TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT ACID HYDROXAMIC HƯỚNG ỨC CHẾ ENZYM HISTON DEACETYLASE

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI






ĐÀO THỊ KIM OANH


TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT
TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ
DẪN CHẤT ACID
HYDROXAMIC HƯỚNG ỨC
CHẾ ENZYM HISTON
DEACETYLASE


TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC


CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƯỢC
MÃ SỐ: 62.72.04.03

HÀ NỘI, 2013

CÔNG TRÌNH ĐÃ HOÀN THÀNH TẠI:
Trường đại học Dược Hà Nội

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. Nguyễn Hải Nam
GS.TS. Sang-Bae Han








1
I. MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Một trong những đích tác dụng phân tử đang được chú ý hiện nay là
các histon deacetylase (HDAC). Nghiên cứu về các HDAC đã xác định
hoạt động bất thường của HDAC có liên quan đến nhiều bệnh ung thư.
Vì vậy, các chất ức chế HDAC đang trở thành các tác nhân chống ung
thư đầy triển vọng. Acid suberoylanilid hydroxamic(SAHA) (Zolinza
®
,
2006) và depsipeptid (Romidepsin
®
, 2009) là hai chất ức chế HDAC đã
được Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ (US-FDA) phê duyệt
trong điều trị u lympho da tế bào T. Bên cạnh đó, một số chất ức chế
HDAC khác cũng đang được nghiên cứu và trải qua các pha thử lâm
sàng như NVL-LAQ824, MS-275, CI-994, PXD-101 Các chất ức chế

HDAC được chia thành 5 nhóm dựa theo cấu trúc hóa học, trong đó các
dẫn chất acid hydroxamic được các nhà khoa học trên thế giới tập trung
nghiên cứu nhiều nhất do cấu trúc đơn giản dễ tổng hợp, hoạt tính ức chế
HDAC mạnh.
Hội nhập với xu hướng nghiên cứu của thế giới và tìm kiếm chất ức
chế HDAC có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt, luận án “Tổng hợp và
thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất acid hydroxamic hướng
ức chế enzym histon deacetylase” được thực hiện với 2 mục tiêu.
2. Mục tiêu của luận án
1. Thiết kế và tổng hợp được khoảng 40 - 50 dẫn chất acid
hydroxamic mới hướng ức chế HDAC.
2. Thử tác dụng ức chế HDAC và tác dụng kháng tế bào ung thư của
các chất tổng hợp được.
3. Những đóng góp mới của luận án
Về thiết kế và tổng hợp các dẫn chất acid hydroxamic
Đã thiết kế, tổng hợp và khẳng định cấu trúc của 51 acid hydroxamic
mới, chưa thấy công bố trong các tài liệu tham khảo được.
Về thử hoạt tính sinh học của các chất
Thử tác dụng ức chế HDAC bằng phân tích Western blot của 51 dẫn
chất cho thấy ở nồng độ 10 µg/ml, các chất 7a-d, 9a-h có hoạt tính. Với
hoạt tính mạnh hơn, các chất 9a-h còn thể hiện tác dụng ức chế HDAC ở
nồng độ 1 µg/ml. Định lượng tác dụng ức chế HDAC2 đối với các chất
9a-h, chất 23 cho thấy cả 9 chất đều ức chế HDAC2 với IC
50
mạnh hơn
SAHA từ 2 – 20 lần.
51 dẫn chất được thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro theo
phương pháp MTT. Kết quả 15 chất đã có khả năng ức chế sự phát triển
2
tế bào trên cả 5 dòng tế bào thử nghiệm và chất 9b, 9g tác dụng tương

đương SAHA.
Chất 9g với hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro và ức chế HDAC
tốt được lựa chọn thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vivo. Thử
nghiệm trên mô hình ghép dị chủng trên chuột trụi lông với dòng tế bào
ung thư tiền liệt tuyến (PC-3) cho thấy ở nồng độ 30 µg/ml, chất 9g ức
chế sự phát triển khối u tương đương SAHA.
4. Bố cục luận án
Luận án có 152 trang, 28 bảng, 73 hình, 33 sơ đồ. Bố cục gồm các
phần: Đặt vấn đề (1 trang), tổng quan (46 trang), nguyên liệu, thiết bị,
nội dung và phương pháp nghiên cứu (10 trang), kết quả nghiên cứu (53
trang), bàn luận (41 trang), kết luận và kiến nghị (2 trang), danh mục các
bài báo đã công bố liên quan đến luận án (1 trang). Luận án có 92 tài liệu
tham khảo (7 trang) và 61 phụ lục (106 trang).
II. NỘI DUNG LUẬN ÁN
Chương 1. TỔNG QUAN
Tổng quan đã trình bày về:
- Histon deacetylase (HDAC): phân loại, cấu trúc; mối liên quan giữa ung
thư và sự bất thường hoạt động của HDAC.
- Các chất ức chế HDAC: phân loại, cơ chế tác dụng và cấu trúc.
- Tổng hợp tình hình nghiên cứu trên thế giới về các chất ức chế
HDAC, đặc biệt chú trọng đến các hydroxamat và dẫn chất.
- Các phương pháp tạo liên kết amid, tổng hợp các acid hydroxamic.
Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, thiết bị
- Các nguyên liệu, hóa chất, dung môi: Đức, Trung Quốc, Việt Nam.
- Các dụng cụ thí nghiệm thông thường dùng trong tổng hợp hữu cơ.
- Các máy đo nhiệt độ nóng chảy, phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ
cộng hưởng từ hạt nhân. Máy đo độ hấp thụ huỳnh quang, tủ nuôi cấy,
máy điện di.

- Các dòng tế bào ung thư người thử nghiệm.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Thiết kế và tổng hợp 51 dẫn chất acid hydroxamic.
- Khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp dựa trên phân tích dữ
liệu phổ khối (MS), phổ hồng ngoại (IR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân
(
1
H-NMR,
13
C-NMR).
3
- Thử tác dụng ức chế HDAC của các chất tổng hợp được và định
lượng tác dụng ức chế HDAC2 của một số chất.
- Thử hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư người in vitro của các chất
tổng hợp được.
- Thử hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư người in vivo của một chất
đại diện.
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Tổng hợp hóa học và phân tích dữ liệu phổ
3.1.1. Nhóm các dẫn chất acid hydroxamic mang khung benzothiazol
Gồm 6 dãy chất 3a-f, 5a-f, 7a-f, 9a-h, 11a-d, 13a-f và chất 23 được
tổng hợp theo các sơ đồ dưới đây:
a) Dãy 3a-f, 5a-f, 7a-f và 9a-h

b) Chất 23

c) Dãy 11a-d và 13a-f


4

3.1.2. Nhóm các dẫn chất của SAHA
Gồm 2 dãy dẫn chất 17a-c, f, h; 20a-f và chất 26 được tổng hợp theo
sơ đồ sau:
a) Dãy 17a-c, f, h và 20a-f

b) Chất 26
i) Acid adipic monomethyl ester
CDI, DCM, DMF
ii) LiOH, MeOH, DCM
NaOH, MeOH
NH
2
OH.HCl
CDI, DMF,TEA
NH
2
H
N
OH
O
H
N
H
N
O
OCH
3
O
O
H

N
H
N
O
NHOH
O
O
4
4
2
4
2
Alanin methyl ester
Cl
Cl
Cl
Cl
26
O

Bảng 3.13. Tóm tắt kết quả tổng hợp các dẫn chất trong luận án
TT Chất CTCT H (%) Rf* t
nc
(
o
C)
Dãy các chất 3a-f
1
3a
S

N
N
H
NHOH
O
O

51,2 0,58 250-251
2
3b
S
N
N
H
NHOH
O
OH
3
C

40,5 0,52 252-253
3
3c
S
N
N
H
NHOH
O
OH

3
CO

40,6 0,46 215-216
4
3d
S
N
N
H
NHOH
O
OC
2
H
5
O

32,3 0,54 232-234
5
3e
S
N
N
H
NHOH
O
OH
3
CO

2
S

51,1 0,34 330-331
6
3f
S
N
N
H
NHOH
O
OO
2
N

63,6 0,35 265-266
Dãy các chất 5a-f
7
5a
S
N
N
H
O
NHOH
O

72,0 0,40 149-150
8

5b
S
N
N
H
O
NHOH
O
H
3
C

68,0 0,40 180-182
9
5c
S
N
N
H
O
NHOH
O
H
3
CO

66,0 0,40 189-191
5
10
5d

S
N
N
H
O
NHOH
O
C
2
H
5
O

65,0 0,41 176-177
11
5e
S
N
N
H
O
NHOH
O
H
3
CO
2
S

53,0 0,39 148-149

12
5f
S
N
N
H
O
NHOH
O
O
2
N

42,0 0,39 171-173
Dãy các chất 7a-f
13
7a
S
N
N
H
O
NHOH
O

78,0 0,44 176-177
14
7b
S
N

N
H
O
NHOH
OH
3
C

78,0 0,48 204-205
15
7c
S
N
N
H
O
NHOH
OH
3
CO

84,0 0,41 189-190
16
7d
S
N
N
H
O
NHOH

OC
2
H
5
O

86,0 0,42 193-194
17
7e
S
N
N
H
O
NHOH
OH
3
CO
2
S

74,0 0,39 220-221
18
7f
S
N
N
H
O
NHOH

OO
2
N

80,0 0,39 214-215
Dãy các chất 9a-h
19
9a
S
N
N
H
O
NHOH
O

83,3 0,42 176-177
20
9b
S
N
N
H
O
NHOH
OH
3
C

80,9 0,45 204-205

21
9c
S
N
N
H
O
NHOH
OH
3
CO

90,3 0,43 189-190
22
9d
S
N
N
H
O
NHOH
OC
2
H
5
O

83,3 0,46 193-194
23
9e

S
N
N
H
O
NHOH
OH
3
CO
2
S

90,5 0,40 220-221
24
9f
S
N
N
H
O
NHOH
OO
2
N

80,0 0,38 214-215
25
9g
S
N

N
H
O
NHOH
OCl

78,0 0,37 196-198
26
9h
S
N
N
H
O
NHOH
OF
3
C

75,0 0,40 186-187
Dãy các chất 11a-d
27
11a
S
N
N
H
O
O
NH NHOH

O

90,6 0,39 178-180
28
11b
S
N
N
H
O
O
NH
H
3
C
NHOH
O

89,9 0,40 189-190
29
11c
S
N
N
H
O
O
NH
H
3

CO
NHOH
O

74,5 0,42 194-196
30
11d
S
N
N
H
O
O
NH
C
2
H
5
O
NHOH
O

68,5 0,38 182-184
6
Dãy các chất 13a-f
31
13a
S
N
N

H
O
NH
O
NHOH
O

86,7 0,36 187-188
32
13b
S
N
N
H
O
H
3
C
NH
O
NHOH
O

82,4 0,39 194-195
33
13c
S
N
N
H

O
H
3
CO
NH
O
NHOH
O

93,3 0,40 198-199
34
13d
S
N
N
H
O
C
2
H
5
O
NH
O
NHOH
O

88,2 0,40 186-187
35
13e

S
N
N
H
O
H
3
CO
2
S
NH
O
NHOH
O

85,0 0,36 210-211
36
13f
S
N
N
H
O
O
2
N
NH
O
NHOH
O

50,0 0,31 230-231
Dãy các chất 17a-c, f, h
37
17a
H
N
O
N
H
O
NHOH
O

34,4 0,30 197-198
38
17b
H
N
O
N
H
O
NHOH
O
F

50,2 0,30 195-196
39
17c

H
N
O
N
H
O
NHOH
O
Cl

42,1 0,32 189-190
40
17f
H
N
O
N
H
O
NHOH
O
H
3
CO

79,1 0,27 205-206
41
17h
H
N

O
N
H
O
NHOH
O
NC

36,5 0,28 195-197
Dãy các chất 20a-h
42
20a
H
N
O
NH
O
NHOH
O

50,5 0,37 189-191
43
20b
H
N
O
NH
O
NHOH
O

F

51,2 0,27 173-174
44
20c
H
N
O
NH
O
NHOH
O
Cl

42,2 0,29 172-173
45
20d
H
N
O
NH
O
NHOH
O
Cl

42,0 0,31 162-163
46
20e
H

N
O
NH
O
NHOH
O
Cl

63,0 0,29 128-130
47
20f
H
N
O
NH
O
NHOH
O
H
3
CO

55,0 0,34 178-179
48
20g
H
N
O
NH
O

NHOH
O
O
2
N

56,0 0,32 175-176
49
20h
H
N
O
NH
O
NHOH
O
NC

50,0 0,28 185-186
50
23
S
N
N
H
O
NHOH
O

47,8 0,37 166-167

51
26
Cl
H
N
N
H
NHOH
O
O O

81,5 0,41 187-188
7
* Hệ dung môi sắc ký: DCM-MeOH-AcOH (90:10:1). Các chất 9a-h, 23, 26 hệ dung môi
sắc ký DCM-MeOH-AcOH (90:8:1). Dung môi kết tinh: Nước-HCl 5%.
3.2. Hoạt tính sinh học
3.2.1. Tác dụng ức chế HDAC
Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp được đánh giá
gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong tế
bào ung thư đại tràng SW620. Phân tích dựa trên Western blot có thể
khẳng định được tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl
hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng. Thử nghiệm được tiến
hành tại khoa Dược, đại học Chungbuk (Cheongju, Hàn Quốc). Các chất
được đánh giá tác dụng ức chế HDAC ở nồng độ 10 g/ml, nếu có tác
dụng thì tiếp tục được đánh giá ở nồng độ 1 g/ml. Kết quả các chất 7a-
f, 9a-h, chất 23 có tác dụng ức chế HDAC được trình bày trong bảng
3.14, những chất còn lại không ức chế HDAC ở nồng độ 10
g/ml.
Bảng 3.14. Tác dụng ức chế HDAC của một số chất tổng hợp
TT Chất

Tác dụng ức chế HDAC
10

g/ml 1

g/ml
Các dẫn chất benzothiazol
S
N
R
N
H
O O
NHOH
m

Các chất có cầu nối 4C (m = 4)
1

7a

(R =
-
H)

+

-

2

7b
(R =
-
CH
3
)

+

-

3

7c
(R =
-
OCH
3
)

+

-

4

7d
(R =
-

OC
2
H
5
)

+

-

5

7e
(R =
-
SO
2
CH
3
)

-

-

6

7f
(R =
-

NO
2
)

-

-

Các chất có cầu nối 6C (m = 6)
7

9a

(R =
-
H)

+

+

8

9b
(R =
-
CH
3
)

+

+

9

9c
(R =
-
OCH
3
)

+

+

10

9d
(R =
-
OC
2
H
5
)

+

-

11

9e
(R =
-
SO
2
CH
3
)

+

-

12

9f
(R =
-
NO
2
)

+

+

13

9g

(R =
-
Cl)

+

+

14

9h

(R =
-
CF
3
)

+

+

15

23

(vòng thiazol)

+

+


SAHA**

KT

+

* KT: Không thử; ** Chuẩn dương tính
8
* Nhận xét:
Kết quả phân tích Western blot cho thấy 4 chất mang khung
benzothiazol có cầu nối 4C (7a-d) ức chế HDAC ở nồng độ 10 g/ml.
Với tác dụng mạnh hơn, hầu hết các chất mang khung benzothiazol cầu
nối 6C (9a-c, 9f-h) và chất 23 (cấu trúc vòng thiazol, cầu nối 6C) đều thể
hiện tác dụng ở nồng độ 1 g/ml.
Dựa trên kết quả phân tích Western blot, các chất 9a-h và chất 23
được lựa chọn để định lượng tác dụng ức chế HDAC2. Kết quả IC
50
của
các chất 9a-h, 23 trên HDAC2 được trình bày trong bảng 3.15.
Bảng 3.15. Kết quả định lượng tác dụng ức chế HDAC2 của các chất
9a-h, 23
TT Chất
IC

50

KLPT
(g/ml) (M)
1 9a (R = -H) 0,013 0,040 321,39
2 9b (R = -CH
3
) 0,036 0,107 335,42
3 9c (R = -OCH
3
) 0,039 0,102 351,42
4 9d (R = -OC
2
H
5
) 0,159 0,435 365,45
5 9e (R = -SO
2
CH
3
) 0,120 0,300 399,49
6 9f (R = -NO
2
) 0,009 0,024 366,39
7 9g (R = -Cl) 0,050 0,140 355,84
8 9h (R = -CF
3
) 0,262 0,673 389,39
9 23 (vòng thiazol) 0,157 0,578 271,34
SAHA 0,530 2,005 264,30

* Nhận xét:
Cả 9 chất đều có khả năng ức chế HDAC2 mạnh hơn cả SAHA với
giá trị IC
50
từ 0,013 – 0,262 g/ml.
3.2.2. Hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro
Các chất tổng hợp được đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư
người trên dòng tế bào SW620 (ung thư đại tràng). Nếu có tác dụng
kháng dòng tế bào trên thì tiếp tục được thử nghiệm trên 4 dòng tế bào
khác: MCF-7 (ung thư vú), PC-3 (ung thư tiền liệt tuyến), AsPC-1 (ung
thư tụy), NCI-H460 (ung thư phổi). Thử nghiệm được tiến hành tại khoa
Dược, đại học Chungbuk (Cheongju, Hàn Quốc) theo phương pháp
MTT. Kết quả giá trị IC
50
của các chất có hoạt tính (dãy 5, 7, 9 và chất
23) được trình bày trong bảng 3.16. Những chất dãy 3, 11, 13, 17, 20 và
chất 26 đều không kháng dòng tế bào SW620.


9
Bảng 3.16. Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư người in vitro
TT Chất IC
50
(g/ml)

SW620 MCF-7 PC-3 AsPC-1 NCI-H460
Các dẫn chất benzothiazol
S
N
R

N
H
O O
NHOH
m

Các chất có cầu nối 3C (m = 3)
1

5a

(R =
-
H)

>30

KT

KT

KT

KT

2

5b
(R =
-

CH
3
)

18,
96

KT

KT

KT

KT

3

5c
(R =
-
OCH
3
)

20,65

KT

KT

KT

KT

4

5d
(R =
-
OC
2
H
5
)

20,41

KT

KT

KT

KT

5

5e
(R =
-

SO
2
CH
3
)

>100

KT

KT

KT

KT

6

5f
(R =
-
NO
2
)

>30

KT

KT

KT

KT

Các chất có cầu nối 4C (m = 4)
7

7a

(R =
-
H)

7,85

4,02

12,51

10,19

14,41

8

7b
(R =
-
C

H
3
)

4,69

4,27

6,23

13,33

10,97

9

7c
(R =
-
OCH
3
)

9,07

5,91

15,29

23,93

21,41

10

7d
(R =
-
OC
2
H
5
)

9,26

8,72

6,69

16,70

7,96

11

7e
(R =
-
SO

2
CH
3
)

>30

>30

>30

>30

>30

12

7f
(R =
-
NO
2
)

>30

>30

>30

>30

>30

Các chất có cầu nối 6C (m = 6)
13

9a

(R =
-
H
)

4,01

6,61

5,44

5,69

5,71

14

9b
(R =
-
CH

3
)

0,56

1,60

0,53

0,54

0,84

15

9c
(R =
-
OCH
3
)

0,96

1,85

1,56

0,79

1,25

16

9d
(R =
-
OC
2
H
5
)

10,43

11,61

16,89

9,88

6,58

17

9e
(R =
-
SO
2

CH
3
)

5,42

15,35

5,69

13,52

6,54

18

9f
(R =
-
NO
2
)

0,29

3,83

1,28

1,65

1,90

19

9g

(R =
-
Cl)

0,32

1,45

0,82

0,34

0,39

20

9h

(R =
-
CF
3
)

0,35

0,78

2,91

2,20

1,28

21

23

(vòng thiazol)

2,55

5,47

4,15

2,10

4,24

SAHA
0,50 0,13 0,94 0,69 0,68
* KT: Không thử

* Nhận xét:
Kết quả cho thấy các chất 5b-d với cầu nối 3C bắt đầu có hoạt tính
nhưng yếu. Các chất cầu nối 4C, chất 7a-d tác dụng trên cả 5 dòng tế bào
thử nghiệm. Cầu nối 6C đã giúp mang lại hoạt tính tốt cho các chất 9a-h.
Trong đó, 5 chất 9b, 9c, 9f, 9g, 9h có hoạt tính trên cả 5 dòng tế bào
(IC
50
từ 0,29 – 3,83 g/ml). Đặc biệt chất 9g ức chế 4/5 dòng tế bào với
giá trị IC
50
đều thấp hơn SAHA (0,32 – 0,82 g/ml). Việc thay nhóm
nhận diện bề mặt bằng vòng thiazol với độ dài cầu nối 6C cũng thu được
chất 23 có tác dụng kháng 5 dòng tế bào thử nghiệm.
10
3.2.3. Hoạt tính kháng tế bào ung thư in vivo
Từ kết quả trên, chất 9g có hoạt tính tốt đã được lựa chọn để thử độc
tính in vivo. Thí nghiệm được tiến hành trên mô hình ghép dị chủng ở
chuột trụi lông, sử dụng dòng tế bào PC-3 (ung thư tiền liệt tuyến người),
tại khoa Dược, đại học Chungbuk (Cheongju, Hàn Quốc). Hoạt tính
kháng tế bào ung thư được tính toán dựa trên phần trăm ức chế sự phát
triển khối u của mẫu thử ở liều xác định so với mẫu trắng đối chiếu. Kết
quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 3.17.
Bảng 3.17.
Sự thay đổi khối lượng của khối u trên chuột ở nhóm thử,
nhóm trắng đối chiếu và SAHA
Nhóm
(n=7)
Liều
(mg/kg)
Thể tích khối u (mm

3
) KL khối u
(mg)

Ngày 1

11 13 15 18 21
Trắng
0
0,0

0,0 35,4±13,4 74,6±20,3 105,1±21,5 184,2± 40,3 341,7± 88,5
733,4± 180,58
9g
3
0,0±0,0 32,2±16,8 57,9±22,1 81,6±22,7 143,2±32,7 266,6±58,1
567,5± 232,20
10
0,0±0,0 28,9±7,6 53,1±26,2 76,8±33,9 121,1±49,1
a
205,9±58,9
b

429,5± 114,23
b

30
0,0±0,0 29,1±7,2 43,0±10,0
b
66,8±14,1

b
105,3±22,1
c
174,8±29,7
c
374,0± 77,78
c

SAHA
30
0,0±0,0 35,9±14,3 44,7±13,1
b
70,7±14,6
b
111,6±21,8
b
179,6±31,8
c
379,2± 54,40
c

* Chú thích: (t-TEST): a: p<0,05, b: p<0,01, c: p<0,001 so với mẫu trắng.
Để sơ bộ đánh giá độc tính trên động vật của mẫu thử, chuột được cân
để xác định sự thay đổi trọng lượng trong quá trình thí nghiệm (bảng
3.18).
Bảng 3.18.

Phần trăm thay đổi cân nặng của chuột trong quá trình thí nghiệm
Nhóm
(n=7)

Liều
(mg/kg)
Cân nặng thay đổi của các ngày thí nghiệm (%)
Ngày 1 4 6 8 11 13 15 18 21
Trắng 0
100,0±
0,0
101,3
± 2,88
103,5
± 2,45
102,9
± 2,34
103,1
± 2,99
106,6
± 3,25
107,4±
1,79
113,8±
2,61
114,7±
1,43
9g
3
100,0±0
,0
101,5
± 1,94
101,6

± 3,38
100,6
± 3,41
102,1
± 3,80
102,7
± 4,40
103,9±
4,34
105,9±
3,98
c
109,4±
3,14
b
10
100,0±
0,0
102,0
± 4,35
103,6
± 3,70
100,3
± 4,11
102,5
± 3,49
105,1
± 4,50
104,9±
5,35

105,9±
3,97
c
106,8±
5,45
b
30
100,0±
0,0
99,6±
4,57
101,4
± 4,10
103,9
± 6,49
104,0
± 5,32
102,9
± 5,45
103,0±
4,51
a
106,7±
5,11
b
108,5±
5,42
a
SAHA 30
100,0±

0,0
102,5
± 2,88
105,8
± 4,31
105,4
± 6,40
105,9
± 5,69
108,9
± 8,25
106,7±
7,37
108,8±
9,15
110,4±
9,79
* Chú thích: (t-TEST): a: p<0,05, b: p<0,01, c: p<0,001 so với mẫu trắng.
* Nhận xét:
Kết quả sau 21 ngày, với liều 30 mg/kg, chất 9g ức chế sự phát triển
khối u tương đương SAHA (bảng 3.17). Mặc dù, cân nặng của chuột ở
nhóm thử giảm nhẹ, tuy nhiên không ghi nhận độc tính nghiêm trọng nào
của nhóm thử so với nhóm trắng và không con chuột nào chết trong quá
trình thí nghiệm.
11
Chương 4. BÀN LUẬN
4.1. Tổng hợp hóa học
Phản ứng tổng hợp 51 chất trong luận án là phản ứng thế ái nhân acyl
với tác nhân thế ái nhân là nhóm amin. Trong luận án này, một số tác
nhân acyl hóa được sử dụng là acid carboxylic, anhydrid acid và ester.

4.1.1. Tác nhân acyl hóa là anhydrid acid
Đây là tác nhân acyl hóa mạnh, dùng để tổng hợp chất 2a-f, 4a-f,
15a-c, 15f, 15h, 18a-h tạo các acid carboxylic, là chất trung gian trong
quá trình tổng hợp các dãy chất 3, 5, 11, 13, 17 và 20 (sơ đồ 4.1).
Ar NH
2
+
C
C
O
O
O
N
DMF
Ar N
H
OH
O
O
Ar NH
2
+
N
DMF
Ar N
H
O
Ar =
S
N

R
2a-f
Ar =
R
15a,b,c,f,h
OH
O
C
O
C
O
O
Ar =
S
N
R
4a-f
Ar =
R
18a-h

Sơ đồ 4.1. Tổng hợp các chất trung gian 2a-f, 4a-f, 15a-c, f, h, 18a-h
Phản ứng sử dụng anhydrid succinic hoặc anhydrid glutaric với xúc
tác pyridin. Lượng anhydrid acid có thể dùng dư và dễ dàng loại bỏ do
tan tốt trong nước. Với các chất chứa vòng benzothiazol, hiệu suất phản
ứng từ 66,0-88,0%. Đối với các dẫn chất anilin, hiệu suất 50,2–96,9%.
4.1.2. Tác nhân acyl hóa là acid carboxylic
Acid carboxylic là tác nhân acyl hóa trung bình. Trong phản ứng tạo
các chất 3a-f và 5a-f (sơ đồ 4.2), các acid carboxylic trung gian phản
ứng với hydroxylamin không phải là tác nhân ái nhân mạnh nên phản

ứng khó xảy ra.
S
N
N
H
R
OH
O O
S
N
N
H
R
NHOH
O O
2a-f (m=2)
4a-f (m=3)
3a-f (m=2)
5a-f (m=3)
m
m
a, R = -H
b, R = -CH
3
c, R = -OCH
3
d, R = -OC
2
H
5

e, R = -SO
2
CH
3
f, R = -NO
2

Sơ đồ 4.2. Tổng hợp các acid hydroxamic 3a-f và 5a-f

Để hoạt hóa acid carboxylic, một số chất được lựa chọn để tạo tác
nhân hoạt hóa ngay trong phản ứng bằng cách tạo anhydrid hoạt hóa.
N,N’-dicyclohexylcarbodiimid (DCC) là chất hoạt hóa nhóm carboxyl rất
hiệu quả trong tổng hợp peptid và là hóa chất sẵn có, rẻ tiền. Vì vậy,
DCC là lựa chọn đầu tiên để tổng hợp thử acid hydroxamic 3a-f từ acid
carboxylic. Tuy nhiên, kết quả tổng hợp thử cho thấy phản ứng xảy ra
12
không hoàn toàn. Vì vậy, tác nhân isobutyl cloroformat được lựa chọn để
tiến hành tổng hợp thử các chất 3a-f. Kết quả sau nhiều lần tổng hợp đều
chỉ thu được vết sản phẩm. Sau khi tham khảo tài liệu, tác nhân hoạt hóa
khác là N,N’-carbonyldiimidazol (CDI) được lựa chọn. Kết quả tổng hợp
cho thấy phản ứng xảy ra hoàn toàn, không còn vết nguyên liệu ban đầu
(sơ đồ 4.6). Ưu điểm của việc sử dụng CDI là sản phẩm thu được khá
tinh khiết, quá trình tinh chế đơn giản do imidazol tạo thành và CDI dư
tan trong nước nên dễ dàng loại ra khỏi sản phẩm.

Sơ đồ 4.6. Tổng hợp 3a-f sử dụng tác nhân hoạt hóa CDI
CDI được dùng làm tác nhân hoạt hóa cho các phản ứng tạo liên kết
amid. Các chất 3a-f, 5a-e được tổng hợp (hiệu suất 32,3 – 72,0%).
Riêng chất 5f phải tổng hợp bằng phản ứng giữa acid carboxylic với
hydroxylamin đã được bảo vệ nhóm OH. Đây là phương pháp rất hay

được sử dụng. Tuy nhiên, giá thành các hydroxylamin có chứa nhóm bảo
vệ rất cao. Lựa chọn NH
2
OTHP làm tác nhân ái nhân cho phản ứng tổng
hợp acid hydroxamic 5f (sơ đồ 4.7). Sau khi sản phẩm trung gian được
tạo thành, loại bỏ nhóm bảo vệ -OH bằng phản ứng thủy phân với acid
para-toluensulfonic thu được acid hydroxamic 5f (hiệu suất 42%).
S
N
N
H
OH
O
O
2
N
pTSA/ DMF
5f
4f
O
ONH
2
CDI, Et
3
N, DMF
O
3
S
N
N

H
NHOTHP
O
O
2
N
O
3
S
N
N
H
NHOH
O
O
2
N
O
3

Sơ đồ 4.7. Tổng hợp acid hydroxamic 5f
Sau khi lựa chọn được CDI làm tác nhân hoạt hóa cho phản ứng tổng
hợp acid hydroxamic từ acid carboxylic, một loạt các phản ứng tạo liên
kết amid để tổng hợp các ester trung gian của các dãy chất 7, 9, 11, 13,
17 và 20 và chất 22 được tiến hành cũng dùng CDI.


13
4.1.3. Tác nhân acyl hóa là ester
Phản ứng tổng hợp các acid hydroxamic từ ester và hydroxylamin chỉ

xảy ra ở pH > 10. Phương pháp tổng hợp chủ yếu là dùng xúc tác base và
ester trong alcol. Qua tham khảo tài liệu và để phù hợp với khả năng hòa
tan trong dung môi của các chất, phản ứng tổng hợp các chất dãy 7, 9,
11, 13, 17 và 20, chất 23, 26 từ ester và hydroxylamin được tiến hành
với xúc tác NaOH, dung môi methanol (một số chất khó tan thì sử dụng
hỗn hợp dung môi MeOH - DMF) ở 0
o
C trong thời gian từ 30 phút đến
1giờ 30 phút. Phản ứng diễn ra nhanh với hiệu suất 34,4 – 93,3%.
4.2. Khẳng định cấu trúc
51 chất trong luận án đều được nhận dạng cấu trúc bằng các phương
pháp phổ hồng ngoại (IR), phổi khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ
hạt nhân (
1
H-NMR,
13
C-NMR). Sau đây là một số bàn luận về việc nhận
dạng cấu trúc thông qua các dữ liệu phổ.
4.2.1. Phổ hồng ngoại
Việc phân tích phổ hồng ngoại trong luận án chủ yếu tập trung vào
vùng nhóm chức để xác định sản phẩm phản ứng đã tạo thành với các
nhóm chức đặc trưng.
- 51 chất đều là acid hydroxamic nên đều có vân hấp thụ của dao động
hóa trị O-H acid mạnh và tù từ 3500 - 2400 cm
-1
.
- Toàn bộ 51 chất trong cấu trúc có 2 hoặc 3 liên kết -NH-CO- nên trong
phổ đồ một số chất xuất hiện 2 - 3 vân hấp thụ của dao động hóa trị N-H
amid cũng như vân hấp thụ của dao động hóa trị C=O amid (5a, 5b, 5e,
5f, 7b-7e, 9b, 9e, 9g, 11a, 11b, 13b, 13c, 17f, 20b, 20g, 20h), còn một

số chỉ xuất hiện 1 vân hấp thụ của 
NH
, 1 vân hấp thụ 
C=O
(3a-3f, 5c, 9c,
9d, 9h). Dao động 
NH
có số sóng từ 3361–3124 cm
-1
. Dao động 
C=O
có
số sóng từ 1707–1625 cm
-1
.
- Cầu nối alkyl cũng cho thấy sự có mặt với dao động hóa trị bất đối
xứng CH
2
từ 2993–2912 cm
-1
và dao động đối xứng từ 2875–2789 cm
-1
.
Bên cạnh đó, phổ đồ hồng ngoại còn thể hiện sự có mặt của các nhóm
thế gắn trên vòng benzothiazol hay vòng phenyl.
4.2.2. Phổ khối lượng
Quá trình phân tích phổ khối được thực hiện qua 2 bước: phân tích
cụm pic ion phân tử và biện giải các phân mảnh xuất hiện trên phổ đồ.
4.2.2.1. Phân tích cụm pic ion phân tử
Pic ion phân tử của các hợp chất hữu cơ nói chung không phải là vạch

riêng lẻ mà là một cụm pic vì các nguyên tố chứa trong hợp chất đều tồn
tại các đồng vị như
13
C là đồng vị của
12
C,
2
H là đồng vị của
1
H,
33
S,
34
S
là đồng vị của
32
S,
15
N là đồng vị của
14
N,
37
Cl là đồng vị của
35
C,
18
O là
14
đồng vị của
16

O Bởi vậy, bên cạnh vạch chính ứng với [M+H]
+
(hoặc
[M-H]
-
) còn có các vạch [M+H+1]
+
(hoặc [M-H+1]
-
= M
-
), [M+H+2]
+
,
[M+H+3]
+
là các vạch được tạo nên bởi các nguyên tử đồng vị có số
khối lớn hơn 1 đvk (
13
C), 2 đvk (
34
S) so với nguyên tử bền (
12
C), (
32
S).
Sự có mặt của các pic đồng vị giúp tính toán công thức cộng của hợp
chất và kiểm tra sự phù hợp giữa CTPT dự kiến với CTPT trên phổ đồ.
Qua phân tích cụm pic ion phân tử của các dẫn chất có thể nhận thấy hầu
hết kết quả chỉ sai lệch không quá 5% so với cường độ lý thuyết tương

ứng. Điều đó cho phép kết luận, các dẫn chất tổng hợp có CTPT phù hợp
với CTPT dự kiến.

Hình 4.5. Phổ khối lượng của chất 7a
4.2.2.2. Cơ chế phá mảnh của phân tử theo cấu trúc dự kiến
Lựa chọn chất 20f làm đại diện để xây dựng cơ chế phá mảnh theo
cấu trúc dự kiến. Cơ chế phá mảnh của 20f được xây dựng cho 5 cụm pic
mảnh m
1
, m
2
, m
3
, m
4
, m
5
là những cụm pic có cường độ tương đối đủ lớn
(> 9% so với pic cơ bản).
15

Sơ đồ 4.14. Sơ đồ phá mảnh của chất 20f
Sự tạo thành 5 mảnh vỡ của 20f là hoàn toàn phù hợp với cơ chế phá
mảnh theo chế độ bắn phá ESI (+) và cấu trúc phân tử dự kiến.
4.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Cùng với dữ liệu phổ hồng ngoại và phổ khối, 51 chất tổng hợp còn
được đo phổ
1
H-NMR và
13

C-NMR để khẳng định chính xác cấu trúc.
4.2.3.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các acid hydroxamic mang
khung benzothiazol
Phổ đồ của các dãy 3, 5, 7, 9, 11 và 13 đều thể hiện sự có mặt của
khung benzothiazol, cầu nối alkyl với đầy đủ tín hiệu proton và carbon.
* Phổ
1
H-NMR:
Khung benzothiazol có các proton ở vị trí 4’, 5’, 6’ và 7’ được xác
định rõ ràng trên phổ đồ. H-4’ có δ trong khoảng 7,60-7,99 ppm, vân phổ
dạng doublet, hằng số tương tác J
H4’-H5’(ortho)
= 7,5–9,0 Hz. H-5’có δ từ
7,00–8,27 ppm, vân phổ có dạng doublet (d) (J
ortho
=7,5–9,0 Hz), một số
chất quan sát thấy cả tương tác với H-7’ nên vân phổ dạng doublet of
16
doublets (dd) (J
meta
= 2,0–2,5 Hz). Các chất không có nhóm thế R (3a, 5a,
7a, 9a, 11a và 13a), H-5’ có thể có vân phổ dạng triplet (t) hoặc dạng
doublet of triplets (dt) (hình 4.7), còn H-7’ có δ=7,72 ppm, vân phổ dạng
doublet, J
ortho
= 8,0 Hz. Ở các chất có nhóm thế R ở 6’, tính chất hút đẩy
điện tử của nhóm thế có ảnh hưởng đến độ chuyển dịch hóa học cũng
như dạng vân phổ của H-7’. H-6’ chỉ có ở 6 chất không gắn nhóm thế
với δ=7,42 ppm, vân phổ dạng triplet hoặc dạng doublet of triplets.

Hình 4.7. Phổ
1
H-NMR dãn rộng của chất 5a
Một nhóm các proton quan trọng khác trong cấu trúc là các proton
mạch nhánh. Hầu hết các chất đều có đủ số proton mạch nhánh với độ
dịch chuyển hóa học của các nhóm -CH
2
- trong khoảng 1,23–3,73 ppm.
Cấu trúc của các chất còn nhóm chức hydroxamic và liên kết amid
nên còn quan sát thấy sự có mặt của proton -NH (=10,30–12,77 ppm), -
OH acid (=8,62–8,78 ppm). H của –NHCO- vị trí 1 sẽ cộng hưởng ở
trường yếu nhất với độ dịch chuyển hóa học khoảng 12,13–12,77 ppm.
Đó là do hiệu ứng hút điện tử mạnh của vòng benzothiazol làm hạt nhân
bị giảm sự chắn tại chỗ. Trong dung môi không proton như DMSO, H
của N-H hoạt động như là proton acid hơn là N-OH. Do linh động hơn
nên -NH cộng hưởng ở trường yếu hơn (=10,31–10,44 ppm). Còn H
của –OH có độ dịch chuyển hóa học là 8,66 ppm. Tuy nhiên, các proton
này linh động và dễ bị trao đổi hoặc hỗ biến nên ở một số chất cho tín
hiệu -NH, -OH rất yếu (3a, 3b, 5e) hoặc không cho tín hiệu trên phổ đồ
(3e, 3f, 7f, 7c, 13f).
Các dẫn chất có nhóm thế chứa proton như -CH
3
, -OCH
3
, -OC
2
H
5
, -
SO

2
CH
3
đều cho tín hiệu của các proton trong nhóm thế.
17
* Phổ
13
C-NMR:
Carbon trong nhóm C=O có δ=165,91–173,01 ppm. 7 carbon của
khung benzothiazol có độ dịch chuyển hóa học nằm trong khoảng
104,67–165,94 ppm. Cầu nối alkyl cho tín hiệu của carbon khoảng
20,30–35,30 ppm. Phổ đồ các chất cũng đều cho tín hiệu cộng hưởng của
các carbon có trên nhóm thế. Riêng chất 9h có gắn nhóm thế -CF
3
nên
còn xuất hiện tương tác C-F ở 123,71 và 123,46 ppm với hằng số tương
tác J = 31,87 Hz.
Tóm lại, dữ liệu các phổ thực nghiệm cho phép khẳng định cấu trúc
các chất dãy 3, 5, 7, 9, 11 và 13 đúng như dự kiến và sản phẩm tinh
khiết.
4.2.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các acid hydroxamic mang
vòng phenyl
* Phổ
1
H-NMR:
Ở các chất không có nhóm thế R (17a, 20a) hoặc nhóm thế ở vị trí 4-
R (17b, 17c, 17f, 17h, 20b, 20c, 20f-20h, 26), H-2’ và H-6’ cũng như H-
3’ và H-5’ có tính chất đối xứng nên từng cặp H-2’ và H-6’; H-3’ và H-
5’ sẽ có cùng độ dịch chuyển hóa học và tùy thuộc bản chất nhóm thế sẽ
làm thay đổi δ. Các chất 20d, 20c có nhóm thế 3-Cl và 2-Cl nên không

còn cấu trúc đối xứng, phổ đồ cho đủ tín hiệu proton còn lại của vòng
phenyl trong khoảng 7,07 – 7,82 ppm với vị trí cộng hưởng tùy thuộc
vào ảnh hưởng của nguyên tử Cl.
Phần mạch nhánh alkyl cho đầy đủ tín hiệu của các nhóm -CH
2
- với
dạng vân phổ triplet hoặc multiplet (m), δ=1,78-3,27 ppm. Độ dịch
chuyển hóa học của proton -OH acid cũng giống như các chất dãy 11 và
13, khoảng 8,69–8,80 ppm. Điểm khác biệt là do hiệu ứng hút e của
vòng phenyl yếu hơn vòng benzothiazol nên H trong -NHCO- vị trí 1
cộng hưởng ở trường mạnh hơn (=9,48-10,35 ppm). H của nhóm -
NHCO- nằm giữa cầu nối alkyl do có tương tác với 2 proton của -CH
2
-
bên cạnh nên vân phổ dạng triplet, =7,90–8,08 ppm, J = 5,5-6,5 Hz.
* Phổ
13
C-NMR:
Độ dịch chuyển hóa học của carbon nhóm C=O và phần cầu nối alkyl
trong các chất dãy 17 và 20, chất 26 tương tự như của các acid
hydroxamic mang khung benzothiazol (phần 4.2.3.1). Về vòng phenyl,
tương tự phổ
1
H-NMR, các chất 17a, 20a và các chất có nhóm thế 4-R,
do cấu trúc có trục đối xứng nên các carbon C2’ và C6’, C3’ và C5’ đối
xứng và có cùng độ dịch chuyển hóa học trên phổ đồ, cường độ tín hiệu
mạnh. Hai chất 17b, 20b có nhóm thế 4-F nên còn xuất hiện tương tác
C4’-F và ảnh hưởng từ trường của flo làm tách đôi tín hiệu của các
carbon C3’ và C5’, C2’ và C6’ (hình 4.14).
18

Hình 4.14. Phổ
13
C-NMR dãn rộng của chất 20b
Từ kết quả biện luận các loại phổ đồ, có thể khẳng định các chất 17a-
c, f, h và 20a-h có cấu trúc đúng như dự kiến và sản phẩm tinh khiết.
4.2.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của acid hydroxamic mang vòng
thiazol
Chất 23 mang vòng thiazol được thiết kế với mục đích khảo sát ảnh
hưởng của nhóm nhận diện bề mặt đến hoạt tính sinh học. Kết quả các
dữ liệu phổ cộng hưởng từ
1
H-NMR và
13
C-NMR của chất 23 cho thấy
xuất hiện đầy đủ tín hiệu của proton cũng như carbon trong cấu trúc. Kết
quả cho phép khẳng định chất 23 đã được tổng hợp và sản phẩm tinh
khiết.
4.3. Hoạt tính sinh học
Dựa trên cấu trúc của acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA), 51
dẫn chất acid hydroxamic của luận án được thiết kế với đích tác dụng
hướng ức chế HDAC.
4.3.1. Các acid hydroxamic mang khung benzothiazol
Từ cấu trúc của SAHA và qua tham khảo nhiều bài báo, dãy dẫn chất
đầu tiên được tổng hợp có cấu trúc nhân phenyl thay bằng vòng
benzothiazol. Do nhóm khóa hoạt động thay đổi nên phải khảo sát xác
định độ dài thích hợp của phần cầu nối. Lựa chọn độ dài cầu nối đầu tiên
là 2 carbon (chất 3a-f). Kết quả phân tích Western blot để xác định khả
năng ức chế HDAC ở nồng độ 10 g/ml cho thấy các chất 3a-f không có
tác dụng đồng thời cũng không gây độc trên dòng tế bào SW620 thử

nghiệm. Như vậy, có lẽ mạch 2 carbon còn ngắn nên độ dài cầu nối tăng
thành 3, 4 carbon thu được các dẫn chất 5a-f, 7a-f. Kết quả Western blot
cho thấy các chất 7a-d đã có tác dụng ở nồng độ 10 g/ml. Đối với hoạt
19
tính kháng dòng tế bào ung thư người, các chất 5a-f cầu nối 3C đã bắt
đầu có hoạt tính nhưng còn yếu (bảng 3.16). Với các chất cầu nối 4C,
độc tính tế bào đã được cải thiện. Các chất 7a-d có tác dụng ức chế trên
cả 5 dòng tế bào. Như vậy, chất 7a-d có ức chế HDAC bằng thử nghiệm
Western blot, đồng thời ức chế sự phát triển của cả 5 dòng tế bào. Từ
mối tương quan này có thể đưa ra nhận xét bước đầu rằng cơ chế gây độc
tế bào của các acid benzothiazol-hydroxamic này là do ức chế HDAC.
Tiếp tục kéo dài mạch thành 6C (cầu nối tương tự SAHA), tổng hợp
được 8 dẫn chất 9a-h. Ở nồng độ 1 g/ml, hầu hết các chất đều thể hiện
tác dụng ức chế HDAC, minh họa bằng hình ảnh điện di trên gel của 6
chất 9a-f (hình 4.20).

Hình 4.20. Kết quả phân tích Western blot của các chất 9a-f
Kết quả thử độc tính tế bào in vitro cũng khá tương đồng với tác dụng
ức chế HDAC. Chất 9a không có nhóm thế trên vòng benzothiazol ức
chế 5 dòng tế bào với giá trị IC
50
4,01-6,61 µg/ml. Khi gắn nhóm thế vào
vị trí số 6 trên vòng benzothiazol, hoạt tính tăng lên rõ rệt. Các chất có
nhóm thế đẩy điện tử như -CH
3
, -OCH
3
cho tác dụng mạnh hơn so với
chất 9a. Chất 9b (nhóm thế 6-CH
3

) cho giá trị IC
50
trên 4 dòng tế bào
tương đương SAHA (bảng 3.16). Chất 9g (nhóm thế 6-Cl) cho hoạt tính
mạnh nhất. Trên 3 dòng tế bào SW620, AsPC-1 và NCI-H460, 9g có tác
dụng mạnh gần gấp đôi so với SAHA, giá trị IC
50
= 0,32; 0,34; 0,39
µg/ml (tương ứng với từng dòng tế bào) so với của SAHA là 0,50; 0,69;
0,68 µg/ml. Với dòng PC-3, tác dụng gần tương đương nhau với IC
50
(9g) = 0,82 µg/ml và IC
50
(SAHA) = 0,94 µg/ml. Nhìn vào bảng độc tính
tế bào nhận thấy tất cả 8 chất đều tác dụng trên MCF-7 yếu hơn SAHA
từ 6 lần trở lên. Có lẽ là do dòng tế bào MCF-7 nhạy cảm hơn với
SAHA. Bên cạnh đó, chất có nhóm thế hút điện tử như 9f (nhóm -NO
2
)
cũng cho hoạt tính tốt, đặc biệt trên dòng SW620, 9f tác dụng mạnh hơn
cả SAHA. Tuy nhiên, chất có nhóm hút điện tử khác là –SO
2
CH
3
(9e) và
chất có nhóm đẩy điện tử -OC
2
H
5
(9d) cho kết quả âm tính trên thử

nghiệm Western blot, độc tính trên 5 dòng tế bào cũng rất kém. Hoạt tính
ức chế sự phát triển tế bào của 2 chất này yếu hơn cả 9a là chất không
Acetyl
-
histone
-
H3

Acetyl
-
histone
-
H4

GAPDH

Tr
ắ
ng

9a

9b

9c

9d

9e

9f

17kDa
11kDa
SAHA

20
gắn nhóm thế. Như vậy, việc gắn các nhóm thế nhỏ vào vị trí 6 trên vòng
benzothiazol đem lại hoạt tính tốt. Các nhóm thế cồng kềnh có vẻ không
thích hợp cho tương tác với phần vành của túi enzym, từ đó dẫn đến
giảm hoạt tính ức chế HDAC và ức chế sự phát triển tế bào. Mặt khác,
không quan sát thấy ảnh hưởng của tính chất hút - đẩy điện tử của các
nhóm thế đến hoạt tính sinh học của các acid benzothiazol-hydroxamic.
Lựa chọn được độ dài cầu nối, tổng hợp chất 23 có vòng thiazol thay
cho vòng benzothiazol. Độc tính của chất 23 trên 5 dòng tế bào thử
nghiệm đều lớn hơn so với chất 9a (bảng 3.16).
Từ kết quả thử hoạt tính sinh học có thể thấy các acid benzothiazol-
hydroxamic cầu nối 6 carbon cho tác dụng tốt nhất. Điều này một lần
nữa khẳng định sự phù hợp của vòng benzothiazol cho vai trò nhóm
khóa hoạt động và cầu nối 6 carbon trong thiết kế các acid hydroxamic
hướng ức chế HDAC của luận án.
4.3.2. Các acid hydroxamic mạch alkyl có liên kết amid
Qua tham khảo nhiều bài báo, việc thay đổi cầu nối alkyl cũng là
hướng tổng hợp được nhiều nhóm nghiên cứu quan tâm. Việc đưa dị tố
vào cầu nối alkyl đã được nhiều nhóm nghiên cứu thực hiện nhưng dị tố
N chưa được nhóm nghiên cứu nào sử dụng. Vì vậy, từ các acid
hydroxamic 9a-h, giữ nguyên vòng benzothiazol, thiết kế thay hai nhóm
methylen ở cầu nối bằng liên kết amid, thu được các chất 11a-d và 13a-f.
Song song, các dẫn chất 17 và 20 với cầu nối giống hệt các chất 11a-
d và 13a-f được tổng hợp nhưng nhân phenyl với các nhóm thế khác

nhau đóng vai trò nhóm khóa hoạt động. Nói cách khác, các dẫn chất 17
và 20 là dẫn chất của SAHA với cầu nối đưa liên kết amid vào thay cho
2 nhóm methylen. Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC bằng Western
blot ở nồng độ 10 µg/ml cho thấy các dẫn chất của 4 dãy trên đều không
ức chế HDAC nên histon H3, H4 đều bị deacetyl hóa. Trên hình ảnh điện
di gel không còn quan sát thấy acetyl histon H3, H4 (hình 4.24).

Hình 4.24. Kết quả phân tích Western blot của một số chất đại
diện dãy 13 và 20

21
Tương đồng với tác dụng ức chế HDAC, thử nghiệm trên dòng tế bào
SW620 của các dẫn chất cả 4 dãy đều không có hoạt tính với giá trị IC
50

lớn hơn 30 µg/ml. Xét về cấu trúc, dãy 17 và 20 khá tương đồng với
SAHA. Tuy nhiên, liên kết C-C có độ dài 1,5Å trong khi liên kết C-N độ
dài ngắn hơn khoảng 1,35Å. Do đó, việc thay liên kết -CH
2
-CH
2
- bằng
liên kết amid -CONH- làm độ dài cầu nối ngắn lại. Có thể điều đó dẫn
đến giảm hoạt tính của các chất. Theo hướng giả thuyết đó, chất 26 được
tổng hợp với cầu nối vẫn có 1 liên kết amid nhưng độ dài mạch tăng
thêm 2 nhóm methylen. Tuy nhiên, chất 26 vẫn không ức chế HDAC
đồng thời không kháng dòng tế bào SW620. Như vậy, độ dài cầu nối
không phải là yếu tố chính làm giảm hoạt tính mà có lẽ sự có mặt của
liên kết amid là yếu tố gây nên sự giảm hoạt tính này. Liên kết amid làm
cho mạch alkyl phân cực hơn trong khi kênh enzym thân dầu đồng thời

tạo liên kết hydro với các acid amin của phần vành trên miệng túi enzym.
Như vậy, thực chất phần cầu nối bị ngắn lại, nhóm chức -NHOH không
đến gần được ion Zn
2+
trong trung tâm hoạt động nên không ức chế được
HDAC và do đó cũng không gây độc với tế bào.
Như vậy, thay thế cấu trúc của phần cầu nối bằng cách đưa thêm liên
kết amid mang lại cấu trúc không thuận lợi cho hoạt tính nên không thu
được các chất ức chế HDAC như mong đợi.
4.3.3. Docking
Để bước đầu lý giải sự khác nhau về tác dụng ức chế HDAC của các
hợp chất do ảnh hưởng của cấu trúc, các chất 9a-h, 23 được tiến hành
docking, sử dụng chương trình AutoDock Vina. Phân tích docking được
tiến hành với HDAC8. Tiến hành docking độc lập SAHA, các chất 9a-h
và chất 23 với HDAC8 cho thấy các hợp chất này gắn kết với ái lực khác
nhau vào trung tâm hoạt động của protein này (bảng 4.6). Kết quả cho
thấy các chất đều có ái lực với HDAC8 mạnh hơn so với SAHA. Tuy
nhiên, nhìn vào hình ảnh docking của các chất so với SAHA vào
HDAC8 thấy rằng cấu trúc của nhóm khóa hoạt động khác nhau làm
thuận lợi hay cản trở nhóm hydroxamat tiến gần đến ion Zn
2+
. Chất
không có nhóm thế (9a) hoặc có nhóm thế nhỏ trên vòng benzothiazol
như -CH
3
(9b), -OCH
3
(9c), -Cl (9g), -CF
3
(9h), nhóm hydroxamic tiến

được gần đến ion Zn
2+
ở trung tâm hoạt động nên ức chế HDAC mạnh.
Trong khi đó, nhóm thế cồng kềnh gắn vào vòng benzothiazol làm phần
cầu nối methylen bị vặn xoắn, kéo nhóm hydroxamat ra xa ion Zn
2+
hơn
so với SAHA. Do đó, hoạt tính ức chế HDAC của các chất 9d, 9e yếu
hơn các chất nhóm thế nhỏ. Vòng benzothiazol của các chất 9b, 9g, 9h
tiến sâu hơn vào túi enzym, nơi mà nó có thể tương tác kỵ nước nhiều
22
hơn với các acid amin của túi. Chính các tương tác thêm này có thể giải
thích cho hoạt lực mạnh hơn của các chất 9b, 9g, 9h so với SAHA và
các chất khác trong cùng dãy 9. Ngoài ra, khi thay vòng benzothiazol
bằng vòng thiazol, chất 23 có hình ảnh docking vào túi enzym tương tự
SAHA. Vì vậy, ái lực với HDAC8 yếu hơn một số chất dãy 9.
Bảng 4.6. Năng lượng liên kết với trung tâm hoạt động của HDAC
TT Chất R kcal/mol TT Chất R kcal/mol
1 9a -H -6,4 6 9f -NO
2
-5,4
2 9b -CH
3
-6,1 7 9g -Cl -6,7
3 9c -OCH
3
-6,1 8 9h -CF
3
-6,8
4 9d -OC

2
H
5
-6,0 9 23

-5,5
5 9e -SO
2
CH
3
-4,7 10 SAHA

-4,4
Kết quả docking cũng phù hợp với kết quả hoạt tính ức chế HDAC và
độc tính tế bào của các chất. Dựa trên kết quả đạt được, có thể khẳng
định vòng benzothiazol gắn nhóm thế nhỏ phù hợp cho vai trò là nhóm
khóa hoạt động thay cho nhân phenyl của SAHA.
4.3.4. Hoạt tính kháng tế bào ung thư in vivo
Chất 9g có hoạt tính tốt nhất nên được lựa chọn thử độc tính in vivo
trên tế bào ung thư PC-3. Phần trăm ức chế sự phát triển của khối u của
mẫu thử ở liều khác nhau được xác định dựa trên so sánh với mẫu trắng
đối chiếu. Kết quả ở liều 30 mg/kg, chất 9g ức chế 49,00% sự phát triển
của khối u, tương đương với SAHA (48,30%) (bảng 4.7, hình 4.29).
Bảng 4.7.
Kết quả ức chế sự phát triển khối u in vivo của chất 9g ở các
liều khác nhau với dòng tế bào ung thư PC-3
Chất
Liều
(mg/kg)
Số chuột/thí

nghiệm (con)
Thay đổi cân
nặng của chuột
(%)
d

Khối lượng
khối u (mg)
Tỷ lệ ức chế
phát triển
khối u (%)
Trắng 0 7 114,7± 1,43 733,4±180,5
9g
3 7 109,4± 3,14
b
567,5±232,2 22,65
10 7 106,8± 5,45
b
429,5±114,2
b
41,44
30 7 108,5± 5,42
a
374,0±77,7
c
49,00
SAHA 30 7 110,4± 9,79 379,2±54,4
c
48,30
* Chú thích:(t-TEST): a: p<0,05, b: p<0,01, c: p<0,001 so với nhóm trắng đối chiếu; d:

Cân nặng sau 21 ngày thí nghiệm.
23

Hình 4.29. Sự thay đổi kích thước khối u trung bình của nhóm thử so với
SAHA

Để sơ bộ đánh giá độc tính của chất 9g trên động vật, cân nặng của
chuột được theo dõi trong toàn bộ quá trình thí nghiệm (hình 4.30). Kết
quả không quan sát thấy độc tính nghiêm trọng nào và các nhóm đều
không có chuột chết trên trong quá trình thí nghiệm.

Hình 4.30. Sự thay đổi cân nặng của chuột trong quá trình thí nghiệm
Tóm lại, kết quả trên cho thấy 9g cần được nghiên cứu sâu hơn và rất
có triển vọng để trở thành ứng viên thử nghiệm lâm sàng.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
1) Về tổng hợp và khẳng định cấu trúc của các chất
Đã tổng hợp được 51 dẫn chất acid hydroxamic mới, chưa thấy công
bố trong các tài liệu tham khảo được. 51 dẫn chất này được chia thành 2
nhóm cấu trúc:
- Các acid hydroxamic mang khung benzothiazol (dãy chất 3, 5, 7, 9,
11 và 13) (36 chất) có cấu trúc vòng thơm là khung benzothiazol, độ dài
cầu nối giữa vòng thơm và nhóm chức acid hydroxamic thay đổi từ 2 - 6
carbon.