Nghiên cứu đặc điểm thực vật, đặc điểm di truyền và thành phần hóa học của các giống mạch môn ở một số địa phương miền bắc việt nam

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ CẨM VÂN
MSV: 1101596

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,
ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ THÀNH
PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁC GIỐNG
MẠCH MÔN Ở MỘT SỐ ĐỊA PHƯƠNG
MIỀN BẮC VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ CẨM VÂN
MSV: 1101596

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,
ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ THÀNH
PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁC GIỐNG
MẠCH MÔN Ở MỘT SỐ ĐỊA PHƯƠNG
MIỀN BẮC VIỆT NAM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

PGS. TS Trần Văn Ơn
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Thực vật – Trường ĐH
Dược Hà Nội
2. Phòng Kiểm nghiệm Mỹ phẩm –
Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện khóa luận, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ
gia đình, thầy cô và bạn bè.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân
thành tới thầy giáo PGS.TS. Trần Văn Ơn, người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo
tận tình và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy giáo Th.S Phạm Hà Thanh Tùng, DS.
Phạm Thị Linh Giang, toàn thể Thầy cô giáo và các chị kĩ thuật viên Bộ môn
Thực Vật đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện
khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn đến Công ty TNHH MTV Dược Khoa
(DKPharma) đã giúp đỡ em trong việc thu thập mẫu, cũng như hỗ trợ các điều kiện
để em có thể hoàn thành khóa luận.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Phòng Kiểm nghiệm Mỹ phẩm – Viện Kiểm
nghiệm Thuốc Trung ương đã tạo điều kiện giúp đỡ để em hoàn thành khóa luận
đúng hạn.
Cuối cùng, với lòng biết ơn vô hạn, em xin phép được gửi lời cảm ơn tới gia
đình, người thân, bạn bè đã động viên và hỗ trợ em trong suốt thời gian qua.
Do thời gian có hạn và trình độ bản thân còn hạn chế nên khóa luận không thể

tránh khỏi những thiếu sót. Vì vậy, em rất mong nhận được sự chỉ bảo tận tình của
các thầy cô và sự góp ý chân thành của bạn bè.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2016
Sinh viên

Nguyễn Thị Cẩm Vân


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................................... 2
1.1. Đặc điểm của chi Ophiopogon Ker Gawl. ............................................................... 2
1.1.1. Vị trí phân loại ...................................................................................................... 2
1.1.2. Đặc điểm thực vật ................................................................................................. 2
1.1.2.1. Đặc điểm thực vật chi Ophiopogon Ker Gawl............................................... 2
1.1.2.2. Phân biệt chi Ophiopogon và một số chi khác về đặc điểm hình thái và giải
phẫu ............................................................................................................................. 3
1.1.3. Đặc điểm sinh thái và phân bố ............................................................................. 5
1.1.4. Tác dụng dược lý và công dụng của Mạch môn................................................... 5
1.1.4.1. Tác dụng dược lý ........................................................................................... 6
1.1.4.2. Công dụng ...................................................................................................... 6
1.1.5. Đa dạng về di truyền............................................................................................. 7
1.2. Thành phần hóa học của một số loài thuộc chi Ophiopogon Ker Gawl. và
Ophiopogonin D ............................................................................................................... 8
1.2.1. Thành phần hóa học của một số loài thuộc chi Ophiopogon Ker Gawl. .............. 8
1.2.2. Tổng quan về Ophiopogonin D .......................................................................... 11

1.2.2.1. Đặc tính lý hóa ............................................................................................. 11
1.2.2.2. Tác dụng ...................................................................................................... 11
1.2.2.3. Hàm lượng của Ophiopogonin D trong củ Mạch môn ................................ 12
1.3. Phương pháp HPLC – ELSD ................................................................................. 12
1.3.1. Nguyên tắc hoạt động ......................................................................................... 12
1.3.2. Ưu – nhược điểm của detector ELSD................................................................. 13
1.4. Phương pháp mã vạch ADN (ADN Barcoding) và trình tự di truyền đoạn ADN
Ribosom nhân cùng ITS1 – 5.8S – ITS2 của Mạch môn ............................................ 14
1.4.1. Phương pháp mã vạch ADN (ADN Barcoding) ................................................. 14
1.4.2. Trình tự di truyền đoạn ADN ribosom nhân vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 của cây
Mạch môn ..................................................................................................................... 14


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............................. 16
2.1. Nguyên liệu và thiết bị ............................................................................................ 16
2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................................ 16
2.1.2. Dung môi, hóa chất............................................................................................. 16
2.1.2.1. Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu ...................................................................... 16
2.1.2.2. Nghiên cứu thành phần hóa học................................................................... 17
2.1.2.3. Nghiên cứu trình tự rADN vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 .................................. 17
2.1.3. Máy móc, thiết bị ................................................................................................ 17
2.1.3.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật và vi phẫu.................................................... 17
2.1.3.2. Nghiên cứu thành phần hóa học................................................................... 17
2.1.3.3. Nghiên cứu đặc điểm di truyền .................................................................... 18
2.2. Phương pháp nghiên cứu........................................................................................ 18
2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái ........................................................................... 18
2.2.2. Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu và giải phẫu. ....................................................... 18
2.2.3. Nghiên cứu thành phần hóa học ......................................................................... 18
2.2.3.1. So sánh vân tay sắc ký lớp mỏng của các mẫu củ Mạch môn ..................... 18
2.2.3.2. So sánh hàm lượng Ophiopogonin D trong các mẫu củ Mạch môn bằng

phương pháp HPLC – ELSD .................................................................................... 19
2.2.4. Nghiên cứu trình tự di truyền ............................................................................. 22
2.2.4.1. Tách chiết ADN toàn phần .......................................................................... 22
2.2.4.2. Khuếch đại ADN (PCR) .............................................................................. 23
2.2.4.3. Điện di ADN trên bản gel agarose 1% ........................................................ 24
2.2.4.4. Giải trình tự ADN ........................................................................................ 24
2.2.4.5. So sánh trình tự ADN .................................................................................. 24
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ............................................ 25
3.1. Đặc điểm thực vật của các mẫu Mạch môn .......................................................... 25
3.1.1. Đặc điểm hình thái.............................................................................................. 25
3.1.1.1. Đặc điểm hình thái mẫu M1 ........................................................................ 25
3.1.1.2. Đặc điểm hình thái mẫu M2 – M6 ............................................................... 26
3.1.2. Đặc điểm giải phẫu ............................................................................................. 27
3.2. Đặc điểm vân tay sắc ký lớp mỏng của các mẫu Mạch môn ............................... 29
3.3. Định lượng Ophiopogonin D trong các mẫu Mạch môn ..................................... 29


3.3.1. Khảo sát chương trình sắc ký ............................................................................. 29
3.3.1.1. Khảo sát chương trình rửa giải pha động chạy sắc ký ................................. 30
3.3.1.2. Khảo sát nhiệt độ ống bay hơi ..................................................................... 30
3.3.2. Đánh giá phương pháp phân tích ........................................................................ 32
3.3.2.1. Đánh giá tính thích hợp của hệ thống .......................................................... 32
3.3.2.2. Khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp ..................................................... 32
3.3.2.3. Xác định khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn .............................. 33
3.3.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và định lượng (LOQ) của phương pháp ............ 33
3.3.2.5. Đánh giá độ lặp lại của phương pháp .......................................................... 34
3.3.2.6. Đánh giá độ đúng của phương pháp ............................................................ 35
3.3.3. Định lượng Ophiopogonin D trong các mẫu Mạch môn .................................... 35
3.4. So sánh trình tự ADN vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 ................................................... 36
3.4.2. Khuếch đại ADN (PCR) ..................................................................................... 36

3.4.3. Giải và so sánh trình tự ADN ............................................................................. 37
3.5. Bàn luận ................................................................................................................... 38
3.5.1. Về đặc điểm thực vật .......................................................................................... 38
3.5.1.1. Về đặc điểm hình thái .................................................................................. 38
3.5.1.2. Về vi phẫu lá, rễ ........................................................................................... 41
3.5.2. Về đa dạng di truyền vùng IST1 – 5.8S – ITS2 ................................................. 41
3.5.3. Về thành phần hóa học ....................................................................................... 42
3.5.3.1. Vân tay sắc ký lớp mỏng ............................................................................. 42
3.5.3.2. Hàm lượng Ophiopogonin D ....................................................................... 42
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu
ADN
AOAC
BOLD
bp
dNTP
EDTA
ELSD
ER
ERK
g
HPLC
HUVECs
ICH
ITS

LOD
LOQ
matK
NF – κB
O.
OPD
PCR
psbA-trnH
rbcL
rADN
RSD
SD
SHTB
trnL – F
TLC
USFDA
UV
v:v

Cụm từ đầy đủ
Deoxyribonucleic acid
Association of Official Analytical
Community
Barcode of Life Database
Base pairs
Deoxyribonucleotide triphotphates
Ethylenendiaminetetraacetic acid
Evaporative Light Scattering Detector
Endoplasmic – reticulum
Extracellular signal – regulated kinase

gam
High performance Liquid
Chromatography
Human Umbilical Vein Endothelial
Cells
International Conference on
Harmonization
Internal transcribed spacer
Limit of detection
Limit of quantification
Maturase K
Nuclear Factor – kappa B
Ophiopogon
Ophiopogonin D
Polymerase chain reaction
Ribulose bisphosphate carboxylase
Ribosomal ADN
Relative standard devition
Standard deviation

Thin layer chomatography
Food and Drug Administration
Ultraviolet

Giải thích
Hiệp hội cộng đồng phân
tích chính thức
Cặp base

Detector tán xạ bay hơi

Mạng lưới nội chất
gam
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Tế bào nội mạc tĩnh mạch
rốn của người
Hội đồng hòa hợp quốc tế
Vùng phiên mã nội
Giới hạn phát hiện
Giới hạn định lượng
gen lục lạp
Yếu Tố Nhân kappa B
Ophiopogonin D
Phản ứng khuếch đại gen
ADN lục lạp
ADN lục lạp
ADN ribosom
Độ lệch chuẩn tương đối
Độ lệch chuẩn
Số hiệu tiêu bản
ADN lục lạp
Sắc ký lớp mỏng
Cục quản lý thuốc và thực
phẩm Hoa Kỳ
Tia cực tím
Tỷ lệ về thể tích


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

Bảng 1.1

Đặc điểm của ba chi Ophiopogon, Liriope, Peliosanthes

3

Bảng 1.2

Đặc điểm phân biệt Liriope và Ophiopogon theo Guy L. Nesom

4

Bảng 1.3

Một số flavonoid có trong rễ củ Ophiopogon japonicus

9

Bảng 1.4

Một số saponin có trong rễ củ Ophiopogon japonicus

10

Bảng 2.1

Ký hiệu, nguồn gốc và mã số tiêu bản của các mẫu nghiên cứu

16

Bảng 2.2

Các thành phần cơ bản của phản ứng PCR

23

Bảng 3.1

Đặc điểm khác biệt của các mẫu từ M2 – M6

27

Bảng 3.2

Đặc điểm sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng của các mẫu

29

Bảng 3.3

Khảo sát các chương trình của pha động

31

Bảng 3.4

Khảo sát nhiệt độ ống bay hơi

30

Bảng 3.5

Đánh giá tính thích hợp của hệ thống

32

Bảng 3.6

Sự phụ thuộc vào diện tích pic sắc ký vao nồng độ Ophiopogonin D

33

Bảng 3.7

Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

34

Bảng 3.8

Độ lặp lại của phương pháp trên mẫu M3

34

Bảng 3.9

Độ thu hồi chuẩn trong quá trình phân tích

35

Bảng 3.10

Kết quả đo nồng độ Ophiopogonin D trong các mẫu

36

Bảng 3.11

Khảo sát thành phần tham gia phản ứng khuếch đại ADN của M1

37

Bảng 3.12

Mã số lưu trữ trên Genbank của các mẫu nghiên cứu

37

Bảng 3.13

Đặc điểm phân biệt loài Liriope gramifolia và Liriope spicata

39

Bảng 3.14

Đặc điểm phân biệt O. longifolius và O. japonicus

39


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

Hình 1.1

Ophiopogonin D

11

Hình 1.2

Cấu tạo của detector ELSD

13

Hình 1.3

Cấu trúc của vùng rADN – ITS và các mồi thường sử dụng

15

Hình 3.1

Đặc điểm hình thái của mẫu M1

25

Hình 3.2

Đặc điểm hình thái của mẫu M2

26

Hình 3.3

Đặc điểm giải phẫu của rễ M2

28

Hình 3.4

Đặc điểm giải phẫu của lá M2

28

Hình 3.5

Kết quả sắc ký quan sát ở bước sóng 254

29

Hình 3.6

Sắc ký đồ biểu diễn độ đặc hiệu của phương pháp

32

Hình 3.7

Tương quan giữa nồng độ Ophiopogonin D và diện tích pic

33

Hình 3.8

Sắc ký đồ của mẫu M3 khi pha loãng bốn lần

34

Hình 3.9

Kết quả tách chiết ADN

36

Hình 3.10 Kết quả PCR

36

Hình 3.11 Kết quả khảo sát chương trình khuếch đại ADN của M1

37

Hình 3.12 So sánh trình tự ADN vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 của mẫu
nghiên cứu với dữ liệu lưu trữ trong Genbank
Hình 3.13 Đặc điểm thân rễ của hai loài O. longifolius và O. japonicus

38

Hình 3.14 Tiêu bản loài Liriope graminifolia

40

Hình 3.15 Tiêu bản loài Ophiopogon longifolius

40

Hình 3.16 So sánh trình tự ADN vùng IST1 – 5.8S – ITS2 của các mẫu

41

39


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, ở một số tỉnh trung du, miền núi phía Bắc, cây
Mạch môn được người dân xem là cây trồng đa mục đích, có thể trồng xen dưới
tán các loại cây trồng lâu năm để bảo vệ và cải tạo đất, làm cảnh và cho thu nhập
cao. Củ Mạch môn là vị thuốc chính trong nhiều bài thuốc cổ truyền của Việt

Nam và Trung Quốc, thường được sử dụng để chữa ho khan, viêm họng, lao
phổi, thổ huyết, chảy máu cam, hen phế quản, khó ngủ, trong các bệnh về tim
mạch, cao huyết áp, xơ vữa động mạch,…[2], [5], [8], [47].
Trong quá trình trồng và sử dụng Mạch môn, người ta thấy có sự tương đồng
về hình thái của thân, lá hoặc củ của cây Mạch môn với một số loài thuộc chi
khác như Liriope, Peliosanthes, Aspidistra. Việc này dẫn đến việc rất nhiều loài
khác nhau được dân gian trồng với tên gọi “Mạch môn” cũng như trên thị trường
cũng xuất hiện nhiều loại củ với tên gọi chung là “Mạch môn”. Một vấn đề được
đặt ra là cần phân biệt được các mẫu Mạch môn được trồng trong cộng đồng về
đặc điểm thực vật, đặc điểm di truyền, thành phần hóa học cũng như chất lượng
của chúng.
Từ lý do trên, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, đặc điểm di truyền và
thành phần hóa học của các giống Mạch môn ở một số địa phương miền Bắc
Việt Nam” được thực hiện với các mục tiêu sau:
1. Phân biệt các loại Mạch môn dựa trên đặc điểm thực vật, trình tự di truyền
và vân tay sắc ký lớp mỏng.
2. Xác định hàm lượng Ophiopogonin D trong củ của các mẫu Mạch môn.


2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm của chi Ophiopogon Ker Gawl.
1.1.1. Vị trí phân loại
Theo hệ thống phân loại thực vật bậc cao của Takhtajan A.L. (1996), vị trí
của chi Ophiopogon Ker Gawl. trong hệ thống phân loại được sắp xếp như sau:
Giới: Thực vật – Plantae
Ngành: Ngọc lan – Magnoliophyta
Lớp: Hành – Liliopsida
Bộ: Hoa loa kèn – Liliales

Họ: Mạch môn – Convallariaceae
Chi: Mạch môn – Ophiopogon
Chi Ophiopogon Ker Gawl. là một trong 12 chi thuộc họ Convallariaceae
Horan. Theo tài liệu được công bố mới nhất, chi Ophiopogon bao gồm 67 loài và
28 thứ [63]. Ở Việt Nam, chi Ophiopogon đã được mô tả trong Thực vật chí Việt
Nam, tập 8 bao gồm 15 loài, 1 thứ và 1 dạng [3].
1.1.2. Đặc điểm thực vật
1.1.2.1. Đặc điểm thực vật chi Ophiopogon Ker Gawl.
Theo tác giả Nguyễn Thị Đỏ (2007) [3], chi Ophiopogon có các đặc điểm
thực vật như sau: Cây cỏ nhiều năm. Thân rễ mập hay mảnh, mọc trườn và có
thể phân nhánh. Rễ chùm dạng sợi, đôi khi rễ chùm nổi lên mặt đất thành rễ
chống, có lông phủ hoặc không. Thân trên mặt đất mọc đơn độc hoặc mọc thành
cụm, có đốt hoặc không. Lá mọc tập trung ở ngọn. Lá có cuống hoặc không;
phiến lá hình dải, hình mũi giáo, hình trứng hoặc hình tim, chất dai, mỏng. Hoa
mọc đơn độc hoặc tập hợp thành cụm hoa chùm, bông, mọc ở đầu cành hoặc
nách lá. Hoa nhỏ, đều, lưỡng tính. Bao hoa 6 hoặc 4 mảnh, một số ít có 9 mảnh,
rời hoặc phần dưới dính nhau thành ống, hình chuông, phần trên có 6 thùy, xếp 2
vòng, bằng nhau hoặc gần bằng nhau. Nhị 6, một số ít 4 hoặc 8 đính ở gốc mảnh
bao hoa hoặc trên vòng tràng phụ hoặc trên họng ống bao hoa, thò ra ngoài hoặc


3

ẩn trong bao hoa; chỉ nhị rời, dạng sợi hoặc dạng bản dính liền nhau thành một
vòng; trung đới không kéo dài hoặc kéo dài thành dạng mào; bao phấn đính gốc
hoặc đính lưng, 2 ô, hướng trong, mở dọc. Bầu trên hoặc bầu giữa, 3 hoặc 4 ô,
mỗi ô có 2 hay nhiều noãn; vòi nhụy dạng cột hoặc sợi, mảnh, một số ít gần như
không có; núm nhụy dạng đầu, đĩa hoặc chia 3 thùy. Quả mọng, vỏ quả dai, một
số nứt trước khi chín để lộ hạt ra ngoài. Hạt 1 hoặc nhiều, một số ít mọng nước,
hình cầu, hình trứng, nội nhũ to, phôi nhỏ hơn.

1.1.2.2. Phân biệt chi Ophiopogon và một số chi khác về đặc điểm hình thái và
giải phẫu
 Sự khác biệt về đặc điểm hình thái
Tác giả Nguyễn Thị Đỏ trong Thực vật chí Việt Nam đã chỉ ra rằng nhiều
loài trong chi này có hình dạng bên ngoài rất dễ nhầm với một số loài trong chi
Aspidistra, Liriope, Peliosanthes nếu mẫu không có hoa [3]. Đặc biệt, sự tương
đồng về hình thái của ba chi Ophiopogon, Liriope, Peliosanthes đã được rất
nhiều tác giả bàn luận, thậm chí có những tác giả còn cho ý kiến về việc gộp ba
chi này thành một chi [22], [25], [44], [56]. Các đặc điểm của ba chi được tóm
tắt trong Bảng 1.1.
Bảng 1.1. Đặc điểm của ba chi Ophiopogon, Liriope, Peliosanthes
Đặc
điểm
Rễ

Ophiopogon

Liriope

Peliosanthes

Các loài trong cả ba chi đều có thân rễ ngắn, dày với các sợi, đôi
khi mọng nước.
Lá
Thường hẹp, có khi giống như cỏ; tuy Chiều rộng khoảng 8 – 60
nhiên với lá của loài O. dracaenoides mm, có thể lên tới 85 mm,
có thể rộng đến 50 mm
có hình mũi giáo
Cụm hoa
Chùm, bông hoặc hỗn hợp

Hoa
Hoa rủ xuống, Hoa mọc hướng Hoa hướng lên trên hoặc
bao hoa rời, thẳng đứng, hướng uốn ngược lại, bao hoa
bầu giữa, chỉ lên trên, bao hoa dính nhau, bầu giữa, chị
nhị tự do
rời, bầu trên, chỉ nhị nhị dính nhau thành hình
tự do
chuông
Quả
Nang
Nang
Mọng


4

Các đặc điểm về hình thái ít có sự khác biệt giữa Liriope và Ophiopogon.
Một số loài có sự tương đồng về hình thái giữa hai chi và dẫn đến sự tranh cãi
của các nhà khoa học khi đưa các loài này vào hệ thống phân loại thực vật.
Maximowicz đã gộp cả hai chi Liriope và Ophiopogon lại thành Ophiopogon,
tuy nhiên, ý kiến này không được đông đảo các tác giả đồng thuận [30]. Bailey
khi bàn luận về lịch sử của hệ thống phân loại của các chi đã cho rằng không có
sự chắc chắn về sự tồn tại riêng biệt giữa hai chi này [12]. Guy L. Nesom đã dựa
vào đặc điểm của hoa và quả để phân biệt hai chi này [35]. Những đặc điểm này
được trình bày cụ thể trong Bảng 1.2.
Bảng 1.2. Đặc điểm phân biệt Liriope và Ophiopogon theo Guy L. Nesom
Liriope

Ophiopogon

Hoa thẳng đứng, nằm ở phần
cuối cùng của cuống hoa, tràng
hoa xếp xen kẽ; bầu trên; bao
phấn tự do, thuôn dài, đỉnh tù, nứt
ở đỉnh, chỉ nhị dài hơn hoặc bao
phấn; đầu nhụy liền thành một
khối; quả màu đen.

Hoa rũ xuống, trên một cuống hoa/ống
hoa uốn ngược, tràng hoa hình chuông; bầu
dưới hoặc bầu giữa; bao phấn đồng sinh,
hình mũi mác hẹp, đỉnh nhọn và hẹp, nứt
dọc, chỉ nhị ngắn hơn nhiều so với bao
phấn; đầu nhụy chia làm 3 thùy; quả
thường màu xanh, đen.

Ở Việt Nam, tác giả Nguyễn Thị Đỏ đã phân biệt hai chi này dựa vào đặc
điểm của bầu và chỉ nhị, trong đó Liriope có chỉ nhị dài hơn hoặc bằng bao phấn
và bầu trên còn Ophiopogon thì chỉ nhị ngắn hơn bao phấn nhiều và bầu giữa
[3].
 Sự khác biệt về đặc điểm giải phẫu
Về đặc điểm giải phẫu của các bộ phận của các loài của các chi này cũng đã
được nhiều tác giả nghiên cứu, tuy nhiên chưa có một nghiên cứu nào nghiên
cứu đầy đủ cho tất cả các loài của các chi trên [16], [17]. Các kết quả nghiên cứu
cho thấy có sự khác biệt giữa các chi về đặc điểm của các lỗ khí trên bề mặt lá,
hình thái và hướng quay của các bó libe – gỗ trong vi phẫu lá.


5

Năm 1992, Cutler đã nghiên cứu so sánh về đặc điểm thực vật, giải phẫu lá
giữa ba chi trên [16]. Ông cũng đồng ý quan điểm với Jessop [22] về sự khác
biệt của 3 chi về sự phân phối các tế bào lỗ khí và sự xuất hiện các nhú xung
quanh lỗ khí ở biểu bì dưới của lá: các tế bào lỗ khí có mật độ dày đặc, có các
nhú xung quanh đối với Ophiopogon và Liriope; còn với Peliosanthes thì mật độ
các tế bào lỗ khí thưa thớt hơn và không có các nhú xung quanh. Ông cũng nhận
thấy có sự khác biệt về sự định hướng của các bó mạch trong vi phẫu lá của các
chi. Phần lớn các loài có bó mạch ngoài cùng xoay 90o so với trục, và đỉnh libe
hướng ra biên, trừ các loài thuộc chi Peliosanthes và O. latfolius thì góc quay
này khá nhỏ (chỉ lên tới 45o), các bó mạch có đỉnh gỗ hơi hướng về bó mạch bên
cạnh. Ở hai chi Ophiopogon và Liriope, các bó mạch có kích thước lớn, và có sự
quay về phía trục của các cực gỗ trong các bó mạch, trong khi ở chi Peliosanthes
lại có một bó mạch nhỏ ở dưới biểu bì, có cấu trúc xoay ngược lại với các bó
mạch khác.
1.1.3. Đặc điểm sinh thái và phân bố
Cây mọc riêng lẻ hay thành từng bụi trên đất ẩm, nhiều mùn, thích hợp với
nơi ẩm và bóng, thường mọc dưới tán rừng kín, rừng tre nứa, trên núi đất hoặc
núi đá granit ở độ cao 800 – 1300 mét so với mặt nước biển. Cây ra hoa và quả
hàng năm, tái sinh bằng hạt. Thời kỳ ra hoa vào khảng tháng 6 – 7, quả tháng 9 –
12 [49].
Chi Ophiopogon có sự phân bố rải rác từ vùng ôn đới ấm đến vùng nhiệt đới
thuộc khu vực Đông Á và Đông Nam Á, trong đó tập trung nhiều ở Đông Nam
Á [3], [10], [13].
Ở Việt Nam, Mạch môn được trồng ở một số nơi để lấy củ làm thuốc như
Phùng (Hà Tây), Nghĩa Trai (Hưng Yên), Ninh Hiệp (Hà Nội), Phú Thọ [5].
1.1.4. Tác dụng dược lý và công dụng của Mạch môn


6

1.1.4.1. Tác dụng dược lý [8]
Thuốc có tác dụng tăng huyết lượng động mạch vành, bảo vệ bệnh thiếu
máu cơ tim, cải thiện lực co bóp cơ tim và chống rối loạn nhịp tim, trên thực
nghiệm, thuốc còn có tác dụng an thần.
Trên thực nghiệm, tiêm bắp cho thỏ nước sắc Mạch môn làm tăng đường
huyết, nhưng cũng có báo cáo nói hạ đường huyết.
Thuốc có tác dụng ức chế mạnh tụ cầu, trực khuẩn đại trường, trực khuẩn
thương hàn.
Tác dụng kháng khuẩn: Bột Mạch môn có tác dụng ức chế Stapylococus
albus và E. Coli.
Tác dụng nội tiết: Dùng nước sắc hoặc cồn chiết xuất Mạch môn pha vào
dịch truyền chích cho thỏ, thấy đảo Langerhans phục hồi nhanh, tăng lưọng dự
trữ glycogen so với lô đối chứng.
Tác dụng chống viêm: Tác dụng chống viêm rõ rệt đối với viêm cấp tính và
mạn tính. Dịch chiết với ethanol của Mạch môn thí nghiệm trên chuột cống trắng
gây phù chân bằng carragenin có tác dụng ức chế phù.
1.1.4.2. Công dụng [2], [5], [8]
Rễ củ Mạch môn được dùng để chữa ho khan, viêm họng, lao phổi nóng ấm
ỉ về chiều, sốt cao, tâm phiền khát nước, thổ huyết, khái huyết, chảy máu cam,
hen phế quản, khó ngủ. Ngoài ra, Mạch môn còn được dùng để lợi tiểu và chữa
thiếu sữa, điều hòa nhịp tim khỏi hồi hộp, chữa táo bón, lở ngứa.
Trong y học Trung Quốc, rễ củ Mạch môn thường được dùng trị các bệnh về
tim mạch, cao huyết áp, xơ vữa động mạch, loạn thần kinh mạch máu, loạn thần
kinh thực vật, khí hư và mất ngủ. Mạch môn còn được dùng phối hợp với các
dược liệu khác trị viêm dây thần kinh.
Ở Ấn Độ những rễ củ có chất nhầy của Mạch môn có thể ăn được và được
dùng thay thế Nhân sâm.


7

Ở các nước Campuchia, Lào, rễ củ Mạch môn được dùng làm thuốc chữa sốt
và lợi sữa, trị viêm phổi và một số bệnh về gan, thận và ruột.
1.1.5. Đa dạng về di truyền
Các nghiên cứu trước đây đã cho thấy có sự đa dạng về dữ liệu di truyền
giữa các loài và giữa các chi Ophiopogon, Liriope, Peliosanthes.
Nghiên cứu về nhiễm sắc thể của Ophiopogon cũng cho thấy sự đa dạng
giữa các loài này. Tổng số nhiễm sắc thể đã được báo cáo cho khoảng 45 loài
Ophiopogon. Số cặp nhiễm sắc thể cơ bản: x = 18 là phổ biến trong hầu hết các
loài, và x = 17 chỉ có ở một số loài đại diện như O. clarkei Hook. f., O.
intermedius D. Don, O. japonicus (L. f.) Ker Gawl., O. ohwii (L. f.) Ker Gawl.,
và loài O. umbraticola Hance [51]. Ngoài ra, số lượng nhiễm sắc thể của loài
còn có thể rất khác so với những loài khác trong cùng chi như: O. variegatum
(2n = 38) [46], O. clarkei (2n = 38) [45] và O. japonicus (2n = 67) [55]. Phần lớn
là nhiễm sắc thể tồn tại dạng lưỡng bội, ngoại trừ 12 loài đa bội [51], [60].
Nghiên cứu của Wang và cộng sự (2013) cũng đã chỉ ra rằng có sự khác biệt về
kích thước của các nhiễm sắc thể giữa các loài chi Ophiopogon (4,77 µm ở O.
chingii var. glaucifolius và 1,66 µm ở O. bodinieri var. pygmaeus) [51].
Năm 2014, Wang. và cộng sự đã sử dụng dữ liệu trình tự ADN có nguồn gốc
từ vùng phiên mã nội (ITS) và một số ADN vùng lục lạp (psbA – trnH, matK,
rbcL, và trnL – F) để phân tích sự đa dạng loài một cách toàn diện của chi
Ophiopogon. Trong nghiên cứu này, ADN được tách bằng phương pháp CTAB
của Doyle and Doyle (1987) và kit tách ADN thực vật (Bioteke, Bắc Kinh,
Trung Quốc). Tác giả đã đưa ra hệ thống dữ liệu ADN của 91 mẫu lấy từ 43 loài
thuộc cả ba chi và mối quan hệ về loài giữa chúng. Kết quả của nghiên cứu
tương đối đồng nhất với các kết quả nghiên cứu trước đây về sự phân loại giữa
ba chi về đặc điểm thực vật và giải phẫu. Ông đề nghị nên giữ cả ba chi
Ophiopogon, Peliosanthes và Liriope [19].

8

Michiho Ito và cộng sự (2015) đã tiến hành so sánh ADN của các mẫu thuộc
hai chi Ophiopogon và Liriope ở Nhật Bản. Kết quả nghiên cứu cho thấy không
có sự khác biệt giữa hai chi về dữ liệu vùng ITS nhưng lại có sự khác biệt về dữ
liệu vùng rbcL giữa hai chi này. Ông cho rằng có thể dùng dữ liệu vùng rbcL để
phân biệt sản phẩm của hai chi này khi bị dùng lẫn trên thị trường [32].
Ở Việt Nam, cho đến nay, chúng tôi chưa tìm thầy tài liệu nào công bố về dữ
liệu di truyền chi Ophiopogon.
1.2. Thành phần hóa học của một số loài thuộc chi Ophiopogon Ker Gawl.
và Ophiopogonin D
1.2.1. Thành phần hóa học của một số loài thuộc chi Ophiopogon Ker Gawl.
Các công trình nghiên cứu về hóa học chi Ophiopogon được bắt đầu từ
những năm 1960. Đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về hóa học của
chi này. Những nghiên cứu này chủ yếu tập trung vào loài Ophiopogon
japonicus, còn số ít còn lại nghiên cứu về các loài khác.
Thành phần hóa học chính của loài Ophiopogon japonicus gồm có: saponin
steroid, homoisoflavonoid, ngoài ra còn có các thành phần khác như
polysaccharid, sesquiterpen, sitosterol, stigmasterol,… [2], [5], [8], [33], [36],
[37], [47], [57] (Bảng 1.3 và 1.4).
Một số loài khác như Ophiopogon ohwii và Ophiopogon jaburan cũng được
xác định có các hợp chất homoisoflavonoid [52].


9

Bảng 1.3. Một số homoisoflavonoid có trong rễ củ Ophiopogon japonicus
HO

O

CH3

O
HO

H3C

O

O

O
OH

OHC

O

Ophiopogonanon A
HO

O

O
OH

O

6 – formyl – isoophiopogonanon A

OCH3

CH3
HO

O

O

H3C
OH

OHC

O

OH

Ophiopogonanon B

CH3
O

H3C
OH

O

HO

O

H3C

O

Methylophiopogonanon A

H3C

HO

O

OHC

O

OH

O

OH

OCH 3

O

6 – formyl – isoophiopogonanon B

CH3

OCH 3
O

H3C
OH

O
O

2 – hydroxy – methylophiopogonon
A

O

Methylophiopogonanon B
HO

O

CH3
O

OH

O

OH

CH3
HO

O

6 – aldehydro – isoophiopogonon A

CH3
HO

O

O

HO

O

H3C

O

Methylophiopogonon A

O

OH

O

OCH 3

OH

Ophiopogonanon E


10

Bảng1.4. Một số saponin có trong rễ củ Ophiopogon japonicus
H3C
Rha(OCOCH 3 )
Xyl

fruc

CH 3

O

H 3C

CH 3

O

O

OH

CH3

O

CH3

O

CH3

CH 3
O

Glu
Xyl

HO

Ophiopogonin E

Ophiopogonin A
H3C

O

CH3
fruc

Rha

CH3

.

CH 3

O

H. O
O

O

O

.

CH3
Glu

Xyl

HO

O

Rha(OCOCH

3)

Ophiopogonin B
Ophiopojaponin A
H 3C

CH 3

O

Glu
O

CH 3

.

CH 3

OH

O
.

CH 3

O
.

(Glu)

2

O

OH

Fruc

Glu

Rha

H 3C

O

CH 3

O

Ophiopojaponin B

Ophiopogonin C
CH 3

.
H. O

O

CH 3

O

Rha

Glu

rha

H3C
Xyl
Rha

O

CH3

O

CH3

O

CH3

OH
O

Ophiopojaponin C

Ophiopogonin C’
fruc

CH3

.
Xyl

Glu

O

.
H. O

O

O

O
CH3

.
OH

HO

Rha

Ophiopogonin D

H3C
CH3

Glu

O

Ophiopojaponin D
O

CH3

H 3C
CH3

O

CH3

Glu

O

OH

CH3
Xyl

O

OH

O

HO

Rha

Ophiopogonin D’

Ophiogenin

Ghi chú: Fruc: Fructose, Glu: Glucose, Rha: Rhamnose, Xyl: Xylose.

CH3


11

1.2.2. Tổng quan về Ophiopogonin D
Ophiopogonin D là một saponin steroid có trong củ của các loài thuộc chi
Ophiopogon, được phát hiện ở loài Ophiopogon japonicus vào năm 1968 bởi
Kato và cộng sự [24]. Tuy nhiên, đến năm 1973 cấu trúc của chất mới được làm
sáng tỏ bởi Akihiro Tada và cộng sự [48].
1.2.2.1. Đặc tính lý hóa
Ophiopogonin D có công thức phân
H3C
Xyl
Rha

fruc

CH3

O
O

O

CH3

tử là C44H70O16.4H2O, góc quay cực
[α]14D = -107,9o (dung môi pyridin).

CH3

Ophiopogonin D là một ruscogenin
HO

Hình 1.1. Ophiopogonin D

triglycosid với các phân tử đường là D –
fructose, L – rhamnose và D – xylose
[48].

1.2.2.2. Tác dụng
Ophiopogonin D được cho là một trong những thành phần có hoạt tính trong
củ Mạch môn. Theo kết quả nghiên cứu của Su Hyun Park và cộng sự (2014),
Ophiopogonin D có khả năng làm tăng PMA – một sản phẩm được làm ra từ
mucin, qua đó gợi ý đến Ophiopogonin D có khả năng làm kích thích sản xuất

mucin đường thở (mucin là một trong những thành phần chính của chất nhày do
niêm mạc đường hô hấp tiết ra, có vai trò ngưng kết các hạt bụi, vi khuẩn, vi
rút… và tạo môi trường thuận lợi cho hoạt động của transferrin, globulin,
lysozym… ngoài ra chúng còn giúp ngăn sự tiếp xúc giữa các chất kích thích hít
vào với niêm mạc đường thở) [40]. Ophiopogonin D được nghiên cứu là có tác
dụng chống viêm [8], [15], [26]. Đây có thể là một căn cứ của việc sử dụng củ
của Ophiopogon japonicus để chữa các bệnh liên quan đến viêm phổi trong dân
gian và Y học cổ truyền.
Các nghiên cứu gần đây cho thấy, Ophiopogonin D còn có tác dụng lên tim
mạch. Ophiopogonin D ngăn chặn H2O2 – yếu tố oxi hóa gây tổn thương nội
mạc mạch máu – một trong những nguyên nhân gây nên các bệnh về tim mạch.


12

Trong nghiên cứu của mình, Qian và cộng sự (2010) đã chứng minh được tác
dụng ức chế của Ophiopogonin D đối với H2O2 được sinh ra khi làm tổn thương
các tế bào nội mạc tĩnh mạch rốn của người (HUVECs). Nó ức chế theo liều lên
mARN của các gen quy định các chất chống oxy hóa, gây viêm, và gen quy định
quá trình chết theo chu trình của tế bào ở HUVECs. H2O2 – được sinh ra từ quá
trình peroxid hóa lipid, carbonyl hóa protein, các phản ứng oxy hóa trong ty thể
và quá trình chết theo chu trình của tế bào, đều giảm khi điều trị bằng
Ophiopogonin D. Hơn nữa Ophiopogonin D còn khôi phục hoạt tính của các tế
bào chống oxy hóa và ức chế sự giải phóng của các cytokin gây viêm, ngăn chặn
hoạt động của NF – κB và ERK [42]. W. You và cộng sự (2016) qua nghiên cứu
của mình cũng đã kết luận rằng Ophiopogonin D là một chất có khả năng cung
cấp lợi ích trị liệu khi điều trị các bệnh tim mạch liên quan đến rối loạn của cân
bằng nội môi của Ca 2+ và stress ER [58].
Ngoài ra, Ophiopogonin D còn được nghiên cứu là có tác dụng chống loãng
xương, chống ung thư, chống lại sự di căn của khối u, tác dụng chống đông máu

[21], [27], [47], [61]. Ophiopogonin D còn được chứng minh tác dụng trên
invitro và invivo về hạn chế độc tính trên tim mạch của doxorubixin – một trong
những hóa trị liệu điều trị ung thư [62].
1.2.2.3. Hàm lượng của Ophiopogonin D trong củ Mạch môn
Hàm lượng Ophiopogonin D trong củ của Ophiopogon japonicus khá dao
động, phụ thuộc vào nhiều yếu tố như địa điểm trồng, thời điểm thu hái, các bảo
quản, chế biến, phương pháp chiết tách,…
Ophiopogonin D đã được phân lập từ củ của loài Ophiopogon japonicus với
lượng là 5,7 mg từ 9,7 kg nguyên liệu thô, đạt tỷ lệ là 0,00006% [43]. Trong một
nghiên cứu khác, Lu Kegang và cộng sự đã dùng hệ thống sắc kí cột silica gel
sephadex LH – 20 phân lập Ophiopogonin D từ củ Mạch môn đạt tỷ lệ 0,005%
[29].
1.3. Phương pháp HPLC – ELSD
1.3.1. Nguyên tắc hoạt động


13

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn
và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng – rắn). Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất
phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các
chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau,
nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy,
chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [6], [7].
Các chất sau khi tách ra khỏi nhau được hóa hơi nhờ nhiệt độ tạo thành các
hạt sương có kích thước nhỏ tại buồng hóa hơi, sau đó đi qua một đường ống dài
(driff) và dưới tác dụng của dòng khí, dung môi được làm bay hơi để lại các hạt
chất tan được làm khô. Dòng hạt này làm tán xạ chùm ánh sáng chiếu tới, cường
độ của tia tán xạ đo được tỷ lệ tương ứng với nồng độ chất phân tích.
1.3.2. Ưu – nhược điểm của detector ELSD

Ưu điểm
- Độ nhạy cao, giới hạn phát hiện
thấp (cỡ nanogam).
- Có thể phát hiện được các chất
bay hơi kém hơn pha động, các chất
không có khả năng hoặc ít hấp thụ bức
xạ UV – VIS.
Hình 1.2. Cấu tạo của detector ELSD
- Không có đáp ứng với dung môi.
- Ít hoặc không bị nhiễu trong quá trình pha động thay đổi theo gradient.
- Thích hợp với các dung môi pha động dễ bay hơi.
Nhược điểm
- Chỉ thích hợp với các dung môi dễ bay hơi và các chất định lượng có khả
năng bay hơi kém hơn dung môi.
Trên thế giới, đã có một số tác giả đã sử dụng phương pháp HPLC – ELSD
để định lượng hàm lượng Ophiopogonin D và một số thành phần khác trong rễ
củ Mạch môn [20], [23], [29], [52], [53], [59]. Ngoài ra, phương pháp này còn
được các tác giả kết hợp với phương pháp HPLC – UV để đánh giá chất lượng
của Mạch môn [28], [39], [52].


14

1.4. Phương pháp mã vạch ADN (ADN Barcoding) và trình tự di truyền
đoạn ADN Ribosom nhân cùng ITS1 – 5.8S – ITS2 của Mạch môn
1.4.1. Phương pháp mã vạch ADN (ADN Barcoding)
Năm 2003, Paul Hebert đã đề xuất "Mã vạch ADN" (ADN Barcoding) như
là một cách để xác định loài. Phương pháp mã vạch sử dụng một đoạn trình tự
gen rất ngắn lấy từ một vị trí chuẩn của hệ gen. Cách dùng giống như cách một
máy quét ở siêu thị phân biệt được các sản phẩm bằng cách phân biệt các mã

vạch màu đen đặc trưng cho từng sản phẩm. Trong công nghệ mã vạch, có thể
hai mẫu trông rất giống nhau và không phân biệt được bằng mắt thường, nhưng
phương pháp mã vạch ADN có thể phân biệt được [70].
Phương pháp ADN barcoding gồm 4 phần cơ bản:
• Mẫu: Từ các viện bảo tàng, phòng tiêu bản, vườn thú, hồ, mô đông lạnh,
ngân hàng giống, các mẫu thu hái được,…
• Phân tích trong phòng thí nghiệm: Các phòng thí nghiệm sinh học phân tử
làm theo các quy trình chuẩn để tạo ra trình tự mã vạch ADN. Các dữ liệu này
sau đó được đặt trong một cơ sở dữ liệu để phân tích tiếp.
• Cơ sở dữ liệu: Một trong những phần quan trọng nhất của sáng kiến Mã
vạch là việc xây dựng một thư viện tham khảo chung để xác định các loài chưa
biết dựa trên các loài đã biết. Hiện nay, trên thế giới, có hai cơ sở dữ liệu mã
vạch chính là: Ngân hàng gen (Genbank) và Barcode of Life Database (BOLD).
• Phân tích dữ liệu: Mẫu vật được xác định bằng cách tìm các báo cáo tham
khảo trùng hợp nhất trong cơ sở dữ liệu. Từ đó so sánh, đối chiếu đoạn ADN
được mã hóa của mẫu chưa biết với đoạn trình tự đã biết trong cơ sở dữ liệu
[64].
1.4.2. Trình tự di truyền đoạn ADN ribosom nhân vùng ITS1 – 5.8S – ITS2
của cây Mạch môn
Khoảng hơn một thập kỷ trở lại đây, trình tự di truyền đoạn ADN ribosom
nhân vùng phiên mã nội (rADN – ITS) là đoạn gen phổ biến trên ADN được sử
dụng trong các nghiên cứu tiến hóa về phân loại các nhóm thực vật. Cấu trúc của
rADN – ITS gồm 3 tiểu phần: tiểu đơn vị 5.8S – trình tự có tính bảo tồn cao
trong tiến hóa và 2 vùng phiên mã nội ITS1 và ITS2. Độ dài trình tự tiểu phần
5.8S gần như không khác nhau (163 – 164 bp), trong khi đó độ dài vùng
phiênmã nội ITS có sự khác nhau: ITS1 (187 bp đến 298 bp) và ITS2 (187 bp


15

đến 252 bp). Toàn bộ vùng ITS ở thực vật có hoa có độ dài dưới 700 bp [11],
[19].

Hình 1.3. Cấu trúc của vùng rADN – ITS và các mồi thường sử dụng
Có 4 lý do để ITS ngày càng trở nên phổ biến:
(i) Tính sẵn có của một số bộ mồi PCR phổ biến (hoặc tương tự) áp dụng với
một lượng lớn của các nhóm loài;
(ii) Cấu trúc đa sao chép tạo điều kiện khuếch đại PCR thậm chí từ mẫu tiêu
bản;
(iii) Các kích thước vừa phải của ITS (dưới 700 bp) thường cho phép khuếch
đại và giải trình tự mà không cần nội mồi, ngoại lệ với nhiều nhóm thực vật hạt
trần;
(iv) Do mức độ của sự biến đổi, ITS thường cung cấp đủ các marker phân tử
thích hợp cho các nghiên cứu tiến hóa ở cấp độ loài, như nguồn gốc của các loài
đa bội, lai tạo, biến đổi gen, suy luận phát sinh loài [38].
Với chi Ophiopogon, trên thế giới có rất nhiều công bố về trình tự đoạn
ADN ribosom nhân vùng phiên mã nội (rADN – ITS1 – 5.8S – ITS2). Các đoạn
trình tự này đã được công bố trên Ngân hàng gen thế giới Genbank [65]. Đây là
cơ sở của việc nghiên cứu xác định đoạn trình tự của mẫu nghiên cứu ở Việt
Nam và so sánh với các trình tự đã so sánh trên thế giới.


16

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
Các mẫu nghiên cứu được thu thập tại 4 tỉnh, gồm: Lào Cai, Phú Thọ, Yên Bái
và Tuyên Quang (Bảng 2.1). Để hạn chế sự sai khác do điều kiện sinh thái, mùa
vụ,... toàn bộ các mẫu này được trồng trong cùng điều kiện tại trại GAP của

DKPharma ở xã Yên Ninh, huyện Phú Lương, tỉnh Thái Nguyên. Mã số tiêu bản
của các mẫu này được trình bảy ở Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Ký hiệu, nguồn gốc và mã số tiêu bản của các mẫu nghiên cứu
Ký hiệu

Nguồn gốc

Mã số tiêu bản

M1

Phố Lu, BảoThắng, Lào Cai

HNIP/18230/16

M2

Bằng Giã, Hạ hòa , Phú Thọ

HNIP/18225/16

M3

Đại Nghĩa, Đoan Hùng, Phú Thọ

HNIP/18226/16

M4

Khánh Hòa, Lục Yên, Yên Bái

HNIP/18227/16

M5

Suối Giàng, Văn Chấn, Yên Bái

HNIP/18228/16

M6

Thị trấn Sơn Dương, huyện Sơn Dương, Tuyên Quang HNIP/18229/16

Mẫu nghiên cứu về đặc điểm thực vật: Toàn cây, được thu tại Trại GAP của
DKPharma tại tỉnh Thái Nguyên (M1 – M6). Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Phòng
Tiêu bản của Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội (HNIP).
Nguyên liệu nghiên cứu thành phần hóa học: Mẫu củ của các mẫu M2, M3,
M4, M6 được thu tại Trại GAP của DKPharma tại tỉnh Thái Nguyên. Các mẫu được
rửa sạch, sấy ở nhiệt độ 60oC đến khô, xay nhỏ, bảo quản trong túi nilon kín. Ngoài
ra còn có các mẫu được gọi là “Mạch môn Bắc” (MB), “Mạch môn Nam” (MN) và
“Thiên môn” (TM) thu được trên thị trường (phố Lãn Ông, Hoàn Kiếm, Hà Nội).
Mẫu dược liệu Mạch môn chuẩn được sử dụng do Viện Dược liệu cung cấp (MC).
Nguyên liệu nghiên cứu trình tự di truyền đoạn ADN ribosom vùng ITS1 –
5.8S – ITS2: Lá non của các mẫu Mạch môn tại Trại GAP của DKPharma tại tỉnh
Thái Nguyên (M1 – M6).
2.1.2. Dung môi, hóa chất
2.1.2.1. Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu