BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ TÌNH HÌNH NHIỄM CIRCOVIRUS TRÊN VỊT VÀ KHẢ NĂNG NHIỄM GHÉP GIỮA CIRCOVIRUS VÀ RIEMERELLA ANATIPESTIFER TRÊN VỊT SIÊU THỊT NHẬP NGOẠI Ở TỈNH ĐỒNG NAI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
***************

BÙI HỮU DŨNG

BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ TÌNH HÌNH NHIỄM CIRCOVIRUS
TRÊN VỊT VÀ KHẢ NĂNG NHIỄM GHÉP GIỮA
CIRCOVIRUS VÀ RIEMERELLA ANATIPESTIFER TRÊN
VỊT SIÊU THỊT NHẬP NGOẠI Ở TỈNH ĐỒNG NAI

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9/2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
***************

BÙI HỮU DŨNG

BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ TÌNH HÌNH NHIỄM CIRCOVIRUS
TRÊN VỊT VÀ KHẢ NĂNG NHIỄM GHÉP GIỮA
CIRCOVIRUS VÀ RIEMERELLA ANATIPESTIFER TRÊN
VỊT SIÊU THỊT NHẬP NGOẠI Ở TỈNH ĐỒNG NAI

Chuyên ngành: Thú Y
Mã số:
ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP
Hướng dẫn Khoa học:

PGS.TS NGUYỄN TẤT TOÀN
TS. NGUYỄN THỊ PHƯỚC NINH

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 5 /2015


MỤC LỤC


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AGP ..............................................................................................Agar Gel Pricipitin
AT ........................................................................................................Achilles Tedon
BFDV .................................................................................Beat feather disease virus
CAD .........................................................................................Chick Edema Disease
DBH ........................................................................................Dot-blot Hybridization
dNTP .....................................................................deoxyribonucleoside triphosphate
DHV ...........................................................................................Duck Hepatitis Virus
DNA ....................................................................................Deoxyribo nucleotid acid
DuCV .................................................................................................Duck circovrius
ELISA .............................................................Enzyme linked immunosorbent Assay
GoCV ..............................................................................................Goose circovirus
HS ................................................................................................................Heart Sac
ISH .............................................................................................In situ Hybridization
LAMP .........................................................Loop-mediated isothermal amplification
M ..................................................................................................................Meninges
OD ...........................................................................................................Odd density
ORF ............................................................................................Open reading Frame
pb ..................................................................................................................Base pair
PBS .....................................................................................Phosphate Bufferd Saline

PCV ................................................................................................Porcine circovirus
PCR ......................................................................................Polymera chain reaction
PiCV ................................................................................................Piegon circovirus
PK15 ........................................................................................................Pig kiney 15
RA .........................................................................................Riemerella anatipestifer
SC ...................................................................................................................Subcutis
TBE ................................................................................................Tris Borate EDTA


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Các hạt phân tử DuCV ở túi bursa fabricius trên vịt Mulard được chụp
dưới kính hiển vi điện tử
Hình 2.2 Cấu trúc bộ gien của DuCV
Hình 2.1 Vịt hư hại lông, chảy nước mắt, nước mũi
Hình 2.4 Vịt bị thất điều vận động, nằm ngửa và bơi chèo
Hình 2.5 Các bệnh tích đại thể phổ biến trên vịt nhiễm RA
Hình 2.6 Các bệnh tích vi thể phổ biến trên vịt nhiễm RA


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Một số kháng sinh và sulfamides sử dụng trong điều trị bệnh do RA
Bảng 3.1 Số lượng trại khảo sát và số mẫu dự kiến
Bảng 3.2 Mẫu thu thập cho các nghiên cứu xét nghiệm bệnh
Bảng 3. Trình tự đoạn mồi dùng trong phản ứng PCR chẩn đoán RA
Bảng 3. Thành phần phản ứng PCR trong chẩn đoán DuCV
Bảng 3. Chu trình luân nhiệt phản ứng PCR phát hiện RA


Chương 1
MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề
Bệnh do Circovirus trên vịt có tỷ lệ lưu hành cao trên nhiều giống vịt nuôi
nhà (Zhang và cs, 2012) như: Mulard, Super meat, Grimaud star 53... và được đặc
trưng bởi tình trạng còi cọc và sự bất thường trong quá trình phát triển của bộ lông.
DuCV được mô tả đầu tiên trong một trại vịt Mulard ở Đức năm 2003 (Hattermann
và cs, 2003). Sau đó, sự lây nhiễm DuCV nhanh chóng được báo cáo ở nhiều quốc
gia trên thế giới như: Hungary, Mỹ, Đài Loan và Trung Quốc (trích dẫn bởi Cha và
cs, 2013). DuCV có thể là nguyên nhân gây suy giảm khả năng sinh sản và hiệu quả
kinh tế chăn nuôi (Cha và cs, 2013). Đây là mối quan tâm rất lớn cho người chăn
nuôi gia cầm hiện nay.
Rõ ràng, trong những năm gần đây, chăn nuôi gia cầm đang chiếm một vị trí
ngày càng quan trọng trong sản xuất nông nghiệp. Trong đó, chăn nuôi vịt siêu thịt
nhập ngoại đang là một trong những hướng phát triển mới cho người chăn nuôi.
Một số giống vịt siêu thịt được nuôi nhiều ở tỉnh Đồng Nai như: Grimaud star 53,
Super meat... đã và đang được phát triển một cách nhanh chóng. Tuy nhiên, các vấn
đề quản lý và vệ sinh trong các trại chăn nuôi vịt còn quá nghèo nàn so với các trại
gà. Hơn thế nữa, khả năng phổ cập kiến thức chăn nuôi cũng như hệ thống các cơ sở
trang trại nuôi vịt không thể đáp ứng kịp thời và đầy đủ so với tốc độ phát triển đầu
con. Đây được cho là một trong những nguyên nhân cơ bản làm cho tình hình dịch
bệnh trong các cơ sở chăn nuôi vịt ngày càng diễn tiến phức tạp. Trong đó, bệnh do
Circovrus trên vịt (DuCV) là một trong những nguy cơ đáng được lưu tâm.
Hầu hết, các nghiên cứu về DuCV thường tập trung vào các dấu hiệu lâm
sàng, bệnh tích vi thể và ứng dụng một số phương pháp phân tử để chẩn đoán
DuCV. Trong khi đó, khả năng nhiễm ghép giữa DuCV và các tác nhân khác cũng là
một vấn đề đáng quan tâm đối với người chăn nuôi. Sự tổn thương các mô lympho
là nguyên nhân gây suy giảm đáp ứng miễn dịch và làm tăng nguy cơ nhiễm ghép
(Soike và cs, 2004).


Ở Việt Nam, chưa có nhiều báo cáo chính thống về tình hình lây nhiễm

Circovirus trên vịt và khả năng nhiễm ghép với một số tác nhân khác như: E.coli,
Salmonella, DHV và Riemeralla anatipestifer. Mặc dù, số lượng trại nuôi vịt siêu
thịt nhập ngoại cũng đã tăng lên một cách nhanh chóng, cũng như tình hình dịch
bệnh trên loài này cũng ngày càng phức tạp hơn.
Xuất phát từ những vấn đề thực tiễn sản xuất đặt ra, đề tài: “Bước đầu đánh
giá tình hình nhiễm Circovirus trên vịt và khả năng nhiễm ghép giữa
Circovirus và Riemerella anatipestifer trên vịt siêu thịt nhập ngoại ở tỉnh Đồng
Nai” đã được thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Tất Toàn và TS.
Nguyễn Thị Phước Ninh.
1.2 Mục tiêu của đề tài
- Đánh giá tình hình nhiễm Circovirus trên đàn vịt nuôi.
- Đánh giá khả năng nhiễm ghép giữa Circovirus và RA trên vịt.
1.3 Yêu cầu của đề tài
- Tỷ lệ nhiễm DuCV trên tổng đàn/ vịt khảo sát.
- Tỷ lệ nhiễm DuCV trên đàn/ vịt khảo sát theo lứa tuổi.
- Tỷ lệ nhiễm RA trên vịt dương tính với Circovirus.
- Tỷ lệ nhiễm RA trên vịt âm tính với Circovirus.
- So sánh tỷ lệ nhiễm RA trên vịt dương tính và âm tính với Circovirus.


Chương 2.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu bệnh circovirus trên vịt
2.1.1 Lịch sử bệnh
Circovirus trên vịt (DuCV) thuộc giống Circovirus, họ Circoviridae được mô
tả đầu tiên trên hai vịt mái Mulard 6 tuần tuổi ở Đức, năm 2003 (Hattermann và cs,
2003). Bệnh gây ra các tác hại chủ yếu như: rối loạn tình trạng mọc lông, chậm tăng
trưởng và gầy ốm (Hattermann và cs, 2003; Soike và cs, 2004). Sau đó, DuCV cũng
đã được phân lập ở Hungary (Fringuell và cs, 2005). Năm 2006, Chen và cs đã mô
tả DuCV trên vịt Muscovy, Pekin và Mule với các triệu chứng còi cọc, sự bất bình

thường trong quá trình phát triển của bộ lông trên vịt nuôi ở Đài Loan. Các phát
hiện về bệnh Circovirus trên vịt cũng được mô tả ở Mỹ (Banda và cs, 2007) và
Trung Quốc (Zhang và cs, 2009). Tháng 3 năm 2011, DuCV đã được phân lập trên
đàn vịt Pockmuark thương phẩm ở Guangxi, Trung Quốc có các dấu hiệu lâm sàng
của bệnh cùng với sự suy giảm đáp ứng miễn dịch (Liji Xie và cs, 2012).
Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào về DuCV được công bố chính thức.
2.1.2 Căn nguyên
Họ Circovirus gồm 2 giống: Gyrovirus và Circovirus. Trong khi Gyrovirus
chỉ gây ra duy nhất bệnh thiếu máu trên gà - CAD (Hailemariam H., 2008), thì
Circovirus có ít nhất 7 thành viên: Circovirus trên heo - PCV1, PCV2 (Allan và
Ellis, 2000; Mankertz và cs, 2000), vi-rút gây bệnh mỏ và lông - BFDV (Bassami
và cs, 2001), Circovirus trên bồ câu - PiCV (Mankertz và cs, 2000; Soike và cs,
2001; Todd và cs, 2002), Circovirus trên ngỗng - GoCV (Chen và cs, 2003; Soike
và cs, 2004), Circovirus trên canary (Phenix và cs, 2001; Pringle, 1999) và
Circovirus trên vịt - DuCV (Hattermann và cs, 2003).
DuCV có 20 mặt, không vỏ, dạng tròn, là một DNA sợi đơn, độ dài khoảng
1,99 kb (nucleotide 1988-1996), kích thước nhỏ, đường kính từ 15-16 nm
(Hattermann và cs, 2003; Wang và cs, 2011). DuCV được chia thành 2 genotype:
DuCV1, DuCV2 và 6 subtype gồm: 1a,1b,1c và 2a, 2b, 2c (Zhilong và cs, 2013).


Hình 2.1 Các hạt phân tử DuCV ở túi bursa fabricius trên vịt Mulard được chụp
dưới kính hiển vi điện tử
(Nguồn: Soike và cs, 2004)
Theo Hattermann và cs (2003), DuCV có 2 khung đọc mở: ORF1 (ORF V1)
và ORF2 (ORF V2). ORF1 còn gọi là gien Rep (nucleotide 33-926), nằm trên sợi
vi-rút, mã hóa cho protein có trọng lượng 33,6 kDa, liên quan đến sự nhân lên của
vi-rút. Gien Rep có sự bảo tồn cao, ít đột biến (Zhilong và cs, 2013). ORF2 còn gọi
là gien Cap (nucleotide 1151-1924), nằm ở hướng đối diện, mã hóa cho protein
capside liên quan đến cấu trúc và miễn dịch của vi-rút (Hattermann và cs, 2003; Liu

và cs, 2010). Năm 2012, Xiang và cộng sự dựa trên cơ sở giải trình tự gien đã
chứng minh DuCV có thêm ORF3 (nucleotide 103-399), nằm ở mạch bổ sung của
ORF1 và có sự đồng nhất với gien ORF3 của PCV2 trên heo. ORF3 liên quan đến
sự chết theo lập trình của tế bào. Tấc cả các ORF đều chịu áp lực chọn lọc codon.


Hình 2.2 Cấu trúc bộ gien của DuCV
(nguồn: Xiang, 2012)
2.1.3 Đặc điểm về dịch tễ
DuCV có tỷ lệ lưu hành cao trên vịt nuôi nhà (Zhilong Zhang và cs, 2013).
Đã có nhiều báo cáo về tỷ lệ nhiễm Circovirus trên nhiều giống vịt như: Vịt Mulard,
Muscovy, Mule, Cherry valley, Pekin và Pockmark (Banda và cs, 2007; Wan C. Và
cs, 2011) ở nhiều nơi trên thế giới gồm: Đức, Mỹ, Hungary, Trung Quốc, Đài Loan
(Liji và cs, 2014). DuCV có thể truyền ngang (Lin và cs, 2010) và truyền dọc từ đàn
vịt giống sang vịt con tại cùng một thời gian ( Li và cs, 2014). Các nghiên cứu của
Hattermann và cs (2003) trên vịt mái 6 đến 8 tuần tuổi đã mô tả các triệu chứng đặc
trưng của bệnh (Soike và cs, 2004). Sự suy giảm miễn dịch làm tăng khả năng đồng
nhiễm một số tác nhân gây bệnh khác như: Riemerella anatipestifer, Pasteurella
multocida, Staphilococus aureus, Duck hepatitis và Aspergillus fumigatus (Soike và
cs, 2004; Fringuelli và cs, 2005; Chen và cs, 2006; Zhang và cs, 2009). Sự nhiễm
ghép của các tác nhân này với Circovirus có tỷ lệ lưu hành cao trên cả gia cầm non
và gia cầm trưởng thành (Leslie Và Kenneth, 2013). Tỷ lệ mắc bệnh cao đã được
mô tả Trung Quốc nhưng các quốc gia liền kề như: Hàn Quốc, Nhật Bản thì chưa có
báo cáo về tình trạng này (Cha và cs, 2014).
Các nghiên cứu của Ritchie và cộng sự (1991); Rittchie và Latimer (1995) đã
chứng minh Circovirus tồn tại trong các chất bài tiết, phân của những con vẹt bị
nhiễm bệnh và bụi trong không khí. Nghiên cứu cũng đề nghị rằng: sự bài thải các
hạt vi-rút và sự tiêu hóa trực tiếp các vật nhiễm bệnh có thể là con đường truyền lây
tự nhiên của vi-rút. Hess (2004) cũng đã chứng minh: vi-rút được phát hiện phổ

biến trên lớp sừng của nang lông, đây có thế là nơi vi-rút tồn tại và bài thải mầm
bệnh ra môi trường.Tuy nhiên, các nghiên cứu trên vịt vẫn chưa được biết rõ. Ngoài
ra, Circovirus còn tồn tại ở gan (Eisenberg và cs, 2003), lách, thận và các cơ quan
đường hô hấp (khí quản, họng và phổi) (Duchatel và cs, 2006).
2.1.4 Sự miễn dịch
ORF2 (Protein capsid) mã hóa protein cấu trúc và độc lực của vi-rút, liên
quan đến đáp ứng miễn dịch của vật chủ (Hattermann và cs, 2003).
Miễn dịch chủ động: Khi gia cầm nhiễm Circovirus, đáp ứng miễn dịch được
hình thành, cho kết quả huyết thanh học dương tính (Ritchie, 1992; Raidal, 1993;
Raidal và Cross, 1994). Gia cầm khỏe mạnh tiếp xúc với Circovirus có titers cao
hơn khi được gây nhiễm chủ động. Như vậy, kháng thể bảo vệ có khả năng chống
lại sự xâm nhiễm của vi-rút, làm giảm các dấu hiệu lâm sàng của bệnh. Nghiên cứu
cũng chứng minh rằng: tỷ lệ lưu hành của PCR dương tính với Circovirus vượt trội
hơn so với tỷ lệ lưu hành huyết thanh dương tính trên những con ngỗng con.
Nguyên nhân có thể do sự thiếu nhạy cảm của các test huyết thanh học hoặc sự suy
giảm đáp ứng miễn dịch do ảnh hưởng của Circovirus đến hệ miễn dịch của cơ thể
(Biagini, 2011; Scott và cs, 2006). Theo Scott và cộng sự (2006), kháng thể được
phát hiện đầu tiên trên ngỗng gây bệnh thí nghiệm là 27 ngày tuổi và 53 ngày tuổi
đối với ngỗng nhiễm bệnh tự nhiên.
Miễn dịch bị động: Những cá thể gà được tiêm vắc-xin vẫn xuất hiện các dấu
hiệu lâm sàng của bệnh khi nhiễm Circovirus. Ngược lại, những cá thể không được
tiêm vắc-xin vẫn có khả năng chống lại Circovirus khi được gây nhiễm với một
lượng vi-rút như nhau. Qua đó cho thấy, gia cầm được gây nhiễm Circovirus chết có
thể truyền kháng thể bảo vệ cho gà con (Jeurissen và cs, 1992; Jeurissen và Boer,
1993). Khả năng đáp ứng miễn dịch chéo không xảy ra đối với các vật chủ khác
nhau khi tiếp xúc Circovirus. Tuy nhiên cần có những nghiên cứu cụ thể hơn về khả
năng đáp ứng miễn dịch đối với Circovirus trên vịt.
2.1.5 Sự nhân lên của Circovirus

Do khó khăn trong việc nhân giống Circovirus trong nuôi cấy tế bào hoặc
phôi gà nên sự hiểu biết về sự nhân lên của Circovirus còn rất hạn chế. Có 2 loài
thuộc họ Circoviridae gồm: CIAV ( Chicken infectious anaemia virus) và PCV
(Porcine circovirus) được nhân giống trong môi trường nuôi cấy tế bào (Murphy và
cs, 1999; Todd và cs, 2001) và đã có những thông tin cơ bản về sự nhân lên của virút. CIAV nhân lên trong tế bào MDCC-MSB1 bắt nguồn từ tế bào lympho của
bệnh Marek, còn PCV phát triển trong tế bào PK15. Do sự giới hạn về kích cỡ của
bộ gen nên khả năng nhân lên của Circovirus phụ thuộc nhiều vào các enzymes
trong tế bào. Circovirus nhân lên trong nhân và phụ thuộc vào protein tế bào được
tạo ra trong suốt pha S của chu kỳ tế bào (Todd và cs, 2001). Các quá trình nguyên
phân cần thiết cho DNA đi vào trong nhân và sự nhân lên xảy ra trong các tế bào
đích như: biểu mô nang lông, các lympho bào và biểu mô đường ruột. Sự nhân lên
xảy ra trên cấu trúc stem-loop của bộ gien, ORF1 mã hóa protein cần thiết cho sự
nhân lên của vi-rút (Mankertz và cs, 2000; Todd và cs, 2001).
2.1.6 Triệu chứng lâm sàng
Các triệu chứng lâm sàng của vịt nhiễm Circovirus thường không điển hình,
không có những biểu hiện bất thường đặc trưng. Vịt chết rãi rác và chậm lớn. Theo
Hattermann và cộng sự (2003), vịt chủ yếu còi cọc, thể trạng kém và hư hại bộ lông
dọc theo sống lưng. Một số con có thể bị xuất huyết ở gốc chân lông. Tình trạng này
cũng được quan sát thấy trên chim sẻ, quạ và ngỗng bị nhiễm Circovirus (Leslie và
Kenneth, 2013). DuCV có thể nhiễm ghép với nhiều tác nhân khác như: E.coli, P.
Multocida, Riemerella anatipestifer, viêm gan vịt (theo trích dẫn của Xiang và cs,
2012) và làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến hiệu quả chăn nuôi (Se-Yeoun và cs,
2014). Nhiễm ghép cũng xảy ra phổ biến trên vịt lớn tuổi và sự suy giảm đáp ứng
miễn dịch do tác động của Circovirus được cho là nguyên nhân cơ bản (Banda và
cs, 2007).
2.1.7 Bệnh tích
Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào các biến đổi bệnh tích vi thể trên vịt bị
nhiễm Circovirus. Phức hợp bệnh tích mô bào, sự hoại tử xảy ra ở lách, tuyến ức và

túi bursa fabricius (Liu và cs, 2010). Ngoài ra, sự viêm và hoại tử cũng xảy ra rất
phổ biến trên lông bị loạn dưỡng (teo) ở vịt nhiễm Circovirus (Soike và cs, 2004).
Các điểm hoại tử phân tán được thấy trong biểu mô chân lông nhưng không thấy
xuất huyết ở tủy chân lông. Các tế bào viêm bị xâm nhiễm nhiều bạch cầu trung
tính và bạch cầu đơn nhân. Nang lông và biểu mô quanh nang lông ở vùng da dọc
sống lưng xâm nhiễm nhiều tế bào viêm bắt màu lưỡng tính (Soike và cs, 2004).
Các thể vùi trong nhân bắt màu lưỡng tính cũng được tìm thấy trong các tế bào biểu
mô lông hoặc nang lông (Latimer và cs, 1991). Ngược lại, các thể vùi dạng chùm
nho hoặc hình que đã được mô tả trong các đại thực bào ở biểu mô lông, nang và
ống lông.
Ở túi fabricius, bệnh tích vi thể chủ yếu là sự cạn kiệt các lympho bào, sự
hoại tử và gây bệnh tích mô bào (Soike và cs, 2004). Tuy nhiên, Fringuelli và cộng
sự (2005) lại cho rằng: sự hiện diện của các đám thể vùi trong nhân tế bào có thể
không phải là đặc trưng phổ biến của Circovirus trên vịt.
2.1.8 Chẩn đoán
Do chưa có môi trường nuôi cấy để phân lập DuCV trong phòng thí nghiệm
nên hầu hết các chẩn đoán DuCV phụ thuộc vào các kỹ thuật phân tử (Fringuellie
và cs, 2005). Các kỹ thuật PCR truyền thống và DBH đã được Todd (2002) sử dụng
để chẩn đoán Circovirus. Ngoài ra, một số kỹ thuật phân tử khác như: real time
PCR (Fringuelli và cs, 2005), nested PCR (Halami và cs, 2008) và ISH cũng đã
được phát triển để phát hiện DuCV. Theo Wan và cộng sự (2011), nested PCR và
ISH nhạy cảm hơn so với PCR truyền thống. Nhưng nested PCR yêu cầu phải phân
tích trên gel agarose để phát hiện sản phẩm khuyếch đại và có nguy cơ tạp nhiễm
cao hơn. Trong khi đó, ISH cần nhiều thời gian để thực hiện. Tuy nhiên, các phương
pháp này không được sử dụng để phân biệt các serotype DuCV1 và DuCV2. Năm
2014, Li và cộng sự đã ứng dụng kỹ thuật duplex PCR - có độ đặc hiệu và độ nhạy
cao - để chẩn đoán phân biệt hai serotypes này. Sau đó, kỹ thuật LAMP cũng được
ứng dụng như một kỹ thuật chẩn đoán nhanh và trực tiếp trên các mẫu lâm sàng
trong chẩn đoán DuCV.

Phương pháp ELISA gián tiếp đã được Liu và cộng sự (2010) sử dụng để
phát hiện Circovirus trên vịt và điều tra dịch tễ của bệnh. Tác giả sử dụng kháng
nguyên protein capside tái tổ hợp của DuCV được sản xuất từ các tế bào E.coli để
phát hiện kháng thể đặc hiệu của Circovirus trong huyết thanh vịt.
2.2 Giới thiệu bệnh bại huyết do Riemerella anatipestifer (RA) trên vịt
Bệnh do RA là một bệnh truyền nhiễm cấp tính trên vịt, ngỗng, gà tây và
nhiều loài gia cầm nuôi nhà khác. Bệnh được biết đến với nhiều tên gọi khác nhau
như: bệnh bại huyết trên vịt, hội chứng anatipestifer, bệnh bại huyết do anatipestifer
hay bệnh viêm thanh mạc truyền nhiễm. Bệnh xảy ra cấp tính hoặc mãn tính với các
đặc trưng như: viêm màng ngoài tim, màng bao gan, viêm túi khí, viêm vòi trứng
tích casein và viêm màng não.
Bệnh gây thiệt hại lớn về kinh tế do có tỷ lệ tử vong cao, tăng trọng kém. Vì
vậy, cần phải kết hợp đồng thời nhiều biện pháp để ngăn ngừa và kiểm soát bệnh
như: chẩn đoán bệnh chính xác, kịp thời, chủng ngừa vắc-xin và điều trị bệnh.
RA được mô tả đầu tiên năm 1932 trên vịt Bắc Kinh từ ba trại vịt ở Long
island, New York. Hendrickson và Hilbert (1932) đã phân lập được mầm bệnh và
lấy tên Pfeifferella anatipestifer. Sau đó, tác nhân gây bệnh đã được phân lập dựa
trên các đặc tính và liên tiếp được thay đổi tên từ Moraxella anatipestifer (Brogden,
Rhoades và Rimler, 1982), Flavobacterium (Piechulla, Pohl và Mannheim, 1986),
Pasteurella anatipestifer. Cuối cùng, Segers và cộng sự (1993) đã quyết định đặt
tên là Riemerrella anatipestifer thuộc họ Flavobacteriaceae để tưởng nhớ Riemer
(Riemer, 1904) - người đầu tiên mô tả bệnh bại huyết tiết dịch trên ngỗng năm
1904.
2.2.1 Căn nguyên
RA có dạng trực khuẩn, Gram âm, hiếu khí, không di động, không bào tử và
có thể kết nhóm đôi hay chuỗi ngắn. RA có kích thước 1-2 mm, dạng lồi, mọc thành
khối, trong suốt và óng ánh.
RA được định serotype dựa vào phản ứng trung hòa và phản ứng AGP. Cả

hai test này đều liên quan đến kháng nguyên bề mặt (Brogden, 1982). Có 21


serotype (từ serotype 1 đến serotype 21) đã được báo cáo. Tấc cả các serotype đều
phản ứng đặc hiệu với kháng huyết thanh, ngoại trừ serotype 5 có phản ứng chéo
với serotype 2 và serotye 9 (Loh và cs, 1992; Sandhu và Harry, 1981).
Subramaniam và cộng sự (2000), đã chèn gien protein màng (Omp A) của RA để
mã hóa protein màng kháng nguyên đặc hiệu (42 kDa). Tấc cả các chủng của RA
đều chứa gien Omp A, mặc dù, một vài sự khác biệt về gien cũng đã được quan sát
trên các chủng khác nhau. Hu và cộng sự (2011) đã chứng minh Omp A là yếu tố
độc lực của RA. Hầu hết các chủng RA đều chứa plasmids (3,9 b) mang các gien
protein. (thêm hình cấu trúc RA)
2.2.2 Đặc điểm nuôi cấy
RA phát triển tốt trong môi trường thạch chocolate, thạch máu và trypticase
soy agar. Để RA phát triển tốt cần bổ sung thêm 0,05 % chiết xuất men bia và 5 %
huyết thanh bê con mới sinh. Sự phát triển của RA sẽ tốt hơn nếu tăng thêm carbon
dioxide (Graham, 1938). Vi sinh vật phát triển tối ưu sau 48-72 giờ nuôi cấy ở 37 0C
trong bình nuôi cấy khi được cung cấp đầy đủ carbon dioxide và ẩm độ. RA không
phát triển ở nhiệt độ quá 55 0C hoặc dưới 4 0C.
2.2.3 Sức đề kháng
Hầu hết các chủng RA không sống sót trong môi trường rắn (solid media)
quá 3-4 ngày ở 37 0C hoặc nhiệt độ phòng, 12-16 giờ ở 55 0C (Bangun và cs, 1981).
Ngược lại, RA có thể tồn tại 2-3 tuần ở nhiệt độ 4 0C trong môi trường nước luộc
thịt. RA nhạy cảm với một số kháng sinh như: penicillin, novobiocin,
chloramphenicol, lincomycin, enrofloxacin, ceftiofur, streptomycin, erythromycin,
ampicillin, bacitracin, neomycin và tetracycline nhưng rất đề kháng với kanamycin,
polymyxin (Bangun và cs, 1981; Chang, 2003) và gentamycin.
2.2.4 Đặc điểm dịch tễ
Bệnh do RA xảy ra trên toàn thế giới và được công bố ở trên nhiều quốc gia
có nền chăn nuôi vịt thâm canh. Sự phức tạp của căn bệnh phụ thuộc vào nhiều yếu

tố như: chủng vi khuẩn, tuổi của vật chủ và đường truyền lây (Heddleston, 1972;
Sarver và 2005). RA được mô tả đầu tiên trên vịt và ngỗng. Sau đó, được báo cáo


trên gà tây (Sarver, 1977; Zehr, 1970), chim trĩ (Bruner, 1970), gà (Rosenfeld,
1973), cút (Pascucci, 1989) và heo (Hinz, 1998).
Vịt từ 1-8 tuần tuổi nhạy cảm cao với mầm bệnh. Vịt nhỏ hơn 5 tuần tuổi
thường chết trong 1-2 ngày sau khi xuất hiện các triệu chứng lâm sàng. Tuổi vịt lớn
hơn thường có thời gian sống sót lâu hơn. Bệnh do RA hiếm khi xảy ra trên vịt đẻ.
Mầm bệnh truyền lây trực tiếp và gián tiếp. RA truyền lây trực tiếp qua
đường hô hấp (Layton, 1984), gián tiếp qua các vết thương trên da thông qua trung
gian các chất độn chuồng nhiễm mầm bệnh (Asplin, 1955). Vi khuẩn xâm nhập qua
các vết trầy xước, vết nứt hay các vết thương trên da hoặc các điểm ở cánh. Vịt
cũng có thể bị nhiễm mầm bệnh qua phân vào thức ăn, nước uống hay môi trường,
nơi vịt nhiễm RA mãn tính là nguồn lây bệnh lâu dài trong trại. Thời gian ủ bệnh
thường từ 2-5 ngày. Sự gây nhiễm thí nghiệm bằng cách tiêm dưới da hoặc trong da
có biểu hiện lâm sàng đặc trưng của bệnh, tỷ lệ tử vong cao và sớm sau 24 giờ.
Ngược lại, gây nhiễm qua đường miệng hoặc hô hấp thì tỷ lệ tử vong thấp hơn
(Asplin, 1956; Hatfield, 1988; Sarver, 2005).
2.2.5 Triệu chứng lâm sàng
Các dấu hiệu lâm sàng thường được quan sát thấy với các biểu hiện: ủ rũ,
chảy nước mắt, nước mũi, ho, hắc hơi, sốt và thở nhanh. Vịt tiêu chảy phân xanh.
Ngoài ra, vịt còn bị thất điều vận động, bơi chèo, quẹo cổ, run đầu và hôn mê. Vịt
chết do nhiễm trùng huyết và nhiễm độc tố huyết. Tùy thuộc vào đặc tính gây bệnh
của vi khuẩn, tỷ lệ bệnh biến động từ 5-75 %, tỷ lệ chết thường cao hơn. Những con
vịt sống sót thường còi cọc hay chậm lớn (Pickrell, 1966).

Hình 2.3 Vịt hư hại lông, chảy nước

Hình 2.4 Vịt bị thất điều vận động,

mắt, nước mũi.
( />_Tren_Vit.pdf)

nằm ngửa và bơi chèo.
( />
2.2.6 Bệnh tích
2.2.6.1 Bệnh tích đại thể
Các tổn thương đại thể chủ yếu là sự tiết dịch có sợi huyết trên một số cơ
quan như: tim, gan hay túi khí. Tình trạng viêm bao tim và có dịch thẩm xuất biểu
hiện qua tình trạng: bao tim trắng đục lúc mới phát, ở giai đoạn sau, bao tim khô có
nhiều sợi huyết. Các tổn thương thường kết hợp với xuất huyết lấm tấm. Gan bị
viêm được bao phủ bởi một lớp trắng đục và không bám dính vào các cơ quan khác.
Lách phì đại trung bình, dạng dài ra, hơi mất màu và bề mặt có dạng đá hoa cương.
Ở thể thần kinh, vịt bị viêm màng não có sợi huyết. Đường đi của mạch nổi lên và
thường biểu hiện rõ ở vùng phù nề. Ở giai đoạn cuối, tấc cả các cơ quan nội tạng
đều được bao phủ bởi lớp sợi huyết. Ngoài ra, có thể gặp tình trạng viêm khớp có
mủ trên vịt bệnh.

Hình 2.5 Các bệnh tích đại thể phổ biến trên vịt nhiễm RA
(a) Viêm màng bao tim, tích fibrin
(b) Viêm màng bao gan


(c) Túi khí viêm dày đục và xuất huyết
(d) Viêm xuất huyết khớp chân
(e) Lách sưng, bề mặt như đóa hoa cương
(Nguồn: Hess và cs, 2013)
2.2.6.2 Bệnh tích vi thể

Bao tim tích dịch có sợi huyết chứa một số tế bào viêm, các tế bào đơn nhân
và bạch cầu trung tính. Ở thể quá cấp, mô cơ tim bị hoại tử điểm nghiêm trọng. Ở
mô gan, có sự xâm lấn nhẹ các bạch cầu đơn nhân ở rìa và sự thoái hoái các tế bao
nhu mô. Ở thể cấp tính, sự xâm lấn các tế bào bạch cầu ở rìa cũng có thể được quan
sát thấy (Pickrell, 1966). Ở túi khí, các tế bào đơn nhân chiếm đa số trong dịch tiết.
Trong khi đó, các tế bào đa nhân khổng lồ và các nguyên sợi bào có thể được quan
sát thấy ở thể mãn tính (Dougherty, 1955). Đường hô hấp cũng bị nhiễm RA nhưng
không có biểu hiện lâm sàng. Phổi có thể không bị ảnh hưởng. Chỉ có sự xâm lấn
nhẹ các tế bào và sự gia tăng nhanh chóng các nốt lympho gần tiểu phế quản
(Pickrell, 1966) hoặc viêm phổi tiết dịch sợi huyết có mủ (Graham, 1938). Hệ thống
thần kinh trung ương có thể tạo sợi huyết và viêm màng não với sự xâm lấn các tế
bào lympho ở trong hoặc xung quanh mạch máu não (Jortner và cs, 1969). Sự hoại
tử các mô lympho và sự suy kiệt các lympho bào cũng được mô tả ở lách và túi
bursa fabricius (Sarver, 2005).


Hình 2.6 Các bệnh tích vi thể phổ biến trên vịt nhiễm RA
(a) Màng bao tim lấp đầy tế bào đơn nhân và các bạch cầu hạt bắt màu lưỡng tính
(b) Viêm màng não lấp đầy tế bào viêm
(c) Viêm vùng mô dưới da lấp đầy bạch cầu trung tính
(d) Các tế bào đơn nhân và bạch cầu hạt nhuộm màu lưỡng cực ở vùng gân gót Asin
(Nguồn: Hess và cs, 2013)
2.2.7 Chẩn đoán
Phân lập và xác định RA: Hầu hết vi khuẩn có thể được phân lập nhanh để
chẩn đoán bệnh trong trường hợp bệnh cấp tính. Các mẫu mô thường được sử dụng
gồm: não, máu tim, túi khí, tủy xương, phổi, gan và dịch tiết các tổn thương. Các
phản ứng trung hòa và phản ứng AGP cũng được sử dụng để xác định các serotype
của RA với kháng huyết thanh đặc hiệu. Thử phản ứng sinh hóa cũng là một trong
những phương pháp chẩn đoán phổ biến. Ngoài ra, các phản ứng phân tử cũng được
sử dụng để xác định các chủng RA và nghiên cứu về dịch tễ của bệnh như: PCR

(Christensen, 2010; Yu, 2008), multiplex PCR (Hu, 2011), LAMP (Han, 2011;
Zheng, 2011).


Chẩn đoán huyết thanh học: Phản ứng miễn dịch huỳnh quang có thể được
sử dụng để xác định RA trong mẫu mô bệnh hoặc dịch tiết từ vịt bệnh (Marshall,
1961). Phản ứng ngưng kết và ELISA có thể được sử dụng để phát hiện kháng thể
trong huyết thanh. ELISA thì nhạy hơn so với phản ứng ngưng kết (Hatfield, 1987;
Lobbedey, 2003).
2.2.8 Chẩn đoán phân biệt
RA nên được chẩn đoán phân biệt với các bệnh gây nhiễm trùng huyết khác
như: P.multocida, E.coli, Salmonella, Streptococcus faecium. Nếu chỉ dựa vào triệu
chứng và bệnh tích đại thể rất khó để chẩn đoán phân biệt được các bệnh này, cần
phải phân lập và xác định căn nguyên gây bệnh chính xác.
2.2.9 Phòng và điều trị
Những vấn đề quan trọng nhất trong việc ngăn ngừa RA là thực hiện an toàn
sinh học, quản lý và thực hành vệ sinh trong chăn nuôi. Chuồng trại thông thoáng,
giảm các yếu tố có nguy cơ gây stress cao như mật độ đông đúc, nhiệt độ quá nóng
hoặc quá lạnh. Nền hoặc sàn nuôi, các dụng cụ thiết bị cần được vệ sinh định kỳ...
Hiện nay, có cả hai loại vắc-xin được sử dụng để phòng bệnh do RA trên vịt,
bao gồm: vắc-xin chết và vắc-sống nhược độc. Vắc-xin chết có thể ngăn ngừa và
làm giảm tỷ lệ tử vong do RA (Harry, 1979; Layton, 1984; Sandhu, 1979). Vắc-xin
chết chứa serotype 1, 2 và 5 được sử dụng ở Mỹ và Canada. Vịt con được chủng
vắc-xin lúc 2-3 tuần tuổi cho đáp ứng miễn dịch bảo vệ đến khi xuất thịt (Layton,
1984). Trong khi đó, vắc-xin sống chứa serotype 1, 2 và 5 cũng đã được sử dụng
cho vịt 1 ngày tuổi bằng cách phun sương hoặc cho uống (Sandhu, 1991). Miễn
dịch có thể bảo vệ vịt tới 42 ngày tuổi. Vịt đẻ có thể sử dụng cả vắc-xin sống và
vắc-xin chết để tạo đáp ứng miễn dịch cho vịt con đến 2-3 tuần tuổi thông qua
kháng thể mẹ truyền (Sandhu, 1992). Tuy nhiên, ở Việt Nam vẫn chưa có vắc-xin
phòng bệnh do RA trên vịt.

Sự đề kháng kháng sinh của RA thay đổi theo thời gian (Zhong, 2009).
Kháng sinh và các sulfamides là những hoạt chất được chứng minh có tác dụng tốt
trong điều trị bệnh do RA (bảng ...)


Bảng 2.1 Một số kháng sinh và sulfamides sử dụng trong điều trị bệnh do RA
Tên
Sulfamethazine
Sulfaquinoxaline
Novobiocin
Lincomycin
Penicillin
Enrofloxacin
Ceftiofur
Sulfadimethoxine + Ormetoprim
Penicillin + Streptomycin
Lincomycin + Spectinomycin

Hàm lượng hoặc
liều sử dụng
0,2-0,25%
0,025-0,05%
0,0303-0,0368%
0,011-0,022%

Đường cấp thuốc

Uống hoặc trộn thức ăn
Trộn thức ăn
Trộn thức ăn

Trộn thức ăn
Tiêm dưới da
50 ppm ngày đầu Pha nước uống
tiên và 25 ppm 4
ngày tiếp theo
2 mg/kgP
Tiêm dưới da
0,02-0,12%
Trộn thức ăn
Tiêm dưới da
Tiêm dưới da
(theo Ruiz và Sandhu, 2013)

Mức độ đề kháng cao với RA trên một số kháng sinh đã được chứng minh
với các tỷ lệ lần lượt gồm: oxacillin (88,6 %), penicillin G (86,9 %),
sulfamethoxazole/trimethoprim (79,2 %), ceftazidime (75,9 %). Mức độ đề kháng
thấp hơn ở amikacin (9,5 %), neomycin (9,5 %).
2.4 Các công trình nghiên cứu về Circovirus ở vịt trên thế giới và Việt Nam
Sau khi Hattermann và cộng sự (2003) đã có những mô tả đầu tiên về các
đặc điểm, hình thái, cấu trúc của Circovirus trên hai vịt mái Mulard 6 tuần tuổi ở
Đức. Hàng loạt các nghiên cứu về triệu chứng, bệnh tích mà đặt biệt là các phương
pháp chẩn đoán bệnh do Circovirus góp phần làm sáng tỏ và chẩn đoán nhanh mầm
bệnh. Những nghiên cứu đó, đóng góp chung vào việc phòng và chống bệnh hiệu
quả, đem lại lợi ích to lớn cho ngành chăn nuôi và công tác thú y trên thế giới.
Fringuelli và cộng sự (2005) đã ứng dụng phương pháp PCR truyền thống
và real time PCR trong chẩn đoán DuCV. Kết quả cho thấy, DNA DuCV được phát
hiện ở 85/104 mẫu fabricius (84 %) từ mẫu vịt bệnh hoặc chết ở lứa tuổi 1 đến 12
tuần tuổi và 35/37 trại (94 %) dương tính với DuCV. Ngoài ra, tác giả cũng đánh giá
phương pháp real time PCR có độ nhạy cao hơn so với phương pháp PCR truyền
thống.

Jiang và cộng sự (2008) báo cáo: đã sử dụng phương pháp PCR để phát hiện
và giải trình tự gien của DuCV trên vịt Muscovy bệnh ở tỉnh Fujian , Trung Quốc.
Theo đó, tỷ lệ mẫu dương tính là 79 %, có 10/12 trại dương tính với DuCV. Tác giả
sử dụng phương pháp PCR để giải trình tự gien cho biết tỷ lệ tương đồng của DuCV
được phân lập ở tỉnh Fujian (FJ0601) là 97,3-97,5 % so với 4 chủng được phân lập
Đài Loan (TC1/2002, TC2/2002, TC3/2002, TC4/2002), 82,9 % so với chủng được
phân lập ở Mỹ và 82,3 % chủng được phân lập ở Đức. Phân tích trình tự gien của
DuCV cho thấy genome hoàn chỉnh có độ dài 1988 bp.
Sự nhiễm ghép của DuCV với các tác nhân khác như: E.Coli, P. multacida,
Riemerella anatipestifer hay viêm gan vịt đã được mô tả. Các nghiên cứu của Zhang
và cộng sự (2009) đã sử dụng phương pháp PCR để điều tra tỷ lệ nhiễm ghép của
DuCV với RA, E.coli và DHV1 trên vịt Cherry Valley ở tỉnh Shangdong, Trung
Quốc. Theo đó, tỷ lệ vịt chỉ nhiễm DuCV là 33,29%. So sánh tỷ lệ vịt dương tính và
âm tính với DuCV khi nhiễm ghép với RA lần lượt là: 23,4 % và 8,28 %; với E.coli
là 16,19 % và 4,85 % và DHV1 là: 25,5 % và 7,47 %.
Sau đó, Cha và cộng sự (2012) cũng đã đánh giá tỷ lệ nhiễm ghép giữa
DuCV với RA và Salmonella trên vịt được nuôi ở Hàn Quốc. Tỷ lệ vịt chỉ nhiễm
Circovirus là 10,9 %. Trong khi đó, tỷ lệ nhiễm ghép giữa DuCV với RA,
Salmonella hay DuCV với RA và Salmonella lần lượt là: 4,1 %, 5 % hay 1,4 %.
Chúng tôi nhận thấy trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về các
đặc điểm của bệnh cũng như vi-rút gây bệnh, trong đó, có các công trình về chẩn
đoán DuCV. Nhưng tại Việt Nam chưa có nhiều mô tả về bệnh, sự đánh giá về khả
năng nhiễm ghép giữa DuCV và các tác nhân khác, cũng như ứng dụng phương
pháp PCR trong chẩn đoán nhanh DuCV.


Chương 3
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm
Đề tài nghiên cứu được tiến hành từ tháng 05/2015 đến tháng 05/2016 trên
các trại vịt siêu thịt nhập ngoại thuộc các huyện Trảng Bom, Thống Nhất và Gia
Kiệm, tỉnh Đồng Nai. Các xét nghiệm mẫu bệnh phẩm được thực hiện tại phòng
Bệnh lý, xét nghiệm PCR tại phòng xét nghiệm PCR, Bệnh viện Thú y - Khoa Chăn
nuôi Thú y, trường đại học Nông Lâm TP.HCM.
3.2 Đối tượng nghiên cứu
Vịt siêu thịt nhập ngoại ở các lứa tuổi: vịt Grimaud star (Pháp), vịt Super
Meat...
Bệnh do Circovirus và bệnh bại huyết do Riemerella anatipestifer trên vịt.
3.3 Nội dung nghiên cứu
Luận văn có 2 nội dung nghiên cứu chính:
- Đánh giá sự lưu hành của DuCV trên đàn vịt nuôi.
- Đánh giá mức độ đồng nhiễm giữa DuCV với RA trên vịt.
3.4 Phương pháp và vật liệu nghiên cứu
3.4.1 Đánh giá sự lưu hành của DuCV trên đàn vịt nuôi


3.4.1.1 Phương pháp quan sát, thống kê
Chúng tôi tiến hành điều tra thu thập thông tin trại theo phương pháp cắt
ngang, một số thông tin theo phương pháp hồi cứu từ các chủ trại hoặc kỹ thuật viên
chính. Vịt nhiễm Circovirus thường không có biểu hiện lâm sàng đặc trưng. Do đó,
chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên những con vịt chết rãi rác (không quá 5 giờ) và một
số lượng nhỏ vịt có biểu hiện chậm lớn, còi cọc hoặc bất bình thường trong sự phát
triển của bộ lông (xơ xác, chậm mọc lông hoặc hư hại vùng lông dọc sống lưng).
Các dữ liệu được chúng tôi thu thập và thống kê theo mẫu điều tra (xem phụ lục 1).
3.4.1.2 Phương pháp bố trí thu thập vịt và phương pháp mổ khám
* Bố trí điều tra và lấy mẫu: Chúng tôi bố trí thu thập vịt để mổ khám theo
phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên ở 3 huyện: Trảng Bom, Thống Nhất và Gia Kiệm,
tỉnh Đồng Nai. Số lượng trại khảo sát và số mẫu dự kiến như sau:

Bảng 3.1 Số lượng trại khảo sát và số mẫu dự kiến
Huyện

Số trại dự

Số vịt dự kiến lấy

Tổng số vịt lấy

Giai đoạn

kiến khảo

trong mỗi trại (con)

mẫu (con)

tuổi (tuần)

2-5

120 - 300

0-8

sát (trại)
Trảng
Bom
Gia Kiệm
Thống

nhất

20
20
20

* Bố trí lấy mẫu mổ khám theo tuổi vịt
Các mẫu vịt được chúng tôi bố trí thu thập để mổ khám theo các lứa tuổi như
sau: < 2 tuần, 2-4 tuần, 4-6 tuần, 6-8 tuần.
* Phương pháp mổ khám và thu thập mẫu
Mẫu vịt thu thập sẽ được chúng tôi tiến hành mổ khám tại chỗ hoặc đưa vịt
(còn sống hoặc chết không quá 5 giờ) về phòng mổ khám, Bệnh viện Thú y trường
đại học Nông Lâm TP.HCM. Chúng tôi tiến hành mổ khám vịt theo phương pháp
mổ khám toàn diện của ngành thú y - Cục Thú y (2006).