Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng bảo vệ gan của cây khúng khéng ở việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ PHƯƠNG LIÊN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ
TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CÂY
KHÚNG KHÉNG Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ PHƯƠNG LIÊN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ
TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CÂY
KHÚNG KHÉNG Ở VIỆT NAM
LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ

: 60720406

Người hướng dẫn khoa học:
TS. Bùi Hồng Cường
TS. Phương Thiện Thương

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN
Luận văn thạc sỹ của tôi được hoàn thành tuy chưa được gọi là một công
trình khoa học, kết quả còn nhiều thiếu sót, tuy nhiên tôi luôn trân trọng quãng
thời gian thực hiện luận văn này vì nó cho tôi cơ hội được làm việc và lĩnh hội
rất nhiều kiến thức từ các thầy cô, bạn bè.
Trước hết cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới : TS. Bùi Hồng
Cường và TS. Phương Thiện Thương. Sự giúp đỡ, cảm thông của các thầy dành
cho tôi không chỉ nằm trong phạm vi của những người thầy đối với học trò, sự
tận tụy ấy có lẽ còn xuất phát từ tình người. Điều đó khiến tôi nể và phục các
thầy hơn cả sự bao la về kiến thức.
Những lời tiếp theo tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể cán bộ khoa
Hóa phân tích – tiêu chuẩn của Viện Dược Liệu và bộ môn Dược học cổ truyền –
Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, chỉ bảo và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình
nghiên cứu
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn với gia đình đã tạo điều kiện tốt nhất
cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn này.
Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu này
Hà Nội, ngày 30 tháng 3 năm 2016
Tác giả luận văn

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN…………………………………………………...1
1.1 Đặc điểm thực vât……………………………………………………………1
1.2 Thành phần hóa học của loài Hovenia dulcis. ………………………………2
1.3 Tác dụng sinh học của Hovenia dulcis Thunb. ……………………………..5
1.4 Công dụng theo y học cổ truyền và dân gian của Khúng khéng……………8
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………..10
2.1 Đối tượng nghiên cứu………………………………………………………10
2.2 Phương tiện nghiên cứu…………………………………………….………10
2.3 Phương pháp nghiên cứu…………………………………………………...12
2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật…………………….…………..………...12
2.3.2 Nghiên cứu tác dụng dược lý …………………………………..…….....12
2.3.3 Nghiên cứu thành phần hóa học …………………………..…………...15
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU…………………………………....25
3.1 Giám định tên khoa học của dược liệu Khúng khéng và đặc điểm vi học….25
3.1.1 Mô tả đặc điểm hình thái……………………..………………………....25
3.1.2 Đặc điểm vi phẫu………………………………..……………………....27


3.1.3 Đặc điểm vi học bột dược liệu Khúng khéng…………..……………….29
3.2 Kết quả nghiên cứu tác dụng dược lý……………………………………....30
3.3 Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học……………………………………34
3.3.1 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất bằng phản ứng hóa học………..34
3.3.2 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất bằng SKLM……………………36
3.3.3 Kết quả chiết xuất và phân lập một số hợp chất từ Khúng khéng………38
3.3.3.1 Chiết xuất………………………………………………………….…39
3.3.3.2 Phân lập……………………………………………………………...39

3.3.3.3 Kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập được…………………..41
3.3.3.4 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được……………………....43
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN…………………………………………………….50
4.1 Về đặc điểm thực vật……………………………………………………….50
4.2 Về tác dụng dược lý………………………………………………………...51
4.3 Về thành phần hóa học……………………………………………………..53
4.4 Về sự liên quan giữa thành phần hóa học và tác dụng dược lý…………….54
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………………..57
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ADH

Alcohol dehydrogenase

ALT

Alanin amino transferase

AST

Aspartat amino transferase

BuOH, Bu

n - buthanol

dd

dung dịch

EtOAc, Et

Ethyl acetat

EtOH, C

Ethanol

Hx

n – hexan

HD

Hovenia dulcis

KK

Khúng khéng

KKC

Cắn chiết Ethanol toàn phần của Khúng khéng

KKE

Cắn chiết phân đoạn Ethyl acetat của Khúng khéng

MDA

Malonyl dialdehyd

MeOH

Methanol

NAPQI

N-acetyl parabenzoquinon-imin

OD

Optical density (Mật độ quang)

PAR

Paracetamol

Rf

Retension factor

SD

Standard deviation (Độ lệch chuẩn)

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

TLC

Thin - layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng)

TT

Thuốc thử

UV

Ultra violet (Tia cực tím)

γ-GT

Gamma glutamyl transferase


DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
Bảng
Bảng 3.1

Tên bảng
Tác dụng của cao khúng khéng đối với hoạt độ AST

Trang
31

trong huyết thanh chuột ở các lô nghiên cứu

Bảng 3.2

Tác dụng của cao khúng khéng đối với hoạt độ ALT 32
trong huyết thanh chuột ở các lô nghiên cứu

Bảng 3.3

Tác dụng của cao khúng khéng đối với hàm lượng MDA

33

trong gan chuột ở các lô nghiên cứu
Bảng 3.4

Kết quả định tính các nhóm chất trong Khúng khéng

34

Bảng 3.5

Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất KK1

43

Bảng 3.6

Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất KK2

46

Bảng 3.7

Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất KK3

48


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

Hình 1.1

Một số flavonoid phân lập từ cây Khúng khéng

3

Hình 1.2

Một số saponin phân lập được từ Khúng khéng

4

Hình 3.1

Quả, hạt và cuống mang quả của dược liệu khúng khéng

26

Hình 3.2

Một số hình ảnh lá và hoa khúng khéng

26

Hình 3.3

Vi phẫu cắt ngang cuống mang quả khúng khéng

27

Hình 3.4

Vi phẫu hạt Khúng khéng

28

Hình 3.5

Một số đặc điểm bột dược liệu Khúng khéng

29

Hình 3.6

Sắc ký đồ SKLM cắn Ethanol toàn phần (EtOH) và cắn

37

phân đoạn ethyl acetat (Et) của Khúng khéng với hệ dung
môi 1
Hình 3.7

Sắc ký đồ SKLM cắn Ethanol toàn phần (EtOH) và cắn

38

phân đoạn ethyl acetat (Et) của Khúng khéng với hệ dung
môi 2
Hình 3.8

Sơ đồ chiết xuất và phân đoạn các chất từ dược liệu khúng

39

khéng
Hình 3.9

Quy trình phân lập các chất từ cắn ethyl acetat dược liệu

40

Khúng khéng
Hình 3.10

Sắc ký đồ HPLC kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất KK1

41

Hình 3.11

Sắc ký đồ HPLC kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất KK2

42

Hình 3.12

Sắc ký đồ HPLC kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất KK3

42

Hình 3.13

Công thức cấu tạo hợp chất acid betulinic

45

Hình 3.14

Công thức cấu tạo hợp chất acid ursolic

47

Hình 3.15

Công thức cấu tạo hợp chất dihydromyricetin

49

Hình 4.1

Bảng thể hiện tác dụng bảo vệ gan của acid betulinic

55


ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây khúng khéng (còn có tên khác là chỉ cụ, vạn thọ, kê trảo) là một loài thực
vật được trồng và mọc hoang rải rác tại một số tỉnh phía Bắc (chủ yếu là Lạng Sơn và
Cao Bằng) có tên khoa học là Hovenia dulcis Thunb., họ Táo (Rhamnaceae) [15]. Cho
đến nay, đã có rất nhiều các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng
dược lý của cây khúng khéng được công bố [15],[29],[52]. Trong đó tác dụng nổi bật
thu hút được sự chú ý nghiên cứu của các nhà khoa học là tác dụng bảo vệ gan trước
các tác nhân gây độc như carbon tetrachloride, D-galactosamine/lipopolysaccharide và
rượu (cồn) trong các mô hình gây độc gan cấp hoặc mạn [24],[29]. Hiện nay, có rất
nhiều sản phẩm giúp giải độc rượu, bảo vệ gan từ dược liệu khúng khéng được sử dụng
rộng rãi trên thế giới.
Khúng khéng được phát hiện tại nước ta từ những năm 50 của thế kỷ trước.
Trong y học cổ truyền, người dân thường sử dụng khúng khéng để giải độc rượu, làm
giảm những cảm giác khó chịu sau khi uống rượu như buồn nôn, khát nước…[13],[15].
Mặc dù đã được sử dụng rất nhiều trong dân gian, nhưng ở Việt Nam có rất ít các công
trình nghiên cứu về dược liệu này [2]. Do vậy, để chứng minh tác dụng bảo vệ gan,
cũng như cung cấp thêm cơ sở dữ liệu về hóa thực vật học của cây khúng khéng, đề tài:
“Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng bảo vệ gan của cây Khúng khéng ở Việt
Nam” được thực hiện với các mục tiêu:
-

Mô tả được đặc điểm hình thái, vi học và giám định tên khoa học của mẫu dược
liệu khúng khéng thu hái tại Việt Nam.

-

Định tính thành phần hóa học, phân lập và xác định được cấu trúc của 2-3 hợp
chất từ khúng khéng

-

Đánh giá được tác dụng bảo vệ gan của khúng khéng.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT
1.1.1 Vị trí phân loại và phân loại chi Hovenia
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan [3], vị trí của chi Hovenia như sau:
Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Hoa hồng (Rosidae)
Bộ Táo ta (Rhamnales)
Họ Táo (Rhamnaceae)
Chi: Hovenia
Trong phân loại của tác giả Nguyễn Tiến Bân, chi Hovenia chỉ có 01 loài Hovenia
dulcis Thunb. [1]
Theo Thực vật chí Trung Quốc [25], chi Hovenia có 3 loài bao gồm:
-

Hovenia dulcis Thunb.

-

Hovenia acerba Lindl.

-

Hovenia trichocarpa Chun.

1.1.2 Đặc điểm thực vật của cây khúng khéng (Hovenia dulcis Thunb.)
Cây gỗ to hoặc hiếm khi cây bụi, cao khoảng 7-10 m. Vỏ thân, cành màu nâu
xám hoặc đen - tím, nhẵn. Cành non màu nâu hồng, có lông nhỏ và nốt sần. Lá mọc so
le, cuống lá dài 3 - 5cm, nhẵn. Phiến lá hình trứng, dài 10 - 15cm, rộng 5 - 9cm, cả hai
bề mặt lá nhẵn hoặc có lông bột trên các gân ở mặt dưới. Gốc lá tròn, đầu lá nhọn, mép
lá khía răng cưa không đều. Ba gân tỏa ra từ gốc lá, 5 - 6 cặp gân phụ khác. Mặt trên
lục sẫm, mặt dưới nhạt [12],[13],[15],[25].
Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành xim ngắn hơn lá. Hoa màu trắng
hoặc lục nhạt, đường kính 6-8mm, cuống hoa nhỏ và nhẵn [15]. Đài hoa hình chén khía

2


5 răng nhỏ kích thước 2,2 - 2,5 × 1,6 - 2 mm, nhẵn. Tràng 5 cánh nhọn, hình thìa hoặc
hình trứng, kích thước 2,4 - 2,6 x 1,8 - 2,1 mm [25]. Đĩa có lông thưa thớt. Nhị 5 xếp
xen kẽ với cánh hoa. Bầu nhụy hình cầu, nhẵn, đường kính 2 - 2,2 mm, bầu có đầu
nhụy chia 3 [15].
Quả hạch có 3 hạt, gần hình cầu, nhẵn, khi chín có màu đen hoặc nâu xám,
đường kính 6,5 - 7,5 mm. Khi chín, cuống quả và những nhánh con mang quả trở nên
mọng nước, màu hồng, nhiều thịt và có vị ngọt, ăn được. Hạt tròn, dẹt, có màu nâu

bóng, đường kính 5 - 5,5 mm [13],[15],[25].
Mùa hoa: tháng 5 - 6, mùa quả: tháng 8 - 10 [15].
1.1.3 Phân bố, sinh thái
Cây khúng khéng (Hovenia dulcis Thunb.) phân bố ở vùng ôn đới ấm và cận
nhiệt đới Đông - Bắc Á bao gồm Trung Quốc, Nhật Bản và Triều Tiên. Ngoài ra cây
còn được tìm thấy ở Nga và cận Himalaya của Ấn Độ. Khúng khéng thường mọc trong
các thung lũng, gần bờ suối trên các loại đất còn tương đối màu mỡ. Ở Việt Nam,
khúng khéng mọc hoang và được trồng rải rác ở các tỉnh Lạng Sơn và Cao Bằng
[13],[15],[16].
Khúng khéng là cây ưa sáng, thường mọc ở vườn hoặc bờ nương rẫy, ra hoa quả
nhiều. Xung quanh gốc cây mẹ thường thấy cây con mọc từ hạt. Có thể trồng Khúng
khéng bằng hạt hoặc bằng cây mọc từ chồi rễ [15],[16].
1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LOÀI HOVENIA DULCIS
-

Các kết quả nghiên cứu đã công bố cho thấy, flavonoid [34],[55],[62] và

saponin [18],[58],[60],[61] là 02 nhóm hợp chất chính trong loài Hovenia dulcis. Ngoài
ra, dược liệu khúng khéng còn chứa alcaloid [39],[42], các thành phần dinh dưỡng như
lipid, protein, đường khử, acid amin, các nguyên tố vi lượng Fe, Ca, Cu, Mn, P, Zn…
[15].
1.2.1 Flavonoid

3


Năm 2000, từ loài khúng khéng Hovenia dulcis, các tác giả Kim H.S và Lee
H.Y đã phân lập được hợp chất hovenodulinol (I) có cấu trúc gần giống với các
flavonoid khác trong khúng khéng đã được phân lập trước đó như hovenitin (II),
ampelopsin (III), laricetrin (IV), myricetin (V), (+) gallocatechin (VI) [34]. (hình 1.1)

Năm 2013, Wu Long-Huo và cộng sự đã phân lập được 10 hợp chất từ cây
khúng khéng. Các hợp chất được xác định là kaempferol, myricetin, dihydromyricetin,
vanillin,

β-sitosterol,

5,7-dihydroxy-3',4',5'-methoxyflavon,

chrysophanol,

ethyl

caffeat, acid 3-hydroxy-4-methoxybenzoic, epicatechin. Trong đó 5 hợp chất cuối là
những hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ loài Hovenia dulcis tại thời điểm công bố
[61].

Hình 1.1: Một số flavonoid phân lập từ cây Khúng khéng
Bên cạnh đó, một số flavonoid khác cũng đã được phân lập từ hạt khúng khéng
như: (2R, 3R) 5,7,4',5' tetrahydroxy 3' methoxy dihydro flavonol; (2R, 3S) 5,7,3',4',5'
pentahydroxyhydro flavanol; (2R, 3S) 5,7,4',5' tetrahydroxy 3' methoxy dihydro

4


flavonol [62]. Như vậy có thể thấy rằng các flavonoid có trong cây khúng khéng chủ
yếu thuộc 02 nhóm chính là flavonol và flavanonol.
1.2.2 Saponin
Cùng với flavonoid thì saponin là một trong hai nhóm hoạt chất chính trong cây
khúng khéng. Các hợp chất saponin chính đã phân lập từ loài này có phần aglycon là
jujubogenin, một sapogenin thuộc nhóm dammaran.

Năm 1995, hai hợp chất triterpen glycosid mới có hoạt tính ức chế sự giải phóng
Histamin được Yosikawa, Masayuki, Ueda Tomishiko phân lập từ khúng khéng. Hai
hợp chất được đặt tên là Hovenidulcinosid A1 và A2 [61] (Hình 1.2). Sau đó, một vài
saponin đã phân lập từ cây khúng khéng được công bố như 20-O-α-Lrhamnopyranosyl jujubogenin, hodulcin, [15], 3-O-(2-O-α-L-rhamnopyranosyl-3-O-βD-glucopyranosyl-α-L-arabinopyranosyl)

jujubogenin,

3-O-(2-O-α-L-

rhamnopyranosyl-β-D-glucopyranosyl)-20-O-α-L–rhamnopyranosyl jujubogenin, và 3O-β-D-glucopyranosyl-20-O-α-L–rhamnopyranosyl jujubogenin [60], jujuboside B,
hoduloside I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, X, hovenoside I, saponin C2, saponin E và
saponin H. Đây là các saponin đặc trưng trong các loài thuộc chi Hovenia [18].

Hodulorid I

Hovenidulciocosid A1 R=R1; A2 R=H

Hình 1.2: Một số saponin phân lập được từ Khúng khéng

5


1.2.3 Alcaloid
Từ hạt của cây khúng khéng, một vài alcaloid đã được phân lập và xác định cấu
trúc như perlorin, perlolyrin, β–carbolin [15],[16],[42].
1.3 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA HOVENIA DULCIS THUNB.
1.3.1 Tác dụng bảo vệ gan
Cắn chiết ethanol, methanol và nước của loài Hovenia dulcis đều đã được được
chứng minh có tác dụng bảo vệ gan trên động vật thí nghiệm trước các tác nhân gây
độc như carbon tetrachloride, D-galactosamine/lipopolysaccharide và rượu trong các

mô hình gây độc gan cấp hoặc mạn [24],[28],[29],[63]. Trong đó thành phần mang lại
hoạt tính được cho là dihydromyricetin (ampelopsin), một hợp chất có nhiều trong
dược liệu khúng khéng [29]. Tuy nhiên, các flavonoid khác, các triterpenoid saponin
cũng đã được chứng minh là có tác dụng bảo vệ gan [27],[29],[62].
Năm 2006, một nghiên cứu được thực hiện tại Đại học Y Bắc Kinh cho thấy
dịch chiết nước của loài Hovenia dulcis có khả năng làm giảm nồng độ cồn trong máu
và tăng cường hoạt tính của enzym ADH sau khi uống rượu. Như vậy, Hovenia dulcis
có khả năng ngăn cản sự hấp thu rượu ở đường tiêu hóa, tăng chuyển hóa rượu tại gan,
phòng chống say rượu và các tác hại do rượu gây ra [20].
Năm 2007, một nghiên cứu khác được thực hiện trên chuột để đánh giá tác dụng
của dịch chiết phân đoạn ethyl acetat của hạt loài Hovenia dulcis lên hệ thống các
enzym chuyển hóa ở gan Cyt P450. Kết quả là phân đoạn dịch chiết này có ảnh hưởng
khác nhau lên một số enzym hệ Cyt P450 cụ thể là: hoạt động của enzym khử
NADPH-cyt C và erythromycin N-demethylase không bị ảnh hưởng, hoạt động của
aminopyrine N-demethylase trong gan đã tăng lên đến 42,4%. Các biểu hiện mARN
của CYP1A1, CYP2C11 và CYP3A1 đều tăng lên rõ rệt [64].
Năm 2010, nghiên cứu của Du J và các cộng sự cho thấy, dịch chiết từ hạt của
loài Hovenia dulcis có tác dụng bảo vệ gan thông qua việc làm giảm đáng kể hoạt độ
men AST và ALT, tăng cường hoạt tính của các enzym chống oxy hóa như: superoxide
6


dismutase glutathione S - transferase, glutathione tạo điều kiện cho quá trình chuyển
hóa rượu [23].
Ngoài các nghiên cứu kể trên, tác dụng bảo vệ gan của dịch chiết nước và giấm
lên men từ Hovenia dulcis chống lại những thay đổi sinh hóa ở chuột đực do ethanol
gây ra cũng đã được nghiên cứu. Khi cho chuột uống ethanol (50%, v/v, 10 ml/kg)
trong 6 tuần, các enzym gan như AST, ALT, γ-GT trong huyết thanh và mức độ
peroxid hóa lipid của gan của chuột tăng đáng kể (p < 0,01). Ngược lại, khi sử dụng
dịch chiết nước hoặc giấm lên men từ khúng khéng (10 ml/kg) cùng với ethanol cho

thấy sự giảm đáng kể (p < 0,05) các enzym (AST, ALT và γ-GT), các chỉ số gan, nồng
độ triglycerid và cholesterol trong huyết thanh. Kết quả trên cho thấy, dịch chiết nước
và dấm lên men từ Hovenia dulcis có tác dụng tốt trong việc làm giảm các tác hại của
rượu [56].
Năm 2012, nhóm nghiên cứu của Minchun Wang đã chứng minh tác dụng bảo
vệ gan (do ngộ độc rượu cấp tính) của các thành phần polysaccharid bao gồm
galactose, arabinose, rhamnose và acid galacturonic trong cuống quả Hovenia dulcis.
Dịch chiết Hovenia dulcis làm giảm đáng kể nồng độ AST, ALT trong huyết thanh,
giảm đáng kể mức độ của MDA trong gan và phục hồi đáng kể các hoạt động của các
enzym superoxide dismutase và glutathione peroxidase ở chuột bị tổn thương gan do
rượu [52].
Gần đây, tác dụng bảo vệ gan của hợp chất myricetin phân lập từ loài Hovenia
dulcis Thunb. trên chuột sử dụng nước chứa 3% choline đã được các nhà nghiên cứu
tại trường Đại học Shaanxi Normal (Trung Quốc) công bố. Myricetin đã được chứng
minh là có tác dụng dọn dẹp các gốc tự do DPPH˙, HO-, và O2˙. Sử dụng liên tục
myricetin liều 400 mg/kg và 800 mg/kg ở chuột uống choline có thể làm giảm đáng kể
cholesterol trong huyết thanh, triglyceride, lipoprotein tỷ trọng thấp, endothelin,
thromboxan A2 cũng như ALT và AST (p < 0,05). Đồng thời, sử dụng myricetin ở liều
400 mg/kg và 800 mg/kg cũng làm giảm MDA gan. Báo cáo này cho thấy, hàm lượng

7


choline cao trong chế độ ăn uống có thể gây tổn thương gan và hợp chất myricetin có
trong khúng khéng có thể giảm bớt tác hại này [27].
1.3.2 Tác dụng chống oxy hóa
Theo một nghiên cứu của Viện Sinh học và Công nghệ Sinh học Hàn Quốc, cắn
phân đoạn ethyl acetat thu được từ dịch chiết methanol của loài Hovenia dulcis Thunb.
cho thấy khả năng bảo vệ hệ thần kinh khỏi tác nhân gây độc glutamat. Tám hợp chất
phenolic (1-8) đã được phân lập trong nghiên cứu này bao gồm: acid vanillic (1), acid

ferulic (2), 3,5-dihydroxystilben (3), aromadendrin (4), methyl vanillat (5), catechin
(6), acid 2,3,4-trihydrobenzoic (7) và afzelechin (8). Trong số các hợp chất phân lập
được, hai hợp chất (6) và (8) thể hiện tác dụng bảo vệ hệ thần kinh khỏi tác nhân gây
độc glutamat, đồng thời nhóm nghiên cứu đã chứng minh được khả năng dọn dẹp gốc
tự do của 02 chất này. Từ các kết quả đó, Lin G. và đồng sự cho rằng catechin và
afzelechin có khả năng trở thành các chất bảo vệ thần kinh nhờ tác dụng dọn dẹp gốc
tự do của chúng [38].
1.3.3 Tác dụng tăng cường hoạt động thể chất, chống mệt mỏi
Khi tiến hành nghiên cứu tác dụng tăng cường sinh lực, nhóm chuột được uống
dịch chiết nước từ cuống quả của loài Hovenia dulcis Thunb. có thời gian bơi tăng so
với nhóm chuột đối chứng (p<0,05). Nồng độ của acid thiobarbituric trong cẳng chân
chuột được uống dịch chiết nước của Hovenia dulcis (ở hai liều 100 mg/kg và 200
mg/kg) giảm đáng kể so với nhóm chuột đối chứng. Ngiên cứu này cũng cho thấy, loài
Hovenia dulcis có khả năng làm tăng đáng kể các tác nhân chống oxy hóa trong gan
như superoxide dismutase. Ngoài ra, Hovenia dulcis còn có khả năng làm giảm đáng
kể lượng glucose máu, cholesterol toàn phần và triglyceride. Những kết quả trên cho
thấy, Hovenia dulcis là dược liệu có tác dụng chống mệt mỏi, tăng cường hoạt động thể
chất và chống oxy hóa [40].
1.3.4 Tác dụng tăng cường miễn dịch

8


Theo một nghiên cứu in vitro đánh giá khả năng tăng cường miễn dịch, các
polysaccharid trong cuống quả loài Hovenia dulcis bao gồm rhamnose, arabinose,
galactose và acid galacturonic có khả năng làm tăng cường đáng kể hoạt động thực
bào, sản xuất oxit nitric và hoạt động acid phosphatase của các đại thực bào phúc mạc.
Có thể xem, Hovenia dulcis là nguồn nguyên liệu tiềm năng giúp điều hòa miễn dịch
[53].
1.3.5 Tác dụng hạ đường huyết

Theo một nghiên cứu đã được công bố trên tạp chí Dược liệu Trung Quốc năm
2002 cho thấy, dịch chiết của loài Hovenia dulcis có tác dụng hạ đường huyết khi sử
dụng mô hình gây tiểu đường bởi alloxan. Glibenclamide được sử dụng làm thuốc đối
chứng dương. Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ đường trong máu của nhóm chuột
được uống dịch chiết từ loài Hovenia dulcis và glibenclamide thấp hơn đáng kể so với
nhóm chứng sinh học. Nồng độ glycogen gan ở nhóm chuột được uống dịch chiết
Hovenia dulcis và glibenclamide được tăng lên đáng kể [31].
1.3.6 Tác dụng chống dị ứng
Bốn hợp chất saponin bao gồm hovenidulcioside A1, A2, B1, B2 được phân lập
từ quả và hạt của loài Hovenia dulcis thu hái tại Trung Quốc đã được chứng minh có
tác dụng ức chế sự giải phóng histamin từ tế bào màng bụng của chuột [60], [61].
1.4 CÔNG DỤNG THEO Y HỌC CỔ TRUYỀN VÀ DÂN GIAN CỦA KHÚNG
KHÉNG
Khúng khéng có vị ngọt, hơi chát, tính bình, có công dụng trừ phiền chỉ khát,
chỉ thổ, thanh nhiệt, lợi tiểu và giải độc rượu [16]. Khúng khéng còn là vị thuốc bổ
dưỡng, điều trị các bệnh về tiêu hóa, chữa nôn mửa, ngộ độc, miệng khô khát [15].
Khi dùng lấy 100 g dược liệu ngâm với một lít rượu 40o. Rượu có màu đỏ sẫm
như rượu vang. Ngày uống 3 lần trước bữa ăn, mỗi lần 30 ml [15].

9


Ở Trung Quốc, cuống quả được dùng để trị say rượu, miệng khát, nôn mửa, tiểu
tiện khó khăn. Ngày dùng 6 g, ngâm rượu uống [15], [16]. Ở Nhật Bản, hạt khúng
khéng là thuốc bổ giải độc chữa ngộ độc rượu, tiểu tiện không thông, cơ thể gầy yếu.
Ngày dùng 3 - 5 g ngâm rượu uống [13], [15].
Ở Ấn Độ, cao chiết từ quả khúng khéng chứa kali nitrat và kali malat là thuốc có
tác dụng lợi tiểu mạnh [15].

10

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
-

Đối tượng nghiên cứu: Cuống mang quả và quả của cây khúng khéng được thu hái
tại Cao Bằng vào tháng 10 năm 2014. Mẫu nghiên cứu được rửa sạch, phơi khô,
đựng trong túi PE kín và lưu trữ tại Phòng lưu mẫu, Khoa Hóa phân tích-Tiêu
chuẩn, Viện Dược liệu.

-

Mẫu thực vật được Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu giám định tên khoa
học là Hovenia dulcis Thunb. (Phụ lục 1).

-

Mẫu thực vật được lưu tại Phòng tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện
Dược liệu với số hiệu là DL-050515.
2.2 Phương tiện nghiên cứu
 Thiết bị dùng cho nghiên cứu:
-

Cân kỹ thuật Precisa (độ chính xác đến 0.01g), cân phân tích (độ chính xác đến
0.0001g), bếp đun cách thủy.

-

Tủ sấy Memmert, máy xác định độ ẩm Precisa HA60

-

Máy cất quay thu hồi dung môi BUCHI R-200.

-

Đèn tử ngoại Vilbez lourmat (hai bước sóng 254 nm và 366 nm).

-

Pipet vạch, Pipet Paster, Pipet chính xác, ống nghiệm, bình nón, bình gạn, bình cầu,
phễu, giấy lọc…

-

Máy chấm sắc ký Camag Linomat 5, máy chụp sắc ký Camag Reprostar 3.

-

Máy vi tính với phần mềm winCATS.

-

Bản mỏng Silica gel 60 F254 (Merck) (code: 1.05554.0001).

-

Kit định lượng ALT, AST và bilirubin do hãng Human cung cấp.

-

Máy định lượng sinh hoá bán tự động Human Lyzer 2000.

-

Máy đo quang MINI 1240 SHIMAZU.

-

Máy nghiền đồng thể.

11


-

Máy đo quang phổ UV-VIS 1800 Shimadzu, Nhật Bản

-

Máy đo phổ hồng ngoại (IR) FT-IR Spectrophotometer 1650 – Perkin Elmer

-

Máy đo phổ khối lượng LC/MS/MS – Water – API – ISI

-

Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H- và 13C-NMR) của hãng Bruker

(500MHz)

 Hóa chất, dung môi.
-

Các dung môi: ethanol, methanol (Me), n-hexan (Hx), ethyl acetat (Et), n-buthanol
(Bu), acid formic, cloroform, toluen… đạt tiêu chuẩn phân tích theo tiêu chuẩn
Dược điển Việt Nam IV.

-

Các thuốc thử dùng trong phản ứng hóa học: TT Lugol, TT Bouchardat, TT Mayer,
TT Dragendoff, TT Diazo...được pha theo hướng dẫn của Dược điển Việt Nam IV.

-

Các thuốc thử hiện màu trong sắc ký lớp mỏng, đặc hiệu cho các nhóm chất: hỗn
hợp acid boric 10% - acid oxalic 10% trong nước (tỷ lệ 2:1), acid sulfuric 10%
trong ethanol

-

Các thuốc thử tinh khiết dùng trong thử tác dụng bảo vệ gan: KCl, acid
tricloracetic, acid thiobarbituric, HCl 0,1N chuẩn, acid acetic, n-butanol, CCl4, dầu
olive ...

-

Các thuốc dùng trong nghiên cứu:
o Silymarin (biệt dược Honymarin) dạng viên nén hàm lượng 70 mg của hãng

Alpha Pharma (Hàn Quốc).
o Paracetamol (độ tinh khiết 98%) do Viện kiểm nghiệm Thuốc Trung ương
cung cấp.

 Động vật thí nghiệm:
Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino khỏe mạnh, sử dụng cả chuột đực và chuột
cái, trọng lượng từ 20 ± 2 g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, được cung cấp bởi Ban chăn
nuôi, Học Viện Quân Y 103.

12


Chuột được nuôi trong điều kiện đầy đủ thức ăn và nước uống tại Phòng chăn
nuôi, Khoa Dược lý Sinh hóa, Viện Dược liệu từ trước khi nghiên cứu 5 ngày và trong
suốt thời gian nghiên cứu.
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật
-

Mô tả đặc điểm hình thái theo phương pháp ghi trong tài liệu [10]

-

Nghiên cứu đặc điểm vi học theo các tài liệu [8],[10]

-

Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu [10],[16] :
 Sử dụng các khóa phân loại tới họ, chi và loài trong tài liệu [3]
 Đối chiếu với mô tả trong tài liệu [25]

 So sánh đối chiếu với mẫu tiêu bản tại phòng tiêu bản của khoa Tài nguyên
dược liệu – Viện Dược liệu

2.3.2 Nghiên cứu tác dụng dược lý
Mẫu thử:
Bột dược liệu khúng khéng 12,3 kg (độ ẩm 12,1%) (cuống mang quả và quả)
được chiết với ethanol 96% (3 lần × 4 giờ/lần) ở nhiệt độ 70oC. Gộp tất cả các dịch
chiết ethanol, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ở 70oC thu được cắn ethanol toàn
phần, ký hiệu là KKC có khối lượng 2,06 kg. Cắn ethanol (1,03 kg) được phân tán
trong 1,0 lít nước cất, rồi lắc chiết với ethyl acetat (1 lít × 3 lần). Gộp các dịch chiết
ethyl acetat, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ở 60oC thu được cắn phân đoạn
ethyl acetat ký hiệu là KKE có khối lượng 115,8 g (Khối lượng của các mẫu cao là
khối lượng khô tuyệt đối).
Các cắn ethanol (KKC) và cắn phân đoạn ethyl acetat (KKE) được hòa vào
nước cất với các nồng độ khác nhau để phù hợp với yêu cầu của thí nghiệm cho chuột
uống.

13


Phương pháp thử: Đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây độc bằng
paracetamol (PAR), dùng chất đối chiếu dương là silymarin (biệt dược Honymarin)
dạng viên nén hàm lượng 70mg của hãng Alpha pharma (Korea) [14], [26], [47], [49],
[54]. Cụ thể, các chuột sử dụng cho thí nghiệm được chia ngẫu nhiên thành 7 lô, mỗi lô
15 chuột. Các lô chuột được dự kiến cho uống nước và mẫu thử như sau:


Lô 1 (chứng sinh học): chỉ uống nước cất



Lô 2 (mô hình): uống nước cất và PAR (liều 220 mg/kg)



Lô 3 (chứng dương): uống silymarin liều 100 mg/kg và PAR (220mg/kg)



Lô 4: uống KKC liều 200 mg cao/kg và PAR (220 mg/kg)



Lô 5: uống KKC liều 500 mg cao/kg và PAR (220 mg/kg)



Lô 6: uống KKE liều 200 mg cao/kg và PAR (220 mg/kg)



Lô 7: uống KKE liều 500 mg cao/kg và PAR (220 mg/kg)

Chuột ở các lô được uống nước cất và mẫu thử hoặc silymarin theo liều đã dự kiến liên
tục trong 8 ngày, mỗi ngày một lần vào 9 giờ sáng. Ở ngày thứ 8 để chuột nhịn đói 16 18 giờ tính đến khi cho uống nước cất và mẫu thử (hoặc silymarin). Sau 1 giờ, gây độc
cho chuột ở tất cả các lô (trừ lô chứng sinh lý) bằng việc cho uống PAR liều 220 mg/kg
với thể tích 0,2 ml/10g.
Phương pháp đánh giá: 24 giờ sau khi gây độc bằng PAR, lấy máu động mạch cảnh
của tất cả các chuột trong thí nghiệm bằng cách cắt cổ, ly tâm lấy huyết thanh để định
lượng enzym ALT, AST. Đồng thời lấy gan để xác định trọng lượng, định lượng MDA

dịch đồng thể để đánh giá tác dụng của mẫu thử.
Nguyên lý phương pháp xác định MDA dịch đồng thể gan: MDA (malonyl
dialdehyd) là một sản phẩm được tạo ra trong quá trình peroxy hoá lipid màng tế bào
gan. MDA phản ứng với acid thiobarbituric để tạo phức trimethine có màu hồng và có
đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 530 - 532nm.

14


Mức độ hấp thụ màu OD (XE) của dung dịch đo tỷ lệ thuận với nồng độ MDA.
Hàm lượng MDA được tính theo hệ số chuyển đổi trên đường cong chuẩn sử dụng
MDA tinh khiết từ 2 nmol đến 40 nmol.
Nguyên tắc định lượng MDA: Định lượng MDA theo phương pháp Wasowich
và Balahoroglu [54].
Quy trình định lượng MDA được tóm tắt như sau: cân 100 mg gan, nghiền đồng
thể trong 1 ml dung dịch KCl 0,15 M. Hút 200 μl dịch đồng thể cho vào ống nghiệm có
1ml H2O, thêm vào đó 1 ml dung dịch acid thiobarbituric 0,25% pha trong acid acetic,
đun cách thủy nhiệt độ 100oC trong 60 phút. Để nguội, thêm 25 µl HCl 5N, lắc đều,
thêm vào 3,5 ml n-butanol, ly tâm 3000 v/phút x 10 phút, hút phần n-butanol đo quang
ở bước sóng 532 nm. Hàm lượng MDA được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính
của chất chuẩn MDA. Lượng MDA trong mẫu thử giảm so với đối chứng gây bệnh (lô
mô hình) sẽ biểu hiện khả năng ức chế quá trình peroxy hóa lipid của mẫu thử.
Xây dựng đường chuẩn hàm lượng MDA trong dịch đồng thể gan.

15


25
y = 32,455x - 0,3411
R² = 0,9974

20

D MDA

Linear (D MDA)

15

10

5

0
0

0,2

0,4

0,6

0,8 D MDA

-5

Hàm lượng MDA trong dịch đồng thể được tính theo phương trình hồi quy
tuyến tính của chất chuẩn MDA:
Trong đó:

y = 32,455 x – 0,3411

- x là mật độ quang đo được.
- y là hàm lượng MDA dịch đồng thể (nmol/ml dịch đồng thể)

Sau khi tính được hàm lượng MDA trong dịch đồng thể (nmol/ml dịch đồng
thể), suy ra hàm lượng MDA trong gan chuột (nmol/100mg gan).
Phương pháp xử lý số liệu, đánh giá kết quả: Các số liệu thu thập được xử lý bằng
phương pháp thống kê y sinh học theo t-test student, sử dụng phần mềm Microsoft –
Excel, để đánh giá mức độ khác nhau giữa các lô. Kết quả thí nghiệm được biểu thị
bằng trị số trung bình cộng trừ độ lệch chuẩn (μ = X ± SD). Sự khác biệt được xem có
ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.
2.3.3 Nghiên cứu thành phần hóa học
2.3.3.1 Định tính sơ bộ các nhóm chất bằng phản ứng hóa học
Định tính các nhóm chất hữu cơ chính trong dược liệu khúng khéng bằng phản
ứng hóa học đặc trưng theo các tài liệu [5],[6],[7].

16


 Định tính flavonoid:
Cân khoảng 10 g bột dược liệu cho vào bình nón 100 ml, thêm 50 ml cồn 90o.
Đun cách thủy 10 phút, lọc nóng lấy dịch lọc làm các phản ứng sau:
a. Phản ứng Cyanidin (phản ứng Shinoda)
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết, thêm một ít bột Mg kim loại (khoảng
10 mg). Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3 - 5) giọt. Để yên một vài phút. Phản ứng dương
tính khi dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ cam.
b. Phản ứng với kiềm
Phản ứng với hơi amoniac: Nhỏ một giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô rồi
hơ trên miệng lọ có chứa amoniac đặc đã mở nút, đối chiếu với tờ giấy nhỏ giọt dịch
chiết đối chứng. Phản ứng dương tính nếu vết màu vàng đậm lên.

Phản ứng với NaOH 10%: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết. Thêm vài
giọt dung dịch NaOH 10%. Phản ứng dương tính nếu thấy xuất hiện tủa vàng và khi
thêm 1 ml nước cất, tủa sẽ tan và màu vàng của dung dịch tăng thêm.
c. Phản ứng với FeCl3
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%.
Phản ứng dương tính nếu thấy xuất hiện dung dịch màu xanh đen
d. Phản ứng với diazo hóa
Chuẩn bị thuốc thử: Hòa tan 0,9 g acid sulfanilic trong 9 ml HCl đậm đặc (đun
nóng), pha loãng với nước đến 100 ml. Lấy 10 ml dung dịch ngâm trong nước đá rồi
cho thêm 10 ml dung dịch NaNO2 4,5% cũng vừa được ngâm trong nước đá. Lắc đều
rồi giữ ở nhiệt độ 0oC trong 15 phút. Dung dịch chỉ pha để dùng ngay.
Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm (NaOH,
KOH, Na2CO3), thêm vài giọt thuốc thử Diazo mới pha, lắc đều (có thể đun nóng trên
nồi cách thủy vài phút). Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa đỏ gạch ở đáy ống
nghiệm.

17