Xây dựng phương pháp định lượng acid shikimic trong đại hồi bằng sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI


MEAS PUTHEKA
Mã sinh viên: 1101413

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG ACID SHIKIMIC TRONG
ĐẠI HỒI BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG
KẾT HỢP ĐO MẬT ĐỘ QUANG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

MEAS PUTHEKA
Mã sinh viên: 1101413

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG ACID SHIKIMIC TRONG
ĐẠI HỒI BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG
KẾT HỢP ĐO MẬT ĐỘ QUANG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Nguyễn Văn Hân
2. ThS. Ngô Quang Trung
Nơi thực hiện:

1. Viện Công Nghệ Dược Phẩm
Quốc gia
2. Bộ Môn Công Nghiệp Dược
Trường Đại Học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN !
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, trước tiên, em xin gửi lời cảm
ơn chân thành tới thầy giáo TS. Nguyễn Văn Hân, ThS. Ngô Quang Trung,
DS Trần Trọng Biên những người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tính
và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này.
Và em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường Đại Học
Dược Hà Nội, những người đã dạy dỗ và chỉ bảo em tận tình trong suốt những
tháng năm học tập tại trường .
Cuối cùng, với long biết ơn vô hạn, em xin phép được gửi lời cảm ơn
tới giá đình, người thân, bạn bè đã động viên và hỗ trợ em trong suốt thời
gian qua .
Em xin chân thành cảm ơn !

Hà Nội, tháng 5 năm 2016
Sinh viên:
Meas Putheka


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN.......................................................................... 2
1.1 Tổng quan về cây hồi ............................................................................ 2
Vị trí phân loại và phân bố ............................................................ 2
Đặc điểm thực vật ......................................................................... 2
Bộ phận dùng, thu hái và chế biến ................................................ 3
Thành phần hóa học và công dụng ............................................... 3
1.2 Tổng quan về acid shikimic ................................................................... 4
Công thức hóa học và tính chất ..................................................... 4
Nguồn gốc acid shikimic............................................................... 5
Vai trò acid shikimic ..................................................................... 5
Kỹ thuật phân tích acid shikimic .................................................. 6
Một số nghiên cứu định lượng acid shikimic bằng TLC-scanning
....................................................................................................... 8
1.3 Tổng quan về sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC
Scanning)....................................................................................................... 9
Sắc ký lớp mỏng............................................................................ 9
Sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC Scanning) ..... 12
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ............................................................................................... 14
2.1. Nguyên vật liệu .................................................................................... 14
2.1.1. Nguyên liệu ................................................................................. 14
2.1.2. Hóa chất, thiết bị, dụng cụ .......................................................... 14


2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 16
2.3.1. Xây dựng phương pháp định lượng ............................................ 16
2.3.2. Thẩm định phương pháp định lượng........................................... 18
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................. 22

3.1. Khảo sát điều kiện triển khai sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ
quang (TLC-Sanning).................................................................................. 22
3.1.1. Khảo sát phương pháp hiện màu bản mỏng................................ 22
3.1.2. Khảo sát nồng độ thuốc thử hiện màu......................................... 23
3.2. Thẩm định phương pháp định lượng bằng sắc ký lớp mỏng kết hợp đo
mật độ quang (TLC-Scanning).................................................................... 25
3.2.1. Độ đặc hiệu ................................................................................. 25
3.2.2. Độ thích hợp hệ thống ................................................................. 26
3.2.3. Độ tuyến tính ............................................................................... 27
3.2.4. Độ lặp lại ..................................................................................... 28
3.2.5. Độ đúng ....................................................................................... 28
3.3. Áp dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang định
lượng acid shikimic trong mẫu quả Đại hồi ............................................... 30
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 32
Kết luận: ...................................................................................................... 32
Đề nghị: ....................................................................................................... 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Vị trí phân loại của cây hồi (Illicium verum Hook. f.)..................... 2
Bảng 1.2: Một số thuốc thử hiện màu acid shikimic ........................................ 6
Bảng 2.1: Hóa chất…….……………………………………………………..14
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát độ thích hợp hệ thống ......................................... 27
Bảng 3.2: Nồng độ acid shikimic chuẩn và diện tích pic đáp ứng ................. 27
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát độ lặp lại ............................................................. 28
Bảng 3.4: Kết quả khảo sát độ đúng ............................................................... 28
Bảng 3.5: Kết quả định lượng acid shikimic trong nguyên liệu Đại hồi ........ 30

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Công thức hóa học của acid shikimic ............................................... 4
Hình 2.1: Nguyên liệu Đại hồi ........................................................................ 14
Hình 3.1: Hình ảnh bản mỏng sau khi hiện màu bằng cách nhúng và phun thuốc
thử . Hình 1 bằng cách phun, hình 2 bằng cách nhúng. .................................. 22
Hình 3.2: Hình ảnh bản mỏng khi hiện màu bằng thuốc thử KMnO4 ở các nồng
độ khác nhau.................................................................................................... 23
Hình 3.3: Hình ảnh bản mỏng sau hiện màu ở những thời điểm khác nhau .. 24
Hình 3.4: Bản mỏng sau khi hiện màu ……………………………………….25
Hình 3.5:Sắc ký đồ (1.Mẫu chuẩn. 2. Mẫu thử).............................................. 26
Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích và nồng độ acid shikimic
......................................................................................................................... 27
Hình 3.7: Bản mỏng xác định LOD………………………………………….29
Hình 3.8: Hình ảnh sắc ký đồ LOD.…………………………………………30


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN

HPLC ( High-Performance Liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chromatography).
GLC ( Gas Liquid Chromatography)

Sắc ký khí lỏng

NMR (Nuclear Magnetic Resonance)

Phổ cộng hưởng từ hạt

nhân

RP-HPLC (Reversed-Phase High-

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Performance Liquid Chromatography)

pha đảo

GC (Gas Chromatography)

Sắc ký khí

GC-MS (Gas Chromatography–Mass

Sắc ký khí khối phổ

Spectrometry)
SIM (Selected Ion Monitoring)

Giám sát ion chọn lọc

HPTLC (High-Performance Thin Layer

Sắc ký lớp mỏng hiệu

Chromatography)

năng cao

TLC (Thin Layer Chromatography )

Sắc ký lớp mỏng

TLC-Scanning (Thin Layer Chromatography- Sắc ký lớp mỏng kết hợp
Scanning)

đo mật độ quang

LOD (Limit of Detection)

Giới hạn phát hiện

LOQ (Limit of Quantitation)

Giới hạn định lượng

Rf (Retention Fector)

Hệ số lưu giữ

RSD (Relative Standard Deviation)

Độ lệch chuẩn

µL

Micrlit

µm

Micromet


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Acid shikimic từ lâu được biết đến là một hợp chất trung gian quan trọng
trong quá trình sinh tổng hợp một số acid amin thơm như phenylalanin, tyrosin,
tryptophan; và một số hợp chất alcaloid. Acid shikimic có thể được phân lập từ
vi khuẩn như E. coli hay từ một số loài thực vật.
Trong những năm gần đây, acid shikimic còn được biết đến với vai trò
quan trọng mới, nó là nguyên liệu dùng để tổng hợp Oseltamivir – hoạt chất
chính của Tamiflu, thuốc có tác dụng điều trị bệnh cúm gia cầm H5N1. Hiện nay,
acid shikimic dùng để tổng hợp Tamiflu được chiết xuất chủ yếu từ quả của cây
Hồi - đây là nguồn cung cấp nguyên liệu chủ yếu cho sản xuất thuốc phòng
chống cúm gia cầm.
Có một số nhà khoa học đã thực hiện nghiên cứu định lượng acid shikimic
trong các loài thực vật chính là cây Hồi bằng phương pháp khác nhau .
Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng
acid Shikimic trong Đại Hồi bằng sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang
(TLC-Scanning )” nhằm đánh giá chất lượng của phương pháp định lượng
acid shikimic trong các dược liệu có chứa acid shikimic.
Đề tài của chúng tôi bao gồm các nội dung sau:
1. Khảo sát và xây dựng được phương pháp định lượng acid shikimic
trong Đại Hồi bằng sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLCScanning).
2. Thẩm định phương pháp định lượng acid shikimic bằng sắc ký lớp
mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC-Scanning).

2

CHƯƠNG 1

: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây hồi
Vị trí phân loại và phân bố
Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan, cây hồi (Illicium verum
Hook. f.) có vị trí phân loại khoa học được thể hiện trong bảng dưới đây [3].
Bảng 1.1: Vị trí phân loại của cây hồi (Illicium verum Hook. f.)
Chi Hồi (Illicium) có khoảng trên 40 loài, phân bố chủ yếu ở Đông Nam
Á, Đông Á và Bắc Mỹ.
Giới

Thực vật - Plantae

Không phân hạng

Nhóm thực vật có hoa - Angiospermae

Bộ

Mộc lan dây - Austrobaileyales

Họ

Hồi - Illiciaceae

Chi

Hồi - Illicium

Loài

I. verum

Ở Việt Nam chi Hồi có 16 loài [9]. Cây hồi (Illicium verum Hook. f.) là
một loại cây xanh quanh năm, phần lớn ở Trung Quốc và Đông Bắc Việt Nam.
Nó còn có tên gọi khác là cây đại hồi, bát giác hồi hương, hồi hương, hồi sao,
mác chác, mác hồi (Tày), pít cóc (Dao),….[4].
Đặc điểm thực vật
Cây gỗ nhỏ, cao 6 - 8m, có thể đến 10m hay hơn. Cành thẳng, nhẵn, lúc
non màu lục nhạt, sau chuyển sang màu nâu xám. Lá mọc so le, nhưng thường
tụ tập ở những mấu trông như mọc vòng, hình mác hoặc hình trứng thuôn, dài
8-12cm, rộng 3-4cm, đầu nhọn, mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới rất nhạt, gân
mờ, cuống lá ngắn [3], [4], [5].


3

Hoa mọc riêng lẻ hoặc 2-3 cái ở kẽ lá; đài 5 răng, dễ rụng, mép viền hồng,
cánh hoa 5-6, đều nhau, màu hồng sẫm dần về phía giữa; nhị thụt, nhẵn, chỉ nhị
rộng, mập, trung đới dày [3], [4].
Quả thường cấu tạo bởi 8 đại đều và rời nhau, có khi 9-12 đại (nhưng
hiếm), các đại hình thoi xếp tỏa tròn thành hình sao hay hình nan hoa, khi non
màu lục sau chuyển sang màu nâu sẫm, phần đính vào cuống rộng bản và dẹt,
đầu có mũi nhọn, ngắn, thẳng, khi chín nứt ở mặt trên; hạt hình trứng nhẵn
bóng, màu nâu. Toàn cây, nhất là quả có mùi thơm [3], [4].

Bộ phận dùng, thu hái và chế biến


Bộ phận dùng
Đại hồi (quả) – Fructus Illicium veri là quả chín đã phơi khô của cây hồi

- Illicium verum Hook. f. (họ Hồi – Illiciaceae).


Thu hái và chế biến
Hàng năm cây ra hoa kết quả theo 2 vụ, vụ chính thu hoạch vào tháng 8-

10 (vụ mùa), vụ muộn thu hoạch vào tháng 2-4 năm sau (vụ tứ quý). Vụ muộn
cho năng suất thấp hơn. Cây trồng sau 5-6 năm bắt đầu cho thu hoạch. Sau 15
năm mỗi cây có thể cho 10-20kg quả tươi/năm, sau 20 năm, năng suất tương
đối ổn định ở mức 20-30kg/năm [4].
Thành phần hóa học và công dụng


Thành phần
- Tinh dầu: hàm lượng 3-3,5 % trong quả tươi, 9-10 % trong quả khô.

Chứa 80-90 % trans-anethol, ngoài ra còn có linalol, estragol, terpineol,
anysaldehyd… [9], [13].
- Acid hữu cơ: acid shikimic, protocatechic, anisatinic, isoanisatinic.
Trong đó quan trọng nhất là acid shikimic [4], [9].
- Ngoài ra còn 1 số chất thuộc nhóm flavonoid, tannin, sesquiterpen,
sesquiterpen lacton, sesquilignan, sesqui-neoliganan; dầu béo chủ yếu chứa
trong hạt [9], [6].

4



Công dụng
Đại hồi (quả) có vị cay, tính ôn, quy kinh can, thận, tỳ, vị. Nó có công

dụng giúp tiêu hóa, lợi sữa, giảm đau, giảm co bóp nhu động ruột, dùng chữa
ỉa chảy, ăn không tiêu, bụng đầy. Khi dùng ngoài, đại hồi có tác dụng chữa đau
nhức, thấp khớp, bong gân [6], [7]. Dạng dùng của loại dược liệu này là bột,
rượu thuốc. Ngày dùng 3-6 g.
1.2 Tổng quan về acid shikimic
Công thức hóa học và tính chất
Acid shikimic có công thức hoá học và các tính chất cụ thể như sau [25],
[32]:
Công thức cấu tạo:

1
6
2
5
3

4

Hình 1.1 : Công thức hóa học của Acid shikimic
Tên khoa học: acid (3R,4S,5R) – 3,4,5 – trihydroxy -1-cyclohexen -1carboxylic.
Công thức phân tử: C7H10O5
Trọng lượng phân tử: 174,15.

Tính chất: Acid shikimic là một chất kết tinh màu trắng, rất dễ tan trong nước
(18%), tan trong ethanol tuyệt đối (2,25%), trong methanol, không tan trong
các dung môi ít phân cực ethyl acetat, aceton, cloroform, benzen, ether dầu hỏa.


5

Nhiệt độ nóng chảy: 183,0 - 184,5 oC.
Năng suất quay cực: []18= -183,8 (c = 4,03% trong nước).
Cực đại hấp thụ: Dung dịch acid shikimic trong ethanol có cực đại hấp thụ ở
213 nm.
Nguồn gốc acid shikimic
Acid shikimic được Eykman F. và cộng sự phân lập lần đầu tiên vào năm
1885 từ một loài hồi Nhật Bản (Illicium anisatum). Đến 50 năm sau cấu trúc
hóa học của acid shikimic mới được xác định [30]. Acid shikimic có trong nhiều
loài thực vật như đại hồi (Illicium verum), bạch quả (Gingko biloba), quyển bá
trường sinh (Selaginella tamariscina, Hoselaginellaceae), kha tử (Terminalia
chebula), chuối tiêu (Musa sapientum), hướng dương (Heliantus annus), tiểu
hồi (Foeniculum vulgare)… [33]. Nhưng hiện nay đại hồi vẫn là nguyên liệu
quan trọng để chiết xuất, bởi hàm lượng acid shikimic trong quả hồi tương đối
cao (5%-10%) [9].
Acid shikimic còn có nguồn gốc từ tổng hợp hoặc bán tổng hợp. Raphael
(1960) và Smissman (1959) đã tổng hợp acid shikimic từ 1,3-butadien-1,4-diyl
diacetate qua phản ứng Diels Alder. Grewe (1964) và cộng sự tổng hợp acid
shikimic từ 1,3-butadien. Ngoài ra, acid shikimic có thể được tổng hợp từ
benzen, bán tổng hợp từ acid quinic và D-manose [19].
Vai trò acid shikimic
 Trong sinh học nói chung, acid shikimic đóng vai trò quan trọng trong quá
trình sinh tổng hợp các acid amin thơm như phenylalanin, tryptophan, tyrosin;
các alcaloid, hợp chất phenolic, các phenyl propanoid [34]. Nó là chất trung

gian hóa học quan trọng của các quá trình chuyển hóa trong thực vật và vi sinh
vật (con đường shikimat) [27], [28].
 Về tác dụng dược lý, acid shikimic có tác dụng chống viêm, giảm đau, có
khả năng ức chế ngưng tập tiểu cầu và bệnh tắc nghẽn động mạch do tác động


6

của acid arachidonic [30]. Các nhà khoa học đã chứng minh acid shikimic có
tác dụng giảm đau, chống viêm, chống co giật, chống oxy hóa, kìm hãm phát
triển tế bào ung thư [4].
 Trong lĩnh vực tổng hợp hóa dược, acid shikimic được biết đến là nguyên
liệu tổng hợp (-)zeylenon, hoạt chất có hoạt tính kháng sinh, có tác dụng chống
virus, chống ung thư và được sử dụng cho bệnh nhân ung thư trước khi tiến hàn
[18].
Kỹ thuật phân tích acid shikimic
D.V. Bochkov et al (2012) đã trình bày các kỹ thuật phân tích acid
shikimic trong bài tổng quan về hợp chất này [23]. Các kỹ thuật được nêu ra
gồm có:
 Sắc ký giấy: Đây là kỹ thuật đơn giản được sử dụng để nghiên cứu acid
shikimic và các dẫn xuất. Với kỹ thuật này, Perkins và Aronoff xác định và
tinh chế acid shikimic tinh khiết từ các tạp chất trong dịch chiết. Pha tĩnh
được các tác giả đã sử dụng là giấy Whatman 3MM.
 Phản ứng màu: Acid shikimic không có màu dưới ánh sáng nhìn thấy và
không phát sáng dưới ánh sáng tử ngoại. Một số thuốc thử thường dùng để
tạo màu acid shikimic được liệt kê trong Bảng 1-2.
Bảng 1.2 : Một số thuốc thử hiện màu acid shikimic
Thuốc thử
Màu
Kali periodat + natri borat/tinh bột

Vết trắng trên nền xanh

Xanh bromocresol

Màu vàng với các acid

Natri metaperiodat + natri
nitroprussid và piperazin

Màu vàng xanh

Bạc nitrat/kiềm

Màu đen

Acid iodic trong aceton

Màu hồng

Kali permanganat trong aceton

Màu vàng nhạt


7

Sắt amoni sulfat

Máu xanh vàng

 Kỹ thuật phân tích định lượng: Một số kỹ thuật phân tích định lượng acid
shikimic đã được nghiên cứu, đa số nhờ phản ứng oxy hóa bởi acid iodic ở
bước đầu, sản phẩm phân hủy glycol sau đó được xử lý với thuốc thử
chromogenic, và nồng độ acid shikimic được định lượng bằng cách phân
tích so màu.
Kỹ thuật đầu tiên là của Yoshida và Hasegawa (1957 ): Mẫu được oxy hóa
trong đệm acetat (pH 4,7), các sản phẩm oxy hóa được xử lý với anilin tạo sản
phẩm chất màu polymethin. Độ hấp thụ được đo tại bước sóng 510 nm, khoảng
nồng độ tuyến tính được xác định là 40-200 mg/ml Acid shikimic.
Gaitonde and Gordon (1958) nhận thấy khi thêm natri hydroxyd hay bari
hydroxyd vào hỗn hợp phản ứng của acid shikimic và acid iodic làm tăng màu
vàng của sản phẩm. Tuy nhiên, màu vàng này có thể được ổn định khi thêm
glycin. Mật độ quang được đo tại bước sóng 380 nm trong 10 phút sau khi
thêm glycin. Sau thời gian đó, giá trị mật độ quang giảm. Giới hạn phát hiện
của kỹ thuật này ở nồng độ acid shikimic khoảng 0,3 μg/ml.
Có một số kỹ thuận phân tích định lượng khác như :
- Phương pháp HPLC với detector UV: Phương pháp này được áp dụng
dựa vào việc xác định đường chuẩn của acid shikimic chuẩn, phát hiện acid
shikimic ở bước sóng 210nm.
- Phương pháp sắc ký khí lỏng (GLC): Phương pháp này được tiến hành
bằng cách tạo dẫn xuất trimethylsilyl. Sử dụng cafein làm chất chuẩn nội, cột
IO và 200 mesh gas – chrom Q với detector FID, nhiệt độ buồng tiêm mẫu và
buồng cột lần lượt là 210 và 1850C.
- Phương pháp chuẩn độ: Acid shikimic sau khi được tách cột Dowex-1x 8
column, chuẩn độ bằng NaOH loãng.


8

 Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Acid shikimic dễ dàng xác định bằng
máy quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) sử dụng dung môi như D2O,
deuterium methanol tetra, và acetone-d6.
 Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo: Acid hữu cơ được xác định theo điều
kiện của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC). Trình
tự tách rửa của acid hữu cơ trong điều kiện RP-HPLC như sau: acid tartaric
 Phương pháp sắc ký lớp mỏng : Được sử dụng để định tính acid shikimic
từ những năm 1960. Sử dụng hệ dung môi thích hợp để chấm sắc ký so sánh
chất thử với acid shikimic chuẩn. Một mẫu có acid shikimic dương tính nếu
có vết cùng Rf và cùng màu sau khi phun thuốc thử với acid shikimic chuẩn.
 Phương pháp HPLC: Gần đây HPLC là phương pháp phổ biến để định
lượng các chất trong đó có acid shikimic.
 Một số kỹ thuật phân tích khác: Sắc ký khí (GC) và sắc ký khí khối phổ
(GC-MS). GC-MS với giám sát ion chọn lọc (SIM) đã trở thành một trong
những phương pháp hiệu quả nhất cho việc phân tích định lượng của tác
phẩm thực vật.
Một số nghiên cứu định lượng acid shikimic bằng TLC-scanning


Saraswathy Ariamuthu, Vidhya Balakrisnan và Amala Kesavan (2012)

đã nghiên cứu đánh giá acid shikimic từ quả cảu Illicium griffithii Hook.f. &
Thoms và Illicium verum Hook.f. [31]. Đưa ra giấy nghiên cứu liên quan đến
phương pháp ước tính định lượng acid shikimic từ quả cây của Illicium griffithii
Hook.f. & Thoms và Illicium verum Hook.f. qua phương pháp sắc ký lớp mỏng
hiệu năng cao ( HPTLC). Bản sắc ký (E. Merck) đã quét với silica gel 60 F254
được dùng làm pha tĩnh và hỗn hợp pha động là: Chloroform: MEthanol : acid

9

formic (7:3:0.5, v/v). Bản mỏng sắc ký TLC đã được phun với thuốc thử acid
vanillin sulphuric và đun nóng ở nhiệt độ 105 ºC trên một bếp điện cho đến khi
xuất hiện màu của các vết và quét ở bước sóng λ=210 nm sử dụng đèn
deuterium. Đường chuẩn đã được xây dựng có độ tuyến tính giữa 3mg và 18mg.
Phương pháp này có thể sử dụng cho việc kiểm tra nhanh các hoạt chất của
thuốc. Dấu vân tay có thể hữu ích trong nhân biệt và thẩm định của cả hai loài
Illicium. Hàm lượng acid shikimic có trong Illicium griffithi và Illicium verum
lần lượt là 1,66 %và 5,48%.
1.3 Tổng quan về sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC
Scanning)
Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng đã được xây dựng, phát triển và ứng dụng
từ lâu. Tuy nhiên hiện nay sắc ký giấy ít được sử dụng. Phổ biến nhất hiện nay
là sắc ký lớp mỏng. Ở nước ta phương pháp sắc ký lớp mỏng đã được sử dụng
rộng rãi, đã có nhiều tài liệu, chuyên gia có kinh nghiệm về phương pháp này.
Trong sắc ký mặt phẳng, quá trình sắc ký được tiến hành trên một tờ giấy
hay một lớp bột rải đều và được giữ trên mặt một tấm kính, chất dẻo hay kim
loại, ví dụ nhôm. Bản thân lớp mỏng có thể là pha tĩnh hoặc chỉ là chất mang
để giữ pha tĩnh trên đó. Pha động là chất lỏng sẽ thấm và chạy trên lớp mỏng
do tác dụng của lực mao dẫn và đôi khi cả trọng lực và điện thể [1], [21].


Nguyên tắc của sắc ký lớp mỏng
Cùng như tất cả các phương pháp sắc ký khác, quá trình tách hỗn hợp các

chất bằng SKLM xảy ra khi cho pha động chuyển động qua pha tĩnh. Trong
SKLM, pha tĩnh được rãi thành một lớp mỏng trên một giá đỡ phẳng. Dưới tác

dụng của lực mao quản, pha động thấm theo lớp mỏng đi qua điểm xuất phát nơi hỗn hợp chất cần phân tích đã được đưa lên bản mỏng. Trong quá trình di
chuyển của pha động qua lớp mỏng chất hấp phụ (pha tĩnh), nhờ các quá trình


10

hấp phụ và giải hấp phụ được lặp lại và do hệ số phân bố khác nhau mà những
chất khác nhau di chuyển theo hướng chuyển động của pha động với các tốc độ
khác nhau. Kết quả là mỗi chất trong hỗn hợp phân tích có thể sẽ được tách
riêng ra ở các vị trí khác nhau trên bản mỏng [20]. Pha động bao gồm dung
dịch cần phân tích được hào tan trong một dung môi thích hợp và được hút lên
bản sắc ký nhờ lực mao dẫn tách dung dịch thí nghiệm dựa trên độ phân cực
của các thành phần trong dung dịch [20], [21].
Đại lượng đặc trưng cho mức di chuyển của các chất phân tích là hệ số
lưu giữ Rf. Trị số của nó được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của
chất phân tích và khoảng cách di chuyển của pha động:
𝑑𝑅
𝑑𝑀
dR: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tấm vết phân tích.
𝑅𝑓 =

dM: khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động( đo trên
cùng đường đi của vết, tính bằng cm).
Rf : có giá trị dao động từ 0-1 [1].
Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thước 10-30µm được rải đều và kết dính
thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250µm trên giá đỡ hình vuông. Bản
mỏng có sẵn trên thị trường có kích thước khác nhau thường 5÷20cm, nhiều
khi có đưa thêm chất huỳnh quang không tan vào pha tĩnh để dễ phát hiện chất
phân tích. Chất hấp phụ thường dùng nhất là silicagel [17], [29].
Pha động dùng cho TLC rất thay đổi, tùy thuộc vào cơ chế sắc ký. Để

tang cường rửa giải thường dung 2 dung môi. Nguyên lý chia tách dựa vào hệ
số phân bố giữa 2 pha. Tuy nhiên, lựa chọn tối ưu hóa sắc ký chủ yếu dựa vào
kinh nghiêm [1].


11




Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng
Đưa chất phân tích lên bản mỏng
Lượng hỗn hợp các chất được đưa lên bản mỏng có ý nghĩa rất quan trọng

đối với hiệu quả tách sắc ký, ảnh hưởng đến giá trị Rf, lượng mẫu đưa lên bản
mỏng khoảng 0.1-50 µg được pha trong dung môi thích hợp. Thể tích dung dịch
chấm 1-5 µL đối với sắc ký phân tích và 0,1-0,2 µL đối với sắc ký điều chế.
Đường xuất phát cách mép bản mỏng khoảng 1,5-2,0 cm và cách bề mặt
dao động 0,8-1,0 cm.
 Khai triển sắc ký
Sau khi chấm sắc ký, bản đã được sấy khô được cho vào bình sắc ký đã bão
hòa pha động. Mép dưới bản mỏng được nhúng vào pha động nhưng vết chấm
còn cách bề mặt pha động khoảng 1 cm.
 Phát hiện vết sắc ký đồ
Dưa trên các tính chất lý hóa khác nhau của chất phân tích để lựa chọn cách
phát hiện thích hợp các vết sắc ký.


Phun thuốc thử hiện màu



Soi dưới đèn UV



Dùng densitometer: thiết bị này cường độ tia phản xạ từ bề mặt bản mỏng

khi soi dưới đèn UV-VIS. Chất phân tích hấp phụ bức xạ được ghi lại thành pic
sắc ký [20], [21], [29].


Ứng dụng của sắc ký lớp mỏng trong phân tích kiểm nghiệm

- Phân tích định tính .
- Thử tính khiết.
- Bán định lượng.
- Định lượng [2], [24].


12

Sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC Scanning)
Sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC-Scanning) là một hình
thức tân tiến nhất của công cụ TLC. TLC-Scanning với dụng cụ tinh vi được
điều khiển bơi một phần mềm thích hợp đảm bảo tính ứng dụng, độ tin cậy, độ
lặp lại cao nhất của các số liệu đưa ra. Trong phân tich TLC-Scanning, các
thông số của quá trình phân tích được ghi lại và kiểm soát chặt chẽ, do đó lặp
lại được độ lặp lại cao. Các bước của quá trình phân tích bào gồm phun mẫu,
khai triển mẫu, nhận diện vết được tiến hành bán tự động, giảm thiểu tối đa các

sai số có thể gặp phải. Quá trình phun mẫu được tiến hành bán tự động, đảm
bảo chính xác thể tích mẫu phun, tốc độ phun và không có nguy cơ hỏng cơ
học bản mỏng. Trong quá trình khai triển, điều kiện khai triển về nhiệt độ và
độ ẩm được kiểm soát chặt chẽ và ghi lại đầy đủ, đảm bảo độ lặp lại của kết
quả khi tiến hành tại các phòng thí nghiệm khác nhau. Hệ thống đèn UV tích
hợp máy ảnh và hệ thống phần mềm giúp phân tích số liệu ứng dụng trong định
tính và định lượng.


Thiết bị của TLC-Scanning
 Thiết bị chấm mẫu bản tự động.
 Thiết bị phát triển tự động.
 Buồng chụp ảnh TLC được điều khiển thông qua phân mềm winCAT và
phần mềm Video Scan trên máy tính : quét bản mỏng với hệ thống phân
tích hình ảnh, nhất là camera kỹ thuật số có độ phân giải cao để thu nhận
hình ảnh của vét sắc ký. Xử lý dữ liệu ảnh bằng máy tính [2], [28].
Hiện nay để tăng cường độ tin cậy của kết quả phân tích, người ta đưa

vào thị trường bản mỏng hiệu năng cao (high-performance plates). Bản này
được tráng lớp pha tĩnh mỏng hơn (dày khoảng 100 µm) với bột mịn có kích
thước hạt 5 µm độ đồng đều cao hơn. Khi dùng bản mỏng này, độ nhạy và độ
phân tích được tăng lên bởi vì:


13

- Vết sắc ký nhỏ hơn .
- Thời gian sắc ký ngắn hơn.
- Lượng dung môi ít hơn .
Pha tĩnh dùng silica và pha liên kết siloxan cho sắc ký lớp mỏng hiệu

năng cao (HPTLC) có sẵn trên thị trường. Tuy vậy trong kỹ thuật này kể cả
HPTLC sai số của phương pháp dao động trong khoảng 5-10 % [22], [23], [31].


Ưu điểm của TLC-Scanning
 Phù hợp với cả phân tích định tính và định lượng.
 Trong một lần triển khai sắc ký có thể phân tích đồng thời rất nhiều mẫu
một lúc, tiết kiệm thời gian và chi phí cho hóa chất, vật tư tiêu hao.
 Các mẫu phân tích và các dung dịch chuẩn được chấm trên cùng 1 bản
mỏng sắc ký, khai triển cùng một điều kiện dung môi, nhiệt độ, độ ẩm
nên cho độ lặp lại cao, hạn chế sử tác động của môi trường giữa các lẫn
phân tích [26].


14

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu
2.1.1. Nguyên liệu
Đại hồi thu mua từ tỉnh Lạng Sơn.

Hình 2.1. Nguyên liệu Đại hồi
2.1.2. Hóa chất, thiết bị, dụng cụ
 Hóa chất
Bảng 2.1: Hóa chất
STT

TÊN HÓA CHẤT

TIÊU CHUẨN, XUẤT XỨ

1

Acid shikimic chuẩn

99,8%, Merck

2

Acid acetic băng

Trung Quốc

3

n-Butanol

Trung Quốc

4

Nước cất

Việt Nam

5

Ethanol 96°

Việt Nam

6

KMnO4

Việt Nam


15

 Thiết bị, dụng cụ
 Máy móc
Hệ thống sắc ký lớp mỏng Camag Reprostar 3, camera Hitachi HV-C20
3CCD. Phần mềm quét VideoStore 2 Manual và xử lý hình ảnh VideoScan
1.01 Manual (Camag).
 Bản mỏng silicagel 60 F254 Merk, kích thước 20x20 cm.
 Thiết bị chiết Soxhlet
 Máy cất quay chân không Buchi B-490 và R-220(Thụy sỹ)
 Máy siêu âm Ultrasonic LC60H(Đức): Công suất P=400 w, Tần số f=35
kHz
 Cân kỹ thuật Sartorius BP 2001S, độ nhạy 10-2 g (Đức)
 Dụng cụ
 Bình cầu 100ml
 Cốc thủy tĩnh loại 100 ml, 250 ml, 500 ml..
 Bình định mức 5 ml,10 ml, 25 ml,50 ml..
 Pipet chính xác 1 ml, 2 ml,5 ml,10 ml.
 Ống nghiệm thủy tinh 10 ml.
 Phễu lọc, giấy lọc và màng lọc mẫu cellulose acetat 0,45 µm (Satorius).
 Mao quản Camag để chấm sắc ký thể tích 1 µl.

 Bình chạy sắc ký.


16

2.2.

Nội dung nghiên cứu



Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid shikimic trong quả

Đại hồi bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLCScanning).
-

Khảo sát một số điều kiện triển khai TLC-Scanning: Phương pháp hiện

màu bản mỏng, nồng độ thuốc thử hiện màu và giới hạn thời gian phân tích
thích hợp cho phương pháp định lượng.
-

Đánh giá độ đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, độ tuyến tính, độ lặp lại, độ

đúng, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp.

Ứng dụng phương pháp đã xây dựng đánh giá hàm lượng acid shikimic
trong mẫu nguyên liệu quả Đại hồi thu mua được.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Xây dựng phương pháp định lượng

- Xử lý mẫu thử:
Cân chính xác khoảng 5,0 g bột quả Đại hồi, gói trong giấy lọc, cho vào
bình chiết Soxhlet, thêm 100 ml EtOH 96º, ngâm qua đêm cho trương nở hoàn
toàn. Chiết Soxhlet trong thời gian 8 tiếng. Lọc dịch chiết qua giấy lọc, cô dịch
lọc thu hồi dung môi đến cắn, hòa tan cắn vào khoảng 20 ml EtOH 96o, sau đó
chuyển vào bình định mức 25 ml, siêu âm 15 phút, bổ sung EtOH 96º đến vạch,
lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm được dung dịch thử chấm sắc ký [14].
- Xử lý mẫu chuẩn:
Cân chính xác khoảng 250 mg acid shikimic chuẩn 99,8% vào bình định
mức 10 ml, thêm 9 ml EtOH 96º, siêu âm đến khi tan hoàn toàn, bổ sung EtOH
96º đến vạch. Thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ khoảng 25 mg/ml. Từ
dung dịch chuẩn gốc pha loãng với EtOH 96o thành các dung dịch chuẩn acid
shikimic có nồng độ lần lượt khoảng 20, 15, 10, 5 mg/ml.
- Lựa chọn các điều kiện triển khai TLC-Scanning:


17

+ Bản mỏng: bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck), hoạt hóa ở 110 oC trong
30 phút. Kích thước bản mỏng tùy theo thí nghiệm cụ thể.
+ Đưa mẫu lên bản mỏng: Chấm thủ công bằng tay, phương chấm vuông
góc với bản mỏng, thể tích chấm 1 µl. Vị trí chấm cách mép dưới bản mỏng 1,5
cm, cách mép dung môi từ 0,8 – 1 cm. Khoảng cách giữa vết ngoài cùng và
mép ngoài cùng bản mỏng là 1,5 cm. Khoảng cách giữa 2 vết kề nhau là 1 cm.
+ Hệ dung môi khai triển: Tham khảo tài liệu [11], lựa chọn hệ dung môi
khai triển n-BuOH : acid acetic : nước ( 6:1:2). Bản mỏng được triển khai trong
bình thủy tinh 2 ngăn, kích thước 8x12x14 cm. Thời gian bão hòa pha động: 15
phút.
+ Hiện màu: Sau khi triển khai sắc ký, bản mỏng được để khô tự nhiên ở
nhiệt độ phòng. Sau đó được hiện màu bằng dung dịch KMnO4 trong nước

(nồng độ theo khảo sát).
+ Phát hiện vết: Đo TLC Scanning ở điều kiện khả kiến (ánh sáng thường).
- Tính toán kết quả:
Xây dựng đường chuẩn định lượng dựa trên diện tích pic và nồng độ acid
shikimic của các mẫu chuẩn. Xác định nồng độ acid shikimic trong mẫu thử
tính theo phương trình hồi quy. Từ đó tính hàm lượng acid shikimic trong dược
liệu theo công thức sau:
A (%) =

𝑪×𝟐𝟓×𝑽×𝟏𝟎𝟎
𝒎×𝟏𝟎𝟎𝟎

Trong đó:
A: hàm lượng acid shikimic trong đại hồi (%)
C: Nồng độ acid shikimic trong dung dịch thử tính theo phương
trình hồi quy (mg/ml)
V: Hệ số pha loãng của dung dịch thử
m: khối lượng Đại hồi đem chiết (g)