồi Ins1F/Ins4R 63
Hình 1.1.21. Kết quả biến nạp hỗn hợp sản phẩm nối pBluescript
và đoạn DNA mang gen mpi vào tế bào E. coli DH5α 64
Hình 1.1.22. Kết qua
̉
phân tích sản phẩm cắt của plasmid pBIns
bằng NcoI va
̀
XhoI trên gel agarose 1%. 65
Hình 1.1.23. Kết quả giải trình tự plasmid pBIns
và so sánh mức độ tương đồng với trình tự l thuyết 66

xiv
Hình 1.2.1. Sơ đồ thiết kế cấu trúc biểu hiện đoạn DNA mang
gen 6xhis-mpi trên plasmid pET43Ins và sản phẩm
biểu hiện 6xHis-MPI 68
Hình 1.2.2. Sơ đồ thiết kế cấu trúc biểu hiện đoạn DNA

mang gen 10xhis-mpi trên plasmid pHTI
và sản phẩm biểu hiện 10xHis-MPI 69
Hình 1.2.3. Sơ đồ dòng hóa gen 6xhis-mpi vào plasmid
pET43.1a tạo plasmid pET43Ins 73
Hình 1.2.4. Chương trình cài đặt máy điều nhiệt
cho phản ứng PCR khuẩn lạc 75
Hình 1.2.5. Các bước tạo dòng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins
biểu hiện 6xHis-MPI ở dạng thể vùi 76
Hình 1.2.6. Kết quả biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E. coli DH5α 80
Hình 1.2.7. Kết quả sàng lọc dòng tế bào E. coli DH5α
mang plasmid tái tổ hợp bằng PCR
khuẩn lạc với cặp mồi Ins1F/Ins4R 82
Hình 1.2.8. Kết quả chọn lọc dòng E. coli DH5

mang
plasmid pET43Ins bằng phương pháp cắt giới hạn 82
Hình 1.2.9. Kết quả so sánh trình tự gen 6xhis-mpi
trên pET43Ins và pBIns 83
Hình 1.2.10. Kết quả tách chiết và kiểm tra vector pET43Ins 85
Hình 1.2.11. Kết quả biến nạp vector pET43Ins vào chủng
E. coli BL21(DE3) trên môi trường LB-Amp100 86
Hình 1.2.12. Kiểm tra vector pET43Ins thu nhận
từ dòng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins 88
Hình 1.2.13. Kết quả phân tích sự biểu hiện 6xHis-MPI 90
Hình 1.2.14. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện protein
6xHis-MPI bằng phần mềm Quantity-One 91

xv
Hình 1.2.15. Sơ đồ dòng hóa gen 10xhis-mpi vào
plasmid pET43.1a tạo plasmid pHTI 95

Hình 1.2.16. Điều kiện phản ứng PCR khuếch đại gen mpi từ pBIns 96
Hình 1.2.17. Chương trình cài đặt máy điều nhiệt
cho phản ứng PCR khuẩn lạc 98
Hình 1.2.18. Các bước tạo dòng E. coli BL21(DE3)/pHTI
biểu hiện 10xHis-MPI ở dạng thể vùi 99
Hình 1.2.19. Phân tích điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gene
10xhis-mpi bằng cặp mồi HTI-F/HTI-R từ pBIns 103
Hình 1.2.20. Kết quả biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E. coli DH5α 104
Hình 1.2.21. Kết quả sàng lọc dòng E. coli DH5α mang
plasmid tái tổ hợp pHTI bằng PCR
khuẩn lạc với cặp mồi HTI-F/HTI-R 105
Hình 1.2.22. Kết quả chọn lọc dòng E. coli DH5α mang plasmid
pHTI dự tuyển bằng phương pháp cắt giới hạn 106
Hình 1.2.23. Kết quả giải trình tự pHTI và so sánh với l thuyết về
độ tương đồng với gen mpi 107
Hình 1.2.24. Kết quả tách chiết và kiểm tra vector pHTI 109
Hình 1.2.25. Kết quả biến nạp vector pHTI vào chủng E. coli
BL21(DE3) trên môi trường LB-Amp100 110
Hình 1.2.26. Kiểm tra vector pHTI thu nhận từ
dòng E. coli BL21(DE3)/pHTI 112
Hình 1.2.27 Kết quả phân tích sự biểu hiện 10xHis-MPI 114
Hình 1.2.28. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện protein
10xHis-MPI bằng phần mềm Quantity-One 115
Hình 1.3.1. Sự hình thành siêu phân tử của protein ngoại lai
dưới tác dụng của phần dung hợp FTNh 118
Hình 1.3.2. Mô hình phễu gấp cuộn 119

xvi
Hình 1.3.3. Vòng đời của các protein trong tế bào 120
Hình 1.3.4. Mô hình minh họa chu trình ATPase của DnaK 121

Hình 1.3.5. Sơ đồ thiết kế cấu trúc biểu hiện đoạn DNA mang gen
6xhis-ftn
h
-mpi trên plasmid pET-FI và sản phẩm
biểu hiện 6xHis-FTNh-MPI 123
Hình 1.3.6. Sơ đồ dòng hóa gen ftn
h
và mpi vào plasmid pET28a
tạo plasmid pET-FI 127
Hình 1.3.7. Sơ đồ dòng hóa gen dnak vào plasmid pET-43.1a
tạo plasmid p43DnaK 128
Hình 1.3.8. Chương trình cài đặt máy luân nhiệt cho phản ứng PCR
khuếch đại gen mpi, dnak và ftn
h
130
Hình 1.3.9. Sơ đồ cấu trúc chủng E. coli BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK
biểu hiện protein dung hợp 6xHis-FTNh-MPI
dạng tan trong tế bào chất 131
Hình 1.3.10. Chương trình cài đặt máy điều nhiệt cho phản ứng PCR
kiểm tra sự hiện diện của plasmid pET-FI và p43DnaK
trong dòng E. coli BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK 133
Hình 1.3.11. Sản phẩm khuếch đại gen ftn
h
và mpi 135
Hình 1.3.12. Biến nạp sản phẩm nối mpi và pFTNH đã
xử l Hind III và XhoI vào tế bào E. coli DH5α 136
Hình 1.3.13. Kết quả kiểm tra dòng E. coli DH5

mang
plasmid pET-FI bằng phương pháp cắt giới hạn 138

Hình 1.3.14. So sánh độ tương đồng và sự đồng khung dịch mã
của gen 6xhis-ftn
h
-mpi 139
Hình 1.3.15. Cấu trúc plasmid pET-FI 140
Hình 1.3.16. Điện di phân tích sản phẩm khuếch đại gen dnak
từ bộ gen E. coli BL21(DE3) 140
Hình 1.3.17. Kết quả biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E. coli DH5α 141

xvii
Hình 1.3.18. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid p43DnaK
dự tuyển được mang bởi dòng E. coli DH5

142
Hình 1.3.19. Cấu trúc plasmid p43DnaK 143
Hình 1.3.20. Kết quả tách chiết và kiểm tra vector
pET-FI và p43DnaK 143
Hình 1.3.21. Kết quả đồng biến nạp hai plasmid pET43DnaK
và pET-FI vào chủng biểu hiện E. coli BL21(DE3) 145
Hình 1.3.22. Phân tích sản phẩm khuếch đại gen mpi
và dnak từ khuẩn lạc E. coli
BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK dự tuyển 146
Hình 1.3.23. Kết quả phân tích sự biểu hiện 6xHis-FTNh-MPI 148
Hình 1.3.24. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện protein
6xHis-FTNh-MPI bằng phần mềm Quantity-One 150
Hình 1.4.1. Con đường oxi hóa và đồng phân hóa trong
chu chất của E. Coli 152
Hình 1.4.2. Cấu trúc DsbA 153
Hình 1.4.3. Con đường hình thành cầu nối disulfide của
protein nhờ DsbA trong chu chất 154

Hình 1.4.4. Khoảng không gian chu chất ở tế bào Gram (-) 155
Hình 1.4.5. Sơ đồ thiết kế cấu trúc biểu hiện đoạn DNA mang gen
dsbA-6xhis-mpi trên plasmid p39TI và sản phẩm
biểu hiện DsbA-6xHis-MPI 158
Hình 1.4.6. Sơ đồ thiết kế plasmid tái tổ hợp p39TI 161
Hình 1.4.7. Chương trình PCR khuếch đại gen mpi 162
Hình 1.4.8. Các bước tạo dòng E. coli BL21(DE3)/p39TI biểu
hiện DsbA-6xHis-MPI ở dạng tan trong chu chất 166
Hình 1.4.9. Sản phẩm khuếch đại gen mpi 170
Hình 1.4.10. Biến nạp sản phẩm nối mpi và pET-39b đã xử l

xviii
Kpn I và EcoR I vào tế bào E. coli DH5α 171
Hình 1.4.11. Kết quả sàng lọc dòng E. coli DH5α
mang plasmid tái tổ hợp bằng PCR khuẩn
lạc với cặp mồi TEVIns-F/TEVIns-R 172
Hình 1.4.12. Kết quả chọn lọc dòng E. coli DH5 mang
plasmid p39TI bằng phương pháp cắt giới hạn 173
Hình 1.4.13. Kết quả so sánh trình tự gen mpi trên p39TI và l thuyết 174
Hình 1.4.14. Kết quả tách chiết và kiểm tra vector p39TI 175
Hình 1.4.15. Điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại gen mpi từ p39TI 176
Hình 1.4.16. Kết quả biến nạp vector p39TI vào chủng
E. coli BL21(DE3)trên môi trường LB-Kan50 177
Hình 1.4.17. Kiểm tra vector p39TI thu nhận từ dòng
E. coli BL21(DE3)/p39TI 178
Hình 1.4.18. Kết quả phân tích sự biểu hiện DsbA-6xHis-MPI
của chủng E. coli BL21(DE3)/p39TI 180
Hình 1.4.19. Kết quả phân tích sự biểu hiện DsbA-6xHis-MPI
của chủng E. coli BL21(DE3)/p39TI
ở các phân đoạn khác nhau 181

Hình 1.4.20. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện protein
DsbA-6xHis-MPI bằng phần mềm Quantity-One 182
Hình 2.1.1. Sơ đồ các bước của quá trình lên men tăng dần
thể tích 188
Hình 2.1.2. Mô hình biểu diễn sự động học của nồng độ tế bào
và của cơ chất trong quá trình nuôi cấy theo thời gian 189
Hình 2.1.3. Động học tăng trưởng của vi sinh vật trong lên men mẻ 190
Hình 2.1.4. Động học tăng trưởng tế bào trong nuôi cấy
mẻ- bổ sung với tốc độ bổ sung chất
dinh dưỡng khác nhau 196

xix
Hình 2.1.5. Kết quả kiểm tra và xác nhận sự biểu hiện của
6xHis-MPI trên môi trường LB+Amp lỏng bằng
phương pháp SDS-PAGE và lai Western blot 202
Hình 2.1.6. Kết quả động học tăng trưởng
của chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins
trên 10 loại môi trường đang khảo sát 205
Hình 2.1.7. Xác nhận sự biểu hiện của protein 6xHis-MPI 206
Hình 2.1.8. Ảnh hưởng của pH môi trường lên sự tăng trưởng
của chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins
và sự tạo thành 6xHis-MPI 208
Hình 2.1.9. Ảnh hưởng của tỷ lệ nạp giống cấp 1
lên sự tăng trưởng của chủng E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins và sự tạo thành 6xHis-MPI 210
Hình 2.1.10. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên sự tăng trưởng
của chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins
và sự tạo thành 6xHis-MPI 212
Hình 2.1.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ cảm ứng lên sự tăng
trưởng của chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins

và sự tạo thành 6xHis-MPI 213
Hình 2.1.12. Sự tăng trưởng của chủng E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins trong hệ thống
lên men 5 lít với 5 lít môi trường MT4 216
Hình 2.1.13. Hình thái khuẩn lạc của chủng E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins trong hệ thống
lên men 5 lít với 5 lít môi trường MT4 217
Hình 2.1.14. Sự tăng trưởng của chủng E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins và sự tạo thành 6xHis-MPI
trong hệ thống lên men 5 lít với 5 lít môi trường MT4 218

xx
Hình 2.1.15. Sự tăng trưởng của chủng E. coli
BL21(DE3)/pHTI và sự biểu hiện 10xHis-MPI
trong hệ thống lên men 50 lít x 2 220
Hình 2.1.16. Kết quả kiểm tra và xác nhận sự biểu hiện của
10xHis-MPI trên môi trường LB+Amp lỏng
bằng phương pháp SDS-PAGE và lai Western blot 222
Hình 2.1.17. Kết quả động học tăng trưởng của chủng E. coli
BL21(DE3)/pHTI trên 10 loại
môi trường đang khảo sát 224
Hình 2.1.18. Xác nhận sự biểu hiện của protein 10xHis-MPI 226
Hình 2.1.19. Ảnh hưởng của pH môi trường lên sự tăng
trưởng của chủng E. coli BL21(DE3)/pHTI
và sự tạo thành 10xHis-MPI 227
Hình 2.1.20. Ảnh hưởng của tỷ lệ nạp giống cấp 1 lên
sự tăng trưởng của chủng E. coli BL21(DE3)/pHTI
và sự tạo thành 10xHis-MPI 229
Hình 2.1.21. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên sự tăng trưởng
của chủng E. coli BL21(DE3)/pHTI

và sự tạo thành 10xHis-MPI 230
Hình 2.1.22. Ảnh hưởng của nhiệt độ cảm ứng lên sự tăng trưởng
của chủng E. coli BL21(DE3)/pHTI
và sự tạo thành 10xHis-MPI 232
Hình 2.1.23. Sự tăng trưởng của chủng E. coli
BL21(DE3)/pHTI trong hệ thống
lên men 5 lít với 5 lít môi trường MT4 235
Hình 2.1.24. Hình thái khuẩn lạc của chủng E. coli

xxi
BL21(DE3)/pHTI trong hệ thống
lên men 5 lít với 5 lít môi trường MT4 235
Hình 2.1.25. Sự tăng trưởng của chủng E. coli
BL21(DE3)/pHTI và sự tạo thành 10xHis-MPI trong
hệ thống lên men 5 lít với 5 lít môi trường MT4 237
Hình 2.1.26. Sự tăng trưởng của chủng E. coli
BL21(DE3)/pHTI và sự biểu hiện 10xHis-MPI
trong hệ thống lên men 50 lít x 2 239
Hình 2.1.27. Kết quả động học tăng trưởng của chủng
E. coli BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK
trên 10 loại môi trường đang khảo sát 242
Hình 2.1.28. Ảnh hưởng của pH môi trường lên sự tăng trưởng của
chủng E. coli BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK
và sự tạo thành 6xHis-FTNh-MPI 244
Hình 2.1.29. Ảnh hưởng của tỷ lệ nạp giống cấp 1 lên sự tăng
trưởng của chủng E. coli BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK
và sự tạo thành 6xHis-FTNh-MPI 246
Hình 2.1.30. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên sự tăng trưởng
của chủng E. coli BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK
và sự tạo thành 6xHis-FTNh-MPI 247

Hình 2.1.31. Ảnh hưởng của nhiệt độ cảm ứng lên sự tăng trưởng
của chủng E. coli BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK
và sự tạo thành 6xHis-FTNh-MPI. 249
Hình 2.1.32. Sự tăng trưởng của chủng E. coli
BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK trong hệ thống
lên men 5 lít với 5 lít môi trường MT4. 252

xxii
Hình 2.1.33. Hình thái khuẩn lạc của chủng E. coli
BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK trong hệ thống
lên men 5 lít với 5 lít môi trường MT4. 253
Hình 2.1.34. Sự tăng trưởng của chủng E. coli
BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK và sự
tạo thành 6xHis-FTNh-MPI trong hệ thống
lên men 5 lít với 5 lít môi trường MT4 254
Hình 2.1.35. Sự tăng trưởng của chủng E. coli
BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK và sự biểu hiện
6xHis-FTNh-MPI trong hệ thống lên men 50 lít x 2 257
Hình 2.1.36. Kết quả động học tăng trưởng của chủng E. coli
BL21(DE3)/p39TI trên 10 loại môi trường đang khảo sát 260
Hình 2.1.37. Ảnh hưởng của pH môi trường lên sự tăng trưởng
của chủng E. coli BL21(DE3)/p39TI
và sự tạo thành DsbA-6xHis-MPI 261
Hình 2.1.38. Ảnh hưởng của tỷ lệ nạp giống cấp 1 lên sự
tăng trưởng của chủng E. coli BL21(DE3)/p39TI
và sự tạo thành DsbA-6xHis-MPI 263
Hình 2.1.39. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên sự tăng trưởng
của chủng E. coli BL21(DE3)/p39TI và sự tạo
thành DsbA-6xHis-MPI 265
Hình 2.1.40. Ảnh hưởng của nhiệt đô cảm ứng lên sự tăng

trưởng của chủng E. coli BL21(DE3)/p39TI
và sự tạo thành DsbA-6xHis-MPI 266
Hình 2.1.41. Sự tăng trưởng của chủng E. coli
BL21(DE3)/p39TI trong hệ thống lên men
5 lít với 5 lít môi trường MT4 269

xxiii
Hình 2.1.42. Hình thái khuẩn lạc của chủng E. coli
BL21(DE3)/p39TI trong hệ thống lên men
5 lít với 5 lít môi trường MT4 270
Hình 2.1.43. Sự tăng trưởng của chủng E. coli
BL21(DE3)/p39TI và sự tạo thành DsbA-6xHis-MPI
trong hệ thống lên men 5 lít với 5 lít môi trường MT4 271
Hình 2.1.44. Sự tăng trưởng của chủng E. coli
BL21(DE3)/p39TI và sự biểu hiện DsbA-6xHis-MPI
trong hệ thống lên men 50 lít x 2 273
Hình 2.2.1. Mô hình minh họa chức năng kép của FTNh
khi được sử dụng như một protein dung hợp 278
Hình 2.2.2. Đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa khối lượng
sinh khối tươi, lực ly tâm và thời gian ly tâm 283
Hình 2.2.3. Đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa khối lượng
sinh khối tươi, lực ly tâm và thời gian ly tâm 287
Hình 2.3.1. Tế bào E. coli quan sát dưới kính hiển vi 291
Hình 2.3.2. Cấu tạo vách tế bào vi khuẩn gram âm 292
Hình 2.3.3. Vi khuẩn E. coli trước (trái) và sau khi
phá tế bào bằng phá tế bào 293
Hình 2.3.4. Kết quả điện di kiểm tra khả năng phá tế bào
thu nhận 10xHis-MPI bằng máy sonicate 398
Hình 2.3.5. Kết quả điện di khảo sát số chu kì phá tế bào 399
Hình 2.3.6. Kết quả khảo sát khả năng phá tế bào với

áp lực 14000psi. 300
Hình 2.3.7. Kết quả khảo sát khả năng phá tế bào với áp lực 16000psi 300
Hình 2.3.8. Kết quả khảo sát khả năng phá tế bào với áp lực 18000psi 301
Hình 2.3.9. Kết quả khảo sát khả năng phá tế bào với áp lực 20000psi 301
Hình 2.3.10. Kết quả khảo sát khả năng phá tế bào với áp lực 22000psi 301