Tuyển chọn chủng vi khuẩn bacillus spp sinh enzyme phytase, cellulase để ủ bã sắn dùng trong chăn nuôi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
------

MẠCH TRẦN PHƢƠNG THẢO

TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP. SINH ENZYME
CELLULASE, PHYTASE ĐỂ Ủ BÃ SẮN DÙNG TRONG CHĂN NUÔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

Khánh Hòa - Năm 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
------

MẠCH TRẦN PHƢƠNG THẢO

TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP. SINH ENZYME
CELLULASE, PHYTASE ĐỂ Ủ BÃ SẮN DÙNG TRONG CHĂN NUÔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch
Mã số : 60.54.01.04

Hƣớng dẫn khoa học:
TS. Nguyễn Minh Trí

Khánh Hòa - Năm 2014

i
LỜI CÁM ƠN
Tôi xin chân thành gửi lời cám ơn tới Trường Đại học Nha Trang, khoa Công
nghệ Thực phẩm, khoa Sau đại học, Trung tâm thí nghiệm – Thực hành với lòng biết
ơn, sự kính trọng, tự hào được học tập, thực hành trong những năm qua.
Tôi xin gửi lời cám ơn tới thầy Nguyễn Minh Trí, cô Phạm Hồng Ngọc Thùy
đã giúp đỡ, động viên, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận
văn.
Cuối cùng tôi muốn tỏ lòng biết ơn tới Mẹ, gia đình và bạn bè đã cùng tôi trong
những năm tháng qua.
Học viên
Mạch Trần Phương Thảo


ii
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực, là một
phần trong đề tài ”Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng vào việc nâng cao
giá trị sử dụng của bã sắn”. Học viên tham gia làm nghiên cứu dưới sự hướng dẫn của
Tiến sĩ Nguyễn Minh Trí.

Học viên

Mạch Trần Phương Thảo


iii

MỤC LỤC

LỜI CÁM ƠN ...................................................................................................................i
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................... ii
MỤC LỤC ..................................................................................................................... iii
PHẦN MỞ ĐẦU .............................................................................................................1
1 Tính cấp thiết ...........................................................................................................1
2 Mục tiêu của đề tài ..................................................................................................2
3 Ý nghĩa đề tài ...........................................................................................................2
3.1 Ý nghĩa khoa học ................................................................................................2
3.2 Ý nghĩa thực tiễn.................................................................................................3
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................................3
Chƣơng 1 – TỔNG QUAN .............................................................................................4
1.1 Tổng quan về nguyên liệu sắn và bã sắn ............................................................4
1.1.1 Tổng quan về cây sắn ......................................................................................4
1.1.1.1 Phân loại thực vật và nguồn gốc ...............................................................4
1.1.1.2 Đặc điểm thực vật học ...............................................................................4
1.1.1.3 Thành phần hóa học của củ sắn .................................................................6
1.1.1.4 Phân loại ...................................................................................................8
1.1.1.5 Diện tích, sản lượng sắn trong và ngoài nước ..........................................8
1.1.2 Bã sắn .............................................................................................................10
1.1.3 Các sản phẩm từ sắn và bã sắn ......................................................................11
1.2 Tổng quan về Bacillus subtilis ..........................................................................12
1.2.1. Đặc điểm của Bacillus subtilis ......................................................................12
1.2.2 Các nghiên cứu sinh tổng hợp cellulase từ Bacillus spp ...............................14
1.2.3 Các nghiên cứu sinh tổng hợp phytase từ Bacillus spp .................................14
1.3 Tổng quan về cellulase, phytase ........................................................................15
1.3.1 Giới thiệu về cellulase ...................................................................................15
1.3.1.1 Giới thiệu về cellulose .............................................................................15
1.3.1.2 Cơ chế cắt cellulose .................................................................................16

1.3.2 Giới thiệu về phytase .....................................................................................17
1.3.2.1 Giới thiệu về phytate ...............................................................................17
1.3.2.2 Cơ chế cắt phytate ...................................................................................18
1.4 Tình hình nghiên cứu và sử dụng bã sắn làm thức ăn chăn nuôi ..................18
Chƣơng 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................22
2.1 Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................22


iv
2.1.1 Mẫu phân lập .................................................................................................22
2.1.2 Bã sắn .............................................................................................................22
2.1.3 Đậu nành ........................................................................................................22
2.1.4 Cám gạo .........................................................................................................22
2.1.5 Rỉ đường ........................................................................................................22
2.1.6 Hóa chất, môi trường, thiết bị .......................................................................22
2.2 Phƣơng pháp phân tích, nghiên cứu – Bố trí thí nghiệm .............................23
2.2.1. Các phương pháp phân tích sử dụng trong đề tài .........................................23
2.2.1.1 Xác định tỷ lệ sống vi khuẩn ...................................................................23
2.2.1.2 Xác định tỷ lệ bào tử ..............................................................................23
2.2.1.3 Kiểm tra khả năng sinh enzyme ..............................................................23
2.2.1.4 Phân tích các chất ....................................................................................24
2.2.2 Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................24
2.2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát .....................................................................24
2.2.3 Bố trí thí nghiệm ............................................................................................26
2.2.3.2 Tuyển lựa chủng có khả năng sinh enzyme cellulase, phytase ...............26
2.2.3.3 Bố trí xác định ảnh hưởng của pH và thời gian đến khả năng sinh tổng
hợp enzyme của Bacillus spp ..............................................................................27
2.2.3.4 Bố trí thí nghiệm xác định một số đặc tính của enzyme cellulase và
phytase thô sinh tổng hợp từ chủng Bacillus spp ................................................29
2.2.3.5 Xác định điều kiện nhân giống của củng Bacillus spp trên môi trường cơ

bản là bã sắn ........................................................................................................30
2.2.3.6 Bố trí thí nghiệm xác định các yếu tố nâng cao hiệu quả thủy phân
cellulose và phytate của bã sắn từ chủng Bacillus subtilis ..................................32
Chƣơng 3 – KẾT QUẢ THẢO LUẬN .........................................................................39
3.1 Tuyển lựa chủng Bacillus spp sinh cellulase và phytase ................................39
3.2 Ảnh hƣởng của các yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase,
phytase .......................................................................................................................41
3.2.1 Ảnh hưởng yếu tố thời gian đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase .41
3.2.2 Ảnh hưởng yếu tố thời gian đến khả năng sinh tổng hợp enzyme phytase ...42
3.2.3 Ảnh hưởng yếu tố pH đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase ..........43
3.2.4 Ảnh hưởng yếu tố pH đến khả năng sinh tổng hợp enzyme phytase ...........44
3.3 Ảnh hƣởng của các yếu tố đến hoạt độ enzyme cellulase, phytase ................45
3.3.1 Ảnh hưởng của yếu tố pH đến hoạt độ enzyme cellulase..............................45
3.3.2 Ảnh hưởng của yếu tố pH đối với hoạt độ enzyme phytase ..........................46
3.3.3 Ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đối với hoạt độ enzyme cellulase ................46
3.3.4 Ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đối với hoạt độ enzyme phytase ..................47
3.3.5 Ảnh hưởng của yếu tố độ bền nhiệt đối với hoạt độ enzyme cellulase .........48
3.3.6 Ảnh hưởng của yếu tố độ bền nhiệt đối với hoạt độ enzyme phytase ...........48


v
3.4 Ảnh hƣởng của các yếu tố đến điều kiện nhân giống tối ƣu của củng Bacillus
subtilis trên môi trƣờng cơ bản là bã sắn ...............................................................49
3.5 Ảnh hƣởng của các yếu tố trong quá trình ủ Bacillus subtilis C7 với bã sắn
nhằm thủy phân cellulose và phytate .....................................................................50
3.5.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ đậu nành đến khả năng thủy phân cellulose ...............50
3.5.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ đậu nành đến khả năng thủy phân phytate ..................51
3.5.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến khả năng thủy phân cellulose .......................52
3.5.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến khả năng thủy phân phytate .........................53
3.5.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung đến khả năng thủy phân cellulose ................54

3.5.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung đến khả năng thủy phân phytate ..................55
3.5.7 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến quá trình thủy phân cellulose ......................56
3.5.8 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến quá trình thủy phân phytate ........................57
3.5.9 Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng thủy phân cellulose ..58
3.5.10 Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến quá trình thủy phân phytate ...59
Chƣơng 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................60
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................61
PHỤ LỤC ........................................................................................................................1


vi
DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: A Cấu trúc cơ bản của cellulose B Mặt cắt của nhánh cellulose ..................15
Hình 1.2: Cấu trúc của lignocellulose ...........................................................................16
Hình 1.3: Vi khuẩn Bacillus spp....................................................................................12
Hình 1.4: Cơ chế cắt phytate .........................................................................................18
Hình 2.1: Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................25
Hình 2.2: Quy trình chung khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng thủy phân .....25
Hình 2.3: Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh
tổng hợp enzyme cellulase và phytase của Bacillus spp ...............................................27
Hình 2.4: Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian lắc môi trường đến khả
năng sinh tổng hợp enzyme cellulase và phytase của Bacillus spp ...............................28
Hình 2.5: Bố trí thí nghiệm xác định pH thích hợp của enzyme cellulase và phytase ..29
Hình 2.6: Bố trí thí nghiệm xác định độ bền nhiệt của enzyme cellulase và phytase ...29
Hình 2.7: Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thích hợp của enzyme cellulase và
phytase ...........................................................................................................................30
Hình 2.8: Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nhân giống của chủng Bacillus spp trên
môi trường cơ bản là bã sắn ..........................................................................................31
Hình 2.9: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ đậu nành đối với khả

năng thủy phân cellulose và phytate ..............................................................................33
Hình 2.10: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đối với khả năng
thủy phân cellulose và phytate ......................................................................................34
Hình 2.11: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ nước đối với khả năng
thủy phân cellulose và phytate ......................................................................................35
Hình 2.12: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian ủ đối với khả
năng thủy phân cellulose và phytate ..............................................................................36
Hình 2.13: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thành phần bổ sung đối với
khả năng thủy phân cellulose và phytate .......................................................................37
Hình 3.1: Đường kính vòng thủy phân của chủng Bacillus spp ....................................39
Hình 3.2: Ảnh hưởng của thời gian tới khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase .......41
Hình 3.3: Ảnh hưởng của thời gian tới khả năng sinh tổng hợp enzyme phytase ........42
Hình 3.4: Ảnh hưởng của pH tới khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase ................43


vii
Hình 3.5: Ảnh hưởng của pH tới khả năng sinh tổng hợp enzyme phytase ..................44
Hình 3.6: Ảnh hưởng của pH tới hoạt độ enzyme cellulase ..........................................45
Hình 3.7: Ảnh hưởng của pH tới hoạt độ enzyme phytase ...........................................46
Hình 3.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ enzyme cellulase .................................47
Hình 3.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ enzyme phytase ...................................47
Hình 3.10: Ảnh hưởng của độ bền nhiệt tới hoạt độ enzyme cellulase .........................48
Hình 3.11: Ảnh hưởng của độ bền nhiệt tới hoạt độ enzyme phytase ..........................48
Hình 3.12: Ảnh hưởng các yếu tố tới nhân giống vi khuẩn trên bã sắn ........................49
Hình 3.13: Ảnh hưởng của tỷ lệ đậu nành đến khả năng thủy phân cellulose .......................51
Hình 3.14: Ảnh hưởng của tỷ lệ đậu nành đến khả năng thủy phân phytate ........................51
Hình 3.15: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân cellulose ........................52
Hình 3.16: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân phytate ..........................53
Hình 3.17: Ảnh hưởng của tỷ lệ nước đến khả năng thủy phân cellulose.....................54
Hình 3.18: Ảnh hưởng của tỷ lệ nước đến khả năng thủy phân phytate .......................55

Hình 3.19: Ảnh hưởng của thời gian ủ đến quá trình thủy phân cellulose .......................56
Hình 3.20: Ảnh hưởng của thời gian ủ đến quá trình thủy phân phytate ......................57
Hình 3.21: Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng thủy phân cellulose 58
Hình 3.22: Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng thủy phân phytate ..59


1
PHẦN MỞ ĐẦU
1 Tính cấp thiết
Sắn là cây nông nghiệp được trồng nhiều ở các nước châu Á, châu Phi đặc biệt
là những nước có điều kiện khí hậu nhiệt đới như Việt Nam, Thái Lan…Hiện nay sắn
được xem là nguồn cung cấp lương thực quan trọng chỉ đứng sau lúa gạo, lúa mì.
Không những là nguồn sản xuất thực phẩm, sản phẩm gia tăng từ sắn cũng là nguồn
chính để làm thức ăn chăn nuôi phát triển nông nghiệp.
Việc sử dụng bã sắn sau khi thu hồi tinh bột để làm thức ăn gia súc đã được
nông dân thực hiện từ lâu. Tuy nhiên có những bất cập khi trong bã sắn có chứa hàm
lượng glycoside cao, gây ngộ độc và hàm lượng cellulose, phytate đáng kể khiến vật
nuôi không hấp thu được dẫn đến hiệu quả kém khi sử dụng sản phẩm dạng này.
Bên cạnh đó vấn đề ô nhiễm môi trường từ bã sắn được phản ánh từ nhiều địa
phương nhưng vẫn chưa có biện pháp khắc phục nào triệt để. Bã sắn sau khi được
người dân thu mua từ những công ty, lò chế biến tinh bột thì vận chuyển về khu đất
vắng, phơi khô. Vào mùa mưa thì nước rỉ từ bã sắn tươi sẽ ôi chua, chảy lênh láng, ô
nhiễm sông ngòi, kênh rạch, mùa nắng thì phát sinh thêm mùi hôi, ruồi, giòi phát triển.
Đã có những nghiên cứu, ứng dụng quy mô nhỏ, mô hình phòng thí nghiệm hay
phương pháp thủ công như lên men, bổ sung vi khuẩn lactic vào bã sắn giúp cho vật
nuôi hấp thụ tốt hơn. Nguyễn Hữu Văn, Nguyễn Xuân Bả và Bùi Văn Lợi (2009)[16]
đã tiến hành khảo sát, đánh giá giá trị dinh dưỡng của bã sắn công nghiệp ủ chua với
các phụ gia để làm thức ăn cho gia súc nhai lại. Kết quả cho thấy ủ chua là biện pháp
phù hợp để bảo quản bã sắn làm thức ăn cho gia súc nhai lại trong điều kiện nông hộ.
Nhóm tác giả Lương Hữu Thành (Viện Môi trường Nông nghiệp) và Nguyễn Kiều

Bằng Tâm (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội)[14] đã sử
dụng chế phẩm vi sinh vật do Bộ môn Vi sinh Môi trường, Viện Môi trường Nông nghiệp
cung cấp (thành phần chính gồm xạ khuẩn, nấm men, vi khuẩn với hoạt tính phân giải
cellulose, tinh bột và phân giải phosphatase khó tan), sau đó cho ủ cùng bã sắn theo
phương pháp ủ kết hợp có bổ sung thêm các nguyên liệu phụ như rỉ mật, ure, kali, super
lân, vôi bột để làm thức ăn cho gia súc.
Đề tài “Bã sắn lên men-nguồn thức ăn giàu dinh dưỡng cho bò sữa và lợn ở
Việt Nam” nghiên cứu bởi Nguyễn Thị Xuân Sâm, Đặng Thị Thu [9] được công bố
trên tạp chí Khoa học và Công nghệ - Viện KHTN&CN Quốc gia có thử nghiệm các


2
qui trình xử lý bã sắn bằng phương pháp lên men vi sinh vật để ủ làm thức ăn gia súc
với qui mô nhỏ ở phòng thí nghiệm nhưng chưa áp dụng trong thực tế sản xuất
Công ty CP thực phẩm và đầu tư công nghệ miền Trung (Fococev) đã sản xuất
phân bón vi sinh từ chất thải tinh bột sắn. Công ty đã sản xuất với công suất 120 tấn
sắn tươi/ngày, khắc phục được tình trạng ôi nhiễm do quá trình chế biến mang lại.
Các nhà khoa học phòng Vi sinh ứng dụng-Viện sinh học nhiệt đới đã thử sản
xuất acid citric bằng cách nuôi một số chủng nấm mốc có lợi trên bã khoai mì. Acid
citric được cho vào nước giải khát và thực phẩm chế biến, tuy nhiên giá thành chưa thể
cạnh tranh với các sản phẩm từ Trung Quốc. Sau đó, các kỹ sư đã nghiên cứu sử dụng
bã sắn làm thức ăn cho vật nuôi khi ủ với chế phẩm Probio-S và Bio-E. Bio-E là chế
phẩm dạng bột khô, được cấy chủng nấm mốc A.Niger lên bã khoai mì với tỉ lệ 2g
mốc/kg bã. Kết quả thử nghiệm trên heo thì sau 3 tháng dùng chế phẩm trên, heo tăng
trọng nhanh hơn 1,3-1,4kg so với heo bình thường.
Kế thừa và tiếp tục góp kết quả vào các nghiên cứu trên, mong muốn của đề tài
là đưa ra sản phẩm có tính ứng dụng cao đồng thời góp phần giảm chi phí thức ăn chăn
nuôi, sử dụng nguồn bã sắn sẵn có hạn chế ô nhiễm môi trường, thúc đẩy ngành chăn
nuôi phát triển.
Với định hướng trên, đề tài sẽ nghiên cứu tuyển lựa chủng Bacillus spp thủy

phân cơ chất là bã sắn tạo ra sản phẩm thủy phân có tính dinh dưỡng và giúp vật nuôi
hấp thụ tốt hơn một cách an toàn.
2 Mục tiêu của đề tài
Xây dựng phương pháp tuyển lựa chủng Bacillus spp. có khả năng sinh enzyme
cellulase, phytase để ủ bã sắn ứng dụng trong chăn nuôi
3 Ý nghĩa đề tài
3.1 Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp cho ngành khoa học thức ăn chăn
nuôi những thông tin cơ bản và hệ thống về phương pháp nghiên cứu chế phẩm vi sinh
bao gồm tuyển chọn chủng giống, nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh
tổng hợp enzyme và thủy phân cơ chất.
Những thông tin này có thể được dùng để tham khảo cho các đề tài ứng dụng và
các đề tài cùng lĩnh vực.


3
3.2 Ý nghĩa thực tiễn
Việc sử dụng bã sắn làm thức ăn cho heo sẽ làm giảm giá thành thức ăn hỗn
hợp và nâng cao hiệu quả chăn nuôi.
Vấn đề môi trường đối với sản phẩm thừa sẽ được giải quyết một phần làm hạn
chế ôi nhiễm ở khu công nghiệp sản xuất.
Ứng dụng trong sản xuất nông hộ về phương pháp ủ mới dùng trong chăn nuôi
heo.
3. Nội dung nghiên cứu
Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus spp sinh enzyme (phytase, cellulase) từ các
nguồn trong tự nhiên
Khảo sát điều kiện sinh tổng hợp và tính chất của enzyme cellulase, phytase
Khảo sát điều kiện nhân giống vi khuẩn Bacillus spp sinh enzyme (phytase,
cellulase) thích hợp với môi trường cơ bản là bã sắn.
Khảo sát điều kiện thích hợp ủ bã sắn bằng vi khuẩn Bacillus subtilis

4
Chƣơng 1 – TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về nguyên liệu sắn và bã sắn
1.1.1 Tổng quan về cây sắn
1.1.1.1 Phân loại thực vật và nguồn gốc
Tên khoa học

: Maniho esculenta Crantz

Tên tiếng Anh

: Cassava, Manioc root, Manihot, Mogo.

Tên gọi khác

: Khoai mì

Loài tương cận

: Sắn lá hẹp Manihot angustiloba (Torr.) Müll.Arg.

Phân loại khoa học:
Giới (regnum )

: Plantae

Bộ (ordo )

: Malpighiles

Họ (familia )

: Euphorbiaceae

Phân họ (subfamilia): Crotonoideae
Tông (tribus )

: Manihoteae

Chi (genus )

: Manihot

Loài (species )

: Manihot esculenta

Cây sắn có tên khoa học là Manihot Esculenta Crantz hay một số tên gọi khác
như cassava, manioc, tapioca, maniva cassava... Ở Việt Nam cây sắn được gọi là cây
khoai mì, cây củ mì, sắn tầu…
1.1.1.2 Đặc điểm thực vật học [8]
Củ sắn: Là tổ chức dự trữ dinh dưỡng chính của cây sắn. Khi trồng bằng hạt thì
cây sắn có 1 rễ cọc phát triển và cắm thẳng đứng xuống đất như cây 2 lá mầm và các
rễ phụ lúc đầu phát triển ngang, sau đó phát triển theo phương thằng đứng thành rễ cái.
Đối với sắn trồng bằng hom thì chỉ có rễ phụ mọc ra từ vết cắt của hom và phát triển
tương tự như rễ phụ của sắn trồng bằng hạt, tất cả các loại rễ này đều phát triển thành
củ sắn. Một số rễ sẽ bị mỏng đi và chỉ có chức năng hút nước và chất dinh dưỡng, còn
rễ phát triển thành củ thì chức năng này không đáng kể

Thân sắn: Là loại cây thân gỗ, hình trụ, có chia đốt và có lóng, sinh trưởng lâu
năm cây cao từ 1-5m. Thân và cành già đã hóa gỗ có màu trắng bạc, xám, nâu hoặc hơi
vàng. Thân được cấu tạo gồm 4 lớp (trong cùng là lớp lõi xốp, tế bào rất to, tiếp đến là
tầng gỗ, mô mềm của vỏ và cuối cùng là tầng bần).


5
Lá sắn: Là loại lá đơn mọc xen kẽ, thẳng hàng trên thân cây. Lá gồm 2 phần:
cuống và phiến lá. Lá có thùy sâu, dạng chân vịt, thùy thường có cấu tạo số lẻ từ 5-7
thùy. Lá gần cụm hoa có số thùy giảm dần và thậm chí không chia thùy, lá phía trên
thường có biểu bì bóng như sáp. Cuống lá dài từ 5-30cm và có các màu sắc khác nhau
phụ thuộc vào giống sắn chủ yếu là màu hồng, vàng, xanh, đỏ tươi.
Hoa sắn: Hoa thuộc loại hoa chùm, đơn tính có cuống dài mọc ra từ chổ phân
cành, ngọn thân. Những cụm hoa gồm một trục dài 2-10cm và nhiều trục bên hợp
thành nên gọi là chùy. Hoa cái thường nở trước hoa đực từ 5-7 ngày.
Quả sắn: Có kích thước từ 1-1,5cm, 1 quả thường có 3 hạt. Màu quả đa dạng
phụ thuộc vào giống. Hạt sắn hình trứng tiết diện hơi giống hình tam giác. Quả sắn
thành thục sau khi thụ phấn 75-90 ngày. Hạt sắn nặng từ 95-136mg, màu nâu đen, trơn
nhẵn, có đường gân màu nâu. Hạt sắn nảy mầm ngay sau khi được thu hoạch, quá trình
nảy mầm mất khoảng 16 ngày.
Sắn là nguồn thực phẩm carbohydrate thứ 3 sau lúa và ngô. Ở những quốc gia
đang phát triển, sắn là nguồn lương thực chính, cung cấp khẩu phần ăn hơn nửa tỷ
người. Nó là một trong những cây trồng chịu hạn lớn nhất, nước Nigeria là nước sản
xuất lớn nhất thế giới về sắn. Rễ sắn là nguồn cung cấp carbohydrate nhưng nó lại khá
nghèo protein. Một chế độ ăn chủ yếu là sắn thì có thể gây nên suy dinh dưỡng.
Sắn được phân thành sắn ngọt hoặc sắn đắng. Như các hệ rễ của thực vật khác,
sắn chứa các chất kháng dinh dưỡng và độc tố vì thế cần sơ chế cẩn thận trước khi chế
biến. Nếu sơ chế không đúng, dư lượng cyanide có thể gây ngộ độc cấp tính. Tuy
nhiên, nông dân hay lựa chọn trồng sắn đắng vì có khả năng chống chịu côn trùng gây
hại cao.

Cây sắn được trồng ở nhiều nước trên thế giới từ 30o vĩ Bắc đến 30o vĩ Nam với
độ cao giới hạn trong khoảng 2000m. Sản phẩm từ sắn (củ, thân, lá) được dùng để chế
biến ra nhiều loại sản phẩm phục vụ cho nhiều ngành công nghiệp như: dược, dệt, hóa
dầu thực phẩm, chăn nuôi…Giá trị của cây sắn ngày càng được nâng cao nhờ những
ứng dụng rộng rãi của nó. Trong ngành dược, tinh bột sắn được dùng làm tá dược
trong sản xuất thuốc, biến tính tinh bột sắn cho nhiều sản phẩm có giá trị như đường
glucose, fructose…để làm dịch truyền hoặc các phụ gia cho các sản phẩm khác. Tinh
bột sắn còn được dùng để làm hồ vải, làm lương thực, thực phẩm cho người, đặc biệt
tinh bột sắn là thành phần không thể thiếu trong ngành công nghiệp thức ăn chăn nuôi.


6
1.1.1.3 Thành phần hóa học của củ sắn [4]
Thành phần củ sắn chủ yếu dao động trong khoảng khá rộng tùy thuộc vào loại
giống, điều kiện phát triển của cây và thời gian thu hoạch. Thành phần trung bình (%)
của củ như sau:
Bảng 1.1: Thành phần hóa học của củ sắn
Stt

Thành phần hóa học

Hàm lƣợng (%)

1

Nước

60- 74,2

2

Tinh bột

20- 34

3

Protein

0,8-1,2

4

Chất béo

0,3- 0,4

5

Cellulose

1,0-3,0

6

Đường

1,0-3,1

7

Các polyphenol

0,1- 0,3

8

Tro

0,54

9

Độc tố

0,001- 0,04

Hàm lượng tinh bột của sắn phụ thuộc vào độ non, già của sắn. Đối với giống
sắn một năm thì vụ chế biến có thể bắt đầu từ tháng 9 và kết thúc vào tháng 4 năm sau,
nhưng đào vào tháng 12 và tháng 11 thì hàm lượng tinh bột cao nhất. Tháng 9 tháng
10 củ ít tinh bột hàm lượng nước cao, lượng chất hòa tan nhiều, như vậy nếu chế biến
sắn non không những tỷ lệ thành phần tinh bột thấp mà còn khó bảo quản. Sau tháng 2
và 3 lượng tinh bột trong củ lại giảm vì một phần phân hủy thành đường để nuôi mầm
non trong khi cây chưa có khả năng quang hợp.
Đường trong sắn chủ yếu là glucoza và một lượng mantoza, saccaroza. Sắn
càng già thì hàm lượng đường càng giảm. Trong chế biến, đường hòa tan trong nước
thải ra theo nước dịch.
Protein của sắn tới nay chưa được nghiên cứu kỹ, tuy nhiên vì hàm lượng thấp
cho nên cũng ít ảnh hưởng tới quy trình công nghệ.
Ngoài những chất dinh dưỡng trên sắn còn có độc tố, tanin, sắc tố và hệ enzym

phức tạp. Những chất này gây khó khăn cho chế biến và nếu quy trình không thích hợp
thì chất lượng sản phẩm kém.


7
Độc tố trong sắn là HCN. Nhưng khi chưa đào nó ở dạng glucozit gọi là
phazeolutatin, dưới tác dụng của enzym hay môi trường axit thì phân hủy tạo thành
glucoza, axeton và axit xyanhydric. Như vậy, khi đào sắn rồi mới xuất hiện HCN tự do
vì chỉ sau khi đào các enzym trong sắn mới bắt đầu hoạt động mạnh đặc biệt xuất hiện
nhiều khi chế biến hoặc sau khi ăn sắn.
Phazeolunatin có công thức hóa học C10H17O6N hòa tan tốt trong nước, kém
tan trong rượu metylic, rất ít hòa tan trong clorofoc và hầu như không tan trong ete. Vì
tan tốt trong nước nên khi chế biến tinh bột độc tố theo nước dịch ra ngoài. Vì vậy,
mặc dù sắn đắng có hàm lượng độc tố cao nhưng tinh bột và sắn lát từ sắn đắng vẫn sử
dụng làm thức ăn cho con người và gia súc tốt. Song nếu chế biến không tách dịch bào
nhanh thì có thể ảnh hưởng tới màu sắc tinh bột do axit xyanhydric tác dụng với sắt
tạo thành sắt xyanat có màu xám.
Tùy thuộc giống và đất nơi trồng mà hàm lượng độc tố trong sắn khoảng
0,001-0,04%. Sắn ngọt có hàm lượng độc tố thấp còn sắn đắng thì cao. Tuy nhiên nếu
trồng sắn ngọt với đất nhiều đạm thì lượng độc tố trong củ nhiều hơn.
Phazeolunatin chủ yếu tập trung ở vỏ cùi nên dễ giảm bớt khi sử dụng sắn
bằng cách bóc vỏ và ngâm vào nước.
Enzym trong sắn tới nay chưa được nghiên cứu kỹ. Người ta cho rằng trong số
các enzym thì polyphenol-oxydase có ảnh hưởng nhiều tới chất lượng sắn trong bảo
quản và chế biến. Khi chưa đào, hoạt độ của các enzym trong sắn yếu và ổn định,
nhưng sau khi đào thì mọi enzym đều hoạt động mạnh. Polyphenoloxydase xúc tác
quá trình oxy hóa polyphenol tạo thành octoquinon sau đó trùng hợp với các chất
không có bản chất phenol như axit amin để hình thành các sản phẩm có màu. Trong
nhóm polyphenoloxydase có những enzym oxy hóa monophenol mà điển hình là
tirozinaza xúc tác sự oxy hóa axit amin tirozin tạo ra khi kinon tương ứng. Sau một

loạt chuyển hóa các kinon này sinh ra sắc tố màu xám đen gọi là melanin. Đây là một
trong những nguyên nhân làm cho thịt sắn có màu đen mà thường gọi là sắn chảy
nhựa. Vì enzyme chủ yếu tập trung trong mủ ở vỏ cùi cho nên các vết đen cũng xuất
hiện trong thịt củ bắt đầu từ lớp ngoại vi.
Khi sắn chảy nhựa thì khi chế biến như luộc, hấp sẽ bị sượng và khi mài xát
khó phá vỡ tế bào để giải phóng tinh bột do đó hiệu suất lấy tinh bột thấp và tinh bột
không trắng.


8
Ngoài tirozinase, các enzym oxy hóa khử khác cũng hoạt động mạnh làm tổn
thất chất khô của củ.
Tanin trong sắn ít nhưng sản phẩm oxy hóa tanin là chất flobafen có màu sẫm
đen khó tẩy.
Khi chế biến, tanin còn tác dụng với sắt tạo thành sắt tanat cũng có màu sẫm
đen. Cả hai chất này đều ảnh hưởng tới màu sắc tinh bột nếu như khi chế biến không
tách dịch bào nhanh và triệt để.
Sắc tố trong sắn tới nay cũng chưa được nghiên cứu đầy đủ, tuy nhiên trong
bảo quản và chế biến đều xảy ra quá trình hình thành của sắc tố mới do tác dụng của
polyphenoloxydaza oxy hóa polyphenol tạo thành các octoquinon và sau đó tạo thành
flobafen có màu đen.
Cũng giống khoai tây trong bảo quản tươi sắn thường nhiễm bệnh thối khô và
thối ướt do nấm và vi khuẩn gây nên đặc biệt đối với những củ bị tróc vỏ và dập nát.
Ngoài ra khác với khoai tây là có bệnh chảy nhựa và nếu chảy nhựa nghiêm trọng thì
dẫn tới hiện tượng thối khô.
1.1.1.4 Phân loại
Có nhiều cách phân loại khác nhau, chủ yếu được phân ra làm hai loại dựa vào
hàm lượng cyanua trong củ sắn:
- Sắn ngọt có hàm lượng cyanua ≤ 10mg/100g củ tươi được dùng làm thực
phẩm tươi vì vị ngọt và dễ tạo thành bột nhão, dễ nghiền nát hay đánh nhuyễn.

- Sắn đắng có hàm lượng cyanua 12 ÷ 14mg/100g củ tươi có hàm lượng tinh
bột cao, sử dụng phổ biến làm nguyên liệu cho các ngành công nghiệp chế biến thực
phẩm, công nghiệp hóa dược, công nghiệp giấy và nhiều ngành công nghiệp khác.
1.1.1.5 Diện tích, sản lƣợng sắn trong và ngoài nƣớc
Việt Nam: Diện tích trồng sắn và sản lượng sắn ngày càng tăng trong cả nước.
Các khu vực canh tác sắn chủ yếu tập trung ở các vùng trung du và vùng núi phía Bắc,
Bắc Trung Bộ và Duyên hải miền Trung, Tây Nguyên và Đông Nam, chiếm khoảng
80 % tổng sản phẩm trên cả nước (Bảng 1.2).


9
Bảng 1.2: Sản lƣợng sắn ở các khu vực Việt Nam giai đoạn 2000 – 2010
Nghìn

Năm

tấn

Khu vực
2000

2005

2006

2007

2008

2009

Sb 2010

87,9

92,4

93,7

102,9

101,3

112,4

108,8

678,5

986,8

1070,8 1132,3 13099

645,9

1855,9 2167,6 2359,9 2736,3 2561,0 2607,6

Tây Nguyên

351,5

1446,6 2058,8 2090,4 2371,7 2148,8 2179,5

Đông Nam Bộ

154,3

2270,5 2327,4 2434,4 2684,8 2401,4 2283,3

68,2

64,0

1986,3

6716,2 7782,5 8192,8 9309,9 8530,5 8521,6

Đồng bằng sông
Hồng
Trung du và miền
núi phía Bắc

1220,1 1260,1

Bắc Trung Bộ và
Duyên hải miền
Trung

Đồng bằng sông Cửu
Long

CẢ NƢỚC

64,2

72,9

105,9

86,8

82,3

Theo GSO (2011)
Trên thế giới:
Sản lượng sắn thế giới năm 2012 ước tính đạt 252,125 triệu tấn củ tươi so với
2011 là 245,71 triệu tấn và 1961 là 71,26 triệu tấn. Nước có sản lượng sắn nhiều nhất
thế giới là Nigeria (54 triệu tấn), kế đến là Thái Lan (26,6 triệu tấn) và Indonesia (23,9
triệu tấn). Việt Nam đứng thứ tám trên thế giới về sản lượng sắn (9,75 triệu tấn). (FAO
2013).
Mức tiêu thụ sắn bình quân toàn thế giới năm 2012 khoảng 18,1 kg/người/năm.
Sản lượng sắn của thế giới được tiêu dùng trong nước khoảng 93% (sử dụng làm
lương thực, thức ăn gia súc, chế biến công nghiệp …), còn lại 7% (17,5 triệu tấn) được
xuất khẩu dưới dạng sắn lát khô, sắn viên (60%) và tinh bột (40%) (FAO, 2013).


10
1.1.2 Bã sắn [6]
Bã sắn được thải ra trong quá trình sản xuất tinh bột và tập trung nhiều tại Đồng Nai,
Gia Lai, Tây Ninh và Bình Phước. Theo ước tính, một nhà máy chế biến có công suất
30÷100 tấn/ngày thì sẽ sản xuất được 7,5÷25 tấn tinh bột, kèm theo đó là 12÷48 tấn bã. Thứ

phế thải này thường được phơi khô thành từng luống trắng xoá trên đồng ruộng và dùng để
bổ sung cellulose cho gia súc, gia cầm. Tuy nhiên, do khó tiêu và không mùi nên bã sắn
không hấp dẫn đối với vật nuôi. Nếu trời mưa vài ngày thì bã sắn thối rữa, bốc mùi hôi thối.
Đến khi trời nắng lên thì nấm mốc độc hại phát triển và theo gió phân tán khắp nơi, ảnh
hưởng tới môi trường và sức khoẻ con người.

Hình 1.1: Hình ảnh bã sắn khô
Bảng 1.3: Thành phần hóa học của bã sắn
STT

Thông số

Hàm lượng, %

1

pH

6,5

2

Hàm ẩm

70- 75

Chất khô

20- 25

+ Protein

0,1- 1,0

+ Lipid

0,1

+ Tinh bột

5-7

+ Cenlulose, hemicenlullose

16

Tạp chất khác

1,8

3

4


11
Từ bảng 1.3 trên cho thấy bã sắn với hàm lượng tinh bột chiếm 5- 7% trọng lượng bã,
ước tính mỗi năm ngành sản xuất tinh bột củ bị thất thoát khoảng 50,8- 69,8 nghìn tấn
tinh bột sắn. Nếu không được xử lí kịp thời, các chất hữu cơ trong bã sắn bị phân hủy
có mùi khó chịu, làm ô nhiễm môi trường không khí, ảnh hưởng tới sức khỏe con

người. Ngoài ra, hàm lượng nước trong bã cao gây khó khăn trong bảo quản và sử
dụng bã.
1.1.3 Các sản phẩm từ sắn và bã sắn [6]
Phương án xử lý bã sắn có hiệu quả nhất là tận dụng bã sắn để sản xuất ra
những sản phẩm có giá trị, vì như vậy có thể tiết kiệm được toàn bộ hoặc đáng kể chi
phí xử lý bã sắn, mang lại hiệu quả kinh tế cao hơn cho cơ sở sản xuất. Ghildal và
Losane (1990) đã xem xét, phân tích lợi ích, tính khả thi của các phương án xử lý bã
sắn như sau:
- Làm thức ăn cho động vật: Bã sắn sau khi phơi nắng hoặc sấy khô thường
được làm thức ăn cho gia súc, có thể cho ăn trực tiếp hoặc trộn lẫn với các chất dinh
dưỡng khác. Phương án này ít có hiệu quả kinh tế vì giá bã sắn phơi khô trên thị
trường rất thấp. Ngoài ra, phơi bã sắn còn phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, gây mùi
hôi và ở chừng mực nào đó có thể bị hư hỏng. Hơn nữa, phơi bã sắn không thể áp
dụng cho các cơ sở sản xuất lớn vì lượng bã sắn thải ra hàng ngày quá lớn.
- Làm phân bón: Ngoài tinh bột và cellulose, bã sắn còn có một ít nitơ,
photpho, kali và các chất khoáng khác nên làm phân bón rất tốt. Nhưng do chi phí vận
chuyển cao nên việc dùng bã sắn làm phân bón chỉ giới hạn ở khu vực gần nhà máy
chế biến. Hơn nữa, lượng axit trong bã sắn ảnh hưởng đến chất lượng phân bón, những
chất dễ bay hơi trong bã sắn ảnh hưởng xấu đến môi trường sinh thái, nên ít được
quan tâm.
- Sản xuất syrup glucose: Đã có các nghiên cứu sử dụng kỹ thuật kết hợp axit –
enzym và enzym – enzym ở mức độ phù hợp để chuyển được 98-99% tinh bột có trong bã
sắn thành siro chứa lượng glucose cao (70% lượng đường khử). Căn cứ vào ước tính chi
phí thì quy trình trên không kinh tế vì chi phí cô đặc sản phẩm thuỷ phân cao, phải dùng
nhiều than hoạt tính để khử màu, khó khuấy trộn khối bã sắn dày trong nồi, nên truyền
nhiệt không hiệu quả.


12
- Sản xuất rƣợu etylic: Sau khi thuỷ phân tinh bột có trong bã sắn theo quy

trình axit – enzym, cô đặc để đạt lượng đường 15%, lên men rượu bằng cách sử dụng
nấm men Saccharomyces cerevisiae FT-18. Quá trình thuỷ phân tinh bột ở bã sắn chỉ
đạt khoảng 7% đường khử. Nếu muốn có dịch đường đạt đến 15%, có thể sử dụng hai
phương án: hoặc cho thêm mật mía vào hoặc cô đặc sản phẩm thuỷ phân. Tuy nhiên,
cả hai phương án đều kém khả thi. Thêm vào đó lượng nước thải ra từ các nhà máy sẽ
nhiều hơn và làm phát sinh chi phí xử lý nước thải cao hơn.
- Làm cơ chất cho quá trình lên men ở trạng thái rắn: Đã có một số công
trình nghiên cứu sử dụng bã sắn thay thế cho cám lúa mì trong quá trình lên men VSV
ở trạng thái rắn.
1.2 Tổng quan về Bacillus subtilis
1.2.1. Đặc điểm của Bacillus subtilis
Bacillus spp là loài vi khuẩn gram dương, hình que, hiếu khi và hình thành bào
tử, đặc điểm hình thái này cho phép phân biệt với các chủng khác. Bacillus có chút
tương đồng hình dạng với Clostridium spp ngoại trừ Clostridium là chủng vi khuẩn kỵ
khí bắt buộc trong khi Bacillus thì hiếu khí hoặc hiếu khí không bắt buộc. Tính chất
hiếu khí của loài Bacillus giúp thuận lợi hơn khi nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
hoặc trong ứng dụng công nghiệp.

Hình 1.2: Vi khuẩn Bacillus spp
Bacillus spp được tìm thấy chủ yếu trong đất, phân vật nuôi, bùn, rác . Hầu hết
các chủng vi khuẩn Bacillus spp không gây hại cao ngoại trừ Bacillus anthracis gây
bệnh than. Có 4 loài chính trong họ Bacillacaea mà hiếu khí, hình thành bào tử là


13
Thermoactinomycetes, Sporoarcina, Sporolactobacillus và Bacillus. Chủng Bacillus
gồm trên 60 loài phân bố rộng rãi khắp nơi. Theo Sonenshein, gene Bacillus có thể
phân thành 6 nhóm dựa trên hình thái và đặc điểm gene tương đồng. Những loài
Bacillus được phân loại dựa trên tương đồng DNA sử dụng phương pháp định danh
theo chuỗi lai giống DNA-DNA và chuỗi 16S rDNA [22].

Bacillus hình thành bào tử dưới điều kiện môi trường sống hạn chế như nhiệt độ
cao, dinh dưỡng kém (đặc biệt hạn chế về hàm lượng carbon, nitrogen hoặc
phosphore). Bào tử được hình thành trong tế bào chất của vi khuẩn ban đầu và chuyển
thành dạng bất hoạt. Nó có thể tồn tại trong điều kiện vật lý và hóa học có thể giết chết
tế bào sinh dưỡng. Bào tử tồn tại trong thời gian dài và khi điều kiện môi trường thích
hợp, nó sẽ chuyển thành tế bào sinh dưỡng. Bào tử tạo thuận lợi cho việc phân tán vi
khuẩn trên diện rộng khi nó có thể bay theo gió, bụi lan vào trong tự nhiên [22].
Nhiều ứng dụng Bacillus liên quan tới tính chất hình thành bào tử. Khả năng
tồn tại ở điều kiện khắc nghiệt giúp nó có tính ổn định trong các quá trình sản xuất.
Một vài chủng Bacillus được ứng dụng cho các sản phẩm giặt tẩy, kháng vi sinh vật,
sinh tổng hợp enzyme .
Bacillus subtilis là loài vi khuẩn hiếu khí có khả năng tồn tại trong môi trường
kỵ khí, đặc biệt là khi có glucose và nguồn nito tương ứng. Bào tử của Bacillus subtilis
có hình oval nằm vị trí trung tâm hoặc phía cuối.
Bacillus subtilis có nhiều ứng dụng trong công nghiệp như thực phẩm, nước
uống, chất tẩy rửa. Ví dụ như nó được sử dụng để sản xuất natto, một sản phẩm lên
men đậu nành của Nhật Bản. Trong nông nghiệp, Bacillus subtilis có thể được dùng để
kháng nấm gây bệnh như Fusarium oxysporum và Botryodiplodia theobromae và để
cung cấp dinh dưỡng như phosphore hay sulphur kích thích giúp cây trồng phát triển.
Vi khuẩn này cũng được dùng trong công nghiệp để sản xuất enzyme quy mô lớn. Nó
có khả năng sản xuất α-amylase, β-glucanase , chitinase, β-galactosidase , cellulase,
phytase [21].
Bacillus subtilis dễ dàng được phân lập từ môi trường xung quanh. Từ đất, vi
khuẩn được lan truyền tới thực vật, động vật, thực phẩm, môi trường nước .


14
1.2.2 Các nghiên cứu sinh tổng hợp cellulase từ Bacillus spp
Nghiên cứu của Rasstogi G [30] “Characterization of thermostable cellulose
produced by Bacillus and Geobacillus strains” động lực học của phản ứng đạt 3,111,08mg/ml và có khả năng chịu được nhiệt độ 70oC trong 1 ngày.

L M Robson (1984) [31] đã nghiên cứu các chủng Bacillus và có nhiều tính
chất tương đồng với Bacillus subtilis qua bài “Characterization of cellulolytic activity
of a Bacillus isolate”. Khi sinh trưởng trên nhiều loại đường, dịch nổi thu được có hoạt
tính cellulolytic khi kiểm chứng bằng cách phân giải với trinitrophenyl0carboxymethyl
cellulose, còn sinh trưởng trên cellobiose và glucose thì khả năng sinh hoạt độ rất tốt.
Enzyme chỉ sinh tổng hợp ở pha cân bằng và thông số tối ưu ở pH=4,8 tại 58oC.
Nghiên cứu “Purification and characterization of cellulases produced by two
Bacillus strains” của Mawadza C, Hatti-Kaul R, Zvauya R [28] đã phân lập được 2
chủng Bacillus CH43 và HR68 từ suối nước nóng của Zimbawe. Các enzyme này có
hoạt độ tối ưu khi pH 5-6,5, nhiệt độ 65-70oC, bền ở nhiệt độ 50oC trong 1 ngày.
Nghiên cứu “Studies on cellulase production by a Bacillus subtilis” của KwongYu Chan [27] đã phân lập được chủng Bacillus subtilis AU-1 sinh tổng hợp
carboxymethylcellulase (CMCase) với môi trường chứa D(+) raffinose 0,2% là chất
cảm ứng, 0,5% cao nấm men, 0,5% acid casamino và 0,5% proteose pepton ở nhiệt độ
50oC với pH=6. Hoạt độ đạt mức cao nhất sau 10 giờ lắc.
1.2.3 Các nghiên cứu sinh tổng hợp phytase từ Bacillus spp
Nghiên cứu “Phytase production by Bacillus subtilis US417 in submerged and
solid state fermentations” của Radhouane Kammoun [25] đã khảo sát ảnh hưởng của
các biến cách ủ, methanol, cao nấm men ảnh hưởng tới sự sinh tổng hợp Bacillus
subtilis US417 theo mô hình tối ưu hóa đáp ứng bề mặt Plackett-Burman có hoạt độ
enzyme đạt 112U/g.
Nghiên cứu “Characterization of a Thermostable alkaline phytase from Bacillus
licheniformis” của Shijun Fu [18] đã phân lập được chủng Bacillus licheniformis. Hoạt
độ cao nhất đạt 0,267U/ml khi ở nhiệt độ tối ưu 55oC, pH=7. Sau khi xử lý ở nhiệt độ
80oC trong 10 phút, hoạt độ còn lại 57,36%.


15
1.3 Tổng quan về cellulase, phytase
1.3.1 Giới thiệu về cellulase
1.3.1.1 Giới thiệu về cellulose

Xơ trong thực vật thành phần chủ yếu là cellulose và hemicellulose, lignin. Nó
là nguồn chất hữu cơ có nhiều trong tự nhiên và chiếm khoảng 50% nguồn carbon trên
thế giới. Cellulose tồn tại nhiều dưới dạng cấu trúc polymer và được thấy nhiều trong
thực vật, tảo, nấm và một vài vi khuẩn. Trong thực vật, hàm lượng cellulose chiếm
trung bình khoảng 20% trong cỏ, 45% trong gỗ (trọng lượng khô) và 90% trong sợi
cotton [11].
Nhiều nghiên cứu đã mô tả cấu trúc cellulose gồm nhiều đơn vị cellobiose, là 2
tiểu đơn vị glucose gắn với nhau bởi cầu nối β-D-1,4 glucosidic ở góc 180o . Chiều dài
của nhánh β-D-glucan tùy vào nguồn gốc của nó, ví dụ 10000 đơn vị mỗi nhánh đối
với gỗ và 15000 đơn vị trong cotton [11].
Các nhánh cellulose nằm song song với nhau tạo thành các vi sợi. Cellulose khá
cứng và không tan trong nước nhờ các cầu nối hydrogen bên trong giữa các phân tử và
liên kết kỵ nước giữa các nhánh với nhau.Vi sợi được cấu tạo từ các vùng tinh thể định
hình xen giữa một số ít vùng vô định hình ít trật tự. Số lượng tinh thể giữa vùng định
hình và vô định hình phụ thuộc vào nguồn gốc sinh học của cellulose. Vi sợi có thể bé
hơn 30nm trong thành tế bào thực vật và rộng khoảng 20nm trong tảo Valonia
Macrophyase [14].

Hình 1.3: A Cấu trúc cơ bản của cellulose B Mặt cắt của nhánh cellulose


16
Trong tự nhiên, các vi sợi cellulose quấn với hemicelluloses và lignin tạo thành
hợp chất khá phức tạp gọi là lignocelluloses. Cấu trúc kết hợp với lignocelluloses giúp
cho thành tế bào thực vật tăng sức căng để chịu được áp suất thẩm thấu và các tác
động cơ học [14].

Hình 1.4: Cấu trúc của lignocellulose
Trong

tự

nhiên

cơ

chất

lignocelluloses

bao

phủ

bên

ngoài

cellulose/hemicelluloses cản trở sự tương tác với enzyme. Lignin là thành phần khá
phức tạp trong hợp chất lignocelluloses. Nhiều phương pháp tiền xử lý được nghiên
cứu nhằm loại bỏ lignin để tăng sự tương tác của cellulose với sự tác dụng của
enzyme. Những cách hay được sử dụng như nghiền, rửa với alcohol hoặc dung môi
hữu cơ; xử lý với kiềm như sodium hydroxide và ammonia; xử lý với acid như acid
acetic và acid hydrochloric; hoặc là xử lý hơi nước cho sợi lignin bung ra. Trong
ngành sản xuất giấy thường sử dụng Lignozyme để làm mềm gỗ dễ xử lý enzyme.
Trong tự nhiên có loại nấm rễ trắng có khả năng tách lignin làm cho nấm và vi khuẩn
có thể tấn công cellulose [14].
1.3.1.2 Cơ chế cắt cellulose
Enzyme cellulase chịu trách nhiệm cắt mạch cellulose thành đường glucose.
Quá trình gồm 2 bước: chuyển cellulose thành cellobiose bằng enzyme β-1,4glucanase và từ đường cellobiose thành glucose bằng β-glucosidase [12].