định tính salmonella

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
---------

BÀI TIỂU LUẬN
MÔN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM
ĐỀ TÀI:CÁC

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH
SALMONELLA


MỤC LỤC

Tháng 11- 2014


LỜI MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, vấn đề ngộ độc thực phẩm càng trở nên cấp thiết,
các báo cáo cho thấy phần lớn ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật. Đã có những
cảnh báo, tuy nhiên tình trạng ngộ độc thực phẩm vẫn leo thang và ngày càng
nghiêm trọng.
Có rất nhiều vi sinh vật gây nghộ độc thực phẩm, ví dụ như: Clostridium
butolinum, Escherichia Coli, Listeria monocytogenes,… trong đó Salmonella là
loài vi sinh vật gây ngộ độc rất nguy hiểm. Salmonella thuộc họ
Enterobactriaceae, gây ra bệnh thương hàn, nhiễm trùng máu và nhiều bệnh
nghiêm trọng khác.
Theo kết quả nghiên cứu, hiện nay có khoảng 4% người mang mầm bệnh.
Tất cả các chỉ tiêu vệ sinh thực phẩm điều không cho phép có mặt Salmonella

trong thành phẩm. Sự hiện diện của chúng được kiểm tra gắt gao bởi các cơ quan
chức năng.
Ngày nay, con người có những hiểu biết sâu rộng hơn thì vấn đề kiểm soát
vệ sinh thực phẩm càng được quan tâm nhiều hơn. Với ý nghĩa thực tiễn nêu trên,
nhóm chúng em tiến hành nghiên cứu đề tài: “phương pháp định tính Salmonella”
nhằm đưa ra một số phương pháp định tính Salmonella để phục vụ cho công tác vệ
sinh thực phẩm.


I.
I.1.

Tình hình nhiễm độc Salmonella ở Việt Nam và trên Thế giới
Trên Thế giới:

Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở các nước Châu Âu giảm điều đặn từ các năm 1990 trở lại
đây, trong năm 2007 có khoảng 152.000 ca nhiễm Salmonella trên người được phát hiện,
sự sai lệch của báo cáo này là rất lớn, số lượng thực tế rất có thể lớn hơn gấp 10 lần như
thế. Ở Mỹ, tình trang khá hơn ổn định ở mức 15 ca trên 100.000 người từ năm 2001 do
kiểm soát tốt Salmonella trong thực phẩm từ năm 1990, bao gồm các thực phẩm sữa,
trứng, sản phẩm tươi sống,…và đặc biệt là thịt.
Một đợt dịch gần đây ở Mỹ gây ra bởi S.typhimurium nhiễm trong bơ đậu phụng đã
gây ảnh hưởng đến hơn 700 người trên khắp đất Mỹ.
Từ tháng 7/2009 tới nay, số ca bị nhiễm Salmonella được phát hiện ở Mỹ tăng lên 184
người thuộc 38 bang khác nhau.
I.2.

Ở Việt Nam:

Hiện nay, mạng lưới kiểm nghiệm VSATTP đã được hình thành rộng khắp cả nước

nhưng thực tế năng lực kiểm nghiệm nhiều chỉ tiêu về an toàn thực phẩm tại một số địa
phương vẫn rất hạn chế. Trong 330 mẫu hoa quả có tới 2,7% số mẫu có tỷ lệ tồn dư
thuốc bảo vệ thực vật cao nhất là táo đỏ, quýt và lê. Đặc biệt trong số 1.416 mẫu thịt và
sản phẩm từ thịt đã phát hiện 40,9% số mẫu nhiễm khuẩn Salmonella gây ra các bệnh về
đường tiêu hóa. Hơn nữa, khu vực Tp HCM và Đồng Nai là những địa phương có tỷ lệ
mẫu thực phẩm nhiễm Salmonella cao nhất, chiếm 84-95% mẫu được giám sát.
II.
II.1.

Đặc điểm của Salmonella:
Lịch sử phát hiện:

Salmonella được lấy tên từ nhà khoa học người Mỹ, Danier Elmer Salmon – một nhà
nghiên cứu bệnh lý động vật. Thực chất ông không phải là phát hiện đầu tiên mà là nhà
khoa học Theobald Smith. Nhưng D.E.Salmon đã công bố trước.T.Smith là bạn đồng
nghiệp của D.E.Salmon, cùng làm việc ở Bureau ò Animal Industry (BAI) vào năm 1884.
Salmonella là một trong những vi khuẩn nguy hiểm nhất hiện nay. Loại vi khuẩn có thể
sống trong các ống ruột của người và động vật. giống vi khuẩn này có nhiều loại khác


nhau, loại phổ biến nhất mà các nhà khoa học Mỹ tìm thấy tại nước này là chủng
S.typhimurium và S.enteritidis gây ra bệnh Samonellosis.
Vi sinh vật gây bệnh đường ruột quan trọng về các khía cạnh bệnh học, dịch tễ học, vi
sinh môi trường, vi sinh an toàn thực phẩm. Vi khuẩn này phân bố rộng khắp trong tự
nhiên, có thể xâm nhiễm và gây bệnh cho người, động vật máu nóng, động vật máu lạnh
dưới nước và trên cạn.

Hình1. Vi khuẩn Samonella ssp
II.2.

Phân loại:

Về phân loại khoa học, Salmonella được xếp vào:
Giới:

Bacteria

Ngành:

Proteobacteria

Lớp:

Gamma proteobacteria

Bộ:

Enterobacteriales

Họ:

Enterobacteriaceae

Chi:

Salmonella

Loài:

Salmonella bongori

Salmonella enteric

Các loài điển hình:


Salmonella typhi: Gây bệnh thương hàn

Hình2. Salmonella typhi

Salmonella paratyphi: Gây bệnh phó thương hàn

Hình 3. Salmonella paratyphy
Salmonella cholera_suis: Gây bệnh nhiễm trùng máu

Hình 4: Salmonella cholera_suis

Salmonella entertidis: Gây rối loạn tiêu hóa


Hình 5: Salmonella entertidis

Một số bệnh thường gặp ở động vật do Salmonella gây ra: phó thương hàn ở bò và
lợn, bệnh sảy thai ở cừu và ngựa, bệnh bạch lỵ ở gà, bệnh thương hàn chuột, bệnh viêm
phổi bò,…
Một số chủng Salmonella khác: S. thompson, S. derby, S. newport, S. kissangani,…
II.3.

Đặc điểm hình thái:
Salmonella là vi sinh vật thuộc hệ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae.

Salmonella là vi khuẩn gram âm (khi nhuộm bằng kỹ thuật gram thì vi khuẩn bắt màu đỏ
hồng), hình que, kích thước khoảng 2-3 x 0.5-1 µm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, có tiên
mao, có thể di động (trừ S.gallinarum và S.pullorum)
II.4.

Cấu trúc của salmonella:
Salmonella có 3 loại kháng nguyên, đó là nhũng chất xuất hiện trong cơ thể thì tạo

kích thích đáp ứng miễn dịch và kết hợp đặc hiệu với những sản phẩm của sự kích thích
đó gồm: kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H và kháng nguyên vỏ K.
• Kháng nguyên vách tế bào (kháng nguyên thân O):
Thành phần cơ bản là vách tế bào có cấu trúc phức tạp gồm 2 lớp. Trong cùng là
một lớp peptidoglycan mỏng, cách một lớp không gian chu chất và tới lớp màng ngoài là
phức hợp lipidpolysaccharide gồm lipoprotein và liposaccharide.
Bao bên ngoài lớp peptidoglycan là lớp photpholipid A và B (quyết định độc tố
của nội độc tố), sau đó là 2 lớp polysaccharide không mang tính đặc hiệu. Kháng nguyên
của nội độc tố có bản chất hóa học là lypopolysaccharide (LPS). Tính đặc hiệu của kháng


nguyên O và LPS là một nhưng tính miễn dịch là khác nhau: kháng nguyên O ngoài LPS
còn bao gồm lớp peptidoglycan nên tính sinh miễn dịch của nó mạnh hơn LPS.
Màng ngoài có cấu trúc gần giống tế bào chất nhưng phospholipid chỉ gặp ở lớp

-

trong còn ở ngoài là lớp polysaccharide dày khoảng 8-10 nm gồm 3 thành phần:
Lipid A
Polysaccharide lõi
Kháng nguyên O
Màng ngoài còn có thêm các protein:

Protein cơ chất: protein ở vi khuẩn còn gọi là protein xuyên màng với chức năng cho

-

phép một loại phân tử đi qua chúng như dipeptide, disaccharide, các ion vô cơ.
Protein màng ngoài: chức năng vận chuyển một số phân tử riêng biệt và đưa ra màng

-

ngoài.
Lipoprotein: đóng vai trò liên kết lớp peptidoglycan bên trong với lớp màng ngoài.

-

•

Kháng nguyên vỏ (kháng nguyên K)
Bản chất hóa học của vỏ vi khuẩn là polypeptide hoặc polysaccharide. Vỏ của vi

khuẩn gây miễn dịch không mạnh nhưng khi gắn với tế bào vi khuẩn vỏ vẫn gây miễn
dịch được. Kháng nguyên vỏ dùng để phân loại các chủng Salmonella.
•

Kháng ngyên lông ( kháng nguyên H)

Được tổng hợp từ các acid amin dạng D. Do đó việc xử lý kháng nguyên của các tế bào
không thuận lợi và đáp ứng kháng thể không mạnh. Khi các sợi lông bị kết hợp bởi các
kháng thể đặc hiệu lông sẽ bất động vi khuẩn không thể di chuyển được. Kháng nguyên
lông dùng để phân loại một số chủng Salmonella.

Bảng 1: Phân biệt các kháng nguyên O, H, K

II.5.

Kháng
nguyên

Tính chịu nhiệt

Tác động của
alcohol 50%

O

Ổn nhiệt 2h30 ở 1000C

K

Biến nhiệt 15’06’’ ở
1000C

Nhạy cảm

H

Biến nhiệt 2h ở 1000C

Nhạy cảm

Kháng

Formol 50%
Bị ngăn trở
ngưng kết
Kháng
Kháng

Điều kiện sinh trưởng
Salmonella phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Trên môi

trường thích hợp, vi khuẩn sẽ phát triển sau 24 giờ. Có thể mọc trên môi trường có chất
ức chế chọn lọc như DCA (deoxycholate xitrate agar) và XLD (xylose lysine
deoxycholate), trong đó môi trường XLD ít chất ức chế hơn nên được dung để phân lập
Salmonella. Khẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường này là tròn, lồi, trong
suốt, có tâm đen đôi khi tâm đen lớn bao trùm khuẩn lạc, môi trường xung quanh
chuyển sang màu đỏ.
Salmonella kém đề kháng với điều kiện bên ngoài, bị phá hủy bởi quá trình tiệt
trùng bằng phương pháp Pasteur, tia bức xạ và đun sôi nấu kỹ. Tuy nhiên, Salmonella có
thể sống xót trong một thời gian dài ở các thực phẩm khối và ướp lạnh. Do đó, khi ta làm
tan thực phẩm đông lạnh vi khuẩn này dễ phát triển trở lại.
Chúng phát triển tốt nhất ở 6 oC – 42oC thích hợp nhất ở 35oC – 37oC, pH từ 6 – 9
và thích hợp nhất ở pH = 7,2. Ở nhiệt độ 18oC – 40oC vi khuẩn có thể sống đến 15 ngày.
Khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn này rất kém: ở 50 oC trong 1 giờ, ở 70oC trong 15
phút và 100oC trong 5 phút. Chúng bị tiêu diệt bởi phenol 5%, Cloramin 1% và clorur
thủy ngân 0,2% trong 5 phút. Với nồng độ muối 8 – 19% thì sự phát triển của vi khuẩn
ngừng lại.
Vi khuẩn này không gây mùi vị khó chịu cho thực phẩm, chúng hiện diện trong
các loại thực phẩm như: thịt, trứng, các sản phẩm từ trứng, thủy hải sản,…

-

II.6.
Tính chất hóa sinh:
Salmonella có khả năng lên men đường glucose và manitol, sinh acid.
Không lên men saccharose và lactose, không phân giải urea, không có khả năng tách

-

nhóm amine từ tryptophane.
Salmonella không sinh indol, không làm lỏng gelatin.
Hầu hết các chủng Salmonella đều sinh H2S.
II.7. Các yếu tố độc lực:

Vi khuẩn Salmonella có thể tiết ra hai loại độc tố: ngoại độc tố và nội độc tố.
→ Nội độc tố của Salmonella rất mạnh gồm 2 loại: gây xung huyết và mụn loét, độc tố ở
ruột gây độc thần kinh, hôn mê, co giật.
→ Ngoại độc tố chỉ phát hiện khi lấy vi khuẩn có tính độc cao cho vào túi colodion rồi đặt
vào ổ bụng chuột lang để nuôi, sau 4 ngày lấy ra rồi lại cấy lại như vậy từ 5 – 10 lần, sau
cùng đem lọc. nước lọc có khả năng gây bệnh cho động vật thí nghiệm. Ngoại độc tố chỉ
hình thành trong điều kiện invivo và nuôi cấy kỵ khí. Ngoại độc tố tác dụng lên thần kinh
và ruột.


III.
Các phương pháp phân tích:
III.1.
Phương pháp truyền thống:
III.1.1. Nguyên tắc:

Salmonella có thể được phát hiện (phân tích định tính) bằng một quy trình bao
gồm 4 bước là tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định. Salmonella thường
có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương và cùng hiện diện chung với một số
lượng lớn vi sinh vật thuộc họ Enterobacteriaceae có tính cạnh tranh mạnh và sự ức chế
sinh trưởng của Salmonella.
 Bước tiền tăng sinh: bằng dung dịch đệm pepton BPW. Tùy theo đặc tính thành phần

hóa học của mẫu cần chọn quy trình tăng sinh phù hợp. Thông thường tỉ lệ giữa mẫu và
môi trường tăng sinh là 1:9, tuy nhiên tùy trường hợp mà tỷ lệ này có thể thay đổi.
 Bước tăng sinh chọn lọc: các môi trường tăng sinh chọn lọc thường dùng để phát hiện
Salmonella trong các mẫu thực phẩm là Rappaport Vassiliadis Soya (RVS), Selenite
Cystein Broth, Tetrathionate Mueler Kauffmanm Broth (MKTTn)…các nghiên cứu gần
đây cho thấy môi trường RVS có thể thay thế cho các môi trường khác để phân tích nhiều
mẫu khác nhau. Tuy vậy, môi trường MKTTn thường dùng để phân tích các mẫu thịt tươi
sống, các mẫu có mật độ nhiễm cao, các mẫu thức ăn gia súc,… Hiện nay người ta
khuyến khích nên dung ít nhất 2 môi trường tăng sinh chọn lọc để phát hiện tất cả các
Serotype Salmonella (kiểu huyết thanh) nếu có hiện diện trong mẫu.
 Bước phân lập: nhằm tách và nhận diện Salmonella khỏi các quần thể vi sinh vật khác

trong mẫu. Nhiều loại môi trường rắn khác nhau được sử dụng để phân lập Salmonella,
mỗi môi trường giúp nhận diện giống của nhóm này dựa trên một số đặc tính. Hiện nay,
các tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm khuyến khích sử dụng ít nhất 2 môi trường phân
lập khác nhau để tăng cường khả năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella, đặc biệt là
môi trường XLD được khuyến khích sử dụng.
 Bước khẳng định: nhằm xác định lại các khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella xuất hiện
trong môi trường phân lập. Bước này dựa trên các thử nghiệm sinh hóa và các thử nghiệm
huyết thanh đặc trưng của Salmonella. Các thử nghiệm sinh hóa được khuyến khích sử
dụng là KIA/TSI, indol, LDC (Lysine decarboxylase), ODC (Ornithine decarboxylase),
urea, manitol, sorbitol, các thử nghiệm huyết thanh O và H.

III.1.2. Môi trường và hóa chất:

Dương tính

Môi trường và hóa chất
Dung dịch đệm pepton
Buffered Pepton Water (BPW)
Canh Rappaport Vassiliadis Soya Pepton
(RVS)
Selenit xystin / Tetrathionat (MKTTn)
Xylose Lysine Deoxycholate (XLD)
Hektoen Entric Agar (HE)
Tryptone Soy Agar (TSA)
Lysine Decacboxylase broth (LDC)
Voges – Proskauer (VP)
Urea Borth
Tryptone Water
Kligler Iron Agar (KIA)/TSI
Đĩa giấy ONPG
Dung dịch creatine
Kháng huyết thanh
Dung dịch α- naphtol
KOH 40%
Thuốc thử Kovac’s
HCl và NAOH 10%

III.1.3. Quy trình thực hiện:

Mục đích
Tăng sinh sơ bộ
Tăng sinh chọn lọc
Phân lập
Phục hồi
Thử nghiệm sinh hóa để khẳng định
Salmonella

Thuốc thử các phản ứng sinh hóa

Chỉnh pH


3.1.4 Các bước tiến hành
Cân một lượng 25g mẫu rắn hoặc 25 ml mẫu lỏng với sai số cho phép ±5% của
phân mẫu thử đại diện cho vào bao PE vô trùng (hoặc bình tam giác) bổ sung 225ml môi
trường BPW và đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu trong 60 giây.
a. Tiền tăng sinh (tăng sinh sơ bộ trong môi trường lỏng không chọn lọc)

Cấy phần mẫu thử trong dung dịch đệm pepton ở nhiệt độ phòng, sau đó ủ ở 37 0C
± 10C trong 18h ± 2h.
Đối với một số loại thực phẩm nhất định, cần phải sử dụng các qui trình tăng sinh
sơ bộ khác.
Thành phần dung dịch đệm pepton
Pepton từ casein

10,0 g

Natri clorua

5,0 g

Dinatri hydro phosphat ngậm 12 phân tử nước (Na2HPO4.12H2O)

9,0 g

Kali dihydro phosphat (KH2PO4)

1,5 g

Nước

1 000 ml

Chuẩn bị môi trường tăng sinh đối với một số thực phẩm có thể chưa các chất có
thể gây độc hoặc ức chế sự tăng trưởng của Salmonella:
Mẫu gia cầm tươi sống:
Đặt gia cầm vào trong một bao nhựa lớn, thêm vào 1 lít môi trường BPW. Lắc
bằng máy lắc khoảng 30 giây để môi trường thấm vào trong toàn bộ mẫu.
Sữa khô:
Cho 25g mẫu vào trong túi PE vô trùng, bổ sung 225ml môi trường BPW, để yên
trong 60 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó lắc cho đến khi sữa tan hoàn toàn.
Các gia vị hay các loại thực phẩm chứa nhiều gia vị:


Đồng nhất mẫu ở độ pha loãng 1/100 trong BPW trước khi nuôi tăng sinh. Biện pháp
này nhằm làm giảm nồng độ các chất ức chế sự tăng trưởng của Salmonella trong bước
tăng sinh.
Casein, phomai, bơ và các sản phẩm tương tự:
Thực hiện đồng nhất trong môi trường tăng sinh đã được làm ấm đến 40oC.

Dừa, các sản phẩm dừa và các sản phẩm có hàm lượng béo cao:
Đồng nhất mẫu với BPW, sau đó thêm vào 2-3 giọt Triton X-100 trước khi ủ tăng
sinh.
b. Tăng sinh chọn lọc:

Lắc để trộn đều dịch tăng sinh, sau đó chuyển 0,1ml sang 10ml môi trường tăng
sinh chọn lọc RSV, ủ ở (41,5±1) °C trong (24 ±3) h. Đồng thời, chuyển 1 ml vào ống
chứa 10 ml môi trường MKTTn ủ ở (37±1) 0C trong (24±3) h. Cẩn thận không được để
vượt quá nhiệt độ ủ tối đa (42,5 0C).
Thành phần môi trường tăng sinh chọn lọc RVS:
Thành phần môi trường RSV
Pepton từ đậu tương
Natri clorua
Kali dihydro phosphat (KH2PO4 + K2HPO4)

4,5g
7,2g
1,44g

Magie clorua khan (MgCI2)

13,4g

Oxalat xanh malachit
Nước
Thành phần môi trường MKTTn

0,036g
1000ml

Cao thịt

4,3 g

Pepton từ casein

8,6 g

Natri clorua (NaCI)

2,6 g

Canxi cacbonat (CaCO3)

38,7 g

Natri thiosulfat ngậm 5 phân tử nước

47,8 g


(Na2S2O3.5H2O)
Mật bò dùng cho vi khuẩn học

4,78 g

Brilliant green

9,6 mg

Nước
1 000 ml
Một số môi trường tăng sinh chọn lọc khác cũng được sử dụng, mỗi loại môi
trường chỉ có tác dụng chọn lọc dựa trên một đặc điểm phát triển của Salmonella, một số
dòng chỉ có thể tăng trưởng trong môi trường này mà không thể tăng trưởng trong môi
trường khác. Do vậy, để tăng khả năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella hiện diện
trong thực phẩm cần phải dùng ít nhất hai loại tăng sinh chọn lọc khác nhau cho cùng một
mẫu. Ngoài ra mỗi môi trường cần được ủ ở các nhiệt độ khác nhau.
c. Phân lập và nhận diện:

Dùng que cấy vòng cấy phân lập dịch cấy thu được trong môi trường RVS và
MKTTn lên bề mặt của một đĩa Petri chứa môi trường chọn lọc XLD ( thạch Xylose
Lysine Desoxycholate) và HE (Hektoen Entric Agar) . Sau khi cấy, lật ngược các đĩa sao
cho đáy hướng lên trên và đặt chúng trong tủ ấm để ở 37 °C, ủ trong 24 ± 3 h.
Thành phần môi trường XLD
Bột cao nấm men

3,0 g

Natri clorua (NaCI)

5,0 g

Xylose

3,75 g

Lactose

7,5 g

Sucrose

7,5 g

L-Lyzin hydroclorua

5,0 g

Natri thiosulfat

6,8 g

Sắt (III) amoni xitrat

0,8 g

Phenol đỏ
Natri deoxycholat
Thạch
Nước

0,08 g
1,0 g
9 g đến 18 g

1)

1 000 ml

Sau khi ủ, kiểm tra các đĩa về sự có mặt của các khuẩn lạc Salmonella điển hình và
các khuẩn lạc không điển hình mà có thể nghi là Salmonella. Đánh dấu các vị trí của
chúng trên đáy đĩa.
 Khuẩn lạc Salmonella điển hình phát triển trên thạch XLD có tâm màu đen và vùng trong

màu đỏ nhạt do sự thay đổi màu của chất chỉ thị.
 Trên môi trường HE, khuẩn lac Salmonella điển hình có màu xanh lam, có hoặc không có
tâm đen.

Chú thích:
•

Hình 6. Khuẩn lạc Salmonella trên HE

Hình 7. Khuẩn lạc Salmonella trên XLD

Salmonella biến thể âm tính H2S (ví dụ: S.
Paratyphi A) phát triển trên thạch XLD có màu hồng có tâm màu hồng sẫm.
• Salmonella dương tính với lactose phát triển trên thạch XLD màu vàng, có hoặc không có
tâm màu đen.
Ủ môi trường đặc chọn lọc thứ hai (HE) ở nhiệt độ thích hợp và sau một khoảng thời
gian thích hợp kiểm tra để phát hiện sự có mặt với các khuẩn lạc, từ các đặc trưng của
chúng mà có thể coi là Salmonella giả định.
d. Khẳng định:
•

Chọn khuẩn lạc để khẳng định:
Để khẳng định, lấy từ mỗi đĩa Petri của từng môi trường chọn lọc ít nhất một
khuẩn lạc được xem là điển hình hoặc nghi ngờ và bốn khuẩn lạc tiếp theo nếu khuẩn lạc

đầu tiên là âm tính.
Nên lấy ít nhất năm khuẩn lạc để nhận dạng trong trường hợp nghiên cứu dịch tễ
học. Nếu trên một đĩa có ít hơn năm khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc nghi ngờ, thì lấy
tất cả các khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ đó để khẳng định.


Cấy ria các khuẩn lạc đã chọn trên bề mặt các đĩa thạch dinh dưỡng Tryptone Soy
Agar (NA/TSA), sao cho các khuẩn lạc phân lập tốt phát triển được. Ủ các đĩa đã cấy ở
37 ±1 °C trong 24±3 h.
Sử dụng các chủng cấy thuần khiết để khẳng định bằng phép thử sinh hoá và huyết
thanh.
•

Khẳng định sinh hoá:
Từ các khuẩn lạc đã chọn cấy ria lên NA/TSA, dùng que cấy cấy vào các môi
trường sau:

 Thử nghiệm TSI/KIA

Nguyên tắc: đồng thời xác định khả năng sử dụng nguồn carbohydrate cụ thể kết hợp
với môi trường tăng trưởng cơ bản, có hoặc không có sinh hơi và khả năng sinh H 2S.
Thành phần môi trường KIA:
Thành phần

Khối lượng

Cao thịt

3,0 g

Cao nấm men

3,0 g

Pepton
Natri clorua (NaCI)

20,0 g
5,0 g

Lactose

10,0 g

Glucose

1,0 g

Sắt (III) xitrat

0,3 g

Natri thiosulphat

0,3 g

Phenol đỏ
Thạch
Nước

0,024 g
9 g đến 18 g

1)

1 000 ml

Môi trường1)
TSI
có thuộc
thêm 10g
Phụ
vàosucrose.
sức đông của thạch
Thực hiện: Cấy ria trên bề mặt nghiêng của thạch và cấy đâm sâu xuống đáy. Ủ ở
37±1°C trong 24±3 h.


Khả năng sử dụng nguồn carbon: Môi trường KIA chứa 2 loại đường là 1% lactose
và 0.1% glucose. Khi cấy chủng vi sinh vật lên môi trường này có 3 trường hợp xảy ra
đối với sự tăng trưởng của VSV: chỉ sử dụng glucose, sử dụng glucose và lactose, không
sử dụng cả hai đường này. Salmonella chỉ lên men được đường glucose vì thế phần
nghiêng của môi trường có màu đỏ, phần sâu có màu vàng. Thời gian ủ từ 18-24 giờ.
Khả năng sinh H2S: đa số các dòng Salmonella đều có khả năng sinh H2S nên có
xuất hiện các vệt màu đen trong môi trường này. Có thể thấy hiện tượng sinh hơi qua hiện
tượng làm vỡ thạch môi trường hoặc môi trường bị đẩy lên trên tạo một khoảng không
bên dưới đáy ống nghiệm.

Hình 8. thử nghiệm KIA.
Ống 1: môi trường KIA không có VSV.

Ống 2: xuất hiện màu vàng chứng tỏ VSV lên
men lactose tốt (lên men glucose cũng tốt).
Ống 3: có sinh khí, chứng tỏ lên men có sinh khí.
Ống 4: màu đỏ trên phần thạch nghiêng, màu
vàng dưới đáy chứng tỏ VSV chỉ lên men
glucose.
Ống 5: màu đen xuất hiện chứng tỏ có quá trình
khử lưu huỳnh và sinh H2S.

 Thử nghiệm urê

Nguyên tắc: Sử dụng để phát hiện khả năng phân cắt ure thành ammoniac do hoạt tính
của enzyme urease từ vi sinh vật và kết quả là môi trường bị kiềm hóa do NH 3 được tạo
ra.
Thành phần môi trường gồm 950ml môi trường cơ bản +50 ml dung dịch ure.
Thành phần môi trường cơ bản
Pepton
Glucoza
Natri clorua (NaCl)
Kali dihydro phosphat (KH2PO4)

1,0g
1,0g
5,0g
2,0g


0,012g

Phenol đỏ

Thạch

1)
9 g đến 18 g
1000ml

Nước
Dung dịch ure
Urê
Nước vừa đủ

400g
1000ml

Thực hiện: Cấy ria trên bề mặt nghiêng của thạch, ủ ở 37±1 °C trong 24±3 h và
kiểm tra thường xuyên.
Nếu phản ứng là dương tính (+), thì sự phân giải urê thành amoniac, làm phenol
màu đỏ chuyển thành màu hồng và sau đó chuyển thành màu đỏ hồng. Phản ứng thường
xuất hiện sau 2h đến 4h.
Ngược lai, nếu phản ứng là âm tính (-) thì môi trường không đổi màu (màu vàng
cam).

(+)

(-)

Hình 9. Thử nghiệm ure
 Thử nghiệm Lysine decarboxylase (LDC)

Nguyên tắc: Sử dụng để phát hiện các vi khuẩn sinh các enzyme decarboxylase, các

enzyme này tương tác với các amino acid có gốc carboxyl (-COOH) ở cuối, tạo thành
amine hay diamine và carbon dioxide (CO 2) làm tăng pH môi trường, thay đổi màu chất
chỉ thị bromocresol purple.
Thành phần môi trường:
Thành phần

Khối lượng


L-Lyzin monohydroclorua
Cao nấm men

5,0g
3,0g

Glucoza

1,0g

0,015g
Bromocresol đỏ tía
Nước
1000ml
Thực hiện: Cấy ngay phía dưới bề mặt của môi trường lỏng, phủ một lớp paraffin
hay dầu khoáng lên bề mặt môi trường. Ủ ở 37±1 °C trong 24±3 h.
•
•

Màu đục và đỏ tía sau khi ủ chứng tỏ phản ứng dương tính.
Màu vàng là phản ứng âm tính.

Hình 10. Thử nghiệm LDC.
 Thử nghiệm Voges-Proskauer (VP)

Nguyên tắc: Xác định khả năng sinh acetylmethylcarbinol (acetoin) và oxi hóa acetoin
thành diacetyl trong quá trình lên men của một số vi sinh vật. diacetyl sẽ kết hợp với
guanidine có trong pepton kết tụ thành diacetyl – guanidine có màu đỏ.
Thành phần
Pepton
Glucoza
Dinatri hydro phosphat (K2HPO4)
Nước

Khối lượng
7,0g
5,0g
5,0g
1000ml

Thực hiện: Cho một vòng đầy các khuẩn lạc nghi ngờ vào ống vô trùng có chứa 3 ml
môi trường VP. Ủ ở 37 °C ± 1 °C trong 24 h ± 3 h.


Sau khi ủ, thêm hai giọt dung dịch creatin, ba giọt dung dịch etylic 1-naphtol và
sau đó thêm hai giọt dung dịch kali hydroxit; lắc đều sau mỗi lần thêm từng loại thuốc
thử.
Khi xuất hiện màu hồng đến màu đỏ nâu trong 15 phút chứng tỏ phản ứng dương
tính. Phản ứng là âm tính khi dịch vi khuẩn không đổi màu.

Hình 11. Thử nghiệm VP

 Thử nghiệm indol

Nguyên tắc: Phát hiện khả năng oxi hóa tryptophan thành các dạng của indol: Indol,
Skatol (methyl indol) và indol-acetate. Và để phát hiện indol, ta dùng thuốc thử chứa
p-DMABA. Nhân pyrrol của indol chứa –CH2 sẽ kết hợp với nhân benzen của pDMABA tạo nên phức chất dạng quinone có màu đỏ.
Thanpâ

Thành phần môi trường trypton/tryptophan
Trypton

Khối lượng
10 g

Natri clorua (NaCI)

5g

DL-Tryptophan

1g

Nước

1 000 ml

Thuốc thử Kovacs
4-Dimetylaminobenzaldehyt

5g

Axit clohydric, p = 1,18 g/ml đến 1,19 g/ml

25ml

2-Metylbutan-2-ol

75ml

Thực hiện: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống chứa 5 ml môi
trường trypton/ tryptophan. Ủ ở 37±1 °C trong 24±3 h. Sau khi ủ,
thêm 1 ml thuốc thử Kovacs.
Nếu có xuất hiện một vòng màu đỏ chứng tỏ phản ứng
dương tính. Khi xuất hiện một vòng màu nâu vàng chứng tỏ phản
ứng âm tính.
Hình 12. Thử nghiệm
indol


Bảng 2. Giải thích các phép thử sinh hoá
Chủng Salmonella
Phép thử

S. Typhi

S.Paratyphi A S.Paratyphi B S.Paratyphi C

Phản
ứng

%*

Sử dụng glucose

+

100 +

100

+

+

+

100

Sinh khí từ glucose

-#

0

+

100

+

+

+

92

Sinh H2S

+

97

-

10

+

+

+

92

Phân giải urê

-

0

-

0

-

-

-

1

Lyzin đã khử nhóm
+
cacboxyl

98

-

0

+

+

+

95

Phản ứng VogesProskauer

-

0

-

0

-

-

-

0

-

0

-

0

-

-

-

1

Sinh indol

Phản
ứng

%*

Phản
ứng

%**

Phản
ứng

Các chủng
khác

%**

Phản
ứng

%*

*

Các tỷ lệ phần trăm này cho thấy rằng không phải tất cả các typ huyết thanh Salmonella
cho các phản ứng đánh dấu + hoặc -. Các tỷ lệ phần trăm này có thể thay đổi tuỳ theo typ
huyết thanh và trong các typ huyết thanh làm nhiễm độc thực phẩm từ các nơi khác nhau.
**
#

Các phần trăm này chưa có số liệu,

Salmonella Typhi là loại yếm khí

•

Khẳng định huyết thanh và typ huyết thanh

-

Loại trừ chủng tự ngưng kết
Cho một giọt dung dịch muối sinh lý lên phiến kính thuỷ tinh đã được làm sạch
một cách cẩn thận. Dùng que cấy vòng trộn đều dung dịch với khuẩn lạc cần thử, để thu


được huyền phù đục và đồng nhất. Lắc nhẹ phiến kính từ 30 giây đến 60 giây. Quan sát
kết quả trên nền tối, tốt nhất là dùng kính lúp.
Thành phần dung dịch muối sinh lý:
Natri clorua (NaCI)
Nước

8,5 g

1000 ml

Chú thích: Cũng có thể trộn đều khuẩn lạc cần thử trong một giọt nước, và sau đó trộn
dung dịch này với một giọt dung dịch muối.
Nếu vi khuẩn ít nhiều có kết dính các đơn vị với nhau, thì chủng này được xem là
tự ngưng kết, và sẽ không phải thử nghiệm tiếp vì không thể phát hiện kháng nguyên
được.
-

Kiểm tra kháng nguyên:
Nguyên tắc thực hiên: Nhỏ một giọt huyết thanh kháng nguyên O, H, K lên một
lam kính sạch. Dùng que cấy vòng trộn đều dung dịch với khuẩn lạc cần thử, để thu được
huyền phù đục và đồng nhất. Lắc nhẹ phiến kính từ 30 giây đến 60 giây. Quan sát kết quả
trên nền tối, tốt nhất là dùng kính lúp.

•

Kiểm tra kháng nguyên O, K
Nếu xuất hiện ngưng kết, thì phản ứng được xem là dương tính. Ngược laị nếu vi
khuẩn phân bố đều trong huyết thanh, làm cho giọt dung dịch đục đều được xem là kết
quả âm tính.

•

Kiểm tra kháng nguyên H
Cấy khuẩn lạc thuần khiết không có khả năng tự ngưng kết vào thạch dinh dưỡng
nửa đặc. Ủ môi trường này ở 37±1°C trong 24 ± 3 h.
Thành phần thạch dinh dưỡng nữa đặc

Cao thịt

3,0 g

Pepton

5,0 g

Thạch

4 g đến 9 g1)

Nước

1 000 ml

Sử dụng chủng cấy này để kiểm tra kháng nguyên H, tiến hành theo nguyên tắc
thực hiện trên.
Nếu xuất hiện ngưng kết thì phản ứng được xem là dương tính. Ngược laị nếu vi
khuẩn phân bố đều trong huyết thanh, làm cho giọt dung dịch đục đều được xem là kết
quả âm tính.

1)1) Phụ thuộc vào sức đông của thạch.