Khóa luận Công nghệ nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh

U

TỐT G IỆP

GV D: BÙI VĂ T Ế VI

MỤC LỤC
IỆ V

U TỐT G IỆP

ỜI CẢ Ơ
D SÁC CÁC BẢ G BIỂU
DANH SÁCH CÁC HÌNH

CHƢƠNG I. ĐẶT V N ĐỀ................................................................................01
1.1. Đặt vấn đề..................................................................................................................01
1.2. ục đích của đề tài........................................................................................02

CHƢƠNG II. TỔNG QUAN.............................................................................03
2.1. Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật......................................................0.3
2.1.1. hái niệm...............................................................................................03
2.1.2. Các kỹ thuật nuôi cấy........................................................................................04
2.1.3. ôi tr ờn nuôi cấy................................................................................08
2.1.4. Các chất điều hòa sinh tr ởn thực vật..................................................09
2.1.5. Các nhân tố đảm bảo thành côn tron nuôi cấy mô tế bào thực vật...............11
2.2. Giới thiệu cây Sâm ọc inh.......................................................................15
2.2.1. Phân loại............................................................................................................15
2.2.2. Đặc điểm hình thái............................................................................................16
2.2.3. Sinh thái và phân bố..........................................................................................18
2.2.4. iện trạn và tiềm năn của cây sâm

ọc inh........................................19

2.2.5. Thành phần hóa học..........................................................................................20

CHƢƠNG III. CÔNG NGHỆ NUÔI C Y TẾ BÀO SÂM NGỌC LINH....27
3.1. uôi cấy mô s o............................................................................................27
3.1.1. uy n liệu..............................................................................................27
3.1.2. ôi tr ờn........................................................................................27
3.1.3. Thiết b và dụn cụ............................................................................................27
3.1.4. óa chất.................................................................................................27
3.1.5. Qui trình thực hiện............................................................................................28
3.1.6. Điều kiện nuôi cấy............................................................................................28
SVT : GUYỄ T Ị T U


3.2. Tái sinh ch i t mô s o..................................................................................29
3.2.1. uy n liệu..............................................................................................29
3.2.2. ôi tr ờn........................................................................................29
3.2.3. Thiết b và dụn cụ............................................................................................29
3.2.4. óa chất.................................................................................................29
3.2.5. Qui trình thực hiện............................................................................................ 29
3.2.6. Điều kiện nuôi cấy............................................................................................ 29
3.3. uôi cấy rễ........................................................................................................ 30
3.3.1. uy n liệu..............................................................................................30
3.3.2. ôi tr ờn........................................................................................30
3.3.3. Thiết b và dụn cụ............................................................................................30
3.3.4. óa chất.................................................................................................30
3.3.5. Qui trình thực hiện............................................................................................ 31
3.3.6. Điều kiện nuôi cấy............................................................................................ 31

3.4. uôi cấy sinh khối.........................................................................................31
3.4.1. uy n liệu..............................................................................................31
3.4.2. ôi tr ờn........................................................................................31
3.4.3. Thiết b và dụn cụ............................................................................................31
3.4.4. óa chất.................................................................................................32
3.4.5. Qui trình thực hiện............................................................................................ 32
3.4.6. Điều kiện nuôi cấy............................................................................................ 32
3.5. Tái sinh cây qua con đ ờn tạo phôi soma........................................................33
3.5.1. uy n liệu..............................................................................................33
3.5.2. ôi tr ờn........................................................................................33
3.5.3. Thiết b và dụn cụ............................................................................................33
3.5.4. óa chất.................................................................................................33
3.5.5. Qui trình thực hiện............................................................................................ 33
3.5.6. Điều kiện nuôi cấy............................................................................................ 34
3.6. hảo sát các điều kiện ảnh h ởn đến nuôi cấy Sâm ọc inh.......................35
3.6.1. hảo sát ảnh h ởn của một số loại chất khử trùn....................................35
3.6.2. hảo sát ảnh h ởn của các t h p hoocmon l n sự phát sinh hình thái....36


3.6.3. Ảnh h ởn của điều kiện chiếu sán l n khả năn tạo mô s o t lá và cuốn
lá..........................................................................................................37
3.6.4. Ảnh h ởn của kích th ớc mẫu cấy ban đầu l n sự tăn sinh mô s o......38
3.6.5. Ảnh h ởn của au in l n khả năn khởi tạo mô s o t lá và cuốn lá.........39
3.6.6. Ảnh h ởn của au in l n khả năn tăn sinh mô s o Sâm ọc inh..........40
3.6.7. Ảnh h ởn của B và

đến khả năn tái sinh ch i t mô s o.............41

3.6.8. Ảnh h ởn của B l n quá trình tăn tr ởn ch i Sâm

ọc inh invitro .. 43

3.6.9. Ảnh h ởn của n n độ đ ờn đến khả năn tăn tr ởn ch i...................43
3.6.10. Ảnh h ởn của than hoạt tính đến khả năn tăn tr ởn ch i invitro........44
3.6.11. Ảnh h ởn của I

IB

3.6.12. Ảnh h ởn của IB và

đến khả năn ra rễ bất đ nh t mô s o.....45
đến khả năn nhân rễ bất đ nh.....................46

CHƢƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................48
4.1. ết luận...................................................................................................48
4.2. iến n h.............................................................................................. 48
TÀI IỆU T
P

C

ẢO


DANH SÁCH CÁC BẢNG BIỂU
Bản 2.1: Thời ian tối thiểu để hấp khử trùn môi tr ờn nuôi
0

cấy mô ở 121 C......................................................................................................13
Bản 2.2: n độ và thời ian sử dụn 1 số chất ử lí mô cấy thực vật.........14

Bản 2.3: àm l n một số saponin chính trong sâm..................................20
Bản 2.4: àm l n saponin của Sâm

ọc inh so sánh với các

loài Panax spp. tr n trọt...........................................................................21
Bản 2.5: Các saponin chính yếu tron thành phần saponin dẫn chất protopana atriol
............................................................................................................................. 21
Bản 2.6: cid Oleanolic...............................................................................22
Bản 2.7: Ocotillol.................................................................................................22
Bản 2.8: Các a id béo đ c tìm thấy..........................................................23
Bản 2.9: Thành phần acid amin chủ yếu.............................................................24
Bản 2.10: Các n uy n tố vi l n......................................................25
Bản 3.1: Ảnh h ởn của các loại n n độ khử trùn.....................................35
Bản 3.2: Ảnh h ởn của các t h p hoocmon l n sự phát sinh hình thái
của Sâm

ọc inh cấy mô...........................................................................36

Bản 3.3: Ảnh h ởn của điều kiện chiếu sán l n khả năn tạo mô s o
t lá và cuốn lá....................................................................................37
Bản 3.4: Ảnh h ởn của kích th ớc mẫu cấy ban đầu l n sự tăn
sinh mô s o................................................................................................... 38
Bản 3.5: Ảnh h ởn của au in l n khả năn khởi tạo mô s o t
lá và cuốn lá.........................................................................................................39
Bản 3.6: Ảnh h ờn của au in l n khả năn tăn sinh mô
s o Sâm

ọc inh................................................................................40

Bản 3.7: hả năn tái sinh ch i t mô s o tr n môi tr ờn S có
b sun B và............................................................................................42
Bản 3.8: Ảnh h ởn của B l n quá trình tăn tr ởn
ch i Sâm ọc inh invitro.........................................................................43
Bản 3.9: Ảnh h ởn của n n độ đ ờn đến khả năn


tăn tr ởn ch i..................................................................................44
Bản 3.10: Ảnh h ởn của than hoạt tính đến khả năn tăn
tr ởn ch i invitro......................................................................................44
Bản 3.11: Ảnh h ởn của I

IB

đến khả năng

ra rễ bất đ nh t mô s o.............................................................................45
Bản 3.12: Ảnh h ởn của IB và

đến khả năn nhân rễ

của mẫu có n u n ốc t môi tr ờn b sun................................................47
Bản 3.13: Ảnh h ởn của IB và

đến khả năn nhân rễ

của mẫu có n u n ốc t môi tr ờn b sun IB....................................47


DANH SÁCH CÁC HÌNH

ình 2.1: Sâm

ọc inh n oài tự nhi n......................................................15

Hình 2.2: ình thái Sâm ọc inh.............................................................16
ình 2.3: Cây Sâm

ọc inh.....................................................................17

ình 3.1: ô s o Sâm ọc inh.......................................................28
ình 3.2: Ch i Sâm
ình 3.3: Rễ Sâm

ọc inh................................................................30
ọc inh.......................................................................31

ình 3.4: uôi cấy tron Bioreactor............................................................32
Hình 3.5: Phôi vô tính Sâm ọc inh...........................................................34


TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. D ơn Tấn hựt và cộn sự Đề tài “ Hoạt chất saponin từ các nguyên liệu
nuôi cấy invitro của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et
Grushv.)”, Trun Tâm Sâm và D c iệu TP. C .
2. uyễn Đức

n

Th Thủy Ti n (2006) Công nghệ tế bào

b Đ QG

TP. HCM.
3. uyễn

ọc Dun

b ôn
4. uyễn

hân iốn Sâm

ọc inh bằn con đ ờn sinh học

hiệp.

ọc Duy (1995), Nhân giống Sâm Ngọc Linh bằng con đường sinh

học và kinh nghiệm trồng Nhân Sâm ở Khai Thành Triều Tiên, Nxb Nông
hiệp.
5. uyễn Thanh Bình

uyễn

ọc Duy (1996) Thăm dò khả năng nhân giống

vô tính bằng phương pháp nuôi cấy mô invitro cây Sâm Ngọc Linh và một
số cây trong dự án chuyên ngành lâm nghiệp Tr ờn Đại ọc ôn âm Tp.
HCM.
6. PGS. TS. Văn oàn

Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật Đại học

Đà ẵn .
7. PGS. TS. Trần Văn inh (1994) Nuôi cấy mô tế bào thực vật Tr ờn Đại ọc
Nông Lâm TP. HCM.
8. Viện D c iệu, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam (Tập II), Nxb
KH & KT.
9. Vũ Văn Vụ Vũ Thanh Tâm oàn inh Tấn Sinh lý học thực vật, Nxb GD.
10. />

PHỤ LỤC
 Thành phần môi trƣờng MS (Murashige và Skoog, 1962):
Khoáng đa lƣợng

-1

(mg l )

NH4NO3

1650

KNO3

1900

CaCL2.2H2O

440

Mg2SO4.7H2O

370

KH2PO4.7H2O

170

Khoáng vi lƣợng
KI
H3BO4

-1

(mg l )
0.83
6.2

MnSO4.4H2O

22.3

ZnSO4.7H2O

8.6

Na2MoO4.2H2O

0.25

CuSO4.5H2O

0.025

CoCl2.6H2O

0.025

Na2.EDTA

27.8

Vitamin và các chất hữu cơ khác

-1

(mg l )

Myo-Inositol

100

Nicotinic acid

0.5

Pyridoxine HCl

0.5

Thiamine HCl

0.1

Glycine

2.0


KH

LU N TỐT NGHIỆP

GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH

CHƯƠNG I. ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1. Đặt vấn đề:
Nhân sâm Panax ginseng C. . Meyer là cây dược liệu được sử dụng từ hàng
ngàn năm nay. Những tác dụng y học của Nhân Sâm, được dùng trong y học cổ
truyền, hiện đã được chứng minh theo nguyên lý của y học hiện đại. Nhân Sâm từ
cây thuốc huyền thoại của phương Đông đã xuất hiện rộng rãi ở phương Tây, với
những sản phẩm thương mại đa dạng. Nhân Sâm ngày nay là cây thuốc mang lại giá
trị kinh tế to lớn.
Việt Nam tự hào có được một loài Nhân Sâm đặc hữu là Sâm Ngọc Linh (hay
còn gọi là Sâm Khu Năm) Panax vietnamensis Ha & Grutzv., được biết đến trên thế
giới với tên gọi Vietnamese ginseng. Sâm Ngọc Linh có thành phần ginsenosid, dược
chất chính trong Nhân sâm, được đánh giá vào loại nhiều nhất so với các loài khác
của chi Panax trên thế giới. Tuy nhiên, Sâm Ngọc Linh được phát hiện khá muộn
(vào năm 1985) cho nên, tuy có nhiều cố gắng để phát triển cây thuốc quý giá này

nhưng tiềm năng của Sâm Ngọc Linh vẫn chưa hoàn toàn được đánh thức. Cộng với
địa bàn phân bố hẹp (chỉ có ở vùng núi Ngọc Linh), lại bị khai thác bừa bãi, nên Sâm
Ngọc Linh sớm đứng trước nguy cơ tuyệt chủng. Với nỗ lực của những địa phương
có Sâm Ngọc Linh phân bố, hiện nay loài dược liệu này đã có thể tránh bị tuyệt diệt.
Nhưng để đưa Sâm Ngọc Linh thành cây thuốc ngang hàng với các loại Nhân sâm có
trên thị trường dược liệu cả về số lượng và chất lượng, cần có nhiều nghiên cứu
chuyên sâu ứng dụng sản xuất hiệu quả.
Trên thế giới, cây Nhân Sâm Panax ginseng C. . Meyer đã được nhân giống
và sản xuất dược chất ginsenosid thành công bằng nuôi cấy mô. Ginsenosid chiết từ
mô sẹo trong nuôi cấy mô cây Nhân sâm có cùng dạng với ginsenosid thu từ rễ Nhân
Sâm tự nhiên, tác dụng dược lý của dịch chiết bằng rượu hoặc bằng methanol và bột
ginsenosid từ mô sẹo hầu như giống với dịch chiết và bột thu từ rễ Nhân Sâm tự
nhiên. Do đó đã có các hệ thống nuôi cấy lớn như bioreactor dùng để sản xuất
ginsenosid theo quy mô công nghiệp, cung cấp cho thị trường tiêu thụ ngày càng
rộng lớn, khắc phục được những hạn chế trong canh tác cây Nhân Sâm như: thời
gian trồng kéo dài, bị giới hạn về khí hậu, thổ nhưỡng, nhiều sâu bệnh...
SVTH: NGUYỄN THỊ THU

9


Sâm Ngọc Linh được cả thế giới biết đến với tên gọi Vietnamese ginseng
nhưng không có nhiều nhà khoa học quốc tế lưu ý nghiên cứu về nó. Việt Nam cần
tự nghiên cứu cũng như sản xuất, cố gắng đánh thức giá trị y học và giá trị kinh tế
của Sâm Ngọc Linh. Trong các hướng nghiên cứu, hướng nuôi cấy mô đã thật sự đưa
nông nghiệp lên bước phát triển tiên tiến, vì vậy muốn nghiên cứu đưa cây Sâm
Ngọc Linh phát triển theo hướng hiện đại, mang lại hiệu quả kinh tế cao không thể
bỏ qua kỹ thuật này. Thực tế, cây Sâm Ngọc Linh đã được nhân giống thành công từ
mô sẹo. Nhưng tiến hơn một bước để sản xuất ginsenosid Sâm Ngọc Linh bằng nuôi
cấy mô thì chưa có nghiên cứu nào được công bố.

Với mong muốn tìm hiểu về loại cây trồng có giá trị kinh tế này cùng với những
công nghệ nuôi cấy tế bào đã và đang được thực hiện nhằm mục đích nhân giống và
sản xuất các hợp chất có giá trị kinh tế, tôi đã thực hiện khóa luận tốt nghiệp: “Công
nghệ nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) dưới sự
hướng dẫn của thầy Bùi Văn Thế Vinh.
1.2. Mục đích của đề tài:
-

Tổng quan về Sâm Ngọc Linh.

-

Tìm hiểu một số công nghệ nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh.


CHƯƠNG II. TỔNG QUAN
2.1. Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.1.1. Khái niệm
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật mô tả các phương pháp nuôi cấy các
bộ phận thực vật ( tế bào đơn, mô, cơ quan ) trong điều kiện vô trùng.
 Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên hai nguyên tắc:
- Dựa vào tính toàn năng của tế bào:
Mỗi một tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm
tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi. Mỗi tế
bào là một hệ thống mở, tự duy trì và tự sản xuất để tiến hành các chức năng chuyên
biệt và sản sinh thế hệ tế bào mới nếu cần thiết.
- Dựa vào khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào:
Biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi cho đến khi thể
hiện một chức năng nào đó.
Các tế bào dùng trong môi trường cấy đều có khả năng biệt hóa về cấu trúc và

chức năng. Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào này trở lại
trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng - tế bào phôi và quá trình đó gọi là quá
trình phản biệt hóa. Vì vậy những tế bào càng gần với trạng thái của tế bào phôi bao
nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu.
 ngh a:
- Nhân nhanh giống cây trồng.
- Bảo quản nguồn gen.
- Tạo cây sạch bệnh.
- Sản xuất các hoạt chất sinh học.
- Mang tính công nghiệp

S

c ịch s phát tri n:


KH

LU N TỐT NGHIỆP

GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH

- 1665: Robert Hooke quan sát được tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa ra khái niệm
tế bào.
- 1838: Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế bào.
- 1904: Hannig nuôi cấy phôi đầu tiên ở các loài họ cải.
- 1934: Kogl xác định vai trò của I .
- 1951: Skoog nghiên cứu sử dụng các hoá chất điều hoà sinh trưởng và phát sinh cơ
quan.
- 1952: Morel và Martin thực hiện vi ghép invitro thành công.

- 1962: Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấy tế bào thực vật.
- 1964: Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo được cây đơn bội từ nuôi
cấy bao phấn của cây cà rốt.
- 1969: Phân

lập tế bào trần từ nuôi cấy tế bào dịch lỏng (huyền phù) của

Hapopappus gracilis.
- 1973: Phát hiện Cytokinin có khả năng phá ngủ ở Gerberas.
- 1978: Marton và cộng sự xây dựng quy trình chuyển gen vào tế bào trần.
- 1983: Công ty Mitsui Petrochemicals lần đầu tiên đã sản xuất chất trao đổi thứ cấp trên
quy mô công nghiệp bằng nuôi cấy tế bào dịch lỏng Lithospermum spp. Mitsui .
0Petrochemicals.
- 1988: Klein và cộng sự tái sinh cây chuyển gen bằng phương pháp bắn gen.
- 1994: Thương mại hóa giống cà chua chuyển gen FlavrSavr.
2.1.2. Các kỹ thuật nuôi cấy
2.1.2.1. Nuôi cấy phôi
Phôi phát triển qua hai giai đoạn dị dưỡng và tự dưỡng. giai đoạn dị dưỡng
cần có các chất điều hòa sinh trưởng để phát triển.
Trong nuôi cấy phôi, đường đóng vai trò rất quan trọng, đường sucrose cho
nhiều kết quả tốt hơn. Ngoài ra một số chất tự nhiên như nước dừa, dịch chiết malt,
casein thủy phân là những chất rất cần trong nuôi cấy phôi. Đối với các chất điều hòa
sinh trưởng, auxin thường dùng ở nồng độ thấp, kinetin có vai trò đặc biệt cho sự
phát triển của phôi.
Nhiệt độ, ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi, thường phôi
o

nuôi cấy cần nhiệt độ, ánh sáng thấp hơn phôi phát triển tự nhiên. Nhiệt độ 25 ± 2 C

thích hợp cho sinh trưởng và nảy mầm của phôi. Các phôi thứ cấp rất khó sinh
trưởng đã hoạt động khi chúng được tách rời và nuôi ở điều kiện chiếu sáng 4.000
lux hoặc hơn trong 4 giờ chiếu sáng suốt 4 ngày nuôi đầu tiên.
 Kỹ thuật nuôi cấy phôi mang lại nhiều hiệu quả như:
-

Nhân giống cây trồng.

-

Thử sức sống của phôi hạt.

-

Duy trì phôi yếu và cứu phôi lai xa.

-

Sản xuất hạt nhân tạo mà bản chất là tế bào phôi.

2.1.2.2. Nuôi cấy mô và c quan tách r i
Trong nuôi cấy mô và cơ quan tách rời, khâu chọn mẫu có tầm quan trọng đặc
biệt, mẫu phải ở tình trạng sinh lý tốt và đang phát triển.
Nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy các bộ phận khác nhau của cây là khác nhau
nhưng có một số yêu cầu chung như nguồn carbon, nguồn đường, nguyên tố đa
lượng, vi lượng và các chất điều hòa sinh trưởng. Muốn duy trì sinh trưởng và phát
triển của cơ quan nuôi cấy cần thường xuyên cấy chuyền qua môi trường mới.
Đối với nuôi cấy mô cần bổ sung thêm các chất hữu cơ chứa ít nitơ dưới dạng
acide amine, đường và inositol. Trong trường hợp nuôi cấy mô, các chất điều hòa
sinh trưởng có vai trò quan trọng hơn vì các mô tách rời không có khả năng tổng hợp

các chất này.
 Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời được ứng dụng trong:
- Nghiên cứu điều kiện sinh trưởng đối với một bộ phận hoặc một mô của cây.
- Nhân cây invitro.
- Tạo mô sẹo phục vụ cho các nghiên cứu như chọn dòng tế bào, đột biến soma,

2.1.2.3. Nuôi cấy mô phân sinh


Đặc điểm của mô phân sinh là chứa các tế bào non trẻ, phân chia mạnh, không
bị virus xâm nhập, vì vậy mô phân sinh là mô duy nhất của cây sạch virus. Mô phân
sinh thường là các mô đỉnh chồi và cành. Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường
tách từ các mầm non, các chồi mới hình thành hoặc các cành non.
Trong nuôi cấy sự cân bằng giữa các chất điều hòa sinh trưởng rất quan trọng.
Muốn tạo chồi cần bổ sung cytokinin hoặc tổ hợp cytokinin với auxin, muốn tạo rễ
thì bổ sung auxin.
 Nuôi cấy mô phân sinh được sử dụng trong:
-

Tạo cây sạch virus.

-

Nhân giống invitro.

-

Tạo cây đa bội qua xử lý colchicin.

-

Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan.

2.1.2.4. Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn
Ưu điểm của nuôi cấy bao phấn là đơn giản về thao tác kỹ thuật và môi trường
nuôi cấy, nhưng có thể tạo ra cả cây lưỡng bội từ soma của thành bao phấn, do vậy sẽ
khó phân biệt với cây tự lưỡng bội từ cây đơn bội.
Hạt phấn nuôi cấy có thể phát triển thành cây đơn bội hoàn chỉnh trong điều
kiện nuôi cấy invitro bằng con đường tạo phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua tạo
mô sẹo và tạo cơ quan. Phương pháp tạo cây đơn bội kép và phương pháp chọn lọc
tạo giống có hiệu quả chọn lọc rất cao, đặc biệt nếu được kết hợp với các phương
pháp tạo ra các biến dị di truyền khác nhau như lai hữu tính hoặc gây đột biến nhân
tạo.
Thành phần môi trường nuôi cấy thay đổi tùy thuộc vào kiểu gen và tuổi của
bao phấn cũng như các điều kiện mà ở đó cây cho bao phấn sinh trưởng. Quá trình
sinh trưởng về sau của phôi hạt phấn đòi hỏi bổ sung các muối khoáng vào môi
trường. Tần số phát sinh cây đơn bội và sinh trưởng của cây nói chung sẽ tốt hơn nếu
chúng được nuôi trong điều kiện chiếu sáng, mặc dù cây hạt phấn của một số kiểu
gen sinh trưởng trong cả hai điều kiện có chiếu sáng và trong tối.

 Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn được dùng cho tạo các dòng thuần để:


-

Nghiên cứu gen lặn vì chúng không biểu hiện ở cơ thể dị hợp tử.

-

Chọn các dòng đột biến.

2.1.2.5. Nuôi cấy tế bào đ n
Tế bào đơn có thể nhận được bằng con đường nghiền mô, hoặc xử lý enzyme.
Sau đó chúng được nuôi cấy dịch lỏng, có khuấy hoặc lắc tạo điều kiện thuận lợi cho
sự trao đổi khí và tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng. Tế bào đơn được lọc và nuôi
cấy trong môi trường đặc biệt và tăng sinh khối.
Mỗi loại cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy khác
nhau. Yêu cầu dinh dưỡng cho nuôi cấy tế bào đơn khá phức tạp, do chúng bị mất
nhiều chất cần thiết cho sinh trưởng khi tách rời khỏi quần thể tế bào.
 Nuôi cấy tế bào đơn được sử dụng cho các mục đích:
- Chọn dòng tế bào.
- Nghiên cứu cấu trúc tế bào, phát triển và phân hóa tế bào trong những điều kiện khác
nhau.
- Thu nhận các chất trao đổi thứ cấp.
2.1.2.6. Nuôi cấy protop ast
Tế bào trần là tế bào đã được tách bỏ thành tế bào bằng phương pháp cơ học
hay sử dụng enzyme. Trong điều kiện nuôi cấy phù hợp protoplast có thể tái sinh
thành tế bào mới, phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Ưu thế của kỹ thuật
tách và nuôi cấy tế bào trần là tế bào không có màng cứng, ở trạng thái đơn bào, mật
6

độ tế bào thu được trên 1 đơn vị thể tích môi trường có thể rất cao (đạt 10 tế
bào/1ml môi trường).
 Ứng dụng nuôi cấy protopast:
- Tạo ra cây lai soma.
- Chuyển các bào quan và chuyển gen. Quá trình dung hợp protoplast có thể được thực
hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài.
- Quá trình sinh tổng hợp màng tế bào.

2.1.3. Môi tr ng nuôi cấy

 Thành phần môi trường nuôi cấy gồm năm thành phần cơ bản sau:
- Muối khoáng đa lượng.
- Muối khoáng vi lượng
- Vitamin.
- Nguồn carbon.
- Chất điều hòa sinh trưởng.
- Ngoài ra có thể bổ sung các thành phần không xác định (nước dừa, dịch chiết nấm
men, ) và agar.
 Môi trường nuôi cấy có thể chia thành ba loại:
- Môi trường ngh o dinh dưỡng: White, Knop.
- Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: Gamborg.
- Môi trường giàu dinh dưỡng: MS.
Cơ sở cho việc xây dựng các môi trường nuôi cấy là xem xét các thành phần
cần cho sự sinh trưởng và phát triển của cây.
Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài
và bộ phận nuôi cấy. Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm
thì thành phần môi trường cũng sẽ thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy.
Tế bào mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong nuôi
cấy. Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu nhận
các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào. Vì vậy cần điều chỉnh độ pH môi
trường thích hợp trước khi nuôi cấy. Thường sử dụng NaOH hay HCl loãng để điều
chỉnh độ pH.

2.1.4. Các chất điều hòa sinh tr ởng thực vật


2.1.4.1. Auxin
uxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng rộng rãi trong

nuôi cấy mô thực vật. I là auxin tự nhiên có trong mô thực vật, còn N , IB
, 2,4-D là các auxin nhân tạo, thường các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn.
Chúng có mặt ở các bộ phận của cây như mô phân sinh đỉnh, các bộ phận non
khác của cây.
 Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào:
- Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu.
- Hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy.
- Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy.
- Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh.
- Đặc tính của auxin.
 Vai trò của các chất thuộc nhóm auxin:
- Kích thích phân chia và kéo dài tế bào.
- Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ra ức chế sinh trưởng của chồi bên.
- Kích thích sự phân hoá của các mô dẫn.
- Ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chín của
quả, sự ra hoa trong mối quan hệ với điều kiện môi trường.
- Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus).
- Kích thích tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp).
- Tạo phôi soma (2,4-D).
2.1.4.2. Cytokinin
Các cytokinin là dẫn xuất của adenine. Các cytokinin được sử dụng thường
xuyên nhất là B P, Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn B và kinetin là các
cytokinin nhân tạo. Chúng được hòa tan trong NaOH hoặc HCl loãng.
Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái trong các
hệ thống nuôi cấy. Đối với sự phát sinh phôi (embryogenesis), để tạo callus và rễ cần
có tỷ lệ auxin/ cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự sinh sản
chồi và chồi nách.
Cytokinin có mặt trong mô phân sinh đỉnh rễ, quả non.
 Chức năng chủ yếu của các cytokinin:

-

Kích thích phân chia tế bào.

-

Tạo và nhân callus.

-

Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô.

-

Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh .

-

Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào.

-

Có thể làm tăng sự mở của khí khổng ở một số loài.

-

Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao) .

-

Ức chế sự hình thành rễ.

-

Ức chế sự kéo dài chồi.

-

Ức chế quá trình già (hoá vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục.

2.1.4.3. Gibberellin
Trong số hơn 20 chất thuộc nhóm gibberellin, G 3 là chất được sử
dụng nhiều hơn cả trong thực tiễn. G 3 kích thích kéo dài chồi và nảy mầm
của phôi vô tính.. G 3 có tính hoà tan trong nước.
Gibberellin được tạo ra trong đỉnh rễ, chồi, lá non, hạt.
 Gibberellin có các chức năng cơ bản sau:
- Kích thích kéo dài chồi do tăng cường phân bào và kéo dài tế bào.
- Phá ngủ hạt giống hoặc củ giống.
- Kiểm soát sự ra hoa của các cây 2 năm tuổi.
- Ức chế sự hình thành rễ bất định.
- Kích thích sinh tổng hợp của α-amylase ở hạt cây ngũ cốc nảy mầm.
- Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá trình tạo củ (thân củ, thân hành và củ).
- Kích thích sự nảy mầm của phấn hoa và sinh trưởng của ống phấn.
- Có thể gây tạo quả không hạt hoặc làm tăng kích thước quả nho không hạt.
- Có thể làm chậm sự hoá già ở lá và quả cây có múi.
2.1.4.4. Abscisic acid (ABA)
bscisic acid là một chất điều hòa sinh trưởng thực vật tự nhiên được tạo ra
trực tiếp từ acid mevalonic hoặc do sự phân giải carotenoid.
Chúng được tạo ra trong lá, quả, mũ rễ, hạt.

 Các tác dụng cơ bản của B là:


- Kích thích sự rụng lá, hoa, quả ở hầu hết các cây trồng và gây ra sự nứt quả
- B thường được sản sinh khi có các yếu tố ức chế cây trồng như mất nước và nhiệt
độ thấp đóng băng.
- Kích thích sự ngủ nghỉ, kéo dài thời gian ngủ nghỉ và làm chậm sự nảy mầm của hạt.
- Ức chế sự kéo dài thân và được sử dụng để kiểm soát sự kéo dài thân cành.
- Gây ra sự đóng khí khổng.
2.1.4.5. Ethylene
Ethylene là một loại khí hiện diện trong bầu khí quyển với một nồng độ rất
thấp. Ethylene được sinh ra bởi những mô thực vật còn sống và có vai trò điều hòa
sự phát triển ở thực vật. Chúng được tạo ra ở các bộ phận như mô phân sinh đỉnh rễ,
chồi, nốt lá, hoa hóa già, quả chín.
 Các chức năng cơ bản của ethylene:
- Gây già hoá lá, kích thích sự rụng lá và quả.
- Làm chín quả.
- Sinh tổng hợp ethylene được tăng cường khi quả đang chín, cây đang bị úng, lão hoá,
tổn thương cơ giới và bị nhiễm bệnh.
- Điều khiển sự chín của một số loại quả.
- Ethylene kìm hãm sự ra hoa của đa số cây. Tuy vậy, sự ra hoa của xoài, dứa, một số
cây cảnh lại được kích thích bởi ethylene.
- Kích thích nở hoa, kích thích sự lão hoá của hoa và lá.
2.1.5. Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.1.5.1. Đảm bảo điều kiện vô trùng
Môi trường nuôi cấy có chứa đường, muối khoáng,... rất thích hợp cho các
loại nấm và vi khuẩn phát triển và với tốc độ phát triển nhanh hơn rất nhiều lần so
với tế bào thực vật.
o

- Dụng cụ thuỷ tinh: Rửa sạch, hấp trong nồi áp suất ở 121 C/15 phút.
- Nút đậy: Sử dụng nút cao su. Nút được nhét bông gòn không thấm nước để bụi và
o

không khí không được đi qua. Sau đó đem đi hấp trong nồi hấp 121 C/15 phút.


- Mẫu nuôi cấy: Các mẫu lấy ngoài tự nhiên như cây, lá, hoa, cành cần rửa sạch bằng xà
bông dưới vòi nước nhiều lần để hạn chế sự tạp nhiễm.
- Sử dụng các chất có hoạt tính diệt khuẩn như cồn chlorua, nước javen,...
- Vô trùng nơi thao tác và tủ cấy.
o

- Môi trường: Môi trường thuờng được hấp khử trùng ở 121 C, 1atm trong 30 phút.
Có một số chất trong môi trường nuôi cấy không bền nhiệt (vitamin, kháng
sinh,..), những chất này được lọc vô trùng sau đó được thêm vào môi trường sau khi
đã được hấp, làm nguội đến khi cầm trên tay được.
2.1.5.2. Chọn đúng môi tr ng và chuẩn bị môi tr ng đúng cách
Tuỳ vào mục đích nuôi cấy, thu nhận sản phẩm. Tuỳ thuộc vào từng loại nuôi
cấy sẽ có một môi trường tối ưu. Thông thường ta phải trải qua quá trình thực
nghiệm, từ đó mới tìm một loại môi trường thích hợp cho từng mục đích
Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, muối khoáng,
vitamin rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân bào
của nấm và vi khuẩn lớn hơn nhiều so với các tế bào thực vật, nếu trong môi trường
nuôi cấy bị nhiễm bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày sẽ phủ đầy vi khuẩn
hoặc nấm, khi đó mô nuôi cấy sẽ chết dần thí nghiệm phải bỏ đi.
Mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật đòi hỏi rất
nghiêm ngặt, đặc biệt quan trọng trong nuôi cấy tế bào đơn trong các bioreactor.
Nhiều loại protein, vitamin, amino axit, hormone,..không bền nhiệt vì vậy nên dùng
phin lọc micropore để khử trùng.

 Có 3 nguồn nhiễm tạp chính:
- Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy không được vô trùng tuyệt đối.
- Trên bề mặt hoặc bên trong mô nuôi cấy.
- Trong quá trình thao tác.


Bảng 2.1: Th i gian tối thi u đ hấp kh trùng môi tr ng nuôi cấy mô
0

ở 121 C.
Th tích môi tr ng (ml)

Th i gian tối thi u (phút)

20-25

24

50

26

100

28.5

250

31.5

500

35

1000

40

2000

48

3000

55

4000

63

2.1.5.3. Chọn mô cấy và x ý đúng cách
Tuỳ mục đích nuôi cấy để chọn loại mô cấy thích hợp. Thông thường các mô
trong cơ thể thực vật đều có thể dùng làm mô cấy, trừ những mô đã hoá gỗ. Khi bắt
đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định thì trước tiên chú ý đến các
chồi nách và mô phân sinh ngọn.
Nguồn lấy mẫu, vị trí lấy mẫu cấy từ cây mẹ là những yếu tố quan trọng trong
việc thiết lập quá trình nuôi cấy sạch. Lấy mẫu vào mùa xuân khi cây đâm lộc, các
chồi mới nhú sạch hơn so với các chồi ngủ. Cây trồng ngoài ruộng dễ bị nhiễm hơn
cây trồng trong nhà kính hoặc chậu trong phòng. Các phần như rễ, củ hoặc gần như
nằm trên mặt đất như thân bò, dạng củ, protocom của lan thì khó làm sạch hơn các

nguyên liệu thực vật khác.
Có rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, trong các rảnh nhỏ hoặc giữa các lớp
vảy chồi, mầm. Để loại bỏ sự tạp nhiễm bề mặt, có thể rửa sơ bộ mô cấy với nước xà
phòng để loại bỏ bụi, đất và làm tăng sự tiếp xúc với các chất khử trùng. Để làm tăng
sự khử trùng có thể dùng chất hỗ trợ làm tăng sự tiếp xúc như Tween - 20, xà phòng.
Thường dùng 1 - 3 giọt Tween cho 100 ml dung dịch nước khử trùng là tốt nhất.


Ngoài ra để tăng sự tiếp xúc bằng cách lắc hoặc khuấy đều mẫu cấy trong lúc đang
khử trùng.
 Qui trình khử trùng bề mặt:
- Rửa mẫu bằng chất tẩy nhẹ trước khi thao tác với dung dịnh khử trùng.
- Rửa mẫu dưới vòi nước chảy từ 10-30 phút.
- Nhúng ngập mẫu vào dung dịch khử trùng trong điều kiện vô trùng. Đậy nắp lọ rồi lắc
nhẹ trong thời gian khử trùng.
- Bỏ dung dịch khử trùng đi rồi rửa vài lần bằng nước cất vô trùng.
Bảng 2.2: Nồng độ và th i gian s dụng 1 số chất x í mô cấy thực vật:
Th i gian kh

Stt

Chất kh trùng

Nồng độ

1

Hypochlorite calcium

9-10%

5-30

Rất tốt

2

Hypochlorite sodium

0,5-5%

5-30

Rất tốt

3

Nước bromine

1-2%

2-10

Rất tốt

4

Oxy già

3-12%

5-15

Tốt

5

Chlorua thủy ngân

0,1-1%

2-10

Tốt

6

Nitrate bạc

1%

5-30

Tốt

7

Kháng sinh

4-50mg/l

30-60

khá

trùng (phút)

Hiệu quả


2.2. Giới thiệu cây Sâm Ngọc Linh
2.2.1. Phân oại
 Lịch s phân oại:
Việt Nam có nhiều cây thuốc được gọi là Sâm. Nhưng chỉ có bốn loài Sâm
thuộc họ Nhân Sâm (Araliaceae). Chi Panax gần gũi với cây Nhân Sâm Panax
gingseng C. A. Meyer là Sâm Ngọc Linh, Sâm Tam Thất, Sâm Nam và Sâm Vũ
Diệp, đều là các cây thuốc quý.
Năm 1968, KS. Vũ Đức Minh đã tìm thấy cây Sâm Ngọc Linh tại vùng núi
Ngọc Linh và tạm đặt tên nó là Sâm Khu 5. Năm 1973, đoàn điều tra cây thuốc của
Ban dân y Khu 5 do DS. Đào Kim Long dẫn đầu đã phát hiện một loài Panax mọc
hoang thành quần thể ở độ cao 1.800 m trên vùng núi Ngọc Linh và tạm đặt tên là
Sâm Đốt Trúc với tên khoa học Panax articulatus, họ Nhân Sâm (Araliaceae)
(Nguyễn Minh Đức, 2003). Tên khoa học của cây được công nhận là Panax
vietnamensis Ha et Grush., họ Nhân Sâm raliaceae, công bố tại Viện thực vật
Kamarov (Liên Xô trước đây) nǎm 1985 do Hà Thị Dung và I. V. Grushvistky đặt
tên (internet 4).

Hình 2.1: Sâm Ngọc Linh ngoài tự nhiên

 Phân oại:
- Giới: Plantae
- Ngành: Magnoliophyta
- Bộ: Apiales
- Họ: Cam Tùng (Araliaceae)
- Chi: Panax
- Loài: Panax
- Loài: Panax vietnamensis Ha et Grush
- Tên khác: Sâm Việt Nam, Sâm Ngọc Linh, Sâm Khu Năm, Thuốc Dấu (Xê Đăng).
- Tên nước ngoài: Vietnamese ginseng.

Hình 2.2: Hình thái Sâm Ngọc Linh
2.2.2. Đặc đi m hình thái
Cây thảo, sống lâu năm nhờ thân rễ, cao khoảng 40 - 80 cm, đôi khi trên 1 m.
Thân rễ nạc, mọc bò ngang như củ gừng, có nhiều đốt, không phân nhánh, dài
30 - 40 cm, có thể hơn, mang nhiều rễ nhánh và củ, có nhiều vết sẹo do thân khí sinh
hàng năm để lại, mặt ngoài màu nâu nhạt, ruột trắng ngà, phần cuối đuôi đôi khi có
một củ hình cầu. Thân rễ còn mang nhiều rễ phụ, ở cây hoang dại, thân rễ là phần
phát triển mạnh nhất chứa chất dự trữ, hoạt chất. Hình dạng rất thay đổi, rễ củ ở cây
sâm hoang dại rất phát triển có dạng con quay, hình trụ, có màu vàng nhạt mang


nhiều rễ con với những vàm ngang. Đối với sâm trồng, rễ củ rất phát triển, tăng
trưởng hàng năm rất r rệt, chúng có ba dạng chính: dạng củ cà rốt, dạng con quay và
dạng bó củ, đây là dạng rất phổ biến. Sâm Ngọc Linh trồng thường cao đến 1 m
mang nhiều lá kép có khi đến 7 lá chét to hơn bình thường.
Thân khí sinh mảnh, th ng màu xanh hay hơi tím, mọc th ng, mang 2 - 4 lá
kép chân vịt mọc vòng, mỗi lá kép có 5 lá chét hình trứng ngược hoặc hình mác, dài
10 - 14 cm, rộng 3 - 5 cm, gốc hình nêm, đầu thuôn dài thành mũi nhọn, mép khía
răng nhỏ.

Hoa tự, cụm hoa mọc thành tán đơn ở ngọn thân, có cuống dài 10 - 20 cm có
thể k m 1 - 4 tán phụ hay một hoa riêng lẻ ở phía dưới tán chính. Hoa nhiều màu lục
vàng, hoa hình tán đơn mọc dưới các lá th ng với thân. Mỗi tán 60 - 100 hoa, cuống
hoa ngắn 1 - 1.5 cm, lá đài 5, cánh hoa 5, vàng nhạt, nhị 5, bầu 1 ô với 1 vòi nhụy.
Đài có 5 răng dài, nhị 5, chỉ nhị hình sợi, bầu 1 ô với một vòi nhụy.
Lá kép, chân vịt mọc vòng với 3-5 nhánh lá, cuống lá kép, mang 5 lá chét, lá
chét phiến bầu dục, mép khía răng cưa, chóp nhọn, có lông ở cả hai mặt.
Quả hạch, hình trứng, khi chín có màu đỏ hay vàng nhạt, sau đen, hạt hình
thận màu trắng, bề mặt hạt có nhiều chỗ lồi l m, có vân, quả mọc tập trung ở trung
tâm của tán lá, dài độ 0,8 - 1cm và rộng khoảng 0,5 - 0,6 cm, mỗi quả chứa một hạt,
một số quả chứa 2 hạt và số quả trên cây bình quân khoảng 10 đến 30 quả.
Mùa hoa: tháng 4 – tháng 6, mùa quả: tháng 7 – tháng 9.

Hình 2.3: Cây Sâm Ngọc Linh