Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất acid hydroxamic hướng ức chế enzym histon deacetylase

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI




ĐÀO THỊ KIM OANH



TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH
SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT
ACID HYDROXAMIC HƯỚNG ỨC CHẾ
ENZYM HISTON DEACETYLASE



LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC





HÀ NỘI 2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



ĐÀO THỊ KIM OANH



TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH
SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT
ACID HYDROXAMIC HƯỚNG ỨC CHẾ
ENZYM HISTON DEACETYLASE


LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC


CHUYÊN NGÀNH HÓA DƯỢC
MÃ SỐ: 62.72.04.03


Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Hải Nam
GS.TS. Sang-Bae Han


HÀ NỘI 2013

i

LỜI CAM ĐOAN


Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và
chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận án



Đào Thị Kim Oanh
ii
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự giúp đỡ
quý báu của các thầy cô giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng đồng
nghiệp, gia đình và bạn bè.
Đầu tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sự biết ơn sâu sắc tới
PGS.TS. Nguyễn Hải Nam, GS.TS. Sang-Bae Han, những người thầy đã tận tình
hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu cả ở Việt
Nam và Hàn Quốc.
Tôi xin chân thành cảm ơn các đồng nghiệp tại bộ môn Hóa dược đã ủng hộ,
động viên tôi trong quá trình nghiên cứu.
Trong thời gian thực hiện luận án, tôi đã nhận được sự phối hợp, giúp đỡ của
các cá nhân, đơn vị trong và ngoài trường. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị
Phòng thí nghiệm trung tâm – Trường đại học Dược Hà Nội, Khoa hóa học – Trường
đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Phòng cộng hưởng từ - Viện
hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Phòng khối phổ - Viện hóa học các

hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, các bạn nghiên cứu
sinh của bộ môn Dược lý, Khoa Dược, Trường đại học Quốc gia Chungbuk
(Cheongju, Hàn Quốc).
Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban giám hiệu, Phòng đào tạo sau đại học,
các bộ môn và phòng ban chức năng – Trường đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập và hoàn thành luận án này.
Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới chồng và hai con trai, người thân, bạn
bè đã luôn là những người động viên, là động lực giúp tôi phấn đấu hoàn thành luận
án.
Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu mà mọi
người đã dành cho tôi.
Đào Thị Kim Oanh

iii
MỤC LỤC
Trang

Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình vẽ, sơ đồ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2

1.1. Histon deacetylase 2

1.1.1. Histon acetyltransferase 4

1.1.2. Histon deacetylase 4

1.1.2.1. Phân loại 5

1.1.2.2. Cấu trúc của HDAC và cơ chế phản ứng deacetyl hóa 7

1.1.3. Mối liên quan giữa ung thư và sự bất thường hoạt động của HAT
hoặc HDAC
10

1.2. Các chất ức chế HDAC 11

1.2.1. Phân loại 11

1.2.2. Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC 14

1.2.3. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC 17

1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về các chất ức chế HDAC 18

1.3.1. Các peptid vòng 19

1.3.2. Dẫn chất benzamid 20

1.3.3. Các acid béo mạch ngắn 21

1.3.4. Các dẫn chất ceton 22

1.3.5. Các hydroxamat và dẫn chất 22

1.3.5.1. Thay đổi cầu nối 24

1.3.5.2. Thay đổi nhóm khóa hoạt động 29

1.3.5.3. Thay đổi nhóm chức hydroxamic 34

1.4. Các phương pháp tạo liên kết amid và tổng hợp acid hydroxamic 39

1.4.1. Các phương pháp tạo liên kết amid 39

1.4.1.1. Acyl halid 40

1.4.1.2. Acyl azid 41

iv
1.4.1.3. Acylimidazol 41

1.4.1.4. Anhydrid 42

1.4.1.5. Ester 43

1.4.2. Các phương pháp tổng hợp acid hydroxamic 45

1.4.2.1. Tổng hợp acid hydroxamic từ ester 45

1.4.2.2. Tổng hợp acid hydroxamic từ acid carboxylic 45

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU

47

2.1. Nguyên liệu 47

2.2. Thiết bị 48

2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 49

2.3.1. Nội dung nghiên cứu 49

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu 49

2.3.2.1. Phương pháp tổng hợp 49

2.3.2.2. Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết 51

2.3.2.3 Phương pháp phân tích cấu trúc 52

2.3.2.4. Phương pháp thử hoạt tính sinh học 53

2.3.2.5. Docking 56

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 57

3.1. Tổng hợp hóa học và phân tích dữ liệu phổ 57

3.1.1. Các dẫn chất N
1
-(benzo[d]thiazol-2-yl)-N
4

-hydroxysuccinamid và
N
1
-(benzo[d]thiazol-2-yl)-N
5
-hydroxyglutaramid
57

3.1.1.1. Kết quả tổng hợp 57

3.1.1.2. Kết quả phân tích phổ của các dẫn chất
3a
-
f
và
5a
-
f
63

3.1.2. Các dẫn chất N
1
-(benzo[d]thiazol-2-yl)-N
6
-hydroxyadipamid và
N
1
-(benzo[d]thiazol-2-yl)-N
8
-hydroxyoctandiamid

66

3.1.2.1. Kết quả tổng hợp 66

3.1.2.2. Kết quả phân tích phổ của các dẫn chất
7a
-
f
và
9a
-
h
73

3.1.3. Tổng hợp chất N
1
-(thiazol-2-yl)-N
8
-hydroxyoctandiamid

(
23
)

76

3.1.4. Các dẫn chất N
1
-(benzo[d]thiazol-2-yl)-N
4

-(3-(hydroxyamino)-3-
oxopropyl)succinamid và N
1
-(benzo[d]thiazol-2-yl)-N
5
-(2-(hydroxy
amino)-2-oxoethyl)glutaramid
77

v
3.1.4.1. Kết quả tổng hợp 77

3.1.4.2. Kết quả phân tích phổ của các dẫn chất
1
1a
-
d
và
13a
-
f
82

3.1.5. Các dẫn chất N
1
-(3-(hydroxyamino)-3-oxopropyl)-N
4
-
phenylsuccinamid và N
1

-(2-(hydroxyamino)2-oxoethyl)-N
5
-phenyl
glutaramid
85

3.1.5.1. Kết quả tổng hợp 85

3.1.5.2. Kết quả phân tích phổ của các dẫn chất
17a
-
c, f, h
và
20a
-
h
93

3.1.6. Tổng hợp N
1
-(4-clorophenyl)-N
6
-(3-(hydroxyamino)-3-oxopropyl)
adipamid (26)
97

3.2. Hoạt tính sinh học 102

3.2.1. Tác dụng ức chế HDAC 102

3.2.2. Hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro 105

3.2.3. Hoạt tinh kháng tế bào ung thư in vivo 107

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 110

4.1. Tổng hợp hóa học 110

4.1.1. Tác nhân acyl hóa là anhydrid acid 110

4.1.2. Tác nhân acyl hóa là acid carboxylic 111

4.1.3. Tác nhân acyl hóa là ester 117

4.2. Khẳng định cấu trúc 118

4.2.1. Phổ hồng ngoại 118

4.2.2. Phổ khối lượng 120

4.2.2.1. Phân tích cụm pic ion phân tử 121

4.2.2.2. Cơ chế phá mảnh của phân tử theo cấu trúc dự kiến 122

4.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 126

4.2.3.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các acid hydroxamic mang
khung benzothiazol
126

4.2.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các acid hydroxamic mang
vòng phenyl
134

4.2.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của acid hydroxamic mang vòng
thiazol
137

4.3. Hoạt tính sinh học 138

4.3.1. Các acid hydroxamic mang khung benzothiazol 138

4.3.2. Các acid hydroxamic mạch alkyl có liên kết amid

143

vi
4.3.3. Docking 147

4.3.4. Hoạt tính kháng tế bào ung thư in vivo 148

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 151

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

vii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

(ppm)
Độ dịch chuyển hóa học (phần triệu)
13
C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (
13
C-Nuclear Magnetic
Resonance)
1
H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (
1
H-Nuclear Magnetic Resonance)
AcOH Acid acetic
ADN Acid desoxyribonucleic
AsPC-1 Dòng tế bào ung thư tụy người
BCL2 B-cell lymphoma 2
CBFb Core-binding factor subunit beta
CBP Cyclic-AMP response element-binding protein
CDI Carbonyl diimidazol
CTPT Công thức phân tử
DCC Dicyclohexyl carbodiimid
DCM Dicloromethan
DMEM Dulbecco’s modified Eagle medium
DMF Dimethylformamid
DMSO-d
6
Dimethylsulfoxid deutri hóa
ESI Ion hóa phun bụi điện tử (Electron Spray Ionization)
FBS Huyết thanh bào thai bò (Fetal bovine serum)

FDA Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm mỹ
HAT Histon acetyltransferase
HATU N-[(dimethylamino)-1H-1,2,3-triazol[4,5-b]pyridin-1ylmethylen]-N-
methylmethanaminium hexafluorophosphat
HDAC Histon deacetylase
HDIs Các chất ức chế HDAC
HDLP Histone deacetylase-like protein
HMBC Phổ tương tác đa liên kết dị nhân
HOBt 1-hydroxybenzotriazol
HSQC Phổ tương tác dị nhân qua một liên kết
IC
50
Nồng độ ức chế 50%
IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectrometry)
i Dịch chuyển điện tích
J Hằng số tương tác (Hz)
MCF-7 Tế bào ung thư vú người
MeOH Methanol
MOZ Monocytic leukemia zinc-finger protein
viii
MS Phổ khối lượng (Mass Spectrometry)
MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid
NCI-H460 Tế bào ung thư phổi người
PBS Đệm phosphat (Phosphat buffered saline)
PC-3 Tế bào ung thư tiền liệt tuyến người
PCl
3
Phosphor triclorid
PCl
5

Phosphor pentaclorid
POCl
3
Phosphor oxyclorid
PVDF Màng polyvinyliden difluorid
rH Dịch chuyển hydro

RAR
Receptor acid retinoic
ROS Reactive oxygen species
RPMI Môi trường nuôi cấy tế bào
SAHA Acid suberoylanilid hydroxamic
SDS-PAGE Gel SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfat polyacrylamid gel
electrophoresis)
Sin 3 Protein ức chế phiên mã
SMMHC Tế bào cơ (Smooth muscle myosin heavy chain)
SW620 Tế bào ung thư đại tràng người
TSA Trichostatin A
t
o
C Nhiệt độ nóng chảy
WAF1 Chất ức chế kinase phụ thuộc cyclin
ZBG Nhóm gắn ion Zn
2+


ix
DANH MỤC CÁC BẢNG
TT

Tên bảng Trang

1 Bảng 1.1 Phân loại các chất ức chế HDAC 13

2 Bảng 1.2 Các chất ức chế HDAC đã và đang được thử lâm sàng 19

3 Bảng 1.3 Tác dụng ức chế HDAC2 và độc tính tế bào của dẫn chất
-alkoxy (AH10)
28

4 Bảng 3.1 Kết quả phân tích phổ khối của các chất
3a
-
f
,
5a
-
f
64

5 Bảng 3.2 Kết quả phân tích phổ
1
H-NMR của các chất
3a
-
f
,
5a
-
f

64

6 Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ
13
C-NMR của các chất
5a
-
f
66

7 Bảng 3.4 Kết quả phân tích phổ khối của các chất
7a
-
f
,
9a
-
h
73

8 Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ
1
H-NMR của các chất
7a
-
f
,
9a
-
h

73

9 Bảng 3.6 Kết quả phân tích phổ
13
C-NMR của các chất
7a
-
f
,
9a
-
h
75

10 Bảng 3.7 Kết quả phân tích phổ khối của các chất
11a
-
d
,
13a
-
f
82

11 Bảng 3.8 Kết quả phân tích phổ
1
H-NMR của các chất
11a
-
d

,
13a
-
f
83

12 Bảng 3.9 Kết quả phân tích phổ
13
C-NMR của các chất
11a
-
d
,
13a
-
f
85

13 Bảng 3.10 Kết quả phân tích phổ khối của các chất
17a
-
c,

f,

h
,
20a
-
h

93

14 Bảng 3.11 Kết quả phân tích phổ
1
H-NMR của các chất
17a
-
c,f,h
,
20a-h
93

15 Bảng 3.12 Kết quả phân tích phổ
13
C-NMR của các chất
17a
-
c,f,h
,
20a-h
96

16 Bảng 3.13 Tóm tắt kết quả tổng hợp các dẫn chất trong luận án 98

17 Bảng 3.14 Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp 102

18 Bảng 3.15 Kết quả định lượng tác dụng ức chế HDAC2 của các chất
9a-h, 23
104

19 Bảng 3.16 Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư người in vitro 105

20 Bảng 3.17 Sự thay đổi kích thước và khối lượng của khối u trên chuột
ở nhóm thử, nhóm trắng đối chiếu và SAHA
107

21 Bảng 3.18 Phần trăm thay đổi cân nặng của chuột trong quá trình thí
nghiệm
108

22 Bảng 4.1 Cường độ cụm pic ion phân tử của chất
7a
122

x
TT

Tên bảng Trang

23 Bảng 4.2 Dữ liệu các phổ cộng hưởng từ hạt nhân của chất
9g
132

24 Bảng 4.3 Dữ liệu phổ
1
H-NMR và
13
C-NMR của chất
23
137

25 Bảng 4.4 Tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào in vitro của các
chất 7a-f
140

26 Bảng 4.5 Tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào in vitro của các
chất 9a-h
141

27 Bảng 4.6 Năng lượng liên kết với trung tâm hoạt động của HDAC 147

28 Bảng 4.7 Kết quả ức chế sự phát triển khối u in vivo của chất
9g
ở
các liều khác nhau với dòng tế bào ung thư PC-3
149

xi
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ
HÌNH VẼ
TT Tên hình Trang

1 Hình 1.1 Sơ đồ cấu tạo nucleosom 3

2 Hình 1.2 HAT và HDAC điều hòa quá trình phiên mã 3

3 Hình 1.3 Phân loại HDAC ở người 7

4 Hình 1.4 Cấu trúc HDAC8 8

5 Hình 1.5 Cấu trúc vị trí hoạt động của HDLP khi liên kết với phần
acetyl-lysin của histon (trái) và Trichostatin A (phải)
9

6 Hình 1.6 Cơ chế phản ứng deacetyl hóa theo Finnin 9

7 Hình 1.7 Điều hòa sự phát triển và sống sót của tế bào bởi các chất
ức chế HDAC
14

8 Hình 1.8 Các chất ức chế HDAC thúc đẩy sự chết tế bào 16

9 Hình 1.9 Công thức cổ điển của HDI và vị trí của HDI trong túi
enzym HDAC
18

10 Hình 1.10

HDIs có cấu trúc peptid vòng 20

11 Hình 1.11

HDIs là các benzamid 21

12 Hình 1.12

HDIs là các acid béo mạch ngắn 21

13 Hình 1.13

HDIs là các dẫn chất ceton 22

14 Hình 1.14

HDIs có cấu trúc hydroxamat 23

15 Hình 1.15

Các dẫn chất N-hydroxy-2-propenamid 24

16 Hình 1.16

a) Các acid biphenyl-4-yl-acrylohydroxamic (
AH2
); b)
Các dẫn chất với cầu nối có hai liên kết đôi (AH3) và
dạng khử hóa của AH3 (AH4)
25

17 Hình 1.17

Một số dẫn chất có liên quan của
AH2
b
25

18 Hình 1.18

Các dẫn chất amid ngược của SAHA 26

19 Hình 1.19

Các aryloxyalkanoic N-hydroxyamid (
AH9
) 26

20 Hình 1.20

Cấu trúc của amamistatin A, B 27

21 Hình 1.21

Các dẫn chất

-alkoxy của SAHA
27

22 Hình 1.22

Cấu trúc của dẫn chất p-methoxybenzyl ether (
AH10
)
28

xii
TT Tên hình Trang

23 Hình 1.23

Một số dẫn chất


-alkyl của SAHA
29

24 Hình 1.24

Các acid phenylthiazol hydroxamic tương tự SAHA 29

25 Hình 1.25

Một số acid phenylthiazol hydroxamic 30

26 Hình 1.26

Các dẫn chất acid biphenyl-hydroxamic 30

27 Hình 1.27

Các acid isoxazol-hydroxamic 31

28 Hình 1.28

ADS100380 32

29 Hình 1.29

Các định hướng tối ưu hóa cấu trúc của ADS102550 32

30 Hình 1.30

Các arylthiophen hydroxamat 33

31 Hình 1.31

Các acid pyridin-thiophen-hydroxamic 33

32 Hình 1.32

Các dẫn chất biphenyl sulfamid 34

33 Hình 1.33

Một số dẫn chất sulfamid khác 34

34 Hình 1.34

Các dẫn chất sulfamid không mang cầu nối amid 35

35 Hình 1.35

Một số dẫn chất trithiocarbonat 35

36 Hình 1.36

Một số trithiocarbonat khác và chất tương tự 36

37 Hình 1.37

Các dẫn chất thiol 36

38 Hình 1.38

Từ disulfid đến KD5170 37

39 Hình 1.39

Sự thủy phân và tạo chelat với Zn
2+
của KD5170 37

40 Hình 1.40

a) Tổng hợp amid thông qua tạo ester hoạt hóa; b) Một số
alcol hay dùng
44

41 Hình 3.1 Công thức cấu tạo của
23
77

42 Hình 3.2 Công thức cấu tạo của
26
98

43 Hình 3.3 Hình ảnh khối u của nhóm thử, nhóm trắng đối chiếu và
SAHA
108

44 Hình 4.1 Phản ứng thế ái nhân acyl 110

45 Hình 4.2 Một số hydroxylamin có gắn nhóm bảo vệ 115

46 Hình 4.3 Công thức cấu tạo chung của 51 chất tổng hợp được 118

47 Hình 4.4 Phổ hồng ngoại của chất
5e
120

48 Hình 4.5 Phổ khối lượng của chất
7a
121

49 Hình 4.6 Phổ khối lượng của chất
20f
124

50 Hình 4.7 Phổ
1
H-NMR dãn rộng của chất
5a
127

xiii
TT Tên hình Trang

51 Hình 4.8 Phổ
1
H-NMR dãn rộng của chất
9f
128

52 Hình 4.9 a) Phổ
1
H-NMR; b) Phổ
13
C-NMR của chất
9g
130

53 Hình 4.10

Phổ tương tác đơn lượng tử dị nhân – HSQC của chất
9g
130

54 Hình 4.11

Phổ tương tác đa liên kết dị nhân - HMBC của chất
9g
132

55 Hình 4.12

Phổ
1
H-NMR dãn rộng của chất
20f
135

56 Hình 4.13

Ảnh hưởng của từ trường flo lên carbon và hằng số tương
tác (J)
136

57 Hình 4.14

Phổ
13
C-NMR dãn rộng của chất
20b
136

58 Hình 4.15

Cấu trúc của TSA và SAHA 138

59 Hình 4.16

Công thức cấu tạo của các acid hydroxamic
3a
-
f
139

60 Hình 4.17

Các acid hydroxamic
5a
-

f
,
7a
-
f
139

61 Hình 4.18

Kết quả phân tích Western blot của các chất
7a
-
f
139

62 Hình 4.19

Cấu trúc các acid hydroxamic
9a
-
h
140

63 Hình 4.20

Kết quả phân tích Western blot của các chất
9a
-
f
141

64 Hình 4.21

Tổng hợp các aryltriazolylhydroxamat
27a
-
d
142

65 Hình 4.22

Cấu trúc của các acid hydroxamic
11a
-
d
và
13a
-
f
143

66 Hình 4.23

Cấu trúc của các acid hydroxamic
17a
-
c, f,
h
và
20a

-
h
144

67 Hình 4.24

Kết quả phân tích Western blot của một số chất đại diện
dãy 13 và 20
144

68 Hình 4.25

Cấu trúc không gian của
SAHA
,
17a
và
20a
145

69 Hình 4.26

Cấu trúc các acid

-lactam-hydroxamic
146

70 Hình 4.27

Cấu trúc chung của các dẫn chất homo-oxa-SAHA 146

71 Hình 4.28

Docking của chất
9g
(màu cam),
9h
(màu tím hồng) và
SAHA (màu xanh lá) với HDAC8
148

72 Hình 4.29

Sự thay đổi kích thước khối u trung bình của nhóm thử so
với SAHA
149

73 Hình 4.30

Sự thay đổi cân nặng của chuột trong quá trình thí nghiệm 150



xiv
SƠ ĐỒ
TT Tên sơ đồ Trang

1 Sơ đồ 1.1 Phản ứng tạo liên kết amid trực tiếp 39

2 Sơ đồ 1.2 Phản ứng tạo liên kết amid thông qua acid hoạt hóa 40

3 Sơ đồ 1.3 a) Phản ứng tạo acyl clorid; b) Tổng hợp amid 40

4 Sơ đồ 1.4 Vai trò xúc tác của pyridin 41

5 Sơ đồ 1.5 Tổng hợp amid thông qua tạo acyl azid 41

6 Sơ đồ 1.6 Tổng hợp amid sử dụng tác nhân hoạt hóa CDI 42

7 Sơ đồ 1.7 Tổng hợp amid sử dụng tác nhân hoạt hóa DCC 43

8 Sơ đồ 1.8 Tổng hợp amid sử dụng tác nhân hoạt hóa ethyl
cloroformat
43

9 Sơ đồ 1.9 Tổng hợp amid sử dụng tác nhân BOP 44

10 Sơ đồ 1.10 Tổng hợp một số dẫn chất amid ngược của SAHA 45

11 Sơ đồ 1.11 Tổng hợp acid biaryl hydroxamic 46

12 Sơ đồ 1.12 Tổng hợp các acid phenylthiazol hydroxamic 46

13 Sơ đồ 3.1 Tổng hợp các dẫn chất
3a
-
f
,
5a
-

f
57

14 Sơ đồ 3.2 Tổng hợp N
1
-(6-nitrobenzo[d]thiazol-2-yl)-N
5
-
hydroxyglutaramid (5f)
63

15 Sơ đồ 3.3 Tổng hợp các dẫn chất
7a
-
f
và
9a
-
h
66

16 Sơ đồ 3.4 Tổng hợp N
1
-(thiazol-2-yl)-N
8
-hydroxyoctandiamid (
23
) 76

17 Sơ đồ 3.5 Tổng hợp các dẫn chất

11a
-
d
và
13a
-
f
77

18 Sơ đồ 3.6 Tổng hợp các dẫn chất
17a
-
c, f, h
và
20a
-
h
86

19 Sơ đồ 3.7 Tổng hợp N
1
-(4-clorophenyl)-N
6
-(3-(hydroxyamino)-3-
oxopropyl)adipamid (26)
97

20 Sơ đồ 4.1 Tổng hợp các chất trung gian
2a
-

f
,
4a
-
f
,
15a
-
c
,
15f
,
15h
,
18a-h
110

21 Sơ đồ 4.2 Tổng hợp các acid hydroxamic
3a
-
f
và
5a
-
f
111

22 Sơ đồ 4.3 Tổng hợp acid hydroxamic
3a
-

f
bằng tác nhân hoạt hóa
DCC
112

23 Sơ đồ 4.4 Vai trò của HOBt trong quá trình tạo ester hoạt hóa 113



xv
TT Tên sơ đồ Trang

24 Sơ đồ 4.5 Tổng hợp
3a
-
f
sử dụng tác nhân hoạt hóa isobutyl
cloroformat
113


25 Sơ đồ 4.6 Tổng hợp
3a
-
f
sử dụng tác nhân hoạt hóa CDI 114

26 Sơ đồ 4.7 Tổng hợp acid hydroxamic
5f
115

27 Sơ đồ 4.8 Tổng hợp các ester trung gian của các dãy chất
7
,
9
,
11
,
13, 17, 20 và chất 22
116

28 Sơ đồ 4.9 Tổng hợp ester trung gian
25
116

29 Sơ đồ 4.10 Tổng hợp các aryltriazolylhydroxamat 117

30 Sơ đồ 4.11
Tổng hợp một số dẫn chất

-alkoxy của SAHA
117

31 Sơ đồ 4.12 Cơ chế phản ứng tổng hợp các acid hydroxamic dãy
7
,
9
,
11, 13, 17 và 20, chất 23, 26 từ ester
117

32 Sơ đồ 4.13 Sơ đồ phá mảnh của chất
7
a
123

33 Sơ đồ 4.14 Sơ đồ phá mảnh của chất
20
f

125


1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Những tiến bộ trong các ngành khoa học cơ bản như di truyền học, sinh học
phân tử, sinh học tế bào và đặc biệt là sự ra đời của bản đồ gen người đã giúp cho các
nhà khoa học có những hiểu biết sâu sắc về khối u ở cấp độ phân tử cũng như các quá
trình quyết định sự phát triển của khối u. Do đó, hàng loạt các protein đóng vai trò
quan trọng trong ung thư đồng thời cũng là đích mà các thuốc điều trị ung thư hướng
tới đã được phát hiện như các protein kinase phụ thuộc cyclin, protein gây ung thư
Bcl-2, p53, các farnesyltransferase, histon deacetylase (HDAC), telomerase,
STAT…[27]. Nhờ vậy, việc nghiên cứu và phát triển thuốc điều trị ung thư theo
phương pháp mới hiện nay, phương pháp thiết kế công thức dựa trên đích tác dụng
phân tử, ngày càng đạt được nhiều thành tựu đáng kể.
Một trong những đích tác dụng phân tử đang được chú ý hiện nay là các histon
deacetylase (HDAC). Nghiên cứu về các HDAC đã xác định hoạt động bất thường của
HDAC có liên quan đến nhiều bệnh ung thư. Vì vậy, các chất ức chế HDAC đang trở
thành các tác nhân chống ung thư đầy triển vọng. Acid suberoylanilid hydroxamic
(Zolinza

®
, 2006) và depsipeptid (Romidepsin
®
, 2009) là hai chất ức chế HDAC đã
được Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ (US-FDA) phê duyệt trong điều trị u
lympho da tế bào T [21]. Bên cạnh đó, một số chất ức chế HDAC khác cũng đang
được nghiên cứu và trải qua các pha thử lâm sàng như NVL-LAQ824, MS-275, CI-
994, PXD-101 [21,33,65]. Các chất ức chế HDAC được chia thành 5 nhóm dựa theo
cấu trúc hóa học, trong đó các dẫn chất acid hydroxamic được các nhà khoa học trên
thế giới tập trung nghiên cứu nhiều nhất do cấu trúc đơn giản dễ tổng hợp, hoạt tính ức
chế HDAC mạnh.
Hội nhập với xu hướng nghiên cứu của thế giới và tìm kiếm chất ức chế HDAC
có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt, luận án “Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học
của một số dẫn chất acid hydroxamic hướng ức chế enzym histon deacetylase”
được thực hiện với 2 mục tiêu:
1. Thiết kế và tổng hợp được khoảng 40 - 50 dẫn chất acid hydroxamic mới
hướng ức chế HDAC.
2. Thử tác dụng ức chế HDAC và tác dụng kháng tế bào ung thư của các chất
tổng hợp được.
2
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. HISTON DEACETYLASE
Các nghiên cứu về ung thư đã xác định căn nguyên của bệnh không chỉ do cơ
chế di truyền học mà còn do cơ chế di truyền biểu hiện gen. Cơ chế di truyền biểu hiện
gen liên quan đến những thay đổi trong quá trình biểu hiện gen mà không ảnh hưởng
đến cấu trúc chuỗi ADN. Cơ chế di truyền biểu hiện gen gồm các biến đổi về ADN và
histon như sự methyl hóa, acetyl hóa [25,55,71,90]. Những biến đổi này dẫn đến các
bất thường của quá trình biểu hiện gen thể hiện ở sự phát triển, sự biệt hóa và sự chết
tế bào theo chương trình, kết quả là tăng khả năng biến đổi của tế bào.
Cho đến nay, các nghiên cứu đã chứng minh cấu trúc của nhiễm sắc thể là yếu

tố quan trọng trong điều hòa quá trình biểu hiện gen [11,22,63,71]. Cấu trúc của nhiễm
sắc thể là một phức hợp cấu tạo bởi ADN, các histon và các protein không phải histon
[22,40]. Histon là các protein cơ bản giàu acid amin như lysin, arginin, được chia
thành 5 nhóm chính (H1, H2A, H2B, H3, H4). Từng cặp của H2A, H2B và H3, H4
cùng nhau tạo nên lõi protein octomer hình đĩa. Lõi protein này được quấn quanh bởi
146 cặp ADN tạo nên nucleosom (hình 1.1) [11,22,63,71,77]. Các nucleosom nối với
nhau nhờ phần amino tận của các histon. Bốn cặp histon lõi có 2 phần quan trọng:
phần đuôi C nằm bên trong lõi của nucleosom và phần đầu N với acid amin kết thúc là
lysin nằm bên ngoài nucleosom [63]. Cấu trúc này chịu ảnh hưởng chính bởi sự biến
đổi phần đầu N của histon. Phần đầu N của histon, đặc biệt H3, H4 là nơi diễn ra rất
nhiều quá trình biến đổi khác nhau trong phiên mã như acetyl hóa/deacetyl hóa lysin,
methyl hóa lysin và arginin, phosphoryl hóa serin và ubiquinin, sumoyl hóa lysin
[22,40,71].
Cơ chế của phần lớn các biến đổi trên đều chưa sáng tỏ. So với sự methyl hóa
và phosphoryl hóa, dường như sự acetyl hóa phần lõi histon là quá trình biến đổi đã
được nghiên cứu và hiểu biết tường tận hơn. Histon có thể tồn tại ở một trong hai dạng
đối lập nhau là acetyl hóa hoặc deacetyl hóa. Các enzym đóng vai trò trong sự chuyển
đổi này là histon acetyltransferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC)
[11,22,40,63,71]. Khi xảy ra sự acetyl hóa histon, nhiễm sắc thể sẽ được tháo xoắn và
hoạt hóa quá trình phiên mã, trong khi đó deacetyl hóa phần đầu N của histon sẽ làm
giảm quá trình phiên mã thông qua sự đóng xoắn nhiễm sắc thể. Nói chung, khi tăng
acetyl histon dẫn đến thúc đẩy quá trình phiên mã và ngược lại khi sự acetyl hóa histon
giảm làm ngăn cản quá trình phiên mã (hình 1.2) [63,71].

3

Hình 1.1. Sơ đồ cấu tạo nucleosom [71]


Hình 1.2. HAT và HDAC điều hòa quá trình phiên mã [71]

* Chú thích: HAT: histon acetyltransferase; HDAC: histon deacetylase; Ac: acetyl.


4
1.1.1. Histon acetyltransferase (HAT)
Histon acetyltransferase (HAT) xúc tác chuyển nhóm acetyl từ acetyl coenzym
A đến liên kết với nhóm -amino của lysin ở phần đầu N của histon. Sự chuyển đổi
này xảy ra nhiều hơn trên histon H3, H4. Vị trí acetyl hóa quan trọng là Lys
9
và Lys
14

trên histon H3; Lys
5
, Lys
8
, Lys
12
và Lys
16
trên histon H4 [71,77]. Sự acetyl hóa histon
làm tháo xoắn nhiễm sắc thể bằng cách trung hòa điện tích dương của phần đầu N của
histon, do vậy làm giảm ái lực của histon với phần tích điện âm trên ADN [70]. Chính
vì vậy, việc tăng acetyl hóa histon làm nới lỏng cấu trúc nhiễm sắc thể và hoạt hóa
gen.
Các histon acetyltransferase được chia thành 5 nhóm bao gồm khoảng 20
isoenzym [15,22,40,70]. Cơ sở của việc phân nhóm này là dựa trên sự tương tự nhau
của cấu trúc chuỗi cơ bản và thường có cơ chất đặc hiệu. Nhóm HAT đầu tiên là các
GNAT (Gcn5-related N-acetyltransferase), bao gồm các protein liên quan đến sự bắt
đầu phiên mã, như là Gcn5 và PCAF (p300/cyclic-AMP-response-element binding

protein-associated factor). Nhóm thứ hai là các MYST, được đặt tên theo protein gắn
Zn trong bệnh bạch cầu đơn nhân to (MOZ-monocytic leukemia zinc-finger protein),
YBF2/SAS3, SAS2 và HIV-1 TAT-interactive protein 60 (TIP60). Nhóm thứ ba là 2
enzym liên quan chặt chẽ đến protein p300 và CBP (cyclic-AMP response element-
binding protein), chúng hoạt động như chất đồng hoạt hóa một số phức hợp của nhân
tố sao chép mã. Hai nhóm HAT khác là các chất đồng hoạt hóa receptor nhân như
phức hợp TFIID (general transcription factor IID) (cấu trúc dưới phân tử là TAFII250)
và ACTR (amplified in breast cancer), SRC1 (avian sarcoma viral oncogene
homologue 1) [20]. Không chỉ acetyl hóa đuôi histon, các HAT còn có thể acetyl hóa
các chất đồng hoạt hóa, chất đồng ức chế sao chép mã như E2F, p53, GATA1 [40,76].
Như vậy, các HAT đóng vai trò quan trọng trong hoạt hóa cũng như ức chế gen. Các
HAT không gắn kết trực tiếp với ADN mà tạo thành phức hợp với các HAT khác cũng
như với các nhân tố sao chép mã.

1.1.2. Histon deacetylase (HDAC)
Histon deacetylase có tác dụng ngược với HAT, nó xúc tác việc loại bỏ nhóm
acetyl của lysin ở phần đầu N của histon, dẫn đến nhiễm sắc thể bị đóng xoắn và ức
chế quá trình phiên mã [22,40,43,63,71,81]. HDAC được bảo tồn trong quá trình tiến
hóa và biểu hiện trong các tổ chức của các sinh vật từ đơn bào nguyên thủy cho đến
loài người.
5
Tương tự như HAT, các HDAC không gắn kết trực tiếp với chuỗi ADN mà tạo
phức hợp với các chất đồng ức chế phiên mã khác. Các HDAC khác nhau tạo các phức
hợp khác nhau. Hoạt tính của HDAC được điều hòa bởi sự biến đổi sau phiên mã. Các
HDAC không chỉ deacetyl hóa histon, mà còn deacetyl hóa các protein không histon
như p53, Ku70, pRB và E2F-1 [16,59,81].
1.1.2.1. Phân loại
HDAC1 ở người là histon deacetylase đầu tiên được xác định bằng cách sử
dụng chất ức chế HDAC trapoxin vào năm 1996 [80]. Cho đến nay, 18 HDAC khác
nhau ở người đã được xác định và chia thành 4 nhóm (hình 1.3) [11,22,33,34,40,56,71,

89]. Các HDAC khác nhau ở tính tương đồng chuỗi, cơ chất đặc hiệu và cofactor phụ
thuộc [33,34,89].
* Nhóm I (HDAC1, 2, 3, 8) (hình 1.3): tương đồng với Rdp3 ở tế bào nấm men
S.cerevisiae, có chức năng ức chế phiên mã, chỉ hoạt động khi nằm trong phức hợp
protein [2,16]. HDAC nhóm I có ở nấm men, động vật có vú và thực vật. Ở động vật
có vú, các HDAC này được chia thành 2 phân nhóm là HDAC1/2 và HDAC3.
Cấu trúc của HDAC1 và 2 khá tương đồng (82%). Vùng xúc tác nằm ở đầu N
tạo nên phần chính của protein. Khi được tạo ra bằng kỹ thuật tái tổ hợp, HDAC1 và 2
không có hoạt tính chứng tỏ các cofactor là cần thiết cho hoạt động của HDAC.
HDAC1, 2 hoạt động khi nằm trong phức hợp như phức hợp SIN3, NuRD/NRD/Mi2
và CoREST. Phosphoryl hóa serin trên HDAC1, 2 điều hòa hoạt động của chúng và
tạo nên phức hợp với các cofactor khác [29,71].
HDAC3 được tìm thấy trong phức hợp với N-CoR (nuclear receptor copressor)
và phức hợp với SMRT (silencing mediator for retinoic acid and thyroid hormon
receptors). HDAC3 có cùng cấu trúc vùng giống như các HDAC nhóm I. Khoảng 68%
vùng các acid amin của HDAC3 đồng nhất với HDAC1, 2. Phần đuôi C không đảo
ngược của HDAC3 cần thiết cho cả hoạt tính deacetyl hóa và ức chế phiên mã [71].
HDAC8 không được xếp vào phân nhóm nào vì nó chủ yếu có ở động vật có
xương sống. HDAC8 có 37% tương đồng vùng các acid amin với HDAC3. Hoạt động
của HDAC8 giảm khi phosphoryl hóa bởi protein kinase A, trong khi đó HDAC1, 2 lại
hoạt động bởi sự phosphoryl hóa [30]. HDAC8 là HDAC đầu tiên ở động vật có vú
xác định được cấu trúc 3 chiều [74].
* Nhóm II
gồm HDAC4, 5, 7, 9 (nhóm IIa) và HDAC6,10 (nhóm IIb) tương đồng với
HDA1 trong tế bào nấm men (hình 1.3). HDAC nhóm II có kích thước phân tử lớn
(855-1122 aa) và khác biệt so với HDAC nhóm I do có đầu N tham gia vào quá trình
ức chế phiên mã. Nhóm này chứa tín hiệu định vị ngoài nhân NES nên có thể di
chuyển từ nhân ra bào tương và ngược lại.
6
Hơn 70% vùng các acid amin của HDAC4, 5 tương đồng với nhau, còn

HDAC7 chỉ tương đồng khoảng 57 - 58% với HDAC4, 5. Cả 3 HDAC này đều có
vùng xúc tác nằm ở đuôi C của protein. Trong khi đó, HDAC9 lại có vùng xúc tác ở
đầu N, giống như các HDAC nhóm I. Các HDAC nhóm IIa có đầu N tương tác đặc
hiệu với yếu tố phiên mã MEF2 (myogenic transcription factor 2). Yếu tố này đóng vai
trò quan trọng trong sự biệt hóa cơ. Do vậy, các HDAC này khi kết hợp với MEF2 gây
ức chế chức năng phiên mã của MEF2, hệ quả là tế bào cơ không biệt hóa được. Các
HDAC này có thể bổ sung cho nhau để kiểm soát sự điều hòa biệt hóa của quá trình
biểu hiện gen trong các giai đoạn khác nhau của sự biệt hóa trong tế bào cơ [71].
HDAC6 và 10 có vùng acid amin tương đồng khoảng 37%. Điểm khác biệt của
HDAC6 và 10 so với các HDAC khác là chúng có 2 vùng xúc tác, tuy nhiên HDAC10
có 1 vùng xúc tác bị bất hoạt. Một đặc điểm riêng chỉ có ở HDAC6 là sự có mặt của
HUB (HDAC6-, USP3- và Brap2-related zinc finger motif) ở đuôi C. Đặc điểm này là
dấu hiệu cho sự ubiquitin hóa và cho thấy HDAC này thiên về sự thoái hóa. Nghiên
cứu in vitro và in vivo đã xác định HDAC6 liên quan chặt chẽ đến các bệnh thoái hóa
mô thần kinh như bệnh Parkinson, bệnh Hutington. HDAC6 chủ yếu có ở bào tương,
tuy nhiên nó còn được tìm thấy ở nhân trong phức hợp với HDAC11. HDAC10 có một
vùng xúc tác ở đầu N và vùng xúc tác bị bất hoạt ở đuôi C. HDAC 10 có khả năng
tương tác với HDAC1, 2, 3, 4, 5, 7, nhưng không tương tác với HDAC6 và vẫn thể
hiện hoạt tính deacetyl hóa khi không tạo phức. HDAC6, 10 kháng lại trapoxin và
butyrat natri tốt hơn các HDAC nhóm I, IIa. [21,45,71].
* Nhóm III: (silent information regulator genes - Sirtuins), gồm SIRT1-7 tương tự
Sir2 ở tế bào nấm men. HDAC nhóm III này không liên quan đến các nhóm khác,
chúng có ở trong nhân (SIRT1,6,7), bào tương (SIRT2) hoặc ty thể (SIRT3,4,5).
HDAC nhóm III ít được nghiên cứu ở người, nhưng đã được xác định có cơ chế hoạt
động phụ thuộc vào cofactor NAD
+
, khác với HDAC nhóm I, II, IV (HDAC kinh điển)
phụ thuộc Zn
2+
và bị ức chế bởi các chất tạo phức chelat với Zn

2+
[45,71,89].
* Nhóm IV
: HDAC 11 (chỉ có ở người). Nghiên cứu hệ thống loài thấy rằng HDAC11
liên quan gần hơn với HDAC3, 8, nên có thể giả định HDAC11 liên quan mật thiết với
HDAC nhóm I hơn là nhóm II. HDAC 11 có vùng xúc tác ở đầu N và có thể bị ức chế
bởi trapoxin (dẫn chất của TSA). HDAC11 chưa được tìm thấy trong các phức hợp
HDAC đã biết để có thể xác định chức năng sinh học [45,71,89].
7

Hình 1.3. Phân loại HDAC ở người [21]
* Chú thích: Hình chữ nhật màu xanh dương là vùng xúc tác được bảo tồn của HDAC; N:
nhân; C: bào tương; Mit: ty thể; Ac: acetyl hóa; P: phosphoryl hóa; S: sumoyl hóa; Ub:
ubiquitin hóa. N.D: chưa xác định.
HDAC không chỉ điều hòa các protein histon mà rất nhiều protein không histon
cũng bị ảnh hưởng bởi hoạt tính của các HDAC. Thuật ngữ các chất ức chế HDAC để
chỉ các chất có khả năng ức chế HDAC nhóm I, II và IV [45,89].

1.1.2.2. Cấu trúc của HDAC và cơ chế phản ứng deacetyl hóa
Việc xác định cấu trúc của HDAC rất cần thiết để xác định cơ chế tác dụng của
HDAC, đồng thời dựa vào cấu trúc HDAC để thiết kế công thức cho các chất ức chế
HDAC. Phương pháp kết tinh tạo tinh thể và chụp tia X được áp dụng để tìm ra cấu
trúc tinh thể của các HDAC khác nhau, đặc biệt là trung tâm hoạt động của nó.
HDAC8 là HDAC đầu tiên ở động vật có vú xác định được cấu trúc 3 chiều [74].
8

Hình 1.4. Cấu trúc HDAC8 ( ion Zn
2+
biểu thị là hình tròn màu xanh lá) [86]
Các HDAC đều có trung tâm hoạt động gồm 2 phần chính: ion Zn

2+
, kênh
enzym dạng túi hình ống. Bao quanh ion Zn
2+
là 2 cặp acid amin Histidin-Aspartic
(HDLP là His131-Asp166 và His132-Asp173, HDAC 8 là His142-Asp176 và His143-
Asp183), một phân tử Tyrosin đóng vai trò cho proton (HDLP là Tyr297, HDAC8 là
Tyr306) và 2 acid aspartic (HDLP là Asp258 và Asp168, HDAC8 là Asp178 và
Asp267), một phân tử Histidin (HDLP là His170, HDAC8 là His180) [11].
- Ion Zn
2+
là coenzym của HDAC, nằm ở đáy kênh enzym. Trong phân tử HDAC,
ion Zn
2+
có thể tạo 5 liên kết phối trí: 4 liên kết với nguyên tử oxy, nitơ của các acid
amin, 1 liên kết phối trí với nguyên tử oxy của nhóm acetyl của phân tử acetyl-lysin ở
phần đầu N của histon, từ đó xúc tác tách loại nhóm acetyl. Khi có mặt các chất ức chế
HDAC như các acid hydroxamic, ion Zn
2+
tạo 2 liên kết phối trí với 2 nguyên tử oxy
của nhóm hydroxamic (hình 1.5) [11].
- Kênh enzym có dạng túi hình ống hẹp, tạo nhiều liên kết Van der Waals với cơ
chất (lysin tận của histon/phần cầu nối của các chất ức chế HDAC). Túi được cấu tạo
từ các acid amin thân lipid: Phenylalanin, Tyrosin, Prolin, Histidin. Đáy túi còn có 1
vài phân tử nước làm nhiệm vụ vận chuyển nhóm acetyl trong phản ứng deactyl hóa và
tham gia tạo liên kết hydro khi không có mặt nhóm -OH của Tyrosin. Cấu trúc túi rất
linh động, có thể biến đổi để phù hợp với chiều dài của các cơ chất khác nhau. Bề rộng
của túi được giới hạn bởi 2 vòng thơm được tìm thấy trên cùng một vị trí ở nhiều
HDAC khác nhau. Trên miệng túi có 1 vành nhỏ được tạo nên từ 1 vài vòng xoắn
protein (phần vành sẽ tương tác với nhóm nhận diện bề mặt của HDAC) [11].