Bước đầu nghiên cứu ứng dụng nhựa macroporous d101 trong phân lập isoflavonoid từ sắn dây

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THẾ VŨ
MÃ SINH VIÊN: 1101608

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG
NHỰA MACROPOROUS D101
TRONG PHÂN LẬP ISOFLAVONOID
TỪ SẮN DÂY
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ

HÀ NỘI - 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THẾ VŨ
MÃ SINH VIÊN: 1101608

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG
NHỰA MACROPOROUS D101
TRONG PHÂN LẬP ISOFLAVONOID
TỪ SẮN DÂY
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ

Người hướng dẫn:

1. Ds. Vũ Văn Tuấn
2. Ds. Trần Trọng Biên

Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp dược

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN!
Lời đầu tiên tôi xin tỏ lòng biết ơn chân thành đối với:
TS. Nguyễn Văn Hân
Người thầy giàu kinh nghiệm và đầy nhiệt huyết đã định hướng, giúp đỡ
tôi thực hiện khóa luận này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Ds. Vũ Văn Tuấn, Ds. Trần Trọng
Biên, người thầy, người anh đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và giúp đỡ
tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Đình Luyện
và toàn thể các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Công nghiệp
Dược đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận.
Tôi xin phép cảm ơn Ban giám Hiệu nhà trường, phòng Đào tạo và các
phòng ban khác, các thầy cô và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà
Nội đã dạy dỗ, chỉ bảo tôi tận tình trong suốt những tháng năm học tập tại
trường.
Cuối cùng tôi xin được cám ơn gia đình, bạn bè đã luôn động viên, giúp
đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Hà Nội, ngày 13 tháng 04 năm 2016
Sinh viên

Nguyễn Thế Vũ


MỤC LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .................................................................
DANH MỤC BẢNG .........................................................................................................
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ .....................................................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ........................................................................................... 2
1.1. Vài nét về Sắn dây ..................................................................................................2
1.1.1. Tên gọi .......................................................................................................... 2
1.1.2. Đặc điểm thực vật ......................................................................................... 2
1.1.3. Bộ phận dùng ................................................................................................ 2
1.1.4. Thành phần hóa học ..................................................................................... 3
1.1.5. Tác dụng dược lý .......................................................................................... 4
1.1.6. Tính vị, công năng ........................................................................................ 6
1.1.7. Công dụng ..................................................................................................... 6
1.1.8. Một số nghiên cứu phân lập isoflavonoid từ Sắn dây .................................. 6
1.2. Nhựa Macroporous ...............................................................................................11
1.2.1. Định nghĩa .................................................................................................. 11
1.2.2. Phân loại ..................................................................................................... 11
1.2.3. Đặc tính....................................................................................................... 12
1.2.4. Sản xuất nhựa Macroporous ...................................................................... 12
1.2.5. Ứng dụng trong phân lập hợp chất thiên nhiên.......................................... 13
CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU .............................................................................................................. 15
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị .......................................................................................15
2.1.1. Nguyên vật liệu ........................................................................................... 15
2.1.2. Hóa chất ...................................................................................................... 15
2.1.3. Dụng cụ ....................................................................................................... 15


2.1.4. Thiết bị ........................................................................................................ 16
2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................16

2.2.1. Nghiên cứu quá trình hấp phụ isoflavonoid từ dịch chiết lên nhựa
Macroporous D101 ............................................................................................... 16
2.2.2. Nghiên cứu quá trình giải hấp phụ isoflavonoid từ nhựa Macroporous
D101………………………………………………………………………………………16
2.2.3. Triển khai chiết xuất và phân lập isoflavonoid từ mẻ 10kg Sắn dây tươi. . 17
2.3. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................17
2.3.1. Phương pháp định lượng isoflavonoid ....................................................... 17
2.3.2. Phương pháp định lượng puerarin ............................................................. 18
2.3.3. Phương pháp chiết xuất isoflavonoid từ rễ củ Sắn dây .............................. 20
2.3.4. Phương pháp xử lý nhựa Macroporous D101 ............................................ 20
2.3.5. Phương pháp xác định dung lượng hấp phụ isoflavonoid của nhựa
Macroporous D101 ............................................................................................... 20
2.3.6. Phương pháp khảo sát điều kiện giải hấp phụ isoflavonoid từ nhựa
Macroporous D101 ............................................................................................... 21
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................................... 23
3.1. Khảo sát quá trình hấp phụ isoflavonoid từ dịch chiết lên nhựa Macroporous
D101 ............................................................................................................................23
3.2. Khảo sát quá trình giải hấp phụ isoflavonoid từ nhựa Macroporous D101 .........26
3.2.1 Lựa chọn dung môi giải hấp phụ isoflavonoid ............................................ 26
3.2.2 Khảo sát quá trình giải hấp phụ isoflavonoid........................................... 27
3.3. Triển khai chiết xuất và phân lập isoflavonoid mẻ 10kg Sắn dây tươi ................30
BÀN LUẬN ................................................................................................................... 35
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .......................................................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 41

PHỤ LỤC ……………………………………………………………………...46


DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

HSCCC : High Speed Counter Current Chromatography
(Sắc ký ngược dòng tốc độ cao)
HPLC : High Performance Liquid Chromatography
(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)
BV
: Bed volume
( Thể tích cột nhựa)
GOT
: Glutamic oxaloacetic transaminase
UV

: Ultraviolet
(Tử ngoại)

tt/tt

: Thể tích/thể tích

tt/kl

: Thể tích/khối lượng

kl/kl

: Khối lượng/khối lượng


DANH MỤC BẢNG
Tên bảng

Trang

Bảng 1.1

Một số isoflavonoid trong Sắn dây

3

Bảng1.2

Đặc tính nhựa Macroporous D101

12

Bảng 3.1

Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch nạp cột đến dung lượng

24

hấp phụ
Bảng 3.2

Quá trình rửa tạp chất bằng nước

28

Bảng 3.3

Kết quả chiết xuất và phân lập isoflavonoid từ mẻ

32

10kg Sắn dây tươi
Bảng 3.4

Hàm lượng isoflavonoid sau các giai đoạn

32


DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Tên hình

Trang

Hình 1.1

Sắn dây

2

Hình 1.2

Nhựa Macroporous D101

11

Hình 1.3

Quy trình sản xuất nhựa Macroporous

13

Hình 3.1

Cột sắc ký

23

Hình 3.2

Quá trình hấp phụ isoflavonoid của nhựa

24

Macroporous D101
Hình 3.3

Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch nạp cột đến dung lượng

25

hấp phụ của nhựa Macroporous D101
Hình 3.4

Khả năng giải hấp phụ của ethanol ở các nồng độ

27

khác nhau
Hình 3.5

Quá trình rửa tạp chất bằng nước

29

Hình 3.6

Đường cong giải hấp phụ bằng ethanol 70%

30

Hình 3.7

Cột sắc ký PVC(9x100cm)

31

Hình 3.8

Sắc ký đồ HPLC của sản phẩm thô (A) và sản
phẩm sau tinh chế (B).

33

Hình 3.9

Sản phẩm isoflavonoid

34

Hình 3.10 Quá trình hấp phụ

36


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Sắn dây là cây trồng phổ biến ở Việt Nam, rễ củ Sắn dây đã được sử
dụng lâu đời trong y học cổ truyền với tên gọi Cát căn. Nhiều nghiên cứu đã
chỉ ra rằng các hoạt chất nhóm isoflavonoid (puerarin, daidzin, daidzein, ...) là
thành phần chính có tác dụng sinh học. Nó có nhiều tác dụng dụng quan trọng
như chống oxy hóa, chống lão hóa, tác dụng chống ung thư, tác dụng trên tim
mạch, tuần hoàn não...[7].
Các phương pháp phân lập isoflavonoid hiện nay được kể đến như sử
dụng sắc ký ngược dòng tốc độ cao (HSCCC), dùng gel agarose, sử dụng hệ
dung môi... Tuy nhiên, các phương pháp trên thu được sản phẩm isoflavonoid
có hàm lượng tương đối thấp và khó thực hiện ở quy mô lớn [5], [9], [17].
Những năm gần đây, nhựa Macroporous được ứng dụng rộng rãi trong
lĩnh vực chiết xuất, phân lập và tinh chế các hoạt chất có nguồn gốc thiên
nhiên. Chúng có nhiều ưu điểm như: có thể làm tăng đáng kể nồng độ của các
thành phần hoạt chất, loại bỏ một lượng lớn các tạp chất, không cần sử dụng
đến các dung môi hữu cơ độc hại, trong khi khả năng lặp lại và ổn định tốt,
chi phí thấp, phù hợp cho sản xuất công nghiệp.
Nhằm xây dựng một phương pháp hiệu quả, kinh tế và dễ ứng dụng vào
sản xuất thực tế để phân lập isoflavonoid từ Sắn dây, đề tài “Bước đầu
nghiên cứu ứng dụng nhựa Macroporous D101 trong phân lập
isoflavonoid từ Sắn dây” được thực hiện với mục tiêu:

1. Xác định được một số điều kiện hấp phụ và giải hấp phụ
isoflavonoid từ dịch chiết Sắn dây trên hạt nhựa Macroporous D101.
2. Triển khai chiết xuất và phân lập isoflavonoid từ Sắn dây tươi mẻ
10kg.


2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Vài nét về Sắn dây
1.1.1. Tên gọi
Tên khoa học: Pueraria thomsonii Benth. Một số tài liệu Trung Quốc
thì ghi loài P. lobata (Will) Ohwi hoặc P. pseudohirsuta Tang et Wang [6].
Tên khác: Bạch cát, Khau cáu (Tày), Bẳn mắm kéo (Thái).
Tên nước ngoài: Kudzu bean, Kudzu vine (Anh), Koudzou (Pháp).
Họ: Đậu (Fabaceae).
1.1.2. Đặc điểm thực vật
Sắn dây là loài dây leo, dài có thể đến 10m, lá
kép gồm 3 lá chét. Cuống lá chét giữa dài, cuống lá
chét 2 bên ngắn. Lá chét có thể phân thành 2-3 thùy.
Về mùa hạ trổ hoa màu xanh tím, mọc thành chùm ở
kẽ lá. Quả loại đậu có nhiều lông. Củ dài to, nặng có
thể tới 20kg, nhiều xơ [7].
Sắn dây phân bố rộng ở Trung Quốc, Ấn

Hình1.1.
1.1Sắn
Sắndây
dây
Hình

Độ, Lào và Việt Nam. Ở Việt Nam, Sắn dây
mọc hoang khắp các miền rừng núi [2], [3] và cũng được trồng từ lâu đời từ
miền núi đến đồng bằng để lấy rễ củ ăn và làm thuốc. Nhiều nơi thường kết
hợp để làm giàn lấy bóng mát, cũng có những vùng chuyên trồng để lấy tinh
bột [6]. Cây ưa sáng, có biên độ sinh thái khá rộng, có thể sinh trưởng và phát
triển tốt trên nhiều loài đất và ở các vùng khí hậu khác nhau [7].
1.1.3. Bộ phận dùng
Rễ củ thu hoạch từ tháng 10 đến tháng 3-4 năm sau.


3

Để chế vị Cát căn thì rửa sạch, bóc bỏ lớp vỏ dày bên ngoài, cắt thành
khúc dài 10-15cm. Nếu củ to thì bổ dọc để có những thanh dày khoảng 1cm,
sau đó xông diêm sinh rồi phơi hoặc sấy khô. Loại trắng ít xơ là loại tốt.
Muốn chế tinh bột Sắn dây thì bóc vỏ, đem giã nhỏ hoặc mài trên tấm sắt
tây có đục thủng lỗ, hoặc xay bằng máy, cho thêm nước rồi nhào lọc qua rây
thưa, loại bã, sau đó lọc lại 1 lần nữa qua rây dày hơn, để lắng gạn lấy tinh bột
rồi đem phơi hoặc sấy khô [4].
1.1.4. Thành phần hóa học
- Tinh bột: Tỷ lệ khoảng 12-15%
- Các

isoflavonoid

chính:

puerarin,

daidzin,

daidzein,

3′-

hydroxypuerarin, 3′-methoxypuerarin, genistin, formononetin-7-glucosid[22].
R3
R2

O
R4
R1

O

R5

Bảng 1.1 Một số isoflavonoid trong Sắn dây
R1

R2

R3

R4

R5

Puerarin

H

OH

-glc

H

OH

Daidzin

H

O-glc

H

H

OH

Daidzein

H

OH

H

H

OH

Genistein

OH

OH

H

H

OH

- Ngoài ra, rễ củ Sắn dây còn chứa các glycosid loại olean triterpen như
kudzusaponin B1, acetyl-kalikasaponin III, acetyl-soyasaponin I, soyasaponin
I, subproside V được phân lập từ P. Thomsonii [7]. Loài P. lobata chứa
kudzusaponin SA1, SA2, SA3, C1 [7].


4

1.1.5. Tác dụng dược lý
 Tác dụng trên tim mạch
Thử nghiệm trên chó, flavon toàn phần của Sắn dây làm tăng lưu lượng
mạch vành và giảm sức kháng mạch vành. Hoạt chất Puerarin với liều
20mg/kg tiêm tĩnh mạch có tác dụng hạn chế nhồi máu cơ tim [7].

 Tác dụng trên huyết áp
Flavon toàn phần của Sắn dây tiêm tĩnh mạch liều 5-30mg/kg gây hạ huyêt
áp trên chó, mèo. Cao Sắn dây liều 750mg/kg tiêm tĩnh mạch đối kháng với
tác dụng kích thích tim của isoprenalin, làm giảm nhịp tim, hạ huyết áp [7].
 Tác dụng chống loạn nhịp tim
So sánh tác dụng chống loạn nhịp tim của puerarin, daidzein và dạng chiết
ethanol từ sắn dây trên chuột cống trắng và chuột nhắt trắng cho thấy tác dụng
của daidzein tương đối mạnh, cho hiệu quả rõ rệt. Dạng chiết ethanol có tác
dụng giống với daidzein; điều này chứng tỏ daidzein là thành phần chủ yếu có
tác dụng chống loạn nhịp tim. Puerarin với liều tương đương có tác dụng
kháng rõ rệt với loạn nhịp tim do aconitin và bari clorid gây nên, giảm nhẹ
mức độ loạn nhịp do thiếu máu cơ tim, tác dụng đối kháng với rung thất
không bằng daidzein [7].
 Tác dụng đối với tuần hoàn não
Thử nghiệm trên chó gây mê, flavon toàn phần của sắn dây bằng đường
tiêm động mạch cảnh với liều 0,1-5,0mg/kg làm lưu lượng máu qua não tăng
87,7-134%, nếu cho thuốc bằng đường tiêm tĩnh mạch flavon toàn phần với
liều 10-30mg/kg chỉ làm lưu lượng máu qua não tăng 20%. Trên bệnh nhân
cao huyết áp, flavon toàn phần tiêm bắp với liều 200mg có 53% bệnh nhân
tuần hoàn não được cải thiện, làm giảm trợ lực mạch máu não [7].


5

 Tác dụng đối với hệ thần kinh
Dịch chiết sắn dây với liều 2g/kg cho thẳng vào dạ dày trên thỏ gây sốt
bằng vaccin thương hàn có tác dụng hạ nhiệt, bột sắn dây có tác dụng tương
tự. Nước sắn dây với liều 6g/kg cho thẳng vào dạ dày trên chuột nhắt trắng,
có tác dụng cải thiện hiện tượng trí nhớ bị tổn thương do scopolamin gây
nên[7].

 Tác dụng đối với cơ trơn
Daidzein có tác dụng giải co thắt đối với ruột non cô lập của chuột [7].
 Tác dung hạ đường huyết và lipid huyết
Nước sắc sắn dây với liều 6-8 g/kg cho thẳng vào dạ dày thỏ bình thường
có tác dụng hạ đường huyết nhưng không thể đối kháng với hiện tượng đường
huyết tăng cao do adrenalin gây nên. Puerain với liều 500mg/kg hoặc dùng
liều thấp phối hợp với aspirin 100mg/kg dùng liên tục trong 9 ngày qua
đường dạ dày, có tác dụng làm giảm cholesterol huyết thanh của chuột nhắt
trắng đã được gây tăng cholesterol bằng alloxan. Aspirin dùng đơn độc không
có tác dụng hạ đường huyết hay lipid huyết [7].
 Tác dụng chống ung thư
Dạng chiết ethanol từ Sắn dây trên động vật thí nghiệm có tác dụng ức
chế nhất định sự phát triển của tế bào sarcom 180, u bụng báng Ehrlich và tế
bào ung thư phổi Lewis. Daidzein có tác dụng ức chế sự tăng trưởng của tế
bào ung thư tủy sống HL60 [7].
 Tác dụng chống oxy hóa
Thí nghiệm trên chuột gây tiểu đường bằng cách tiêm phúc mạc
streptozotocin. Thí nghiệm sử dụng cao sắn dây chứa khoảng 10,42%
puerarin và một vài chất liên quan, với liều 500mg/kg, dùng đường uống
trong 3 tuần, kết quả cho thấy nồng độ malondialdehyd-một sản phẩm oxy


6

hóa của chất béo trong huyết tương, đã giảm xuống mức tương tự như ở chuột
khỏe mạnh, và giống như trong nhóm được điều trị tích cực hàng ngày bằng
tocopherol acetat với liều 50mg/kg [7].
 Các tác dụng khác
Puerarin có tác dụng gây tê cục bộ trên động vật thí nghiệm [7]. Trên
chuột, cao Sắn dây có tác dụng chống nghiện rượu [7], daidzein hạ thấp hàm

lượng rượu trong máu và rút ngắn thời gian ngủ do rượu gây nên [7].
Isoflavon chiết từ Cát căn ức chế 30,7% hoạt độ của men GOT trên chuột gây
nhiễm độc bằng CCl4 [7].
1.1.6. Tính vị, công năng
Rễ Sắn dây có vị ngọt, cay, tính bình, quy vào 2 kinh tỳ và vị, có tác
dụng giải cơ, thoát nhiệt, sinh tân, chỉ khát, thoát chẩn, thăng dương, chỉ tả.
1.1.7. Công dụng
Trong y học cổ truyền, rễ Sắn dây dùng chữa các bệnh cảm sốt phong
nhiệt, cổ gáy cứng đau, sởi mọc không đều, viêm ruột, kiết lị kèm theo sốt,
khát nước. Bột Sắn dây được dùng để pha với nước có đường uống vào mùa
hè, có tác dụng giải nhiệt, làm mát cơ thể. Ngoài ra, bột Sắn dây còn được
dùng làm tá dược dính trong bào chế thuốc [7].
1.1.8. Một số nghiên cứu phân lập isoflavonoid từ Sắn dây
Nhóm phương pháp sử dụng dung môi:
Năm 2007, Hua-Neng Xu và cộng sự đã chiết isoflavonoid từ Sắn dây
với dung môi n-butanol/nước 1:1 (tt/tt) gồm các bước: chiết 100g bột Sắn dây
bằng 1000mL n-butanol với thời gian 60phút ở 25oC, lọc thu lấy dịch lọc,
điều chỉnh pH=4,0 bằng HCl/NaOH. Thêm đồng lượng nước và khuấy trong
60phút, điều chỉnh pH lên 8,0 bằng HCl/NaOH. Trong giai đoạn chiết với nbutanol, isoflavonoid được chọn lọc ra khỏi các tạp chất ưa nước. pH thấp


7

thuận lợi cho việc chiết isoflavonoid sang pha hữu cơ. Isoflavonoid được tiếp
tục tinh chế ở giai đoạn chiết bằng nước. pH cao thuận lợi cho việc chuyển
isoflavonoid sang pha nước [13]. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp
này là sử dụng lượng lớn dung môi hữu cơ, thời gian chiết kéo dài, tính kinh
tế không cao, quy mô chiết mỗi mẻ 100g.
Năm 2009, nghiên cứu chiết puerarin từ rễ củ sắn dây Pueraria lobata,
Lingzhao Wang và cộng sự nhận thấy bốn yếu tố chính ảnh hưởng tới hiệu

suất chiết puerarin từ rễ củ Pueraria lobata là áp suất, nhiệt độ, thời gian chiết
và thể tích đồng dung môi. Ở áp suất 20Mpa hiệu suất chiết đạt được là 5,8 ±
0,3mg/g, áp suất cao hơn và thấp hơn đều làm giảm hiệu suất chiết puerarin.
Tương tự như vậy, chiết ở nhiệt độ 50C sẽ cho hiệu suất chiết cao nhất, nhiệt
độ cao hơn hoặc thấp hơn đều làm giảm hiệu suất. Thời gian chiết càng lớn,
khả năng chiết kiệt puerarin càng cao, đặc biệt là trong khoảng thời gian dưới
100 phút. Hiệu suất chiết puerarin tăng lên không rõ rệt khi kéo dài thời gian
hơn 100 phút. Điều này có thể giải thích do độ tan của puerarin trong dung
môi tới hạn và tốc độ chuyển khối đều là các yếu tố phụ thuộc vào thời gian.
Do vậy, thời gian chiết xuất càng lớn sẽ giúp hòa tan được nhiều dược chất
vào dung môi chiết hơn, và do đó tăng hiệu suất chiết lên. Đồng dung môi
được sử dụng là ethanol tuyệt đối. Người ta thấy rằng hiệu suất chiết puerarin
sẽ đạt giá trị tối đa khi thêm một lượng xác định ethanol (120g). Từ những kết
quả kể trên, các tác giả đã thực hiện tối ưu hóa và tìm được điều kiện chiết
puerarin tối ưu từ rễ củ Pueraria lobata bằng dung môi siêu tới hạn ở
20,04Mpa, 50,24C và thể tích đồng dung môi sử dụng là 181,24mL ethanol
trong tổng khoảng thời gian chiết là 90phút [17]. Phương pháp này có nhược
điểm là điều kiện thí nghiệm phức tạp phải kiểm soát chặt chẽ, thiết bị đắt
tiền,.....


8

Năm 2014, Vũ Văn Tuấn và Phạm Thị Phương Dung đã chiết xuất
isoflavonoid từ Sắn dây bằng ethanol 60%, hiệu suất chiết isoflavonoid đạt
90,61%, tinh chế dịch bằng phương pháp sử dụng nhiệt, hàm lượng
isoflavonoid trong sản phẩm đạt 10,78% [5]. Phương pháp này cho hiệu suất
chiết cao, tuy nhiên hàm lượng isoflavonoid trong sản phẩm còn thấp.
Nhóm phương pháp sắc ký:
Phương pháp sắc ký được sử dụng rất nhiều và đóng vai trò quan trọng

trong nghiên cứu các chất tự nhiên. Các kỹ thuật sắc ký thường dùng là sắc ký
lớp mỏng điều chế, sắc ký lỏng cao áp điều chế, sắc ký cột…
Năm 1999, Xueli Cao và cộng sự sử dụng sắc ký ngược dòng tốc độ
cao (HSCCC) với hệ dung môi ethyl acetat–n-butanol–nước (2:1:3, tt/tt/tt)
phân lập được 6 isoflavonoid chính trong Sắn dây trong lần chạy sắc ký đầu
tiên. Các hợp chất phân lập được gồm: 3’-hydroxyl-puerarin, puerarin, 3’methoxy-puerarin, puerarin-xylosid, puerarin-xylosid, daidzin. Các chất phân
lập được có độ tinh khiết cao trên 90%, đáng kể nhất là puerarin có độ tinh
khiết trên 98%. Tuy nhiên, quy mô mỗi mẻ chỉ là 80mg cắn chiết [9].
Để cải thiện tính chọn lọc của cột chất nền cho puerarin – một
isoflavonoid từ Sắn dây, Tan và cộng sự đã tổng hợp nhiều vật liệu dựa trên
b-cyclodextrin, chẳng hạn như b-cyclodextrin gắn với gel agarose [22], nhựa
gắn oligo-b-cyclodextrin [16], [26]. Mặc dù độ tinh khiết và thu hồi của
puerarin thu được cao nhưng quy mô tiến hành rất nhỏ. Hơn nữa, các vật liệu
được tổng hợp ở quy mô phòng thí nghiệm và không thương mại hóa nên khó
khăn để ứng dụng ở quy mô công nghiệp.
Năm 2004, Xiangling He và cộng sự sử dụng sắc ký hấp phụ trên
epichlorohydrin gắn ligand -cyclodextrin. Pha động là dung dịch acid acetic


9

10%. Dung lượng phân tích khoảng 1,2mg dịch chiết. Puerarin thu được có độ
tinh khiết khoảng 98% [22].
Năm 2010, P.Y. Bi và H.R. Dong đã tiến hành chiết isoflavonoid bằng
2 pha nước/amoni sulfat như sau: 10g Sắn dây tươi được chiết bằng 200mL
nước khử khoáng trong 2 lần, thời gian chiết mỗi lần 2giờ. Dịch chiết được
chuyển vào bình định mức 1000mL và được trộn với amoni sulfat. Sau đó sử
dụng phương pháp phân tách bằng hệ 2 pha PEG600 và amoni sulfat thu được
sản phẩm puerarin tinh khiết tới 87%. Sản phẩm tiếp tục được tinh chế bằng
sắc ký ngược dòng. Độ tinh khiết của sản phẩm puerarin cuối cùng đạt hơn

95% [19]. Phương pháp này cho sản phẩm có hàm lượng puerarin cao. Tuy
nhiên, phương pháp này cần lượng lớn dung môi, quy mô mẻ chiết nhỏ, thiết
bị phức tạp và tính kinh tế chưa cao.
Để khắc phục những khó khăn, hạn chế của các phương pháp trên, một
phương pháp phân lập isoflavonoid Sắn dây sử dụng nhựa macroporous D101
đã được phát triển. Nhựa macroporous – một loại polyme có nhiều lỗ xốp
đường kính trên 50Å là vật liệu mới, được sản xuất và ứng dụng phổ biến
trong phân lập các hoạt chất thiên nhiên như flavonoids, glycosides,
carotenoids...[15] .
Năm 2013, Pengyue Li và cộng sự đã tiến hành chiết xuất và tinh chế
isoflavonoid từ Sắn dây như sau: chiết isoflavonoid từ Sắn dây bằng dung
môi nước với thời gian 1,5giờ, tỷ lệ dung môi : nguyên liệu 12:1, chiết 3 lần.
Dịch chiết có nồng độ isoflavonoid khoảng 1,05 – 1,10g/mL. Thêm ethanol
95% để loại tạp, tỷ lệ ethanol : dịch chiết là 1,5:1 (tt/tt). Nồng độ isoflavonoid
trong dịch sau xử lý 0,25g/mL. Sau đó sử dụng nhựa Macroporous HPD200A
để tinh chế isoflavonoid tiến hành như sau: Dịch sau xử lý được cho chảy qua
cột nhựa. Thể tích dịch cho chảy qua cột nhựa bằng 2 lần thể tích cột nhựa
(BV) , giải hấp phụ với 2BV nước, giải hấp phụ với 4BV ethanol 30%. Sản


10

phẩm thu được có hàm lượng puerarin và isoflavonoid tương ứng là 32% và
75% [20].
Cũng trong năm 2013, CUI Yun-hui và cộng sự đã phân lập
isoflavonoid từ Sắn dây bằng nhựa Macroporous XDA-5 tiến hành như sau:
10g nhựa Macroporous XDA-5 được nạp vào cột kích thước 1cm x 20cm.
2BV dịch chiết có nồng độ 0,8mg/mL được hấp phụ qua cột với tốc độ
2BV/h. Giải hấp phụ bằng 4BV nước với tốc độ 1BV/h. Sau đó giải hấp phụ
lần lượt 4BV các dung dịch: ethanol 50%, ethanol 30% và ethanol 70%. Kết

quả: đã tách các isoflavonoid :3’-hydroxy puerarin hàm lượng 23,39%,
puerarin hàm lượng 52,09%, daidzin hàm lượng 19,21% [10].
Năm 2015 Hai-Dong Guo và cộng sự đã chiết isoflavonoid từ Sắn dây
bằng ethanol 10%, thời gian 30 phút, chiết 2 lần. Sau đó sử dụng nhựa
Macroporous H103 để tinh chế isoflavonoid. Sử dụng 4BV ethanol 75% để
giải hấp phụ cho sản phẩm có hàm lượng puerarin và isoflavonoid là 41,78%
và 69,25% tương ứng tăng 3 lần so với trước khi sử dụng nhựa Macroporous
H103 [12].
Phương pháp phân lập bằng nhựa Macroporous có nhiều ưu điểm như:
làm tăng đáng kể nồng độ của các thành phần hoạt chất, không sử dụng các
dung môi hữu cơ độc hại, khả năng lặp lại và ổn định tốt, chi phí thấp do có
thể tái sử dụng nhiều lần vì vậy phù hợp cho sản xuất công nghiệp [15].


11

1.2. Nhựa Macroporous
1.2.1. Định nghĩa

Hình 1.2 Nhựa Macroporous D101
Nhựa Macroporous hay nhựa hấp phụ Macroporous là hạt polyme hình
cầu, có cấu trúc xốp với các lỗ lớn trên bề mặt, có cấu trúc mạng và diện tích
bề mặt tiếp xúc lớn, được ứng dụng chủ yếu để tách các nhóm chất khác nhau
[24].
1.2.2. Phân loại
Dựa vào tính phân cực, nhựa Macroporous có thể được chia làm 2 loại
chính: không phân cực và phân cực. Theo độ phân cực được chia thành phân
cực yếu, phân cực trung bình và phân cực mạnh. Hiện nay các nhựa
Macroporous thường được sử dụng gồm: D101, H103,... (không phân cực);
AB-8, HPD722,...(phân cực yếu); ADS-17, LSA-10,... (phân cực trung bình);

NKA-9, NKA-2,... (phân cực mạnh) [11].


12

1.2.3. Đặc tính
Các đặc tính quan trọng đặc trưng cho khả năng hấp phụ của nhựa
Macroporous là tổng diện tích bề mặt (bề mặt bên trong và ngoài), đường
kính lỗ xốp và độ phân cực bề mặt. Diện tích bề mặt hạt thường nằm trong
khoảng từ 100 đến 1000m2/g. Đường kính lỗ xốp khoảng từ 100 đến 300 Å
[15], đường kính lỗ xốp gấp khoảng 10-20 lần kích thước phân tử chất tan thì
sự phân tách là tốt nhất [8].
Bảng 1.2 Đặc tính nhựa Macroporous D101(*)
Tiêu chí
Tính phân cực
Kích thước hạt (mm)

Thông số kỹ thuật
Không phân cực
0,3 – 1,25

Độ ẩm (%)

65-75%

Tỷ trọng (g/mL)

1-1,07

Diện tích bề mặt (m2/g)

500-550

Đường kính lỗ xốp trung bình (nm)

9-10

Độ xốp (%)

50-60

Thể tích lỗ xốp (mL/g)

1,18-1,24

*: Số liệu do nhà sản xuất Anhui Sanxing Resin Technology Co.,Ltd cung
cấp.
1.2.4. Sản xuất nhựa Macroporous
Các nhựa Macroporous là sản phẩm của quá trình trùng hợp polyme.
Ngoài các monome (thường sử dụng styren divinylbenzen) để tổng hợp
polyme, còn có chất độn không polyme hóa (porogens) bao gồm các hợp chất
như toluen, n-heptan, iso-octan và isobutanol... Các chất độn có thể trộn lẫn
với hỗn hợp monome, không hoà tan polyme, có khả năng bay hơi ở những


13

điều kiện nhất định sau khi kết thúc quá trình polyme hoá để lại những lỗ
hổng trong cấu trúc polyme [8].

Hình 1.3 Quy trình sản xuất nhựa Macroporous [8].
1.2.5. Ứng dụng trong phân lập hợp chất thiên nhiên
Những năm gần đây, nhựa Macroporous được ứng dụng rộng rãi trong
lĩnh vực chiết xuất, phân lập và tinh chế các hoạt chất có nguồn gốc thiên
nhiên như flavonoid, glycosid, saponin, carotenoid,... [15].
Chúng có nhiều ưu điểm như có thể tăng đáng kể nồng độ của các
thành phần hoạt chất, loại bỏ một lượng lớn các tạp chất, không cần sử dụng
đến các dung môi hữu cơ độc hại; trong khi khả năng lặp lại và ổn định tốt,
chi phí thấp, phù hợp cho sản xuất công nghiệp [15].


14

Nhựa Macroporous D101 đã được Dược Điển Trung Quốc 2010 quy
định sử dụng trong phân lập saponin từ Tam thất và flavonoid từ lá Bạch quả.
Tuy nhiên, khả năng phân lập của nhựa Macroporous phụ thuộc rất
nhiều vào các điều kiện tiến hành, vì vậy, việc nghiên cứu xác định các điều
kiện tối ưu là việc cần thiết.


15

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
Rễ củ sắn dây thu mua tại xã Ninh Hiệp, Gia Lâm, Hà Nội, được thái
thành lát mỏng, sấy khô ở 60oC/6giờ, nghiền nhỏ (qua rây 1mm) và bảo quản
nơi khô ráo.
Nhựa Macroporous D101 (không phân cực, kích thước hạt 0,3-1,25nm,

tỉ trọng ướt 1,00-1,07g/mL, diện tích bề mặt 500-550m2/g, đường kính lỗ xốp
9-10nm, thể tích xốp 1,18-1,24mL/g) (Trung Quốc).
2.1.2. Hóa chất
Chất đối chiếu:

Isoflavonoid Sắn dây 40,23% (Trung Quốc).
Puerarin 82,31% (Trung Quốc).

Dung môi:

Ethanol 96% (Việt Nam).
Nước cất (tự cất).

2.1.3. Dụng cụ
- Cột thủy tinh (đường kính trong 3cm, chiều cao 40cm).
- Cột PVC ( đường kính trong 9cm, chiều cao 1m).
- Bình cầu 100mL, 500mL, 1000mL.
- Cốc thủy tinh loại 100mL, 250mL, 500mL, 1000mL.
- Bình định mức 10mL, 25mL, 50mL, 100mL.
- Pipet định mức 1mL, 2mL, 5mL, 10mL.
- Ống đong 10mL, 300mL, 500mL.
- Màng lọc cellulose acetat 0,45μm (Satorius).
- Bản mỏng silicagen 60F254.
- Bình hút ẩm.


16

2.1.4. Thiết bị
- Máy cất quay Buchi B480 (Thuỵ Sỹ).

- Cân phân tích Mettler Toledo AB204S (Thuỵ Sỹ).
- Cân kỹ thuật Sartorius BP2001S (Đức).
- Máy đo quang HITACHI U-1900.
- Đèn tử ngoại.
- Tủ sấy MEMMERT (Đức).
- Máy xay sinh tố.
- Hệ thống lọc hút Buchner.
- Máy khuấy từ IKA,RH basic KT/C (Đức).
- Máy siêu âm ultrasonic LC60H (Đức).
- Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Shimadzu (Nhật Bản).
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu quá trình hấp phụ isoflavonoid từ dịch chiết lên nhựa
Macroporous D101
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ isoflavonoid trong dịch chiết lên quá
trình hấp phụ isoflavonoid của nhựa Macroporous D101
Xác định dung lượng hấp phụ isoflavonoid của nhựa Macroporous D101.
2.2.2. Nghiên cứu quá trình giải hấp phụ isoflavonoid từ nhựa Macroporous
D101
Đánh giá khả năng giải hấp phụ isoflavonoid từ nhựa Macroporous D101
của các dung môi: nước, ethanol 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 96%.
Xác định thể tích dung môi tối ưu cho quá trình giải hấp phụ.


17

2.2.3. Triển khai chiết xuất và phân lập isoflavonoid từ mẻ 10kg Sắn dây
tươi.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp định lượng isoflavonoid
Xác định hàm lượng isoflavonoid trong nguyên liệu, trong cao chiết và

sản phẩm bằng phương pháp đo quang tại bước sóng 250nm. Tham khảo các
tài liệu [5], [20], [22], [25] và qua thực nghiệm, định lượng isoflavonoid
được tiến hành như sau:.
 Chuẩn bị mẫu thử
Cân chính xác một lượng mẫu cần phân tích chứa khoảng 10mg
isoflavonoid vào bình định mức 50mL, thêm 40mL ethanol 96%, siêu
âm trong 30phút, thêm ethanol 96% đến vạch, lắc đều, lọc, bỏ 10mL
dịch lọc đầu. Hút chính xác 10mL dịch lọc vào bình định mức 50mL,
thêm ethanol 96% đến vạch, lắc đều. Hút chính xác 5mL dung dịch vừa
pha vào bình định mức 50mL, thêm nước cất đến vạch, lắc đều.
 Chuẩn bị mẫu đối chiếu
Cân chính xác khoảng 24,8mg chất đối chiếu isoflavonoid Sắn dây
40,23% (tương đương khoảng 10mg isoflavonoid) vào bình định mức
50mL, thêm 40mL ethanol 96%, siêu âm trong 30phút, thêm ethanol
96% đến vạch, lắc đều, lọc, bỏ 10mL dịch lọc đầu. Hút chính xác 10mL
dịch lọc vào bình định mức 50mL, thêm ethanol 96% đến vạch, lắc đều.
Hút chính xác 5mL dung dịch vừa pha vào bình định mức 50mL, thêm
nước cất đến vạch, lắc đều.
 Mẫu trắng
Hút chính xác 5mL ethanol 96% vào bình định mức 50mL, thêm nước
cất đến vạch, lắc đều.