Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng giải lo âu của cây trinh nữ móc

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
----------

VŨ THỊ THANH LAN
MÃ SINH VIÊN: 1101283

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA
HỌC VÀ TÁC DỤNG GIẢI LO ÂU CỦA
CÂY TRINH NỮ MÓC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

VŨ THỊ THANH LAN
MÃ SINH VIÊN: 1101283

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA
HỌC VÀ TÁC DỤNG GIẢI LO ÂU CỦA
CÂY TRINH NỮ MÓC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. ThS. Phạm Tuấn Anh
2. DS. Đỗ Văn Khái
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Dƣợc liệu

2. Bộ môn Dƣợc lực

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới
ThS. Phạm Tuấn Anh, TS. Nguyễn Quỳnh Chi, DS. Đỗ Văn Khái ngƣời thầy,
ngƣời cô luôn nhiệt tình giúp đỡ, hết lòng chỉ bảo và trực tiếp hƣớng dẫn tôi trong
suốt thời gian tôi thực hiện đề tài này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Thùy Dƣơng, anh Phạm Đức
Vịnh, bạn Lê Ngọc Quỳnh Giao đã giúp đỡ tôi trong thời gian tôi làm khóa luận
này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên trong bộ
môn Dƣợc lực và Dƣợc liệu đã quan tâm tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn
thành khóa luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể các thầy cô giáo cùng cán bộ
trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy, giúp đỡ, mang lại cho tôi
những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tập tại trƣờng.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ sự yêu thƣơng và biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn
bè đã luôn bên tôi, ủng hộ tôi và là chỗ dựa tinh thần của tôi khi gặp khó khăn trong
học tập cũng nhƣ trong cuộc sống.

Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Vũ Thị Thanh Lan

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ....................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về cây Trinh nữ móc .................................................................... 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật của cây Trinh nữ móc ............................................. 2
1.1.2. Thành phần hóa học ............................................................................. 3
1.1.3. Tác dụng dƣợc lý của Mimosa diplotricha C. Wright ex Sa. ................ 8
1.1.4. Sử dụng loài Mimosadiplotricha C. Wright ex Sa. trong y học cổ
truyền..................................................................................................................... 9
1.2. Tổng quan về lo âu và rối loạn lo âu .............................................................. 9
1.2.1. Định nghĩa, phân loại ........................................................................... 9
1.2.2.Thuốc hóa dƣợc sử dụng trong điều trị rối loạn lo âu .......................... 10
1.2.3. Sử dụng dƣợc liệu trong điều trị rối loạn lo âu ................................... 10
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 13
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu .................................................................................. 13
2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu ............................................................................... 13
2.2.1. Hóa chất ............................................................................................ 13
2.2.2. Thiết bị .............................................................................................. 13
2.2.3. Động vật thí nghiệm .......................................................................... 14
2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 14
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................. 15

2.4.1. Chiết xuất, phân lập các chất trong bộ phận trên mặt đất cây Trinh
nữ móc ................................................................................................................. 15
2.4.2. Đánh giá độc tính cấp của trinh nữ móc ............................................. 17
2.4.4. Đánh giá tác dụng giải lo âu của dịch chiết nƣớc toàn phần của trinh
nữ móc ................................................................................................................. 19
2.3.5. Đánh giá ảnh hƣởng của dịch chiết nƣớc toàn phần Trinh nữ móc
đến vận động tự nhiên trên mô hình OFT ............................................................. 21
2.3.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu và tính toán kết quả .................................. 22
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................ 23
3.1. Chiết xuất, phân lập các hợp chất ................................................................ 23
3.1.1. Chiết xuất .......................................................................................... 23
3.1.2. Định tính cắn các phân đoạn ............................................................. 24
3.1.3. Phân lập ............................................................................................. 28
3.2. Đánh giá độc tính cấp của cây Trinh nữ móc ............................................... 31
3.3. Đánh giá tác dụng giải lo âu của dịch chiết nƣớc toàn phần của Trinh nữ móc ... 32
3.4. Đánh giá ảnh hƣởng của dịch chiết nƣớc toàn phần trinh nữ móc đến hoạt
động tự nhiên và hành vi khám phá của chuột trên thử nghiệm OFT........................... 33
3.5. Bàn luận ...................................................................................................... 34
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ...................................................................................... 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

APA

Hiệp hội tâm thần Hoa Kì ( The American Psychiatric Association)

BZD

DSM-5TM

Benzodiazepin
Diagnostic and Statist manual of Mental disoreders ( Fifth edition)

DZP
EPM

Diazepam
Mô hình chữ thập nâng cao (Elevated plus maze)

GABA

Gamma amino butyric acid

GAD

Rối loạn lo âu lan tỏa (Generalized anxiety disorder)

ICD-10

International Classification of Diseases, Tenth Revision

LD50
MS

Lethal Dose
Khối phổ (Mass spectrometry)

NMR

Nuclear magnetic resonance

OFT

Mô hình môi trƣờng mở (Open frield test)

PD
RLLA

Rối loạn hoảng sợ (Panic disorder)
Rối loạn lo âu

SIT

Mô hình tƣơng tác xã hội (Social interaction test)

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

SLTT
SSRI

Số lần ở trung tâm
Ức chế tái thu hồi chọn lọc serotonin (Serotonin selective reuptake
inhibitors)

TGTT
TT

WHO
YHCT

Thời gian ở trung tâm
Thuốc thử
Tổ chức y tế thế giới (The World Health Organization)
Y học cổ truyền


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Tên bảng
3.1.
Kết quả định tính các phân đoạn n-hexan, EtOAc và phân đoạn nƣớc

Trang
26

3.2.
3.3.
3.4.
3.5.

29
30
31
32

3.6.

Kết quả SKLM của MD1 với 3 hệ dung môi
Số liệu phổ 1H-NMR của phần aglycon MD1 [MeOD, δ (ppm), 500 MHz]
Bố trí thí nghiệm cho thử độc tính cấp của mẫu thử cao Trinh nữ móc
Tác dụng giải lo âu của diazepam 2 mg/kg và dịch chiết nƣớc toàn
phần của dƣợc liệu Trinh nữ móc ở ba mức liều 4,8 g/kg; 9,6g/kg;
14,4 g /kg
Ảnh hƣởng của diazepam (DZP) và dịch chiết nƣớc toàn phần Trinh
nữ móc đến các thông số thử nghiệm OFT trên chuột

33


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình

Tên hình

Trang

1.1.
1.2.
1.3.
1.4.
1.5.
2.1.

Quercetin và các glycosid.
Luteolin và các dẫn chất.
Các glycosid của myricetin.

Các hợp chất 5-deoxy-flavon.
Các flavonoid khác.
Ảnh loài Mimosa diplotricha C. Wright ex Sauvalle
thu hái ở Cẩm Giàng, Hải Dƣơng
Mô hình chữ thập nâng cao
Mô hình môi trƣờng mở
Sơ đồ chiết xuất phân đoạn từ dịch chiết nƣớc Trinh
nữ móc
Sắc kí đồ của cắn ethyl acetat với hệ dung môi (II)
Sắc kí đồ của MD1
Công thức cấu tạo của quercetin

4
5
5
6
7
13

2.2.
2.3.
3.1.
3.2.
3.3.
3.4.

19
21
24
27

29
30


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Rối loạn lo âu (RLLA) là một bệnh lý nghiêm trọng, ảnh hƣởng tới tâm sinh lý
cũng nhƣ hành vi của ngƣời bệnh. Bệnh có tỷ lệ mắc cao cũng nhƣ xu hƣớng ngày
càng gia tăng [20]. Hiện nay, phƣơng pháp điều trị rối loạn lo âu chủ yếu là phối
hợp liệu pháp tâm lý với thuốc giải lo âu (anxiolytics). Các thuốc giải lo âu có
nguồn gốc hóa dƣợc chính đƣợc sử dụng là các dẫn chất của benzodiazepin,
buspiron và các thuốc chống trầm cảm ức chế chọn lọc tái thu hồi serotonin hoặc chống
trầm cảm 3 vòng [35]. Hạn chế lớn nhất của các thuốc có nguồn gốc hóa dƣợc là tác
dụng phụ, khả năng lệ thuộc thuốc và phản ứng cai thuốc xảy ra khi dừng điều trị.
Vì vậy, sử dụng các thuốc và sản phẩm có nguồn gốc dƣợc liệu hiện đƣợc coi là
hƣớng tiếp cận bổ sung và thay thế cho các thuốc có nguồn gốc hóa dƣợc trong điều
trị rối loạn lo âu [39].
Cây Trinh nữ móc có tên khoa học là Mimosa diplotricha C. Wright ex Sa.
(tên đồng nghĩa là Mimosa invisa), thuộc họ Đậu (Fabaceae). Đây là một loài cây
vốn đƣợc biết đến là một loài ngoại lai xâm hại các thực vật khác. Cây này chƣa
đƣợc sử dụng làm thuốc ở Việt Nam nhƣng đã đƣợc sử dụng trong YHCT một số
nƣớc với tác dụng trấn an tinh thần.
Trên thế giới mới chỉ có rất ít nghiên cứu về thành phần hóa học của Trinh nữ
móc. Tại Việt Nam, kết quả nghiên cứu bƣớc đầu trên loài M. diplotricha của chúng
tôi cho thấy alcaloid và flavonoid là hai nhóm chất đáng chú ý trong cây. Ngoài ra
các kết quả nghiên cứu bƣớc đầu đánh giá tác dụng an thần của cây Trinh nữ móc
cho thấy đây là một loài có tiềm năng [12]. Nhằm tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về
thành phần hóa học cũng nhƣ tác dụng giải lo âu, đề tài ―Nghiên cứu thành phần
hóa học và tác dụng giải lo âu của cây Trinh nữ móc‖ đƣợc thực hiện với hai

mục tiêu sau:
1. Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học của cây Trinh nữ móc.
2. Đánh giá độc tính cấp và tác dụng giải lo âu của dịch chiết nƣớc toàn phần
cây Trinh nữ móc.


2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về cây Trinh nữ móc
1.1.1. Đặc điểm thực vật của cây Trinh nữ móc
1.1.1.1. Tên gọi, vị trí phân loại của cây Trinh nữ móc
Tên khoa học: Mimosa diplotricha C. Wright ex Sauvalle [8].
Tên đồng nghĩa: Mimosa invisa [38].
Tên địa phƣơng: Anathottawadi, padaincha (Ấn Độ), banla saet
(Campuchia), duri semalu (Malaysia), makahiyang lalaki (Philippin), maiyaraap
thao (Thailan), cogadrogadro (Fiji) [38].
Theo hệ thống phân loại Takhtajan 1987, Mimosa diplotricha C. Wright ex
Sauvalle thuộc chi Mimosa L., phân họ Trinh nữ (Mimosoideae), Họ Đậu
(Fabaceae), bộ Đậu (Fabales), phân lớp Hoa Hồng (Rosidae), lớp Ngọc Lan
(Magnoliopsida), ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta), giới thực vật (Plantae) [2].
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật, phân bố
 Đặc điểm thực vật chi Mimosa L.
Cây bụi hay cây cỏ, hiếm khi cây gỗ hoặc leo, thƣờng có gai. Lá kèm nhỏ,
rụng sớm. Lá kép lông chim, thƣờng rất nhạy cảm. Cụm hoa hình cầu hay hình trụ
nhọn, đơn độc hay tụ lại thành bó, mọc ở nách lá, có cuống. Hoa nhỏ, lƣỡng tính
hay tạp tính, không cuống, thƣờng 4 cánh, hình chuông, có răng cƣa, tiền khai hoa
van. Tràng hợp ở gốc. Nhị 4 - 8, rời, thò. Bao phấn không có nắp. Bầu nhụy chứa
rất nhiều noãn, dạng sợi mảnh. Quả đậu, hình thuôn dài hay thẳng, thƣờng dạng
phẳng - bẹt, dai. Quả thắt lại theo các hạt, có nhiều lông cứng, mỗi đốt mang một
hạt. Hạt hình elip hoặc hình cầu, phẳng [49].

 Đặc điểm thực vật loài Mimosa diplotricha C. Wight ex Sa.
Cây bụi thấp hay cây cỏ lâu năm. Thƣờng có dạng bụi dày đặc, hệ thống rễ
phát triển mạnh mẽ, thƣờng hóa gỗ ở phần gốc sát mặt đất. Thân leo hoặc mọc bằng
phẳng trên mặt đất, có thể cao đến 5m, 4 góc, nhiều lông, với nhiều gai uốn ngƣợc
lại mọc rải rác ngẫu nhiên dọc theo chiều dài thân, gai dài 3 - 6 mm. Lá kép lông chim,
dài 10 - 15 cm, nhạy cảm khi chạm phải, có từ 4 - 9 cặp thứ diệp, dài 2 - 4,5 cm, mỗi lá


3
mang 12 - 30 cặp lá chét, không cuống, hình thuôn dài, dài 12 mm, rộng 1,5 mm. Cụm
hoa đầu, 1- 3 ở nách lá, dài 1 cm (có nhiều sợi lông nhỏ), cuống hoa dài 5 - 10 mm. Hoa
lƣỡng tính. Đài hoa kín. Tràng hình phễu, chia 4 thùy, có lông tơ ở ngoài. Nhị 8,
màu hồng tím nhạt có lông tơ. Thời kì ra hoa là từ tháng tám đến tháng 2, nhƣng có
thể thay đổi từ vùng này sang vùng khác. Ở một số nƣớc nhiệt đới, cây ra hoa quanh
năm. Quả mọc thành cụm, hơi cong, thuôn dài, có nhiều lông cứng, màu vàng nâu,
tách ngang thành nhiều đoạn, mỗi đoạn có chứa một hạt. Hạt phẳng, hình trứng, dài
2 - 2,5 mm, màu nâu sáng [8], [38], [49]. Phân bố: Nam và Đông Nam Á, Thái Bình
Dƣơng, miền bắc Australia, Nam và Trung Mỹ, quần đảo Hawaii, Châu Phi, Nigeria
và Pháp [38].
1.1.1.3. Bộ phận dùng, thu hái,chế biến
Tại Việt Nam, Mimosa diplotricha C. Wight ex Sa. chƣa đƣợc sử dụng làm
thuốc. Tuy nhiên, y học cổ truyền ở một số nƣớc sử dụng rễ hoặc toàn cây với một
số tác dụng dƣợc lý khác nhau nhƣ giảm đau, chống ung thƣ, chống độc, cầm máu,
trấn an tinh thần [24].
1.1.2. Thành phần hóa học
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài thuộc
chi Mimosa. Trong thành phần hoạt chất của loài Mimosa diplotricha C. Wight ex
Sa., các nhóm chất chính đã đƣợc phát hiện là alcaloid, flavonoid, 2-phenoxychrome, diterpenoid, triterpenoid [26] .
- Flavonoid
Flavonoid là nhóm chất đƣợc nghiên cứu nhiều nhất, đa số là các flavon và

flavon glycosid. Isoflavon cũng đƣợc phát hiện trong loài Mimosa diplotricha C.
Wight ex Sa..
Các flavon thƣờng có trong Mimosa diplotricha C. Wight ex Sa. là quercetin
[17]; quercetin-7-methyl ether, apigenin, acacetin [44]; 5’’-methoxyhydrocarpin-D;
7,3’,4’-trihydroxy-3,8-dimethoxy-flavon;

2’-hydroxy-3,7,8,4’,5’-pentamethoxyflavon;

luteolin; 5,3’-di-O-methylluteolin; betulinic acid [26] và các nhóm các hợp chất 5deoxyflavon: diplotrin A (2’,5’-dihydroxy-3,7,8,40-tetramethoxyflavon), diplotrin B (3’-


4
hydroxy-3,7,8,4’-tetramethoxy-flavon),
trimethoxyflavon),

diplotasin

diplotrin

(2’-hydroxy-7,4’,5’-

C

(4-hydroxy-3,10,11-trimethoxyisochromeno-4,3-b-

chromen-7(5H)-on) [26] .
Ngoài các flavon còn có các flavonol nhƣ kaempferol; 4’,6,7-trimethoxy flavonol
[17]; các isoflavonoid nhƣ 4’- O – methylepinumisoflavon, alpinumisoflavon cũng
đã đƣợc phân lập từ phần trên mặt đất loài trinh nữ móc này [24].
Phần glycosid thƣờng là các đƣờng rhamnose, arabinose và glucose gắn vào

các aglycon nhƣ các glycosid là quercetin-3-rhamnosid, quercetin-3-rutinosid, quercetin3,7-dirhamnosid, quercetin-3-O-xylopyranosid; quercetin-3-O-arabinofuranosid [44],
[17] của aglycon quercetin; các glycosid của kaempferol là kaempferol-3-rhamnosid,
kaempferol-3,7-dirhamnosid; luteolin-7-arabinosid [44]; myricetin-3-O-xylopyranosid,
myricetin-3-O-arabinofuranosid [26].
OH

OH

OH

OH
HO

HO

O

O
O
OH

OH
OH

O

OH

O

O
OH
OH

quercetin

quercetin-3-O-xylopyranosid
OH

OH
OH
HO

O

OH
HO

O

O
OH

O

O

OH

H 3C

OH

O

OH

O

O
OH

OH

OH

OH

quercetin-3-O-rhamnopyranosid

quercetin-3-O-arabinofuranosid

Hình 1.1. Quercetin và các glycosid


5

OH

CH3

O

OH

OH

HO

O
HO

OH

O

O

O

O
CH3

5, 3’-dimethoxy-luteolin

luteolin

Hình 1.2. Luteolin và các dẫn chất

OH

OH
OH

HO

O

OH

OH
HO

O

OH

O
OH

O

OH

O

OH

O
OH

O

O
OH

OH

OH

OH

myricetin-3-O-xylopyranosid

myricetin-3-O-arabinofuranosid

Hình 1.3. Các glycosid của myricetin


6
OH
O

CH3

HO

OH

OCH3

H3CO

HO

OCH3

O

OH

O

OCH3
O
O

O

CH3

7,3’,4’- trihydroxy-3,8-dimethoxy-flavon

OCH3

OCH3
H3CO

diplotrin A

O

OH

HO
H3CO

OCH3

O

OCH3

OCH3
O

O

diplotrin B

diplotrin C

OCH3

OCH3

OCH3

OCH3

H3CO

O

H3CO

H3CO

O
OH
OCH3

OH
O

O
diplotasin

2’-hydroxy-3,7,8,4’,5’-pentamethoxyflavon

Hình 1.4. Các hợp chất 5-deoxy-flavon


7
OCH3

OH
H3CO

O

OH

O

H3CO

OH

O

O

O

4’,6,7-trimethoxy-flavonol

alpinumisoflavon
O

HO

O

CH2OH
OCH3

O

OH
OH

O

OCH3

5‖-methoxy hydnocarpin-D
Hình 1.5. Các flavonoid khác
- Dẫn chất phenol: một số hợp chất phenol đã đƣợc tìm thấy trong dịch chiết
cloroform của loài Mimosa diplotricha C. Wright ex Sa. là 4-hydroxy-3,5dimethoxy benzaldehyd; acid 4-hydroxy-3-methoxybenzoic (acid vanillic); 4hydroxy-3-methoxy benzaldehyd (vanillin) [17].
- Các hợp chất triterpenoid: gồm 3 triterpenoid đã đƣợc phân lập lupeol, β amyrin và acid betulinic [26], [24].
- Các hợp chất khác:
Hai hợp chất nhóm lignan (salicifoliol, pinoresinol), dẫn chất coumarin (acid p
- hydroxy coumaric) và sitosterol đƣợc phân lập từ thân loài Mimosa diplotricha C.
Wright ex Sa. [17].
Ngoài ra, một aldol ester của acid béo mới có tên là 17-O-triacontanoyl
heptadecanal cũng đã đƣợc phân lập từ loài này [24].
Tại Việt Nam, đã định tính thành phần hóa học trong loài Mimosa diplotricha
C. Wight ex Sa. thấy có alcaloid, flavonoid, coumarin, acid amin, đƣờng khử, sterol
[12]. Đây là nghiên cứu duy nhất ở Việt Nam về thành phần hóa học của loài


8
Mimosa diplotricha C. Wight ex Sa. và cho đến hiện nay chƣa có nghiên cứu nào ở
Việt Nam về phân lập thành phần hóa học của cây Trinh nữ móc.
1.1.3. Tác dụng dƣợc lý của Mimosa diplotricha C. Wright ex Sa.
- Tác dụng giải lo âu
Trên thế giới chƣa thấy báo cáo tác dụng giải lo âu của trinh nữ móc. Trong
nghiên cứu về tác dụng an thần, đánh giá ban đầu trên dịch chiết nƣớc toàn phần
của loài M. diplotricha C. Wright ex Sa. thu hái ở Quốc Oai- Hà Nội với hai mức
liều 2,4 g/kg và 4,8 g/kg có tác dụng giải lo âu trên chuột và tác dụng này tƣơng

đƣơng với tác dụng của diazepam liều 2 mg/kg [12].
- Tác dụng chống oxy hóa
Các hợp chất trong Mimosa diplotricha C. Wright ex Sa. có tác dụng chống
oxy hóa. Tác dụng này đƣợc chứng minh là do sự có mặt của một số nhóm hợp
chất: flavonoid và lignan. Trong đó, quercetin có tác dụng mạnh hơn quercetin
glucoside; salicifoliol có tác dụng mạnh hơn pinoresinol [17] .
- Tác dụng kháng khuẩn
Cao thô của loài Mimosa diplotricha C. Wright ex Sa. có tác dụng kháng
khuẩn trên 7 loại vi khuẩn (Escherichia coli; Enterobacter aerogenes;
Staphylococcus

aureus;

Pseudomonas aeruginosa; Klebsiella pneumoniae;

Salmonella typhi; Candida albicans) với nồng độ ức chế tối thiểu từ 128-256 μg/ml.
Tác dụng này đƣợc chứng minh là do sự có mặt của hợp chất 17-O-triacontanoyl
heptadecanal cùng với 8 hợp chất đã đƣợc biết đến (β-sitosterol, β-amyrin, lupeol,
4’-O-methylepinumisoflavon,

alpinumisoflavon,

3-O-β-D-glucopyranosyl-sitosterol,

acid betulinic, epirobinetinidol) [24].
- Tác dụng chống ung thƣ
Các hợp chất 5-deoxyflavon (diplotrin A, diplotrin B, diplotrin C, diplotasin
và 5‖- methoxyhydnocarpin-D) đƣợc đánh giá là có tác dụng trên một số dòng tế bào
ung thƣ A549, AGS, HT29, và PC3 ở ngƣời. Trong đó, hợp chất diplotrin B và 5‖methoxyhydnocarpin-D có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào mạnh nhất [26] .

9
1.1.4. Sử dụng loài Mimosadiplotricha C. Wright ex Sa. trong y học cổ truyền
Ở Việt Nam, loài Mimosa diplotricha C. Wright ex Sa. chƣa đƣợc sử dụng làm
thuốc.
Trên thế giới, một số nƣớc đã sử dụng loài Mimosa diplotricha C. Wright ex
Sa. làm thuốc. Ở Formosan, rễ hoặc toàn cây của loài Mimosa diplotricha C. Wright
ex Sa. đƣợc sử dụng nhƣ một loại thuốc truyền thống với các tác dụng: giảm đau,
chống ung thƣ, chống độc, cầm máu, trấn an tinh thần [26]. Ở Cameroon, trong
Dƣợc điển Quốc gia đã sử dụng nƣớc sắc của loài này phối hợp với một số thành
phần khác để điều trị viêm phế quản và hen phế quản. Dịch chiết nƣớc đƣợc sử
dụng nhƣ thuốc sát trùng để súc miệng, làm dịu cơn đau răng [24].
1.2. Tổng quan về lo âu và rối loạn lo âu
1.2.1. Định nghĩa, phân loại
Lo âu bình thƣờng là phản xạ tự nhiên của con ngƣời trƣớc những khó khăn và
các mối đe dọa của tự nhiên, xã hội mà con ngƣời phải tìm cách vƣợt qua, tồn tại,
vƣơn tới. Lo âu là một tín hiệu báo động, báo trƣớc một nguy hiểm sắp xảy đến, cho
phép con ngƣời sử dụng mọi biện pháp để đƣơng đầu với sự đe dọa.
Lo âu bệnh lý là lo âu quá mức hoặc dai dẳng không tƣơng xứng với sự đe dọa
đƣợc cảm thấy, ảnh hƣởng đến hoạt động của ngƣời bệnh, có thể kèm theo những ý
nghĩ hay hành động có vẻ nhƣ quá mức hay vô lý [9].
- Phân loại RLLA:
Theo hệ thống phân loại bệnh tật quốc tế ICD – 10 của Tổ chức Y tế thế giới
(WHO, 2003) và DSM-5TM của Hiệp Hội tâm thần Hoa Kỳ (APA, 2013) thì RLLA
về cơ bản đƣợc chia thành các dạng nhƣ sau [41], [42]:
+ Ám ảnh sợ khoảng trống, bao gồm có hoặc không có rối loạn hoảng sợ.
+ Ám ảnh xã hội (Social phobias).
+ Ám ảnh sợ đặc hiệu/riêng lẻ (Specific phobias).
+ Rối loạn hoảng sợ (Panic disorder, PD).
+ Rối loạn lo âu lan tỏa (Generalized anxiety disorder , GAD).

+ Rối loạn hỗn hợp lo âu và trầm cảm.


10
+ Rối loạn stress sau chấn thƣơng.
1.2.2. Thuốc hóa dƣợc sử dụng trong điều trị rối loạn lo âu
Trong điều trị rối loạn lo âu biện pháp trị liệu tâm lý luôn luôn đi kèm với liệu
pháp hóa dƣợc [9]. Các nhóm thuốc hóa dƣợc chính đƣợc sử dụng trong điều trị rối
loạn lo âu bao gồm: thuốc chống trầm cảm, các benzodiazepin và các chất chủ vận
receptor 5-HT1A của serotonin [3], [35]. Gồm có:
- Các thuốc chống trầm cảm ức chế chọn lọc tái thu hồi serotonin (SSRI):
fluoxetin, paroxetin, fluvoxamin, sertralin, citalopram, escitalopram.
- Các thuốc chống trầm cảm ba vòng: imipramin, clomipramin, doxepin.
- Các benzodiazepin (BZD): diazepam, alprazolam, clorazepam.
- Chất chủ vận từng phần receptor 5-HT1A (buspiron).
1.2.3. Sử dụng dƣợc liệu trong điều trị rối loạn lo âu
Việc sử dụng các thuốc hóa dƣợc trong điều trị RLLA hiện nay khá phổ biến.
Ƣu điểm của các thuốc này là đã đƣợc chứng minh hiệu quả rõ rệt trên lâm sàng.
Tuy nhiên, hạn chế lớn nhất của các thuốc có nguồn gốc hóa dƣợc là các tác dụng
phụ, đặc biệt khi sử dụng kéo dài, khả năng lệ thuộc thuốc, hội chứng cai thuốc xảy
ra khi dừng điều trị và nguy cơ tƣơng tác thuốc bất lợi với nhiều nhóm thuốc khác.
Vì vậy sử dụng các thuốc và sản phẩm có nguồn gốc dƣợc liệu hiện đƣợc coi
là hƣớng tiếp cận bổ sung và thay thế cho các thuốc có nguồn gốc hóa dƣợc trong
điều trị rối loạn lo âu, đồng thời khắc phục những hạn chế của thuốc hóa dƣợc.
Nghiên cứu của Kessler (2001) cho thấy 57% trong số 2055 bệnh nhân có RLLA
đƣợc phỏng vấn cho biết họ đã sử dụng dƣợc liệu trong vòng 12 tháng trở lại để
điều trị các triệu chứng của RLLA [37].
Một số dƣợc liệu đã đƣợc sử dụng trong y học phƣơng Tây cũng nhƣ các
nghiên cứu đánh giá tác dụng điều trị rối loạn lo âu nhƣ:
- Kava Kava (Pipermethysticum G Forst) họ Piperaceae là một loại thực vật

sống ở Thái Bình Dƣơng, rễ đƣợc sử dụng để điều trị lo âu, căng thẳng và bồn chồn.
Ngoài ra Kava Kava còn có tác dụng chống co thắt và giãn cơ, có hiệu quả trong
điều trị lo âu và mất ngủ [39], [40].


11
- Valerian (Valeriana officinalis L.), họ Valeriaceae, còn gọi là cây nữ lang.
Thân và rễ đƣợc sử dụng rộng rãi để điều trị mất ngủ, giải lo âu, an thần. Cơ chế tác
dụng có thể là kết quả của sự tƣơng tác của valerian với receptor GABAA. Acid
valerenic đã đƣợc chứng minh là có tác dụng ức chế enzym GABA-transaminase,
dẫn đến tác dụng an thần [19].
- Cây Rau má (Centella asiatica (L.) Urban), họ Apiaceae, còn gọi là cây Liên
tiền thảo, đã đƣợc sử dụng từ hàng thế kỉ trƣớc trong y học Ayurvedic với công
dụng giải lo âu, làm tinh thần thoải mái, thƣ giãn [16], [47]. Cao cồn ethylic Rau má
đƣợc chứng minh có hoạt tính chống stress, trong đó có stress gây bởi sự tạo loét dạ
dày ở chuột cống trắng, giống nhƣ hoạt tính của diazepam [16]. Dịch chiết methanol
của Rau má ở mức liều 500 mg/kg thể trọng chuột và chất asiaticosid phân lập từ
Rau má với mức liều từ 1-10 mg/kg thể trọng chuột đã đƣợc chứng minh có tác
dụng giải lo âu trong một số mô hình nghiên cứu hành vi trên chuột (mô hình chữ
thập nâng cao - EPM, mô hình môi trƣờng mở - OFT, mô hình tƣơng tác xã hội –
SIT) [47].
- Hoa khô của cây Matricaria recutita L. đƣợc sử dụng nhiều ở châu Âu và
Mỹ để làm trà có tác dụng chống co thắt và an thần. Trong dịch chiết nƣớc có 1 số
hợp chất có tác dụng có ái lực đáng kể với các thụ thể benzodiazepin và trong số đó
đã phân lập và nhận diện đƣợc một chất là 5,7,4-trihydroxyflavone (apigenin).
Apigenin cũng đã đƣợc chứng minh có tác dụng giải lo âu trong thử nghiệm mô
hình chữ thập trên chuột (EPM) [45].
- Lạc tiên (Passiflora spp.), họ Lạc tiên (Passifloraceae), đƣợc sử dụng trong y
học cổ truyền của nhiều nƣớc với tác dụng an thần, giải lo âu, chống co giật và mất
ngủ [16], [27] . Ở châu Âu thƣờng sử dụng hai loài P. coeruela và P.incarnata. Ở

Brasil loài P. eldulis lại đƣợc sử dụng chủ yếu dƣới dạng nƣớc ép quả. Việt Nam
phổ biến với loài lạc tiên P. foetieda [16]. Trên thế giới, đã có rất nhiều nghiên cứu
chứng minh tác dụng an thần giải lo âu của các loài lạc tiên trên các mô hình thực
nghiệm trên động vật [25], [27], [31]. Trong số các thành phần chính của lạc tiên thì
flavonoid đƣợc cho là thành phần có liên quan đến tác dụng trên thần kinh [27].


12
Theo Miguel Coleta và các cộng sự (2006), dịch chiết nƣớc và các flavonoid của lá
loài P. eldulis có tác dụng giải lo âu, trong số đó có luteolin-7-O-(2rhamnosylglucoside) [27]. Một sự tƣơng quan giữa hàm lƣợng flavonoid trong lá P.
eldulis (gồm vitexin, isovitexin, orientin và isooreientin) với tác dụng trên thần kinh
cũng đƣợc De-Paris và các cộng sự chỉ ra [23]. Chrysin đƣợc phân lập từ P.
incarnata cũng đƣợc chứng minh là có tác dụng giải lo âu rõ rệt ở mức liều 1 mg/kg
thể trọng chuột và cơ chế của nó có thể liên quan đến sự kích thích receptor GABAA
[50].
- Cao lá Ginkgo biloba L. (bạch quả) cũng đƣợc chứng minh là có tác dụng
làm giảm triệu chứng ở những bệnh nhân rối loạn lo âu lan tỏa (GAD) [48].
Hƣớng nghiên cứu tác dụng dƣợc lý hƣớng giải lo âu trên các mô hình thực
nghiệm cũng đã bƣớc đầu đƣợc triển khai bởi một số nhóm nghiên cứu trên các
dƣợc liệu hoặc một số công thức phối hợp dƣợc liệu và chế phẩm có nguồn gốc
dƣợc liệu tại Việt Nam. Nguyễn Thị Thu Hƣơng và cộng sự đã xác định đƣợc
majonosid R2 là hoạt chất quan trọng quyết định tác dụng giải lo âu và chống trầm
cảm của nhân sâm do nguyên nhân stress trên chuột [7]. Nhóm nghiên cứu của
Nguyễn Ngọc Khôi, Võ Phùng Nguyên đã áp dụng thành công các mô hình: môi
trƣờng mở, chữ thập nâng cao và ngăn sáng/ tối để đánh giá tác dụng giải lo âu của
các tinh dầu từ vỏ quả cây chi Citrus [1], của phối hợp các dƣợc liệu Rau má, quế
và nhân sâm [14]. Nhóm nghiên cứu Bộ môn Dƣợc lực trƣờng Đại học Dƣợc Hà
Nội cũng đã triển khai mô hình đánh giá tác dụng giải lo âu trên mô hình chữ thập
nâng cao ở chuột bình thƣờng và ở chuột stress do cô lập và đã áp dụng để đánh giá
tác dụng của chế phẩm Sleepy care [10], [11].

13

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Bộ phận trên mặt đất của cây Trinh nữ móc thu hái ở huyện Cẩm Giàng, tỉnh
Hải Dƣơng vào tháng 10, năm 2015. Dƣợc liệu đƣợc rửa sạch, phơi ráo nƣớc, sấy ở
60oC, bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô ráo.
Mẫu dƣợc liệu đƣợc ThS. Nghiêm Đức Trọng, bộ môn Thực Vật, trƣờng đại
học Dƣợc Hà Nội, giám định tên khoa học là Mimosa diplotricha var. diplotricha,
thuộc họ Đậu (Fabaceae). Tiêu bản mẫu đƣợc lƣu tại phòng tiêu bản cây thuốc
trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội, mã số tiêu bản: HNIP/18161/16.

Hình 2.1. Mimosa diplotricha C. Wright ex Sauvalle thu hái ở Hải Dƣơng.
2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu
2.2.1. Hóa chất
- Các thuốc thử thƣờng dùng trong định tính (Dragendorff, Mayer, Bouchardad,
NH3,…); thuốc thử NP/PEG.
- Dung môi: nƣớc cất, diclomethan, methanol, ethyl acetat, n-hexan.
- Diazepam (Biệt dƣợc Seduxen 5 mg của Gedeon Richter, Hungari, pha thành
dung dịch có nồng độ 0,2 mg/ml).
2.2.2. Thiết bị
- Các dụng cụ thí nghiệm thƣờng qui (bình nón, bình gạn, cốc có mỏ, pipet...).


14
- Bản mỏng silicagel GF254 (Merck) pha thƣờng tráng sẵn.
- Bột silicagel pha thƣờng cỡ hạt 40 - 60µm.
- Bột Sephadex LH-20.

- Cột sắc kí, đèn tử ngoại.
- Tủ sấy SELLAB, tủ sấy MODEL UNB 500, máy cất quay Buchi
ROTAVAPOR R-200.
- Cân phân tích Precisa, cân kỹ thuật Satorius.
- Máy xác định độ ẩm Sartorius.
- Máy ảnh Sony.
- Máy đo phổ cộng hƣởng hạt nhân (NMR): Bruker AM 500 FT-NMR
Spectrometer, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam.
- Mô hình chữ thập nâng cao thử tác dụng an thần, bộ môn Dƣợc lực, trƣờng
Đại học Dƣợc Hà Nội.
- Mô hình môi trƣờng mở (OFT), bộ môn Dƣợc lực, Đại học Dƣợc Hà Nội.
- Các dụng cụ bắt giữ động vật, bơm và kim đầu tù để cho động vật uống mẫu
thử.
- Đồng hồ bấm giây, camera quan sát.
2.2.3. Động vật thí nghiệm
Chuột nhắt trắng, chủng Swiss albino khỏe mạnh, 4 tuần tuổi, trọng lƣợng 20 ± 2g
đƣợc cung cấp bởi Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng. Chuột đƣợc chia lô ngẫu nhiên 910 con/lô, nuôi ổn định trong điều kiện thí nghiệm ít nhất 5 ngày trƣớc khi tiến hành
nghiên cứu, uống nƣớc tự do, nuôi bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ
Trung ƣơng cung cấp.
2.3. Nội dung nghiên cứu
- Chiết xuất bộ phận trên mặt đất của Trinh nữ móc bằng phƣơng pháp sắc với
dung môi nƣớc.
- Chiết lỏng – lỏng dịch nƣớc sắc với các dung môi lần lƣợt n-hexan, ethyl
acetat.


15
- Định tính alcaloid, flavonoid trong các phân đoạn dịch chiết.
- Bƣớc đầu phân lập thành phần chính bằng sắc kí cột pha thuận.

- Đánh giá độc tính cấp theo hƣớng dẫn của Bộ Y tế kết hợp với hƣớng dẫn của
OECD.
- Đánh giá tác dụng giải lo âu của dịch nƣớc sắc toàn phần của phần trên mặt
đất cây Trinh nữ móc trên mô hình chữ thập nâng cao.
- Đánh giá ảnh hƣởng của dịch nƣớc sắc toàn phần của phần trên mặt đất cây
Trinh nữ móc tới vận động tự nhiên và khả năng khám phá của chuột trên mô hình
môi trƣờng mở (OFT).
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Chiết xuất, phân lập các chất trong bộ phận trên mặt đất cây Trinh nữ
móc
* Chiết xuất
Chiết xuất bằng phƣơng pháp sắc với nƣớc. Các phân đoạn dịch chiết thu đƣợc
bằng phƣơng pháp chiết lỏng - lỏng với dung môi có độ phân cực tăng dần nhexan, ethyl acetat. Các phân đoạn dịch chiết đƣợc cất thu hồi dung môi tới cắn.
Phần nƣớc còn lại cô đến cắn.
* Định tính các phân đoạn bằng phản ứng hóa học và sắc kí lớp mỏng
- Định tính các phân đoạn bằng phản ứng hóa học [6].
- Định tính các phân đoạn bằng sắc kí lớp mỏng.
+ Dịch chấm sắc kí: Mẫu phân tích đƣợc hòa tan trong methanol.
+ Bản mỏng silicagel GF254 (Merk) tráng sẵn đƣợc hoạt hóa ở 110oC trong 1h.
+ Khai triển với hệ dung môi thích hợp.
+ Hiện màu bằng thuốc thử của từng nhóm chất.
+ Tiến hành: Chấm dich phân tích lên bản mỏng đã hoạt hóa và để nguội,
sấy nhẹ cho khô, đặt bản mỏng vào bình sắc kí đã bão hòa dung môi. Sau khi triển
khai lấy bản mỏng ra khỏi bình, sấy nhẹ cho bay hơi hết dung môi. Quan sát tại các
điều kiện: ánh sáng thƣờng, UV254nm, UV365nm. Sau đó phun thuốc thử. Sau khi phun
thuốc thử, sấy bản mỏng ở nhiệt độ thích hợp và quan sát dƣới ánh sáng thƣờng và
UV254nm, UV365 nm.


16

* Phân lập
Sử dụng phƣơng pháp sắc kí cột rây phân tử và sắc kí cột hấp phụ pha thuận
để phân lập các chất.
- Sắc kí cột rây phân tử [5]
+ Chất nhồi cột: Bột rây phân tử Sephadex LH-20.
+ Dung môi triển khai cột là methanol.
+ Chuẩn bị cột: Cột thủy tinh, đƣờng kính 20 cm, dài 100 cm, có khóa, rửa
sạch, đển khô trên giá theo hƣớng thẳng đứng. Lót một lớp bông vào đáy cột.
+ Nhồi Sephadex vào cột: Cân 30g bột Sephadex LH-20 vào cốc có mỏ,
thêm một lƣợng dƣ methanol, khuấy đều cho tới khi tạo hỗn dịch đồng nhất, để yên
trong 3 giờ cho khối hỗn dịch trƣơng nở hoàn toàn rồi rót vào cột đã chuẩn bị sẵn.
Mở khóa cột, dùng dung môi rửa sạch thành cột, gõ quanh thành cột cho đến khi
chiều cao của cột Sephadex không đổi, mặt thoáng của cột trở nên phẳng và không
còn bọt khí. Cho dung môi chảy đến khi gần sát mặt thoáng thì khóa cột và tiến
hành nạp mẫu.
+ Nạp mẫu: Mẫu đƣợc nạp dƣới dạng dung dịch. Cắn đƣợc hòa tan trong
một lƣợng dung môi tối thiểu đến tan hoàn toàn. Sau đó đƣợc đƣa lên cột bằng cách
cho dung dịch chảy theo thành cột để tránh làm xáo trộn lớp mặt thoáng đến khi
chiều cao của mẫu đạt khoảng 0,8-1cm. Mở khóa cho mẫu thử thấm hết vào đầu cột
rồi nhẹ nhàng nạp methanol vào đầy cột và bắt đầu triển khai cột.
+ Triển khai cột: Để cột chảy nhanh và đều. Hứng dịch rửa giải vào các ống
nghiệm. Sử dụng SKLM để kiểm tra thành phần dịch hứng để gộp các phân đoạn có
nhóm chất cần nghiên cứu. Phần phân đoạn sau khi gộp cất thu hồi dung môi tới
cắn. Cắn đƣợc sử dụng làm mẫu để tiếp tục phân lập bằng sắc kí cột hấp phụ pha
thuận.
- Sử dụng sắc kí cột pha thuận để phân lập các chất [5]
+ Chất nhồi cột: silicagel pha thuận cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm (Merk).


17

+ Dung môi rửa giải: Hỗn hợp đƣợc pha từ các dung môi thƣờng dùng :
diclomethan, methanol, acid formic theo tỉ lệ thích hợp đã đƣợc khảo sát qua
SKLM.
+ Chuẩn bị cột: Cột thủy tinh có khóa , đƣờng kính 1,5 cm, dài 70 cm, rửa
sạch, để khô, cố định trên giá theo phƣơng thẳng đứng. Lót một lớp bông vào đáy
cột.
+ Nhồi cột: Cân 20 g silicagel pha thuận cho vào cốc có mỏ, thêm dung môi
rủa giải rồi khuấy đều cho đến khi hết bọt. Rót hỗn dịch trên vào cột đã chuẩn bị.
Mở khóa cột, rót tiếp dung môi và gõ quanh thành cột cho đến khi chiều cao của cột
silicagel không đổi. Sau đó cho hệ dung môi tiếp tục chảy cho đến khi mực dung
môi còn cách lớp silicagel khoảng 2 mm thì khóa cột và chuẩn bị đƣa mẫu lên cột.
+ Nạp mẫu: Mẫu đƣợc hòa tan trong một lƣợng dung môi tối thiểu đến tan
hoàn toàn sau đó trộn đều với một lƣợng silicagel tối thiểu, đem bốc hơi đến khi thu
đƣợc bột khô tơi rồi rải thành một lớp đều đặn trên bề mặt silicagel trong cột.
+ Rửa giải: Cho hệ dung môi rửa giải thích hợp vào cột đã đƣợc nạp mẫu một
cách nhẹ nhàng sao cho không làm xáo trộn lớp bề mặt. Trong quá trình rửa giải
phải liên tục bổ sung dung môi rửa giải lên cột để đảm bảo dung môi không bao giờ
đƣợc dƣới bề mặt silicagel. Hứng dịch rửa giải vào các ống nghiệm, mỗi ống 1ml.
Kiểm tra dịch rửa giải bằng SKLM để dồn các ống có cùng thành phần. Bay hơi
dung môi để thu đƣợc cắn.
- Kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập bằng 1 số hệ dung môi khai
triển.
* Nhận dạng các chất tinh khiết
Nhận dạng chất phân lập đƣợc từ dữ liệu các phổ: phổ cộng hƣởng từ hạt nhân
1 chiều (1H-NMR), phổ COSY.
2.4.2. Đánh giá độc tính cấp của trinh nữ móc
Phƣơng pháp thử độc tính cấp theo hƣớng dẫn của Bộ Y tế kết hợp với hƣớng
dẫn của OECD [4], [28], [29], [30].