Đánh giá tác dụng hạ glucose máu của cao giàu saponin từ 2 loài gynostemma sp tại việt nam

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

MAI THỊ THANH THẢO
MÃ SINH VIÊN: 1101470

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE MÁU
CỦA CAO GIÀU SAPONIN TỪ 2 LOÀI
GYNOSTEMMA SP. TẠI VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
Ths. Thân Thị Kiều My
Nơi thực hiện:
Bộ môn Dược Liệu – Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2016


LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện khóa luận này, tôi đã nhận được sự hướng
dẫn và giúp đỡ tận tình về mọi mặt từ các thầy cô, bạn bè và gia đình. Nhân
dịp này tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, phòng Đào tạo, các phòng
ban và các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi học
tập và nghiên cứu trong thời gian tại trường. Tôi xin trân trọng cảm ơn ThS.
Đỗ Thị Nguyệt Quế cùng bộ môn Dược lý đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn
thành khóa luận này. Đặc biệt, tôi xin gửi lời biết ơn chân thành nhất tới ThS.
Thân Thị Kiều My, người đã hết lòng chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong thời gian
làm khóa luận.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cha mẹ, anh em, bạn
bè trong suốt thời gian qua đã luôn ở bên cạnh, động viên tôi.
Do thời gian và điều kiện có hạn, khóa luận không thể tránh khỏi
những thiếu sót, rất mong được sự góp ý của thầy cô và các bạn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Mai Thị Thanh Thảo


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
Chương 1. TỔNG QUAN .........................................................................................3
1.1. Tổng quan về bệnh Đái tháo đường..................................................................3
1.1.1. Khái niệm ...................................................................................................3
1.1.2. Cơ chế bệnh sinh ........................................................................................3
1.1.3. Điều trị ........................................................................................................3
1.1.4 Các phương pháp đánh giá tác dụng hạ glucose máu .................................5
1.2. Tổng quan về chi Gynostemma ........................................................................7
1.2.1. Vị trí phân loại chi Gynostemma. ...............................................................7
1.2.2. Đặc điểm thực vật và phân bố. ...................................................................7
1.2.3. Thành phần hóa học ...................................................................................9
1.2.4. Tác dụng dược lý. .....................................................................................13
1.2.5. Độc tính ....................................................................................................14
1.2.6 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học chi Gynostemma tại Việt
Nam. ...................................................................................................................15
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................19
2.1. Nguyên vật liệu, trang thiết bị, phương pháp nghiên cứu ..............................19

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...............................................................................19
2.1.2. Hóa chất và thiết bị...................................................................................19
2.2. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................17
2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................17
2.3.1. Định tính các nhóm hợp chất chính trong dịch chiết toàn phần ...............17
2.2.2 Chiết xuất saponin từ mẫu Giảo cổ lam ....................................................24
2.2.3 Đánh giá tác dụng hạ glucose máu ............................................................24
2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu .........................................................................26
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................................27
3.1. Định tính các nhóm hợp chất. .........................................................................27
3.2. Chiết xuất saponin ..........................................................................................29


3.3. Đánh giá tác dụng hạ glucose máu của 2 loài Giảo cổ lam ............................29
3.4. Bàn luận ..........................................................................................................32
3.4.1. Về nhóm hợp chất ....................................................................................35
3.4.2. Về dược liệu và phương pháp chiết xuất saponin từ 2 mẫu Giảo cổ
lam ......................................................................................................................35
3.4.3 Về đánh giá tác dụng hạ glucose máu của saponin chiết xuất từ Giảo
cổ lam thu hái tại Yên Bái và Bắc Cạn ..............................................................35
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................38
Kết luận ..............................................................................................................38
Kiến nghị ............................................................................................................38
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

G.:

Gynostemma

STZ:

Streptozotocin

M1 :

Mẫu Giảo cổ lam tại Yên bái

M2:

Mẫu Giảo cổ lam tại Bắc Cạn

ĐTĐ:

Đái tháo đường

TLC:

Thin-layer chromatography

HPTLC :

High performance thin layer chromatography

GOD :

Glucose oxidase

CMC :

Carboxymethylcellulose

TT :

Thuốc thử

D/c :

Dịch chiết

EtOH :

Ethanol

n- BuOH :

n-butanol

STT :

Số thứ tự

TB :

Trung bình

Glu :

Glucose

CHCl3:

Chloroform

Glu:

Glucose

Rha:

Rhamnose

Xyl:

Xylose

HPLC:

High performance liquid chromatography

HPLC-MS:

High performance liquid chromatography
mass spectrometry


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1. Saponin thường gặp trong G.pentaphyllum (Thunb.) Makino ....... 11
Bảng 2. Kết quả định tính các nhóm chất trong lá và thân Giảo cổ lam
thu hái tại Yên Bái và Bắc Cạn. ...................................................... 27
Bảng 3: Hàm lượng saponin thu được sau chiết xuất................................... 32
Bảng 4. Tác dụng hạ glucosse huyết của M1, M2 ....................................... 33


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1: Cấu trúc khung Dammaran ................................................................ 10
Hình 2: Cấu trúc saponin................................................................................. 11
Hình 3: Các dạng cấu trúc R7 trong G.pentaphyllum ..................................... 11
Hình 4: Giảo cổ lam tại Yên Bái ..................................................................... 16
Hình 5: Giảo cổ lam tại Bắc Cạn .................................................................... 16
Hình 6: Sơ đồ chiết xuất saponin .................................................................... 31


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh tiểu đường hay còn gọi là bệnh đái tháo đường là một dạng bệnh
nội tiết do rối loạn chuyển hóa cacbohydrat khi hoóc môn insulin của tụy bị
thiếu hay giảm tác động trong cơ thể. Theo báo cáo toàn cầu năm 2016 của
WHO [45], số lượng người lớn tuổi sống chung với bệnh tiểu đường đã gần
như tăng gấp bốn lần kể từ năm 1980 là 422,000,000 người. Với lối sống hiện
đại ngày nay, bệnh tiểu đường đã trở thành một bệnh phổ biến. Chính vì thế,
điều trị tiểu đường không chỉ là vấn đề của ngành y tế mà còn là vấn đề của
toàn xã hội. Một trong những hướng nghiên cứu trên thế giới hiện nay là sàng

lọc, tìm ra các hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên, chủ yếu là từ thực vật, hoàn
thiện và phát triển các chất/nhóm chất có triển vọng để dùng làm thuốc chữa
tiểu đường.
Giảo cổ lam là một trong những dược liệu đang được nghiên cứu và sử
dụng với các tác dụng như chống oxy hóa [23], hạ lipid máu [41], chống ung
thư [34], [38], [49],... Nhiều nghiên cứu đã chứng minh tác dụng hạ glucose
máu của các loài Gynostemma.
Khi phát hiện 2 mẫu Giảo cổ lam tại Yên Bái và Bắc Cạn với trữ lượng
ổn định, nhóm nghiên cứu đã tiến hành khảo sát về đặc điểm thực vật, hình
thái, thành phần hóa học và tập trung chiết xuất saponin từ mẫu Giảo cổ lam
mới, đồng thời dùng saponin thu được để tiến hành thử nghiệm đánh giá khả
năng hạ glucose máu. Với nhiều nghiên cứu trên thế giới về tác dụng hạ
đường huyết của Giảo cổ lam đồng thời theo kinh nghiệm người dân địa
phương thường sử dụng các mẫu này để chữa bệnh tiểu đường, nhóm nghiên
cứu quyết định thực hiện đề tài “Đánh giá tác dụng hạ glucose máu của cao
giàu saponin từ 2 loài Gynostemma sp. tại Việt Nam” với 02 mục tiêu:


2

1. Chiết xuất cao giàu saponin từ 2 loài Giảo cổ lam thu hái tại Yên Bái
và Bắc Cạn.
2. Đánh giá tác dụng hạ glucose máu của cao giàu saponin từ 2 loài
Giảo cổ lam thu hái tại Yên Bái và Bắc Cạn.


3

Chương 1
TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về bệnh Đái tháo đường
1.1.1. Khái niệm
Đái tháo đường là bệnh rối loạn chuyển hóa gây tăng đường huyết mạn
tính do thiếu Insulin tương đối hoặc tuyệt đối. Những rối loạn này có thể dẫn
đến hôn mê và tử vong trong một thời gian ngắn nếu không được điều trị kịp
thời [18].
1.1.2. Cơ chế bệnh sinh
Đái tháo đường là một bệnh tự miễn có sự tác động của các yếu tố: di
truyền, miễn dịch, môi trường và chế độ dinh dưỡng.
Insulin là một hormon của tuyến tụy đóng vai trò quan trọng trong điều
hòa đường huyết. Nó làm giảm hàm lượng đường trong máu thông qua tác
động đến sự tổng hợp glycogen, triglycerid, protein. Ở người bình thường,
nồng độ Insulin trong máu phụ thuộc vào lượng glucose huyết. Khi đường
huyết tăng, lượng Insulin bài tiết ra sẽ tăng lên để điều hòa lại nồng độ đường
huyết. Vì nguyên nhân nào đó, lượng Insulin được bài tiết ra không đủ để
đảm bảo chức năng kiểm soát đường huyết. Kết quả nồng độ đường huyết cao
dẫn đến dẫn đến đái tháo đường typ I. Ngược lại, khi nồng độ đường huyết
tăng cao trong khi lượng Insulin vẫn ở mức bình thường thậm chí mức cao
nhưng do có sự suy giảm về chất lượng và số lượng receptor nhận biết Insulin
của tế bào đích nên không có sự đáp ứng của Insulin với đường huyết dẫn đến
bệnh đái tháo đường typ II [18], [21].
1.1.3. Điều trị
Nguyên tắc điều trị.
-

Làm mất triệu chứng tăng đường huyết (nhưng cũng tránh hạ quá mức).


4

-

Điều chỉnh chứng tăng glucose huyết và niệu.

-

Duy trì một thể trạng hợp lý.
Thuốc điều trị

-

Thuốc tân dược:
+ Insulin: gồm 4 nhóm theo thời gian tác dụng
 Insulin tác dụng cực nhanh: tác dụng xuất hiện sau 15 phút và đạt
tối đa sau 30 phút, kéo dài tác dụng khoảng 4h.
 Insulin tác dụng nhanh:
Insulin hydroclorid: xuất hiện tác dụng sau 1h và đạt tối đa sau 3h,
kéo dài khoảng 6h.
Insulin – kẽm nhũ dịch: chỉ tiêm dưới da, tác dụng xuất hiện sau 1h
và kéo dài 14h.
 Insulin tác dụng trung bình: xuất hiện tác dụng sau 2h và kéo dài
khoảng 24h.
 Insulin tác dụng chậm: xuất hiện tác dụng sau tiêm dưới da 4-6h,
kéo dài tới 37h.
+ Thuốc dùng đường uống
 Dẫn xuất sulfonylure : ĐTĐ typ II.
 Các Biguanid: Metformin điều trị ĐTĐ typ II.
 Acarbose: đái tháo đường typ II.
 Một số thuốc khác: Ciglitazone, Pioglitazone... [18], [27]

-

Thuốc dược liệu
Từ lâu người dân đã biết khai thác nguồn dược liệu phong phú ở Việt

Nam để điều trị Đái tháo đường như Mướp đắng, Dây thìa canh, Giảo cổ
lam,... Việc sử dụng thảo dược điều trị đái tháo đường không chỉ giúp giảm
tác dụng phụ, giảm độc tính mà còn giảm chi phí điều trị. Chính vì thế, ngày
nay, không chỉ dừng lại ở việc sử dụng thảo dược theo kinh nghiệm dân gian,


5

các nhà nghiên cứu đã tập trung rất nhiều vào nghiên cứu ở cả thế giới và Việt
Nam để khẳng định tác dụng và tìm ra cơ chế hạ đường huyết của nhiều loại
thảo dược [18].
1.1.4 Các phương pháp đánh giá tác dụng hạ glucose máu
Được chia thành 2 loại: nghiên cứu in vivo và nghiên cứu in vitro.
1.1.4.1 Nghiên cứu in vivo:

Thường được dùng để sàng lọc hoặc nghiên cứu hướng cơ chế tác dụng
của thuốc. Các mô hình hay được áp dụng bao gồm:
- Đánh giá ảnh hưởng của thuốc lên glucose máu
- Đánh giá khả năng dung nạp glucid (như glucose, disaccharide…)
- Đánh giá ảnh hưởng của thuốc trên mức độ kháng insulin.
 Gây mô hình đái tháo đường:
- Gây ĐTĐ bằng cắt bỏ tuyến tụy của động vật thí nghiệm: Tuy nhiên,
sau khi cắt bỏ tuyến tụy, động vật ít đáp ứng với bất kỳ tác động nào
nhằm hạ glucose máu, trong quá trình thí nghiệm lại phải thường xuyên
bổ sung các enzyme tụy cho động vật [24], [42].

- Gây ĐTĐ bằng hóa chất: hóa chất phá hủy tế bào β đảo tụy trong đó
hay được sử dụng nhất là streptozocin. Streptozocin (STZ) có cấu trúc
gần giống glucose và tác dụng chọn lọc trên tế bào β tiểu đảo tụy. Sau
khi xâm nhập vào tế bào, STZ sẽ tách thành 2 thành phần là glycose và
methylnitrosourea. Methylnitrosourea là tác nhân alkyl hóa mạnh gây
biến đổi cấu trúc AND, ức chế sao chép AND do đó ức chế nhân lên
của tế bào β. Việc giảm số lượng tế bào β gây ra tình trạng ĐTĐ [42].
- Gây ĐTĐ di truyền: bằng phương pháp lai và chọn giống sẽ tạo được
động vật ĐTĐ typ 1 di truyền với nhiều biểu hiện tương đối giống với
biểu hiện ở người. Tuy nhiên những gen đột biến này ít gặp ở người


6

nên động vật ĐTĐ di truyền typ 1 không đại diện cho cơ chế bệnh sinh
ĐTĐ ở người [43].
- Gây ĐTĐ typ 2 do chế độ dinh dưỡng: Nguyên tắc cơ bản là cho chuột
ăn thức ăn giàu chất béo (chiếm 40-60% thành phần calo) trong thời
gian dài (1-2 tháng) để gây kháng insulin và gây tổn thương tế bào β
đảo tụy, gây tình trạng ĐTĐ. Việc gây ĐTĐ với chế độ dinh dưỡng
trên chuột có nhiều đặc điểm giống với ĐTĐ typ 2 thể béo phì trên
người [31].
 Đánh giá tác dụng hạ glucose máu in vivo
- Đánh giá ảnh hưởng của thuốc lên glucose máu: nguyên tắc chung là
định lượng glucose máu trước và sau khi cho động vật thí nghiệm dùng
thuốc. So sánh giá trị glucose máu sau khi dùng thuốc với trước khi
dùng thuốc để đánh giá tác dụng của mẫu thử. Song song tiến hành lô
chứng để so sánh.
- Đánh giá khả năng dung nạp glucid: Định lượng glucose máu trước khi
cho uống glucose (hoặc polysaccharide) và các thời điểm sau uống

glucose (hoặc polysaccharide), so sánh mức độ tăng glucose tại các thời
điểm, so sánh với lô chứng để đánh giá khả năng ức chế tăng glucose
(hoặc polysaccharide) của thuốc thử.
- Đánh giá tác dụng tăng nhạy cảm insulin với mô đích của thuốc: Giữ
cho nồng độ insulin máu ổn định ở mức cao đồng thời duy trì nồng độ
glucose máu ổn định bằng cách truyền dung dịch glucose. Khi đưa
nồng độ insulin tăng cao và duy trì mức tối đa, tốc độ truyền glucose và
tốc độ chuyển hóa glucose phản ánh mức độ gắn insulin vào các
receptor ở các mô ngoại vi. Mức độ nhạy cảm insulin của tất cả các mô
trong cơ thể được xác định thông qua khả năng tiêu thụ glucose của cơ
thể ở điều kiện nồng độ glucose đạt trạng thái ổn định .


7

1.1.4.2. Nghiên cứu in vitro:

Có 2 loại mô hình đánh giá:
- Đánh giá tác dụng của thuốc trên các cơ quan, tế bào cô lập: chủ yếu
tập trung vào đánh giá ảnh hưởng của thuốc đến khả năng bài tiết
insulin của đảo tụy và đánh giá ảnh hưởng của thuốc đến mức độ nhạy
cảm insulin tại tế bào đích và quá trình sử dụng glucose của tế bào.
- Đánh giá tác dụng của thuốc trên một số enzyme tham gia điều hòa
glucose máu: Dựa vào khả năng thủy phân của các enzyme đối với cơ
chất thích hợp ở các điều kiện thích hợp.
1.2. Tổng quan về chi Gynostemma
1.2.1. Vị trí phân loại chi Gynostemma.
Theo Từ điển cây thuốc Việt Nam [6], Thực vật dược và phân loại thực
vật [17], Thực vật chí Trung Quốc [25], Giảo cổ lam thuộc chi Gynostemma,
một chi nằm trong họ bầu bí (Curcubitaceae), có vị trí phân loại: Giới Thực

vật (Plantae), Ngành

Ngọc lan

(Magnoliophyta), Lớp

Ngọc lan

(Magnoliopsida), Phân lớp Sổ (Dilleniidale), Liên bộ Hoa tím (Violanae), Bộ
Bí (Cucurbitales), Họ Bầu Bí (Cucurbitaceae), Chi Gynostemma.
1.2.2. Đặc điểm thực vật và phân bố.
1.2.2.1. Đặc điểm thực vật chi Gynostemma Blume.
Chi Gynostemma được mô tả lần đầu tiên bởi Blume vào năm 1825 dựa
trên hình thái của loài G.simplicifolium [28]. Theo Từ điển cây thuốc Việt
Nam [6] và Thực vật chí Trung Quốc [25], các loài thuộc chi Gynostemma có
đặc điểm chung như sau:
Cây thảo lâu năm, khác gốc, ít khi cùng gốc, thân leo mảnh, nhẵn hoặc
có lông mịn.
Lá kép, ít khi là lá đơn, lá có cuống, phiến lá chân vịt có 3-9 lá chét.
Cụm hoa khác gốc. Hoa đực: nhỏ, màu trắng hoặc lục nhạt, có lá bắc con,


8

cuống hoa có đốt. Đài hoa hình bánh xe. Tràng hình bánh xe, hơi hàn liền
phần gốc tràng. Nhị 5. Bao phấn 1 ô. Hoa cái: Đài và tràng giống hoa đực.
Nhụy 1 hoặc 2.
Quả hình cầu lớn hơn hạt đậu, không mở. Hạt sần sùi [1], [25].
1.2.2.2 Phân bố chi Gynostemma
Các loài của chi Gynostemma Blume phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới

châu Á và Đông Nam Á từ Himalaya tới Nhật Bản, Malaysia và Tân Guinea .
Hiện trên thế giới đã ghi nhận 21 loài thuộc chi Gynostemma [28]. Ở Trung
Quốc đã ghi nhận được 14 loài [25]. Tại Việt Nam đã công bố 4 loài thuộc chi
Gynostemma là G. Pentaphyllum (Thunb.) Makino, G. Laxum (Wall.) Cogn
[5], [6], G. Longipes C.Y.WU [12], [20], G. Pedeta Blume [7].
1.2.2.3 Đặc điểm thực vật và phân bố một số loài trong chi Gynostemma tại
Việt Nam.
Trong khuôn khổ khóa luận, tôi xin trình bày đặc điểm của 2 loài là G.
Pentaphyllum ( Thunb.) Makino và G. Burmanicum King ex Chakrav.
1.2.2.3.1 Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino
Tên gọi khác: Cổ yếm, giảo cổ lam, thất diệp đởm,nam nhân sâm,...[6]
Đặc điểm thực vật:
Cây thảo mọc leo yếu, không lông hoặc lông thưa thớt ở mấu.
Lá kép có cuống chung dài 3-4cm; phiến lá do 5-7 lá chét với mép có
răng dài 3-9cm, rộng 1,5-3cm. Tua cuốn mảnh, xẻ đôi ở đỉnh [6], [7], [25].
Cụm hoa đực dạng chùm kép. Hoa có cuống mảnh cỡ 1-4mm, ống đài
rất ngắn, thùy đài hình tam giác, dài khoảng 0,7mm, đỉnh nhọn, thùy tràng
hình bầu dục hoặc mũi mác, đỉnh nhọn có một gân, nhị 5, bao phấn dính
thành đĩa. Cụm hoa cái dạng chùy ngắn hơn hoa đực. Hoa có đài và tràng
giống hoa đực, bầu hình cầu 2-3 ô, vòi nhụy 3, ngắn [25].
Quả khô, tròn, khi chín màu đen. Hạt màu nâu [6], [25].


9

Hoa tháng 3-10. Quả tháng 4-12. Thu hái dây lá vào mùa thu, phơi khô
[5], [6], [25].
Phân bố: Phân bố ở Ấn Độ, Xrilanca, Mianma, Trung Quốc, Nhật Bản,
Thái Lan, Lào, Việt Nam và bán đảo Malaixia [7]. Tại Việt Nam, cây mọc
nhiều nơi như Lào Cai, Lạng Sơn, Hòa Bình, Thừa Thiên Huế, Kon Tum,

Đồng Nai [5], [6], [7].
1.2.2.3.2 Gynostemma burmanicum King ex Chakrav [3].
Đặc điểm thực vật: Cây thảo, mảnh, thân leo có góc-rãnh. Toàn thân có
nhiều lông mịn bao gồm cả mấu, chiều dài mỗi lóng thân 5-15cm.
Lá kép chân vịt với cuống chung hình trụ có vân dọc ở giữa; cuống
chung dài 3-7cm; phiến lá do 3 lá chét tạo thành. Lá chét ở giữa hình thoi, gốc
hình nêm, mép khía tai bèo, đầu và gốc lá nhọn, cả hai mặt đều có nhiều lông,
kích thước mỗi phiến lá chét ở giữa 5-12cm × 3-6cm. Lá chét bên có hình trái
xoan, kích thước 4-9cm ×3-4cm. Gân lá hình lông chim với 8-9 gân bên.
Cuống lá chét ở giữa dài 5-6mm, cuống lá chét bên ngắn hơn, đôi khi gần như
không có cuống. Trên cây còn có cả lá đơn hoặc lá kép hai lá chét. Tua cuốn
chia đôi ở phía ngọn và có nhiều lông ngắn bao phủ.
Cụm hoa đơn tính khác gốc.
Quả mọng không tự mở khi chín, màu xanh, hình cầu, đường kính 5-6
mm, bề mặt có lông, bên trong chứa 3 hạt.
Hạt màu nấu, hình trứng rộng, kích thước trung bình 3-5 × 3mm, dày
khoảng 2mm, cả hai mặt đều có gai nhú, bên rìa có nếp nhăn.
Phân bố: Việt Nam [3].
1.2.3. Thành phần hóa học
Theo Võ Văn Chi [6], trong Giảo cổ lam có saponin, flavonoid và các loại
đường.
1.2.3.1 Saponin


10

Các nghiên cứu đầu tiên đã phát hiện saponin có mặt trong Giảo cổ lam
thuộc nhóm dammaran ( Hình 1 )

Hình 1: Cấu trúc khung Dammaran

Dammaran là một nhóm saponin thuộc loại saponin 4 vòng ( saponin
triterpenoid tetracyclin). Khung cấu trúc có 4 vòng và một mạch nhánh 8
carbon, 4 vòng gồm 3 vòng 6 cạnh, 1 vòng 5 cạnh. Phần đường nối vào OH ở
carbon C-3 hoặc C-20 để tạo thành glycosid [4], [10].
Saponin trong G. pentaphyllum còn được gọi là gynopenosid, hàm
lượng saponin toàn phần chiếm khoảng 2,4% khối lượng dược liệu khô và đã
có khoảng 100 loại gynopenosid được phân lập [41].
Số lượng các gynopenosid gấp khoảng 5 - 6 lần các ginsenosid (thành
phần có hoạt tính chính của Nhân sâm Panax ginseng). Cấu trúc saponin
trong G.pentaphyllum (thunb.) Makino được trình bày qua hình 2, 3 và bảng 1
như sau:


11

a

R6
R4

20

R5

R7

b

CH2OH

OH
OOH

18

R3

R2

1

17

O

e

d

f

9
30

R1

OCH3

O
28

OH

c

29

g

Hình 2: Cấu trúc saponin

OH
CH2O Glu

h

O
Rha

i

Hình 3: Các dạng cấu trúc R7
trong G.pentaphyllum

Bảng 1. Saponin thường gặp trong G.pentaphyllum (Thunb.) Makino

R1

R2

R3

R4

R5

R6

R7

Các nhóm thế
Đường glu, rham, xyl, có thể 1 hoặc

Ví dụ

2, 3 đường kết hợp với nhau
- H; - OH

Gypenosid I, Rb1
Gynos TN1, Gynos TN2

-CH3; -CH2OH; -CHO

Gypenosid

I,

Rb1;

Gylongiposid I

-OH; -H; =O

Rb1;

Gylongiposid

I;

Gypentonosid A
-OH; -đường đôi; thường là glu kết Rg3, Rf
hợp với rha hoặc xyl

Rb1, gymnemasid II

-CH3; -CH2OH; -CH2O-glu hoặc
-CH2O-xyl

Rb1

Có thể là a, b, c, d, e, f, g, h hoặc i

Các ginsenosid đều có cấu
trúc a


12

Loại đường chính trong gynopenosid (hầu hết là loại pyranose) là b-Dglucose, b-D-xylose, a-L-arabinose và a-L-rhamnose nối ở C-3 và C-20.
Nhóm chức tiêu biểu là hydroxyl, methyl, aldehyd, alcol và ít phổ biến nhất là
ceton nối vào C-19. Một nhóm hydroxyl cũng có thể được đính vào C-2 và

C-12 [41].
1.2.3.2. Flavonoid
Flavonoid là một thành phần chính có mặt trong các loài thuộc chi
Gynostemma nhưng ít được nghiên cứu hơn saponin.
-

Đã xác định được trong G.pentaphyllum có ombuin, ombuoside, rutin

[29],

quercetin-di-(rhammo)-hexosid,

quercetin-rhammo-hexosid,

kaempferol- rhammo-hexosid và kaempferol-3-O-rutinosid [32].
-

Phương pháp chiết xuất flavonoid tối ưu là sử dụng phương pháp chiết

hồi lưu với dung môi ethanol 70% ở nhiệt độ 90 °C [39].
1.2.3.3. Một số thành phần hóa học khác.
-

Sterol: được xác định có mặt trong G. pentaphyllum và chiếm một

lượng nhỏ ( khoảng 0,0001%) bao gồm ergostanol, sitosterol, stigmasterol
[33],[ 41].
-

Carotenoid: năm 2004, H. L. Liu và các cộng sự đã xác định 25

carotenoid có mặt trong G.pentaphyllum bằng phương pháp HPLC, trong đó
nhiều nhất là trans- Lutein, kế đến là cis- Lutein [35].
-

Polysaccharid: Đã phân lập được 1 heteropolysaccharid phi tinh bột

điển hình với thành phần chính là glucose (23,2%), tiếp theo là galactose
(18,9%), arabinose (10,5%), rhamnose (7,7%), acid galacturonic (4,7%),
xylose (3,9%), mannose (3,1%) và acid glucuronic (1,2%),... [46].
-

Chlorophyll và dẫn chất: bằng phương pháp HPLC-MS, đã tách và

xác định được trong G.pentaphyllum có 15 chlorophyll và dẫn chất [30].


13

-

Alcaloid: được báo cáo là không có mặt trong G.pentaphyllum [22].

1.2.4. Tác dụng dược lý.
Các tác dụng của Gynostemma được cho là có được bởi saponin và
flavonoid, đặc biệt là saponin [41].
1.2.4.1 Tác dụng hạ lipid máu
Các kết quả nghiên cứu cho thấy sử dụng dịch chiết thô và các
gypenosid ở các liều khác nhau đều có khả năng làm giảm mức triglycerid và
cholesterol trên động vật thí nghiệm và người [41].

1.2.4.2 Tác dụng trên hệ tim mạch
G.pentaphyllum có khả năng ảnh hưởng tới hoạt động của hệ tim mạch,
cụ thể là làm giảm áp lực máu, làm giảm nhịp tim, làm tăng độ bền mạch
ngoại vi, động mạch não và động mạch vành [41].
1.2.4.3 Tác dụng hạ đường huyết [16]
Phân đoạn saponin của G.pentaphyllum (Thunb.) Makino (liều 1 mg/kg
tt) đã làm giảm đáng kể lượng đường trong máu khi điều trị trong 2 tuần trên
chuột cống đã được kích thích tăng đường huyết bằng Streptozocin (STZ) .
Đã tìm ra phanosid (một saponin dammaran mới) từ G.pentaphyllum
(Thunb.) Makino kích thích giải phóng insulin từ tụy chuột cống cô lập. Cho
chuột cống uống phanosid (liều 40 và 80 mg/ml) đã cải thiện được sự dung
nạp đường và tăng lượng insulin trong huyết thanh trong bệnh cảnh tăng
đường huyết.
Gypenosid (100 và 200 mg/kg tt) dùng qua đường uống trong 2 tháng đã
ngăn chặn được bệnh tăng đường huyết ở chuột cống lão hóa và cải thiện
được khả năng dung nạp đường ở chuột lão hóa nuôi bằng glucose (2 g/kg) .
Trong một nghiên cứu gần đây, gypenosid (250 mg/kg) làm giảm sự kích
thích tăng glucose ngoại sinh trên chuột béo phì đái đường Zucker do cải
thiện được sự nhạy cảm của receptor insulin .


14

1.2.4.4 Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương
Gypenosid toàn phần có tác dụng bảo vệ não thỏ khỏi bị thiếu máu khi
co thắt 2 động mạch cảnh [41].
Cao Gynostemma có tác dụng ức chế các hoạt động tự phát của chuột
khi quan sát tác dụng giảm đau của chuột bằng cách sử dụng tấm kim loại
nóng [41].
1.2.4.5 Ảnh hưởng tới chức năng miễn dịch

Các gypenosid đưa vào dạ dày chuột nhắt trong 7 ngày gây tăng chức
năng thực bào ở đại thực bào, tăng thành phần có hoạt tính trong huyết thanh
và giảm lượng kháng thể tiêu huyết. Lượng IgG huyết thanh tăng và tăng thời
gian sống sót của chuột được ghép cơ tim [41].
1.2.4.6 Tác dụng tới các tế bào ung thư
Một số hợp chất tinh khiết phân lập được từ G.pentaphyllum có tác
dụng gây độc tính với các dòng tế bào ung thư [34]. Các Gypenosid cũng
ngăn chặn tác nhân gây đột biến cyclosphosphamid ở chuột nhắt và đẩy mạnh
quá trình hồi phục ADN [37].
1.2.4.7. Một số tác dụng khác
- G. pentaphyllum (Thunb.) Makino bằng đường uống với mức liều
50g/kg thể trọng không có biểu hiện ngộ độc cấp, với mức liều 3g/kg
thỏ/ngày liên tục trong 30 ngày không thấy biểu hiện độc tính bán trường
diễn.
- Cao lỏng G. pentaphyllum (Thunb.) Makino thấy có khả năng tăng
lực theo nghiệm pháp chuột bơi.
1.2.5. Độc tính
Đã có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng việc sử dụng Gynostemma
pentaphyllum (thunb.) Makino là khá an toàn và không có tác dụng phụ,
không độc tính [23], [ 26], [ 50].


15

1.2.6 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học chi Gynostemma Blume.
tại Việt Nam.
Tại Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về chi Gynostemma
trong đó, nhiều nhất là các nghiên cứu về thành phần hóa học.
1.2.6.1. Định tính.
Bằng các phản ứng hóa học đã xác định trong G.pentaphyllum và

G.longipes đều có saponin, flavonoid, sterol, polysaccharid [2], [8], [9], [12].
Bằng phương pháp đo phổ phát xạ tia X, đã xác định được trong cây có
Al, Si, Ca, Mg, P, K, Mn, Na, Fe, Ba, Ti, Cu, Cr, Pb, Ag [8].
Đối với nhóm hợp chất chính saponin, đã định tính saponin toàn phần
trong Giảo cổ lam bằng phương pháp dấu vân tay trong HPLC [16], sắc kí lớp
mỏng [11].
1.2.6.2. Định lượng
-

Trịnh Thị Diệp Thanh đã xây dựng được phương pháp định lượng

saponin toàn phần trong Giảo cổ lam bằng phương pháp đo quang [19].
1.2.6.3. Chiết xuất, tinh chế
-

Chiết xuất: Chiết xuất bằng cồn 70° cho khối lượng cao toàn phần lớn nhất

[13], [15].
-

Tinh chế saponin từ dịch chiết:
Phương pháp 1: Loại tạp bằng ethanol tuyệt đối, saponin từ dịch lọc

được tinh chế bằng phương pháp kết tủa trong aceton [15].
Phương pháp 2: Tinh chế saponin từ dịch chiết bằng phương pháp chiết
lỏng-rắn sử dụng nhựa hấp phụ D101, rửa giải bằng EtOH 80°. [19].
Phương pháp 3: Tinh chế saponin bằng phương pháp chiết lỏng - rắn sử
dụng nhựa hấp phụ Diaion HP-20, rửa giải bằng H2O và MeOH 20% để loại
tạp và rửa giải trong khoảng nồng độ MeOH từ 50-80% để thu saponin.
Phương pháp loại được hết chlorophyl và phần lớn flavonoid [16].

16

Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu, trang thiết bị, phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Nguyên liệu là phần trên mặt đất của 2 loài Giảo cổ lam đã được chọn.
Dược liệu sau khi thu hái được làm tiêu bản khô, phân tích mẫu tươi rồi sấy
khô ở nhiệt độ 600C trong tủ sấy Shellab có quạt thông gió, sau đó cắt nhỏ và
bảo quản trong túi nilon kín ở nơi khô ráo.
Với mẫu Giảo cổ lam tại Yên Bái, về cơ bản, thành phần hóa học giống
với thành phần hóa học của các mẫu G.pentaphyllum đã nghiên cứu tại Việt
Nam. Mẫu dược liệu Giảo cổ lam tại Bắc Cạn được thu hái trong thời gian từ
tháng 8 đến tháng 10 năm 2014 có ghi nhận sự ra quả và hoa cái, bước đầu đã
có những kết quả nghiên cứu về thực vật để xác định tên khoa học, khẳng
định đây là loài Gynostemma burmanicum King ex Chakrav đã được nghiên
cứu gần đây ở Việt Nam.

Hình 4: Giảo cổ lam tại Yên Bái

Hình 5: Giảo cổ lam tại Bắc Cạn

2.1.2. Hóa chất và thiết bị
Dung môi, hóa chất:
- Chloroform, n- Butanol đạt tiêu chuẩn để chiết xuất, được cung cấp bởi
công ty sinh hóa Xilong (Trung Quốc).

17

- Ethanol, aceton
- n- Hexan đạt tiêu chuẩn chiết xuất của Merck (Đức).
- Streptozotocin (STZ) bột pha tiêm của hãng Sigma (Pháp).
- Gliclazid (Diamicron) viên nén 80 mg của hãng Les Laboratoires
Servier (Pháp).
Thiết bị, dụng cụ
- Cân kỹ thuật Precisa (Switzerland).
- Tủ sấy SHELLAB (Đức).
- Máy cất chân không BÜCHi ROTAVAPOR R-200.
- Nồi đun cách thủy, bình chiết và bộ dụng cụ chiết hồi lưu.
- Kit định lượng glucose của hãng Johnson (Mỹ)
Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả 2 giống, khỏe
mạnh, trọng lượng 25,0 ± 2,0gr đạt tiêu chuẩn thí nghiệm do Viện Vệ sinh
dịch tễ Trung ương cung cấp.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Định tính các nhóm hợp chất hữu cơ chính trong 2 mẫu Giảo cổ lam
nghiên cứu.
- Chiết xuất saponin từ mẫu Giảo cổ lam.
- Đánh giá tác dụng hạ glucose máu của 2 loài Gynostemma.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Định tính các nhóm hợp chất hữu cơ chính trong dược liệu
Bằng các phản ứng đặc trưng của các nhóm hợp chất hữu cơ:
1. Định tính flavonoid
Lấy 10g dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml, chiết với dung
môi thêm 50ml ethanol 90%. Đun cách thủy sôi 5 phút. Dịch chiết được lọc
nóng, dịch lọc thu được đem đun cách thủy ở nhiệt độ 80°C. Gạn lấy phần

18

dịch, bỏ phần tạp tách ra dưới đáy bình. Phần dịch thu được lắc 3 lần với
ethylacetat, cho bay hơi dung môi tới cắn, mỗi lần 5ml ethylacetat. Gạn lấy
phần dịch ethylacetat, cô cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn trong 5 ml ethanol
70%, chia đều vào 4 ống nghiệm nhỏ, thực hiện các phản ứng định tính sau:
-

Phản ứng Cyanidin:
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết cồn, thêm một ít bột Mg kim loại,

thêm tiếp vài giọt HCl đặc, đun cách thủy. Thấy dịch chiết chuyển từ vàng
sang đỏ.


Phản ứng dương tính.

-

Phản ứng với FeCl3 5%:
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết cồn, thêm vài giọt dung dịch FeCl3

5%. Thấy dịch chiết chuyển sang màu xanh đen


Phản ứng dương tính.

-

Tác dụng với kiềm:

Với dung dịch NaOH loãng:
Cho 1 ml dịch chiết cồn vào ống nghiệm, thêm vài giọt NaOH 10%.
Màu vàng của dung dịch đậm lên.


Phản ứng dương tính.

Với hơi NH3:
Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên một miếng giấy lọc, hơ khô rồi đặt lên miệng
lọ NH3 đặc đã mở nút. Quan sát thấy màu vàng của vết dịch chiết đậm lên.


Phản ứng dương tính.
Kết luận: Trong 2 loài Giảo cổ lam có chứa flavonoid.
2. Định tính saponin

-

Quan sát hiện tượng tạo bọt:
Cho vào ống nghiệm 1g dược liệu và 5ml cồn 70° đặt trên nồi cách

thủy trong 10 phút, lọc nóng được dịch chiết cồn. Lấy 1 ml dịch lọc cho thêm