Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất n hydroxybenzamid mang khung 2 oxoindolin và cầu nối triazol

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THÙY DƢƠNG

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA
MỘT SỐ DẪN CHẤT N-HYDROXYBENZAMID
MANG KHUNG 2-OXOINDOLIN
VÀ CẦU NỐI TRIAZOL

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI - 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THÙY DƢƠNG

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA
MỘT SỐ DẪN CHẤT N-HYDROXYBENZAMID
MANG KHUNG 2-OXOINDOLIN
VÀ CẦU NỐI TRIAZOL

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƢỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC
MÃ SỐ: 60720402

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. TS. Đào Thị Kim Oanh
2. ThS. Trần Thị Lan Hƣơng

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn tận tình
và nhiều giúp đỡ quý báu của các thầy cô, đồng nghiệp, gia đình và bạn bè.
Từ tận đáy lòng mình, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sự biết ơn sâu sắc
tới TS. Đào Thị Kim Oanh và ThS. Trần Thị Lan Hƣơng, những ngƣời thầy đã
chỉ dẫn tôi tận tình và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị em làm việc và thực hiện đề tài tại bộ
môn Hóa dƣợc, đặc biệt là Ds. Đỗ Thị Mai Dung và em Lê Văn Cƣờng đã ủng hộ
và giúp đỡ tôi rất nhiệt tình trong suốt quá trình nghiên cứu.
Tôi cũng nhận đƣợc sự phối hợp và giúp đỡ từ các cán bộ làm việc tại Khoa
Hóa – trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học quốc gia Hà Nội, Viện Hóa học
các hợp chất tự nhiên, Viện hóa học Việt Nam, Viện Khoa học và Công Nghệ Việt
Nam, cùng toàn thể các thầy cô trong các phòng, ban, thƣ viện. Tôi xin chân thành
cảm ơn.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bè bạn – những
ngƣời luôn sát cánh, động viên và khích lệ tôi trong cuộc sống và học tập.
Hà Nội, ngày 31 tháng 03 năm 2016

Học viên

Nguyễn Thị Thùy Dương


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN .........................................................................................2
1.1. HISTON DEACETYLASE ..............................................................................2
1.1.1. Khái niệm, phân loại ...................................................................................2
1.1.2. Cấu trúc của HDAC ....................................................................................4
1.2.3. Mối liên quan giữa ung thƣ và sự bất thƣờng hoạt động của HDAC .........4
1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC ..........................................................................5
1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC ................................................................5
1.2.2. Cơ chế tác dụng...........................................................................................8
1.2.3. Liên quan cấu trúc - tác dụng của các chất ức chế HDAC .........................8
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VỀ CÁC ACID HYDROXAMIC
ỨC CHẾ HDAC .....................................................................................................10
1.4. NGHIÊN CỨU VỀ TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ CỦA CÁC TRIAZOL .20
1.5. NGHIÊN CỨU VỀ TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ CỦA CÁC ISATIN .....23
Chƣơng 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................................................................26
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ ..................................................................26
2.1.1. Hóa chất ....................................................................................................26
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ .......................................................................................26
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ...........................................................................27
2.2.1. Tổng hợp hóa học .....................................................................................27
2.2.2. Thử tác dụng sinh học của các dẫn chất tổng hợp đƣợc ...........................28
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................28
2.3.1. Phƣơng pháp tổng hợp hóa học ................................................................28

2.3.2. Phƣơng pháp thử tác dụng sinh học ..........................................................29
Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ........................................................33


3.1. HÓA HỌC .......................................................................................................33
3.1.1. Tổng hợp hóa học .....................................................................................33
3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết ...............................................................................44
3.1.3. Khẳng định cấu trúc ..................................................................................44
3.2. HOẠT TÍNH SINH HỌC ...............................................................................49
3.2.1. Tác dụng ức chế HDAC ............................................................................49
3.2.2. Hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro ....................................................50
3.3. NGHIÊN CỨU DOCKING ............................................................................50
Chƣơng 4. BÀN LUẬN ...........................................................................................52
4.1. TỔNG HỢP HÓA HỌC .................................................................................52
4.2. KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC ..........................................................................53
4.2.1. Phổ hồng ngoại .........................................................................................53
4.2.2. Phổ khối ....................................................................................................54
4.2.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân .....................................................................55
4.3. HOẠT TÍNH SINH HỌC ...............................................................................57
4.3.1. Tác dụng ức chế HDAC2 ..........................................................................57
4.3.2. Tác dụng thử hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ.........................................58
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................61
1. KẾT LUẬN ........................................................................................................61
2. KIẾN NGHỊ .......................................................................................................62
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

13
1

C – NMR

: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C

H – NMR

: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H

AsPC-1

: Tế bào ung thƣ tụy ngƣời

Dd

: Dung dịch

HAT

: Histon acetyltranferase

HDAC

: Histon deacetylase

HDI, HDIs

: Histon deacetylase Inhibitor(s)

IR

: Phổ hồng ngoại

MCF-7

: Tế bào ung thƣ vú ngƣời

MS

: Phổ khối lƣợng

NCI-H460

: Tế bào ung thƣ phổi ngƣời

NST

: Nhiễm sắc thể

PC-3

: Tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến

Rt

: Nhiệt độ phòng

SAHA

: Acid suberoylanilid hydroxamic

SKLM

: Sắc ký lớp mỏng

SW620

: Tế bào ung thƣ đại tràng

TSA

: Trichostatin A


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1:

Enzym HDAC: phân loại, số lƣợng acid amin, vị trí, chức năng sinh
lý và cấu trúc tinh thể ............................................................................. 3

Bảng 1.2:

Một số chất ức chế HDAC đang đƣợc thử lâm sàng ............................... 7

Bảng 1.3:

Khả năng ức chế HDAC của các saccarin của N-hydroxybenzamid .... 16

Bảng 1.4:

Tác dụng ức chế HDAC và tế bào ung thƣ Hela của N-hydroxy-4(4-(2-(3-methoxy-4-(thiophen-2yloxy)phenyl)acetamido)phenethyl)benzamid ...................................... 17

Bảng 1.5:

Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học của chất của 7a-d ......................... 18

Bảng 1.6:

Kết quả đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro của Nhydroxybenzamid có vòng indon. ......................................................... 19

Bảng 3.1:

Giá trị Rf và Tonc của các chất IVa-f .................................................... 44

Bảng 3.2:

Số liệu phân tích phổ IR của IVa-f ....................................................... 45

Bảng 3.3:

Số liệu phân tích phổ khối lƣợng của các chất IVa-f ............................ 46

Bảng 3.4:

Số liệu phân tích phổ 1H-NMR ............................................................. 47

Bảng 3.5:

Số liệu phân tích phổ 13C-NMR ............................................................ 48

Bảng 3.6:

Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất IVa-f bằng
phƣơng pháp huỳnh quang .................................................................... 49

Bảng 3.7:

Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ in vitro của các chất
IVa-f ...................................................................................................... 50

Bảng 3.8:

Kết quả docking của các chất IVa-f với HDAC2 ................................. 51

Bảng 4.1.

So sánh hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của 2 dãy IVa-f và 20a-f ..... 60


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1:

Vai trò sinh học của các HDAC trong hoạt động tế bào ung thƣ ............5

Hình 1.2:

Điều hòa sự phát triển và sống sót của tế bào bởi các chất ức chế HDAC ..........8

Hình 1.3:

Liên quan cấu trúc – tác dụng của các chất ức chế HDAC dẫn chất acid
hydroxamic ............................................................................................10

Hình 1.4:

HDIs có cấu trúc acid hydroxamic ........................................................11

Hình 1.5:

Các acid phenylthiazol hydroxamic tƣơng tự SAHA............................12

Hình 1.6:

Một số acid phenylthiazol hydroxamic .................................................13

Hình 1.7:

Các dẫn chất acid biphenyl-hydroxamic ...............................................13

Hình 1.8:

Các acid isoxazol-hydroxamic ..............................................................15

Hình 1.9:

Các triazol-hydroxamic .........................................................................16

Hình 1.10: Công thức của CRA-024781/ PCI-24781/Abexinostat .........................19
Hình 1.11: Các nucleosid có vòng triazol ...............................................................21
Hình 1.12: Các chất kết hợp giữa 3-phenylpyrazolopyrimidin và 1,2,3-triazol ......21
Hình 1.13: Các 4-aryl-5-cyano-2H-1,2,3-triazol .....................................................22
Hình 1.14: Các phân tử nhỏ giống Lavendustin ......................................................22
Hình 1.15: Các chất kết hợp giữa 2,3,4,6-tetra-O-acetyl- β-D -glucopyranosyl azid
với propynyl 3-[3-(aryl)-1,2,4-oxadiazol-5-yl] propionat . ...................23
Hình 3.1:

Mô hình tƣơng tác của IVd với HDAC2 ..............................................51

Hình 4.1:

Phổ hồng ngoại của IVe ........................................................................54


DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1:

Tổng hợp các acid isoxazol-hydroxamic ..............................................14

Sơ đồ 1.2:

Tổng hợp acid triazol-hydroxamic .......................................................15

Sơ đồ 1.3:

Tổng hợp các 4-aryl-1,2,3-triazol .........................................................20

Sơ đồ 2.1:

Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất Nhydroxybenzamid mang khung 2-oxoindolin và cầu nối triazol. .........28

Sơ đồ 3.1:

Sơ đồ phản ứng tổng hợp chất IVa.......................................................33

Sơ đồ 3.2:

Quy trình tổng hợp chất IIa ..................................................................33

Sơ đồ 3.3:

Quy trình tổng hợp chất IIIa ................................................................34

Sơ đồ 3.4:

Quy trình tổng hợp chất IVa ................................................................35

Sơ đồ 3.5.

Quy trình tổng hợp chất IVb. ...............................................................36

Sơ đồ 3.6:

Quy trình tổng hợp chất IVc .................................................................38

Sơ đồ 3.7:

Quy trình tổng hợp chất IVd ................................................................39

Sơ đồ 3.8:

Quy trình tổng hợp chất IVe .................................................................41

Sơ đồ 3.9:

Quy trình tổng hợp chất IVf .................................................................42

Sơ đồ 4.1:

Cơ chế phản ứng Click .........................................................................52

Sơ đồ 4.2:

Cơ chế phản ứng tạo thành IVa-f………….…………………………53


ĐẶT VẤN ĐỀ
Histon deacetylase (HDAC) và histon acetyltransferase (HAT) là các enzym
quan trọng tham gia vào quá trình điều hoà biểu hiện gen. Nhiều nghiên cứu cho
thấy sự huy động quá mức các HDAC có khả năng gây nên các sai lệch trong quá
trình phiên mã, làm kích thích sự phát triển của các tế bào ung thƣ [23, 53]. Do đó,
các HDAC là mục tiêu phân tử hấp dẫn cho nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung
thƣ hiện nay [21, 29, 47]. Trong số các loại chất ức chế HDAC đã đƣợc tổng hợp và
công bố cho đến nay, các dẫn xuất của acid hydroxamic có hoạt tính tốt, đặc biệt
một dẫn xuất acid hydroxamic - acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA, Zolinza®),
đã đƣợc FDA phê duyệt năm 2006 cho điều trị u lympho da tế bào T (CTCL).
Nhiều nghiên cứu đã tập trung vào các N-hydroxybenzamid, trong số đó có

nhiều hợp chất có tác dụng ức chế HDAC mạnh [9, 20, 21, 32, 53]. Các nhà khoa
học cũng nhận ra nhiều hợp chất chứa vòng indolin trong tự nhiên hoặc tổng hợp
hóa học, mà đặc biệt là các isatin thể hiện tác dụng nổi bật trong điều trị ung thƣ
trên lâm sàng [29, 32]. Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng dị vòng
1,2,3-triazol có tác dụng trên nhiều tế bào ung thƣ ở mức độ in vitro [6].
Do đó, với mục đích thiết kế các N-hydroxybenzamid có vòng indolin nhƣ một
nhóm khóa hoạt động và cầu nối triazol, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất N-hydroxybenzamid
mang khung 2-oxoindolin và cầu nối triazol” với 2 mục tiêu chính:
1. Tổng hợp đƣợc một số dẫn chất N-hydroxybenzamid mang khung 2oxoindolin và cầu nối triazol.
2. Thử tác dụng ức chế enzym histon deacetylase và tác dụng gây độc tế bào của
các dẫn chất tổng hợp đƣợc trên một số dòng tế bào ung thƣ ngƣời.

1


Chƣơng 1. TỔNG QUAN

1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC)
1.1.1. Khái niệm, phân loại
Histon là các protein cơ bản cấu tạo nên nhiễm sắc thể, trong đó bốn cặp histon
(H2A, H2B, H3 và H4) tạo nên lõi protein của nucleosom. Các cặp histon lõi có 2
phần quan trọng: đuôi C nằm bên trong lõi và đầu N nằm bên ngoài nucleosom. Đầu
amin này mang nhiều điện tích dƣơng nên tƣơng tác mạnh với phần phosphat mang
điện âm trên phân tử ADN tạo nên cấu trúc nucleosom và các cấu trúc bậc cao hơn
của nhiễm sắc thể.
Việc tích điện dƣơng của histon mạnh hay yếu thông qua quá trình acetyl hóa
đầu amin ở phần đuôi của histon. Ở dạng deacetyl hóa, histon tích điện dƣơng lớn,
tƣơng tác điện tích với ADN mạnh làm đóng xoắn nhiễm sắc thể gây ức chế quá
trình dịch mã và tổng hợp protein, ức chế sự biểu hiện gen. Ngƣợc lại, khi bị acetyl

hóa, điện tích dƣơng bị trung hòa, nhiễm sắc thể đƣợc tháo xoắn, quá trình tổng hợp
protein diễn ra và đặc tính của gen đƣợc biểu hiện. Trong tế bào, quá trình acetyl
hóa này đƣợc điều hòa bởi 2 enzym: histon acetyltranferase (HAT) và histon
deacetylase (HDAC) [2, 17, 26, 43].
Hiện nay ngƣời ta đã biết đến 18 HDAC, chia làm 4 nhóm (bảng 1.1). Nhóm
I, II và IV gồm 11 thành viên, đƣợc coi là những HDAC “kinh điển” là những
enzym phụ thuộc Zn2+. Vị trí xúc tác của chúng có dạng túi với một ion Zn2+ ở
đáy nên những enzym này có thể bị ức chế bởi các hợp chất tạo chelate với Zn2+
nhƣ các acid hydroxamic. Ngƣợc lại nhóm III là những sirtuin không bị ức chế
bởi những hợp chất nhƣ vậy vì chúng có cơ chế hoạt động khác là phụ thuộc vào
NAD+ [34].

2


Bảng 1.1: Enzym HDAC: phân loại, số lượng acid amin, vị trí, chức năng sinh lý
và cấu trúc tinh thể
Phụ thuộc Zn2+
Nhóm

I

IIA

HDAC1
HDAC2
HDAC3
HDAC8
HDAC4

Số lƣợng
acid amin
483
488
428
377
1084

HDAC5

1122

Thành viên

HDAC7

912

HDAC9

1069

HDAC6

1215

HDAC10
HDAC11

669

347

SIRT1

747

SIRT2
SIRT3
SIRT4
SIRT5

389
399
314
310

SIRT6

355

SIRT7

400

IIB
IV

III

Vị trí

Chức năng sinh lý

Nhân TB
Nhân TB
Sự sống và phát triển của tế bào
Nhân TB
Nhân TB
Nhân TB/ Quy định sự hình thành xƣơng
Bào tƣơng
và glucose trong cơ thể
Nhân TB/ Sự phát triển và chức năng tim
Bào tƣơng mạch, tổng hợp glucose, chức
năng của tế bào nội mô
Nhân TB/ Biệt hóa tế bào miễn dịch, tổng
Bào tƣơng
hợp glucose
Nhân TB
Biệt hóa tế bào miễn dịch, sự
Bào tƣơng
phát triển và chức năng tim
mạch
Bào tƣơng Kiểm soát động học quá trình
phân bào
Bào tƣơng
Tái tổ hợp tƣơng đồng
Nhân TB
Sao chép AND
+
Phụ thuộc NAD

Nhân TB/
Điều hòa sự ô xy hóa và hệ
Bào tƣơng
thống tự miễn
Nhân TB
Thực bào
Ty thể
Chu trình u rê, quá trình chuyển
Ty thể hóa năng lƣợng, điều chỉnh ATP,
sự trao đổi chất, sự chết và
Ty thể
truyền tín hiệu tế bào.
Nhân TB
Quá trình chuyển hóa năng
lƣợng
Nhân TB
Sự chết của tế bào

3

X-ray
Crystal

Có

Có

Không
Có
Không

Có
Không
Không
Có
Có
Có
Không
Có
Có
Không


1.1.2. Cấu trúc của HDAC
Bằng phƣơng pháp kết tinh tạo tinh thể và chụp tia X ngƣời ta đã xác định
đƣợc cấu trúc 3D của một số HDAC và các trung tâm xúc tác phản ứng deacetyl của
chúng. Về cơ bản các HDAC có cấu trúc trung tâm hoạt động khá giống nhau,
chúng đều gồm các phần cơ bản sau:
- Ion Zn2+ là coenzym của HDAC nằm ở trung tâm xúc tác của chúng. Đây là
thành phần tham gia liên kết mạnh nhất với phần đuôi histon bằng liên kết phối trí.
Thông thƣờng các chất ức chế HDAC liên kết càng mạnh với Zn2+ thì tác dụng ức
chế HDAC và độc tính tế bào càng mạnh [35, 46, 50].
- Kênh enzym là nơi chứa đựng cơ chất và tham gia liên kết Van der Walls
với cơ chất. Kênh này có cấu trúc dạng túi hình ống hẹp, đƣợc cấu tạo bởi các acid
amin thân dầu đặc biệt là các acid amin có nhân thơm nhƣ: Phe, Tyr, Pro, His. Nó
có cấu trúc khá linh động có thể thay đổi kích thƣớc để phù hợp với cơ chất và tham
gia phản ứng deacetyl. Trên miệng túi có một vành nhỏ đƣợc tạo nên từ 1 vài vòng
xoắn protein (phần vành sẽ tƣơng tác với nhóm nhận diện bề mặt của HDAC). Đối
với các hợp chất acid hydroxamic chiều dài của kênh này là tối ƣu với khoảng 5-6
liên kết carbon [17, 46, 50].
1.2.3. Mối liên quan giữa ung thƣ và sự bất thƣờng hoạt động của HDAC

Nhƣ đã trình bày trong phần khái niệm, hoạt động của HDAC ảnh hƣởng tới
sự tích điện trên phần đầu amin của histon, từ đó gây tác động lên quá trình phiên
mã. Các sai lệch của quá trình phiên mã là một trong những nguyên nhân dẫn tới sự
hình thành khối u. Chẳng hạn, mối tƣơng quan giữa hoạt động của HDAC và sự tạo
thành khối u đƣợc thể hiện rõ nhất trong bệnh ung thƣ bạch cầu tiền tủy bào cấp
tính (APL). Những nghiên cứu trên phạm vi rộng đã chỉ ra rằng sự ức chế phiên mã
không thích hợp của HDAC là cơ chế phổ biến tạo ra các protein gây ung thƣ
(oncoprotein). Ngoài ra trong các tế bào ung thƣ ngƣời ta còn thấy sự hoạt động quá
mức của HDAC nhƣ ung thƣ buồng trứng (HDAC1-3), ung thƣ dạ dày (HDAC2);
ung thƣ phổi (HDAC1) [18, 24].

4


Các nghiên cứu có ý nghĩa thống kê đã chỉ ra rằng các HDAC liên quan đến
nhiều giai đoạn điều hòa cơ bản của quá trình sinh học trong tế bào ung thƣ nhƣ chu
trình tế bào, sự biệt hóa, sự chết tế bào theo chƣơng trình, kể cả sự di chuyển, sự
xâm lấn và sự tạo mạch. Vai trò chức năng của các HDAC trong quá trình sinh học
của tế bào ung thƣ đƣợc tóm tắt ở hình 1.1 [10, 18, 24, 45].

Hình 1.1: Vai trò sinh học của các HDAC trong hoạt động tế bào ung thư
1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC
1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC
Các chất ức chế HDAC (HDIs) có thể phục hồi lại sự biểu hiện gen, ức chế
sự phát triển và sống sót của tế bào ung thƣ. Khả năng chống ung thƣ của các chất
ức chế HDAC bắt nguồn từ khả năng tác động lên nhiều chu trình tế bào đã bị biến
đổi ở các tế bào ung thƣ. Trong hầu hết các trƣờng hợp, sự hoạt hóa các chƣơng
trình biệt hóa, ức chế chu trình tế bào và thúc đẩy sự chết tế bào theo chƣơng trình
là chìa khóa cho tác dụng chống ung thƣ của HDIs. Thêm vào đó, sự hoạt hóa của
chuỗi phản ứng miễn dịch và sự ức chế tạo mạch cũng đóng vai trò quan trọng trong

tác dụng ức chế khối u in vivo của HDIs [26].
5


Một số chất ức chế HDAC đã đƣợc miêu tả là ức chế sự phát triển khối u
in vitro và in vivo mà có ít hoặc không có độc tính, và một vài chất đã đƣợc thử
nghiệm trong lâm sàng. Tất cả các HDIs đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng
đều ức chế sự tăng sinh của tế bào bị biến đổi trong nuôi cấy bằng cách làm giảm sự
ngắt quãng của chu trình tế bào, sự phân hóa và/hoặc sự gây chết tế bào theo
chƣơng trình, và ức chế sự phát triển của khối u ở các động vật mẫu.
Trichostatin A (TSA) là một trong những hợp chất hydroxamate tự nhiên đầu
tiên đƣợc phân lập từ xạ khuẩn Streptomyces hygroscopicus đã đƣợc tìm thấy có
khả năng ức chế HDACs tại IC50 dƣới 10 nM, có mức chọn lọc hơn 300 lần so với
lớp IIa [34, 39]. Bên cạnh đó một chất ức chế tổng hợp là acid suberoylanilid
hydroxamic (SAHA) đã đƣợc nghiên cứu và báo cáo cho thấy chúng ức chế sự phát
triển của tế bào, dẫn đến kết thúc sự biệt hóa và ngăn ngừa hình thành khối u trên
chuột. Năm 2006, SAHA (Vorinostat, Zolinza) đã đƣợc FDA cấp phép dùng trong
điều trị u lympho da tế bào T. Bảng 1.2 đề cập đến những chất ức chế enzym
HDAC khác cũng đang đƣợc thử nghiệm lâm sàng để sử dụng trong điều trị ung
thƣ, bao gồm 4 nhóm chính: các acid béo chuỗi ngắn, các acid hydroxamic, các
tetrapeptid vòng, các benzamid [33].
Mỗi nhóm có những hạn chế riêng: các acid hydroxamic bị chuyển hóa
nhanh và ức chế không chọn lọc các HDAC; các benzamid và các acid béo có hiệu
lực hạn chế; dẫn chất ceton bị khử hóa trong huyết tƣơng; trong khi các peptid vòng
có cấu trúc quá phức tạp [1].

6


Bảng 1.2: Một số chất ức chế HDAC đang được thử lâm sàng

Pha thử
Chất

Nhóm

Đích HDAC

nghiệm lâm
sàng

Vorinostat

Nhóm I, II, IV

FDA đã phê
duyệt

(SAHA,Zolinza)
Panobinostat (LBH589)

Nhóm I, II, IV

FDA đã
phê duyệt

Belinostat (PXD101)

Nhóm I, II,IV

II

Acid

Abexinostat (PCI24781)

Nhóm I, II

II

hydroxamic

Resminostat (RAS2410)

Nhóm I, II

II

Givinostat (ITF2357)

Nhóm I, II

II

Nhóm I, II

I

Nhóm I, II

II

Dacinostat
(LAQ824,
NVP-LAQ824)
Pracinostat (SB939)
Romidepsin
Các peptid vòng (Depsipeptid,FK228)
Apicidin

phê duyệt
II

HDAC 1, 2, 11

II

HDAC1,9,11

II

Rocilinostat (ACY-1215)

HDAC6

II

Valproic acid (VPA)

Nhóm I

III

Pivanex (AN-9)

No data

II

Nhóm I, IIa

II

(MGCD0103)
Entinostat (MS275,SNDX-275)

Acid carboxylic

FDA đã

HDAC 2, 3

Mocetinostat

Benzamid

HDAC 1, 2

Butyrat

7

1.2.2. Cơ chế tác dụng
Các chất ức chế HDAC có tác dụng chống ung thƣ do tác động lên nhiều giai
đoạn quan trọng của chu trình tế bào làm mất sự điều hòa trong tế bào ác tính.
Trong đó, yếu tố then chốt quyết định hoạt tính chống ung thƣ của HDIs là thúc đẩy
sự biệt hóa, ức chế chu trình tế bào và thúc đẩy sự chết tế bào.
Ngoài ra, hoạt hóa đáp ứng miễn dịch và ức chế tạo mạch cũng là vai trò rất
quan trọng của HDIs, gián tiếp ức chế sự phát triển in vivo của khối u (hình 1.2) [3, 26].

Hình 1.2: Điều hòa sự phát triển và sống sót của tế bào bởi các chất ức chế HDAC
1.2.3. Liên quan cấu trúc - tác dụng của các chất ức chế HDAC
Phần mang dƣợc tính của các chất ức chế HDAC thông thƣờng bao gồm:
- Nhóm gắn với kẽm (ZBG): tƣơng tác với Zn2+ ở vị trí hoạt động của các
enzym HDAC: acid hydroxamic, các thiol, benzamid, mercaptoceton. Với các chất
ức chế HDAC có nhóm hydroxamic, ion Zn2+ tạo 2 liên kết phối trí với 2 nguyên tử
oxy của nhóm hydroxamic.
- Vùng cầu nối sơ nƣớc: là những hydrocacbon thân dầu mạch thẳng hay
vòng, có thể no hoặc không no.
- Nhóm khóa hoạt động (capping group) hay vùng nhận diện bề mặt: thƣờng là
vòng thơm hoặc peptid vòng, sẽ tạo tƣơng tác với 1 vành nhỏ trên miệng túi trong cấu
tạo của kênh enzyme HDAC đƣợc tạo nên từ vài vòng xoắn protein [1, 26, 36, 44].

8


Khi phân tích cấu trúc tia X của một đồng đẳng của HDAC, protein giống
HDAC (HDLP), kết hợp đƣợc với SAHA hay TSA, và gần đây khi nghiên cứu
HDAC8 ở ngƣời, ngƣời ta đã xác định đƣợc ZBG tƣơng tác với một ion Zn2+ của vị
trí hoạt động có dạng túi (Zn2+ ở đáy của túi) [36]. Cầu nối sơ nƣớc đƣa ZBG đến vị

trí hoạt động một cách có hiệu quả bằng cách lấp kín túi. Trong khi đó, nhóm khóa
hoạt động ở phía bên kia của dây nối liên kết với những đuôi amino acid ở mép túi.
ZBG thông thƣờng của những chất ức chế HDAC là một nửa hydroxamat. Sự thay
đổi cấu trúc của ZBG hydroxamat đạt đƣợc một số thành công: sinh ra những đẳng
vị nhƣ benzamid, những α-ketoester, những keton ái điện tử, mercaptoamid và
những phosphonat.
Trong một chất ức chế HDAC nguyên mẫu, nhóm khóa hoạt động có thể đƣợc
nối với cầu nối sơ nƣớc thông qua những nhóm cho hay những nhóm nhận liên kết
hydro khác nhƣ những nhóm keto và amid. Sự thiếu hụt những nhóm cho hay những
nhóm nhận liên kết hydro trong một nửa dây nối đƣa đến một cơ hội liên kết với những
nhóm khác mà dễ tổng hợp hơn và có dƣợc động học thuận lợi hơn từ đó có thể giúp
đơn giản hóa việc thiết kế và tổng hợp những chất ức chế HDAC mới.
Các chất ức chế HDAC dựa trên cấu trúc amid-alkyl-acid hydroxamic đã
đƣợc biết đến nhiều (ví dụ SAHA). Cấu trúc của chúng bao giờ cũng bao gồm 3
phần chính A-B-C [51].
- Phần A liên quan đến hiệu lực và tính đặc hiệu (thƣờng là aryl)
- Phần B là cầu nối nhƣ amid-alkyl
- Phần C là nhóm gắn kết với Zn2+: acid hydroxamic
Cho đến nay phần lớn các nghiên cứu liên quan cấu trúc – tác dụng đều tập
trung tìm hiểu vai trò của nhóm gắn kết Zn2+, cố gắng nghiên cứu thay thế acid
hydroxamic và một vài cầu nối. Sau đây là tổng kết liên quan cấu trúc – tác dụng
của một dãy các dẫn chất của acid hydroxamic đã đƣợc nghiên cứu [51].

9


Hình 1.3: Liên quan cấu trúc – tác dụng của các chất ức chế HDAC
dẫn chất acid hydroxamic
Khi phân tích cấu tạo trung tâm hoat động của dạng túi của HDAC, nhóm
nghiên cứu thuộc trung tâm Sigma-Tau (Ý) đặc biệt chú trọng phần miệng túi với

các vòng aminoacid có thể tham gia tƣơng tác quan trọng với các nhóm nhận diện
bề mặt hoặc các nhóm lân cận. Phần nhận diện bề mặt tại trung tâm hoạt động của
HDAC chấp nhận một hệ vòng khá đa dạng, từ indol, bemzofuran, quinolin,
benzodioxol… Nhóm nitơ trong cấu trúc của phần nhân thơm R có thể tạo liên kết
hydro với các nhóm aminoacid trong cấu trúc túi, tăng tƣơng tác với mép túi tại
trung tâm hoạt động của enzyme HDAC, do đó tăng hoạt tính của các chất ức chế
HDAC. Vì vậy, các nghiên cứu khảo sát dẫn chất ức chế HDAC bằng cách thay đổi
nhóm khoá hoạt tính (thay thế vị trí phenyl bằng các nhân thơm nhƣ benzothiazol,
phenylthiazol, isoxazol...) trong SAHA có tính khả quan cao.
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VỀ CÁC ACID HYDROXAMIC
ỨC CHẾ HDAC
Acid hydroxamic là nhóm chất ức chế HDAC đƣợc nghiên cứu rộng rãi nhất,
với nồng độ ức chế nằm trong khoảng micromol đến nanomol.
Trichostatin A ((R)-TSA) là chất đầu

tiên đƣợc phân

lập từ

Streptomyceshygroscopicus đã đƣợc chứng minh có tác dụng ức chế mạnh, đặc hiệu

10


với HDAC (Ki=3,4nM), có tác dụng rất tốt trong việc làm giảm sự biệt hóa tế bào
trong bệnh bạch cầu Friend, và đóng vai trò nhƣ chất ngăn cản sự di căn trong ung
thƣ đại tràng. Tuy nhiên việc sản xuất ra TSA rất tốn kém với hiệu suất thấp (trải
qua 20 bƣớc với hiệu suất 2%) nên việc nghiên cứu ra các chất ức chế HDAC thay
thế TSA đang đƣợc nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Hiện nay, TSA chủ yếu đƣợc
dùng làm chất đối chiếu trong nghiên cứu tìm ra HDIs mới [8].

Một chất ức chế HDAC đã đƣợc nghiên cứu tổng hợp thành công là acid
suberoylanilid hydroxamic (SAHA). Chất này đã đƣợc FDA phê duyệt sử dụng
trong điều trị u tế bàolympho T dƣới da. SAHA làm tăng sự acetyl hóa của các
histon H2B, H3 và H4, đồng thời thay đổi sự biểu hiện của một số gen dẫn đến sự
chết tế bào theo chƣơng trình [11].
Bên cạnh đó, nhiều dẫn chất acid hydroxamic ức chế HDAC đang đƣợc
nghiên cứu rộng rãi và đƣợc chia thành nhiều phân nhóm nhỏ (hình 1.4).

Hình 1.4: HDIs có cấu trúc acid hydroxamic
Đặc điểm chung của các chất này là nhóm hydroxamic dễ tạo phức với Zn2+
của HDAC nên ức chế không chọn lọc cả HDAC nhóm I, II và bị chuyển hóa nhanh
[36, 52].

11


Chính vì vậy các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang nỗ lực tìm kiếm các
dẫn chất mới dựa trên phiên mẫu TSA, SAHA và các chất đã tìm đƣợc. Dựa trên
đặc điểm cấu trúc của các chất ức chế HDAC dẫn chất hydroxamic (hình 1.3), các
nghiên cứu có thể tiến hành thay đổi một trong 2 phần cấu trúc: nhóm khóa hoạt
động (C), cầu nối (B). Sau đây là tổng kết một số nghiên cứu trên thế giới về thay
đổi nhóm khóa hoạt động của các acid hydroxamic.
Các nhà khoa học thuộc Viện nghiên cứu quân đội Walter Reed (Mỹ) đã
thiết kế và tổng hợp hàng trăm dẫn chất acid hydroxamic mang hợp phần
phenylthiazol thay thế vào vị trí của phenyl trong SAHA (1, hình 1.5). Một dẫn chất
oxazol là WR301849 cũng đƣợc tổng hợp [7].

Hình 1.5: Các acid phenylthiazol hydroxamic tương tự SAHA
Kết quả đánh giá tác dụng trên HDAC cho thấy dẫn chất WR301801 (1a) với
nhóm khóa hoạt động là 3-aminophenyl-5-thiazolyl có tác dụng ức chế mạnh nhất

với IC50 = 10,4 nM, mạnh hơn cả SAHA trên cùng thử nghiệm. Đồng phân vị trí
của WR301801 là WR301826 (1b) (nhóm thế amino ở vị trí ortho) cũng có tác
dụng mạnh tƣơng đƣơng SAHA [52].
Sử dụng hai chất WR301801 và WR301826 làm những chất dẫn đƣờng mới,
nhóm nghiên cứu của Alan P. Kozikowski thuộc Đại học Illinois (Chicago, Mỹ) tiếp
tục thiết kế dãy acid phenylthiazol-hydroxamic dẫn chất hóa dựa trên nhóm amino
của vòng phenyl (hình 1.6). Kết quả cho thấy, khi nhóm amin thế trên vòng phenyl
đƣợc acyl hóa bằng những nhóm cồng kềnh, tác dụng ức chế nhiều týp HDAC tăng.

12


Tác dụng mạnh nhất thu đƣợc với dẫn chất 1a-5 (hình 1.6). IC50 của dẫn chất này
với HDAC2, HDAC3 thấp dƣới mức 0,2 nM. Kết quả thử độc tính trên 5 dòng tế
bào ung thƣ tụy công bố với 1a, 1b, 1a-2 cho thấy các dẫn chất này đều có IC50 nhỏ
hơn 3 M [30].

Hình 1.6: Một số acid phenylthiazol hydroxamic
Trong quá trình nghiên cứu các dẫn chất acid phenylthiazol-hydroxamic,
nhóm nghiên cứu của Alan P. Kozikowski cũng đồng thời tiến hành thiết kế và tổng
hợp một dãy các dẫn chất acid biphenyl-hydroxamic tƣơng tự SAHA (hình1.7) [30].
Kết quả các dẫn chất biphenyl ức chế HDAC mạnh hơn SAHA trên 6 loại HDAC
(HDAC1, 2, 3, 8, 10, 6). Khi gắn thêm nhóm -NH2 vào vị trí ortho trên vòng phenyl
thứ 2 hoạt tính giảm, nhƣng khi nhóm -NH2 này đƣợc acyl hóa bằng những nhóm
aminoacyl cồng kềnh, tác dụng ức chế HDAC lại đƣợc tăng cƣờng. Điều này chứng
tỏ phần nhận diện bề mặt của trung tâm hoạt động của HDAC có thể chấp nhận
nhiều nhóm có kích thƣớc lớn. Kết quả này cũng gợi ý các tƣơng tác đƣợc tạo lập
thêm từ những nhóm aminoacyl này với các acid amin tại vành của túi hoạt động đã
làm tăng ái lực đối với HDAC của các dẫn chất. Một số acid biphenyl-hydroxamic
cũng cho độc tính trên 5 dòng tế bào ung thƣ tụy thử nghiệm nhƣng tác dụng không

tốt bằng các acid phenylthiazol hydroxamic.

Hình 1.7: Các dẫn chất acid biphenyl-hydroxamic

13


Trong quá trình nghiên cứu các dẫn chất acid phenylthiazol-hydroxamic,
nhóm nghiên cứu của Alan P. Kozikowski thuộc Đại học Illinois (Chicago, Mỹ) đã
tổng hợp dẫn chất acid phenylisoxazol-hydroxamic WR301849 (hình 1.8) [30]. Dẫn
chất isoxazol này có tác dụng ức chế các HDAC1, 3 và 6 rất mạnh với IC50 thấp đến
0,002 nM. Tiếp tục mạch nghiên cứu này, một số dẫn chất trong đó vòng isoxazol
đƣợc đƣa vào vị trí ngay sát cạnh nhóm acid hydroxamic đã đƣợc thiết kế và tổng
hợp (sơ đồ 1.1) [48].

Sơ đồ 1.1: Tổng hợp các acid isoxazol-hydroxamic
* Tác nhân và điều kiện: (a) acid 7-heptynoic, POCl3, pyridin, -13oC, khuấy đều, 30 phút; (b)
ethyl clorooxamidoacetat, triethylamin, THF, nhiệt độ phòng, 16 h; (c) NH2OH.HCl, KOH,
MeOH, khuấy đều, 15 phút.

Kết quả thử hoạt tính ức chế HDAC cho thấy một số dẫn chất trong các acid
isoxazol-hydroxamic tổng hợp ức chế cả 5 týp HDAC1, 2, 3, 6 và 10 với IC50 trung
bình khoảng 150 nM [48]. Tác dụng này kém hơn nhiều so với các acid
phenylthiazol-hydroxamic (1) và acid biphenyl-hydroxamic (2). Có thể nhận xét, khi
có mặt vòng isoxazol cạnh nhóm hydroxamic, nhóm khóa hoạt động là quinolin hoặc
biphenyl không tối ƣu cho hoạt tính, trong khi hai dẫn chất với vòng 5-phenylthiazol
(3a, 3b) có tác dụng ức chế HDAC khá mạnh, gần tƣơng đƣơng SAHA (hình 1.8).
Đây cũng là hai dẫn chất thể hiện độc tính tế bào mạnh nhất với IC50 thấp đến 1 µM.
Điều ngạc nhiên là mặc dù 3b ức chế HDAC mạnh hơn 3a song 3a lại có độc tính tế
bào mạnh hơn 3b [48]. Có thể sự có mặt của nhóm 3-amino ở 3b đã làm giảm tính

thấm qua màng tế bào của chất này, dẫn đến độc tính tế bào thấp hơn so với 3a. Có
thể các dẫn chất acyl hóa của 3b sẽ cải thiện cả tác dụng trên HDAC và tế bào, tƣơng
tự nhƣ với các dẫn chất acid phenylthiazol-hydroxamic (1).

14


Hình 1.8: Các acid isoxazol-hydroxamic
Cũng nhằm mục tiêu tìm ra cầu nối và nhóm khóa hoạt động thích hợp, các nhà
khoa học tại Viện Parker H. Petit thuộc Viện Công nghệ Georgia đã thiết kế và tổng
hợp dãy các dẫn chất hydroxamic chứa vòng triazol (4, sơ đồ 1.2) [30].

Sơ đồ 1.2: Tổng hợp acid triazol-hydroxamic (4).
*Tác nhân và điều kiện: (a) CuI, Hunig base, THF, nhiệt độ phòng; (b) dd NH2OH, KCN,
THF/MeOH (1/1), khuấy đều.

Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế HDAC cho thấy cầu nối giữa phần
hydroxamic và triazol 5, 6 carbon là tối ƣu. Tuy nhiên, không thấy có quy luật rõ
ràng khi so sánh hai dẫn chất có cùng nhóm khóa hoạt động Ar và khác nhau về độ
dài cầu nối. Với nhóm Ar cồng kềnh, dẫn chất 5C thƣờng có tác dụng ức chế
HDAC mạnh hơn trong khi những chất có Ar nhỏ, dẫn chất 6C thƣờng biểu thị hoạt
tính trên HDAC mạnh hơn. Khi so sánh với SAHA, rất nhiều dẫn chất triazol chứng
tỏ có ái lực mạnh hơn với HDAC. Đánh giá in vitro, 4 dẫn chất 4t, 4v, 4y, 4w gây
độc đối với dòng tế bào ung thƣ tiền liệt tuyến của ngƣời DU145 với IC50 thấp nhất
đến 2,25 µM, tƣơng đƣơng với SAHA (hình 1.9) [44].

15


Hình 1.9: Các triazol-hydroxamic Cấu nối

Nhận thấy khả năng ức chế HDAC của các dẫn chất N-hyroxybenzamid,
Huansheng Fu và các cộng sự đã công bố kết quả tổng hợp và thử hoạt tính sinh học
của một dãy các chất saccarin của N-hydroxybenzamid ở bảng 1.3 [4].
Bảng 1.3: Khả năng ức chế HDAC của các saccarin của N-hydroxybenzamid

Chất

R

Cầu nối

5a
5b
5c
5d
5e
5f
5g
5h
5i
5j
5k
5l
5m
5n
5o
5p
5q
SAHA

H
H
H
H
H
H
NO2
I
Ph
H
NO2
I
Ph
I
Ph
H
H

-(CH2)2CONH-(CH2)3CONH-(CH2)4CONH-(CH2)5CONH-(CH2)5CONH-(CH2)2CONH-(CH2)2CONH-(CH2)2CONH-(CH2)2CONH-(CH2)3CONH-(CH2)3CONH-(CH2)3CONH-(CH2)3CONH-(CH2)4CONH-(CH2)4CONH-(CH2) 2CONHCH2-(CH2)4CONHCH2-

16

Vị trí nhóm
hydroxamic
meta
meta
meta
meta
meta
para

para
para
para
para
para
para
para
para
para
para
para

IC50 of
HDACs (µM)
>5
>5
>5
>5
>5
0,300±0,021
2,02±0,77
0,523±0,151
1,70±0,551
0,233±0,135
1,55±1,45
0,419±0,243
1,51±1,23
0,305±0,028
>5
2,79±1,00

3,40±0,84
0,193±0,082