Bước đâu nghiên cứu ứng dụng nhựa macroporous d101 trong phân lập iridoid từ quả dành dành
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.75 MB, 60 trang )
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
LÊ HỮU HUY
Mã sinh viên: 1101223
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ỨNG
DỤNG NHỰA MACROPOROUS D101
TRONG PHÂN LẬP IRIDOID TỪ QUẢ
DÀNH DÀNH
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2016
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
LÊ HỮU HUY
Mã sinh viên: 1101223
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ỨNG
DỤNG NHỰA MACROPOROUS D101
TRONG PHÂN LẬP IRIDOID TỪ QUẢ
DÀNH DÀNH
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
TS. Nguyễn Văn Hân
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp Dược
Trường Đại học Dược Hà Nội
HÀ NỘI - 2016
LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới người
thầy của tôi - TS. Nguyễn Văn Hân, người luôn tận tình chỉ bảo, hướng dẫn
tôi phương pháp nghiên cứu khoa học, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi
có thể hoàn thành khóa luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới DS. Vũ Văn Tuấn, DS. Trần
Trọng Biên, người thầy, người anh đã chỉ bảo tận tình và giúp đỡ tôi hoàn
thành khóa luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, các thầy cô giáo Trường Đại
học Dược Hà Nội, các thầy cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Công
nghiệp Dược đã tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn
bè luôn bên cạnh ủng hộ, khích lệ, giúp đỡ tôi những lúc khó khăn nhất để tôi
có thể đạt được kết quả ngày hôm nay.
Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2016
Sinh viên
Lê Hữu Huy
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁCCHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ
DANH MỤC CÁC BẢNG
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
Chương 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 2
1.1. Vài nét về cây Dành dành .................................................................... 2
1.1.1. Tên gọi ........................................................................................ 2
1.1.2. Đặc điểm thực vật ....................................................................... 2
1.1.3. Bộ phận dùng .............................................................................. 3
1.1.4. Thành phần hóa học ................................................................... 3
1.1.5. Tính vị công năng ....................................................................... 4
1.1.6. Công dụng................................................................................... 4
1.2. Iridoid ................................................................................................... 4
1.2.1. Tổng quan về nhóm hoạt chất Iridoid glycosid .......................... 4
1.2.2. Geniposid .................................................................................... 6
1.3. Một số nghiên cứu phân lập iridoid từ Dành dành .............................. 7
1.4. Nhựa macroporous ............................................................................... 8
1.4.1. Giới thiệu .................................................................................... 8
1.4.2. Phân loại và đặc tính nhựa Macroporous .................................. 9
1.4.3. Các ứng dụng của nhựa Macroporous hấp phụ ....................... 10
1.4.4. Nhựa Macroporous D101 ......................................................... 11
Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ............................................................................................... 12
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị..................................................................... 12
2.1.1. Nguyên vật liệu ......................................................................... 12
2.1.2. Thiết bị ...................................................................................... 12
2.2. Nội dung nghiên cứu.......................................................................... 13
2.2.1. Nghiên cứu phân lập iridoid toàn phần từ quả Dành dành sử
dụng nhựa Macroporous D101 .......................................................... 13
2.2.2. Nghiên cứu phân lập geniposid từ iridoid toàn phần .............. 14
2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................... 14
2.3.1. Phương pháp chiết xuất iridoid từ quả Dành dành ................. 14
2.3.2. Phương pháp xử lý dịch chiết quả Dành dành ......................... 14
2.3.3. Phương pháp xử lý và xác định tỉ lệ nhựa Macroporous D101
sử dụng................................................................................................15
2.3.4. Phương pháp phân lập iridoid từ dịch chiết đã xử lý .............. 15
2.3.5. Phương pháp phân lập geniposid từ iridoid tinh chế...............15
2.3.6. Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm.................. 16
2.3.7. Phương pháp bán định lượng iridoid bằng sắc ký lớp mỏng kết
hợp đo mật độ quang TLC Scanning .................................................. 17
2.3.8. Xác định cấu trúc của sản phẩm .............................................. 18
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ....................... 20
3.1. Chiết xuất và phân lập iridoid toàn phần từ quả Dành dành ............. 20
3.1.1. Chiết xuất iridoid từ quả Dành dành ....................................... 20
3.1.2. Khảo sát xử lý dịch chiết .......................................................... 23
3.1.3. Xác đinh tỉ lệ hạt nhựa sử dụng................................................ 25
3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ ethanol dùng giải hấp phụ iridoid
từ cột nhựa Macroporous D101 ......................................................... 26
3.2. Phân lập geniposid từ iridoid toàn phần ............................................ 31
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 36
DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
μL
Micro lít
Μm
Micro mét
13
C NMR Carbon 13 nuclear magnetic resonance
Cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13
1
H NMR
Proton nuclear magnetic resonance
Cộng hưởng từ hạt nhân proton
BV
Bed volume
Thể tích phần cột ứng với chiều cao nhựa
cm
Centimet
ED50
Effective dose
Liều có hiệu quả ở 50% số con vật thí nghiệm
DMSO
Dimethyl sulfoxid
HPLC
High-performance liquid chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
HSCCC
High-Speed Counter-Current Chromatography
Sắc ký phân bố tốc độ cao
g
Gam
MS
Mass spectrometry
Phổ khối
mg
Mili gam
mL
Mili lít
m
Mét
IUPAC
International Union of Pure and Applied Chemistry
Liên minh Quốc tế về Hóa học thuần túy và Hóa học ứng dụng
IR
Infrared spectrometry
Phổ hồng ngoại
TLC
Thin layer chromatography
Sắc ký lớp mỏng
v/v
Tỉ lệ thể tích
h
Giờ
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình
Tên hình
Trang
Hình 1.1
Dành dành - Gardenia jasminoides
2
Hình 1.2
Dược liệu chi tử - quả Dành dành
3
Hình 1.3
Cấu trúc hóa học của geniposid
6
Hình 1.4
Hình ảnh nhựa Macroporous D101
11
Hình 3.1
Sắc ký đồ của các phân đoạn ngấm kiệt với dung môi
21
ethanol nồng độ khác nhau
Hình 3.2
Hình ảnh pic TLC - Scanning
23
Hình 3.3
Sản phẩm phẩm iridoid sau tinh chế theo phương án A
25
Hình 3.4
Hình ảnh sản phẩm thu được với các nồng độ ethanol
28
rửa giải ethanol 10%(a), ethanol(b), ethanol (c) và
ethanol 20%
Hình 3.5
Hình ảnh chất màu di chuyển trong quá trình rửa giải
29
với ethanol 40%
Hình 3.6
Sắc ký lớp mỏng iridoid tinh chế và geniposid phân lập
31
được
Hình 3.7
Hình ảnh sắc ký đồ HPLC của mẫu sản phẩm
32
Sơ đồ 3.1
Sơ đồ tóm tắt quy trình phân lập iridoi từ quả Dành
30
dành
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng
Tên bảng
Trang
Bảng 1.1
Một số đặc điểm kỹ thuật của nhựa macroporous D101 11
Bảng 2.1
Danh mục các dung môi hóa chất
13
Bảng 3.1
Kết quả đo diện tích pic trên bản mỏng sắc ký
22
Bảng 3.2
Kết quả khối lượng và nhiệt độ nóng chảy của sản
24
phẩm khảo sát loại tạp trước khi hấp phụ lên cột nhựa
Macroporous D101
Bảng 3.3
Kết quả rửa giải iridoid từ quả Dành dành với các
27
nồng độ ethanol rửa giải khác nhau
Bảng 3.4
Kết quả phổ IR của sản phẩm phân lập
33
Bảng 3.5
Dữ liệu phổ 13C - NMR của geniposid
34
Bảng 3.6
Dữ liệu phổ 1H – NMR của geniposid
35
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây Dành dành mọc hoang và được trồng tại nhiều vùng ở miền Bắc
nước ta. Tại miền núi, Dành dành thường mọc ở ven suối. Tại đồng bằng, nhân
dân thường thường trồng làm cảnh và lấy quả làm thuốc hay để nhuộm bánh
trái thành màu vàng (bánh xu xê, thạch) [7].
Iridoid là một trong những thành phần có trong lá và quả của cây Dành
dành. Nó có nhiều tác dụng như giảm đau, kháng khuẩn, chống viêm, lợi mật
[11], hạ đường huyết [10].
Các phương pháp phân lập iridoid hiện nay có sử dụng sắc ký ngược
dòng tốc độ cao, các hệ dung môi, dùng silicagel, sử dụng nhựa macroporous,...
Trong đó phương pháp sử dụng nhựa macroporous có nhiều ưu điểm: chi phí
thấp, đặc tính chọn lọc tốt và tốc độ hấp phụ nhanh chóng, cũng như quá trình
tái sử dụng đơn giản. Trên cơ sở đó, đề tài “Bước đầu nghiên cứu ứng dụng
nhựa Macroporous D101 trong phân lập iridoid từ cây Dành dành” được
thực hiện với mục tiêu:
1. Phân lập được iridoid toàn phần từ quả Dành dành sử dụng nhựa
Macroporous D101.
2. Phân lập được geniposid từ iridoid toàn phần.
2
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Vài nét về cây Dành dành
1.1.1. Tên gọi
Cây Dành dành còn có tên khác là thuỷ hoàng chi, mác làng
cương (Tày), sơn chi tử.
Tên khoa học: Gardenia jasminoides Ellis.
Thuộc họ cà phê Rubiaceae.
Các tên khoa học đồng nghĩa gồm có: Gardenia florida L., Gardenia
angustifolia Lodd, Gardenia augusta L. [11].
1.1.2. Đặc điểm thực vật
Hình 1.1. Dành dành - Gardenia jasminoides.
Cây cỏ, cao 1 - 2m, xanh tốt quanh năm, phân nhánh nhiều. Cành màu
nâu, nhẵn, có khía rãnh dọc. Lá mọc đối hay mọc vòng 3, dày, hình thuôn - trái
xoan, gốc thóp lại, đầu tù hoặc hơi nhọn, mặt trên màu lục sẫm đến nâu đen,
nhẵn bóng, mặt dưới rất nhạt có gân nổi rõ, cuống lá rất ngắn, lá kèm to, nhọn,
bao quanh lấy thân và cành.
3
Hoa to, mọc đơn độc ở đầu cành, màu trắng hoặc trắng ngà, rất thơm,
cuống hoa có 6 cạnh, đài gồm 6 thùy, thuôn nhọn, ống đài có 6 cánh dọc, tràng
có 6 cánh, tròn đầu, ống tràng nhẵn; nhị 6, chỉ nhị ngắn, bao phấn tù; bầu 2 ô,
noãn rất nhiều.
Quả hình trứng, có đài tồn tại ở đỉnh và cạnh lồi có cánh, khi chín màu
vàng, thịt quả màu vàng cam, hạt dẹp, nhiều.
Mùa hoa: tháng 3 - 5, mùa quả: tháng 8 - 10 [11].
1.1.3. Bộ phận dùng
Hình 1.2. Dược liệu chi tử - quả Dành dành.
Bộ phận dùng là quả. Quả chín già thu hái vào tháng 8 - 10 ngắt bỏ cuống
phơi hay sấy nhẹ đến khô. Nếu bóc vỏ trước khi phơi sấy, ta được chi tử nhân.
Tùy theo cách sử dụng, có thể phơi khô dùng sống để thanh nhiệt, sao qua dùng
chín để tả hỏa hoặc sao đen để cầm máu [11].
Lá và rễ cũng được dùng. Lá thu hái quanh năm dùng tươi [5].
1.1.4. Thành phần hóa học
Quả Dành dành chứa:
- Các
iridoid
glycosid
(gardenosid,
geniposid,
shanzhisid,...) trong đó geniposid là thành phần chính.
- Các acid hữu cơ (acid picrocrocinic,...).
- Các sắc tố: α - crocin, α - crocetin.
gardosid,
4
Trong quá trình sinh trưởng của cây, sự hình thành crocin và geniposid
được phân chia thành hai giai đoạn:
- Giai đoạn 1 (1 - 6 tuần lễ sau khi cây ra hoa): Trọng lượng quả và
hàm lượng geniposid trong quả tăng, không xuất hiện crocrin.
- Giai đoạn 2 (8 - 23 tuần lễ sau khi cây ra hoa): Hàm lượng
geniposid trong quả thay đổi trong khi đó crocin lại tích lũy và
tăng lên cho tới khi quả chín hoàn toàn [5], [7], [11].
1.1.5. Tính vị công năng
Quả Dành dành có vị đắng, tính hàn, vào các kinh: tâm phế, tam tiêu, có
tác dụng tả hỏa, trừ phiền, thanh nhiệt, lợi tiểu, hương huyết giải độc. Gardenin
có tác dụng ức chế với sắc tố mật trong máu, làm giảm bớt xuống nên được
dùng trị bệnh hoàng đản. Nước sắc Dành dành cũng có tác dụng kháng khuẩn
với một số vi khuẩn [5], [11].
1.1.6. Công dụng
Dành dành là một vị thuốc được sử dụng từ lâu trong y học cổ truyền để
chữa sốt, bồn chồn khó ngủ, vàng da, huyết nhiệt, tiểu tiện khó khăn, mắt đỏ
đau, miệng khát. Quả sao đen có tác dụng chỉ huyết, lương huyết dùng chữa
chảy máu cam, nôn ra máu, đái ra máu, băng lậu. Quả thường dùng nhuộm màu
vàng, nhất là nhuộm thức ăn vì sắc tố dịch quả không có độc [4], [11].
1.2. Iridoid
1.2.1. Tổng quan về nhóm hoạt chất Iridoid glycosid
a. Định nghĩa:
- Monoterpenoid glycosid gồm những glycosid mà bộ khung của
phần aglycon được cấu tạo từ 2 đơn vị isopren. Trong cây, các
monoterpenoid glycosid được gặp nhiều nhất là nhóm iridoid, cho
đến nay, người ta đã biết đến trên 600 chất. Khung cơ bản gồm
một vòng cyclopentan nối với một vòng hydropyran.
5
- Trong tự nhiên các hợp chất iridoid hay gặp trong các họ thực vật:
Rubiaceae
(Lá
mơ
lông,
Dành
dành),
Euphorbiaceae,
Apocynaceae (Thông thiên, Bông sứ), Plantaginaceae (Mã đề),
Verbenaceae (Cỏ roi ngựa), Cornaceae (Sơn thù du),
Valerinaceae, Gentianaceae (Long đờm), Caprifoliaceae (Kim
ngân),
Oleaceae,
Ericaceae,
Loganiaceae
(Mã
tiền),
Scrophulariaceae (Sinh địa, Huyền sâm),...
b. Phân loại Iridoid gồm các nhóm:
- Iridoid có aglycon đủ 10 carbon: Geniposid, gardenosid, gardosid
trong quả Dành dành (Gardenia jasminoides Ellis.), loganin trong
lá kim ngân (Lonicera japonica Thunb.),...
- Iridoid không đủ 10 carbon: Rehmaniosid, catalpol trong sinh địa
(Rehmania glutinosa (Gaertn.) Liboseh).
- Iridoid trên 10 carbon: Plumericrin trong vỏ cây đại (Plumeria
rubra L. var aeutifolia (Poir) Bailay).
c. Tính chất:
- Iridoid glycosid có tính chất dễ tan trong nước, ethanol loãng.
Thường dùng ethanol 50% để chiết xuất.
- Dưới tác dụng của enzym có sẵn trong cây, iridoid glycosid bị thủy
phân biến đổi thành các sản phẩm màu đen. Ngoài enzym, iridoid
glycosid cũng dễ bị thủy phân bằng acid. Dưới tác dụng của
NaOH, Ba(OH)2 thì các nhóm ester bị cắt.
d. Kiểm nghiệm:
- Để định tính hoạt chất này, người ta thường dùng phương pháp
sắc ký giấy hay TLC. Phần lớn các hợp chất iridoid có nhóm mang
màu -O-C=C-CO-O- nên thể hiện băng hấp thụ trong vùng tử
ngoại ở 233 - 238nm [1], [4].
6
1.2.2. Geniposid
a. Đặc điểm: Genoposid là một iridoid glycosid có trong vị dược liệu Dành
dành:
- Công thức phân tử: C7H24O10.
- Tên khoa học: Methyl(1S,4aS,7aS)-7-(hydroxymethyl)-1[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2yl]oxy-1,4a,5,7a-tetrahydrocyclopenta[c]pyran-4-carboxylat
[12].
- Tên khác: Genipin - 1 - glucosid.
- Phân tử lượng: 388,38 [12].
- Cấu trúc hóa học geniposid như sau:
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học geniposid.
b. Tính chất:
- Bột kết tinh màu trắng, vị đắng.
- Nhiệt độ nóng chảy khoảng 162oC [18].
- Dễ tan trong nước, ethanol, methanol, khó tan trong ether,
cloroform.
- Năng suất quay cực: +7,5o (dung dịch nước) [12].
c. Tác dụng dược lý của geniposid:
7
- Geniposid có tác dụng kích thích tái tạo tế bào nội mạc là các tế
bào đóng vai trò quan trọng làm đông máu, do đó có tác dụng cầm
máu [16].
1.3. Một số nghiên cứu phân lập iridoid từ Dành dành
Nguyễn Thị Ngọc Thùy (2008) đã chiết shoxlet 200g dược liệu bằng
ethanol 96% trong 8giờ. Dịch chiết được cô đến thể tích 30mL và lắc với dung
môi hữu cơ để loại tạp chất béo, chất màu thu được 7,41g cắn iridoid. Dùng
6,5g cắn iridoid tinh chế bằng cột silicagel và kết tinh lại trong methanol thu
được 2,65g sản phẩm gardenosid. Gardenosid được thử tác dụng hạ đường
huyết trên chuột [10]. Phương pháp này sử dụng dung môi hữu cơ loại tạp chất
béo, chất màu. Có nhược điểm cho hiệu suất thấp, sử dụng nhiều dung môi hữu
cơ, khó nâng cấp quy mô.
Nguyễn Việt Hà (2010) đã nghiên cứu thiết lập chất chuẩn geniposid từ
quả Dành dành. Chiết xuất hồi lưu với dung môi là methanol. Tinh chế bằng
than hoạt, sắc ký cột silicagel sau đó kết tủa lại trong aceton. Hiệu suất đạt
2,14%. Sản phẩm có độ tinh khiết trên 98% [6]. Phương pháp này có ưu điểm
cho sản phẩm có hiệu suất và độ tinh khiết cao, tuy nhiên quy trình phức tạp,
quy mô nhỏ, khó áp dụng vào quy mô công nghiệp.
Tingting Zhou và cộng sự (2005) đã chiết hồi lưu 500g bột quả Dành
dành bằng 4000mL ethanol 50% ba lần mỗi lần 2giờ. Dịch chiết được cất cô
quay dưới áp suất giảm ở 60oC đến cắn thô. Hòa cắn thô tan trong nước và được
phân lập bằng cột nhựa Macroporous D101. Dịch rửa giải được cô đến cắn
được 46,6g cắn. Đem 1g cắn trên phân lập bằng HSCCC thu được 389mg
geniposid với độ tinh khiết hơn 98% [21]. Phương pháp này có ưu điểm độ tinh
khiết cao, nhược điểm cần trang thiết bị, cần kiểm soát quá trình.
Xiao Qin Zhou và cộng sự (2007), 10kg quả Dành dành được chiết xuất
lần lượt với ethanol 90%, ethanol 70%, dịch chiết được tập trung lại. Sử dụng
8
dung môi hữu cơ kết hợp silicagel và Sephadex LH-20 phân lập các thành phần
iridoid mới là 6’-O-sinapoylgeniposid [22].
Zhao Chao và cộng sự (2007) đã chiết 1,8 kg quả Dành dành ethanol
70%. Sử dụng n - butanol loại tạp. Sau khi phân lập bằng sắc ký cột, sản phẩm
kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi (ether: ethyl acetat = 1:2) thu được 28,5g
sản phẩm với hiệu xuất đạt 1,58% [20]. Phương pháp này có ưu điểm thực hiện
trên quy mô 1,8kg, nhược điểm hiệu suất thấp, sử dụng nhiều dung môi hữu cơ
được, qua nhiều bước.
Feng J. và cộng sự (2014) đã chiết xuất 600g bột quả Dành dành, dịch
chiết được hấp phụ và giải hấp phụ với nhựa Macroporous LX60. Giải hấp phụ
lần lượt với nước, ethanol 20% và ethanol 70% thu được 20,7g geniposid và
14,7g chất màu. Trong nghiên cứu này, tác giả đã khảo sát khảo năng hấp phụ
geniposid của 9 loại nhựa Macroporous khác nhau, trong đó Macroporous
LX60, D101, X5 và LX17 cho khả năng hấp phụ cao hơn [13]. Phương pháp
này cho hiệu suất cao, có khả năng nâng cấp quy mô, đồng thời thu được chất
màu.
1.4. Nhựa macroporous
1.4.1. Giới thiệu
Sự hấp phụ và giải hấp phụ lên nhựa macroporous không ion hóa là một
kỹ thuật hiệu quả trong nhiều lĩnh vực. Ưu điểm như khả năng hấp phụ cao, chi
phí thấp (do hoạt động và tái sử dụng đơn giản vật liệu hấp phụ). Vì vậy, đã có
ngày càng nhiều báo cáo ứng dụng nhựa macroporous để phân lập các chất có
nguồn gốc thiên nhiên như: flavonoid, glycosid và carotenoid [15].
Theo IUPAC, polyme Macroporous có các lỗ xốp trong khoảng 50nm
đến 1μm. Tuy nhiên gần đây, nhiều sự chú ý đã được đưa đến các vật liệu có
kích thước lỗ xốp từ 1μm dến 100μm, và xa hơn nữa. Có thể gọi đó là các
polyme supermacroporous. Những polyme macroporous co những khả năng
9
mới và thú vị trong công nghệ sinh học và y học do cấu trúc dị thể của chúng.
Cụ thể các lỗ xốp chứa đầy dung môi và được bao quang bởi các phần mỏng là
các đoạn polyme. Bản chất polyme, kích thước lỗ xốp, phân bố kích thước lỗ
xốp, kết nối các lỗ xốp là những yếu tố tác động chính đến các tính chất và khả
năng ứng dụng khác nhau trong các lĩnh vực đời sống [17].
Nhựa macroporous là một vật liệu hấp phụ polyme tan trong dầu có cấu
trúc xốp lớn nhưng không có nhóm trao đổi ion. Nhựa macroporous cho hiệu
quả giải hấp phụ cao,quá trình đơn giản dễ thực hiện. Diện tích bề mặt của nhựa
macroporous thường là 100-600m2/g. Nhưng một số phân tử hữu cơ có cấu trúc
lập thể lớn, kích thước lỗ xốp của nhựa cần được xem xét để cho phép sự xâm
nhập của các phân tử [19].
Thuật ngữ “nhựa macroporous hấp phụ” được dùng để mô tả loại nhựa
có các liên kết ngang không ion và được đặc trưng bởi số lượng lớn các lỗ xốp
ổn định (lỗ xốp tương đối rộng với đường kính lỗ xốp > 50Å) [15].
1.4.2. Phân loại và đặc tính nhựa Macroporous
Nhựa Macroporous có thể được phân loại theo độ phân cực thành 2 loại
chính: không phân cực và phân cực. Hiện nay các nhựa Macroporous được sử
dụng gồm: AB - 8, NKA - 9, NKA - 2, D3520, D101, H1020, H103, AL2,
HPD200A,...
Các đặc tính quan trọng đặc trưng cho khả năng hấp phụ của nhựa
Macroporous là tổng diện tích bề mặt (bề mặt bên trong và ngoài), đường kính
lỗ xốp và độ phân cực bề mặt. Tỉ lệ đường kính lỗ xốp của hạt nhựa
Macroporous với kích thước phân tử hấp phụ là một yếu tố quan trọng. Đường
kính lỗ xốp lớn so với kích thước phân tử hấp phụ giảm diện tích bề mặt hấp
phụ, làm giảm dung lượng hấp phụ. Đường kính lỗ xốp bé so với kích thước
phân tử gây khó khăn trong quá trình chất hấp phụ đi vào lỗ xốp [15].
10
1.4.3. Các ứng dụng của nhựa Macroporous hấp phụ
Công nghệ nhựa hấp phụ Macroporous lần đầu tiên được sử dụng trong
xử lý nước thải, công nghiệp dược, công nghiệp hóa chất, hóa phân tích, thử
nghiệm lâm sàng và điều trị cùng nhiều lĩnh vực khác. Những năm gần đây
nhựa Macroporous đã được sử dụng nhiều trong chiết xuất hoạt chất, tách, phân
lập ở Trung Quốc với thảo dược. Trong y học cổ truyền Trung Quốc, ứng dụng
công nghệ nhựa Macroporous có nhiều ưu điểm trong nâng cấp công thức y
học cổ truyền, thúc đẩy sự phát triển trong các nghiên cứu trong việc hiện đại
hóa y học cổ truyền. Nhựa Macroporous có các đặc tính chọn lọc tốt, độ bền cơ
học cao, và tốc độ hấp phụ nhanh chóng, cũng như quá trình tái sử dụng đơn
giản. Vì vậy, nhựa Macroporous rất thích hợp sử dụng trong việc tách các hợp
chất phân cực thấp từ dung dịch nước. Sau khi một mẫu được hấp phụ trong
một loại nhựa Macroporous, cột nhựa thường được tách rửa với một nồng độ
nước, methanol, ethanol và aceton với tỉ lệ thích hợp từ 10%, 20%...(v/v) trong
từng bước, cuối cùng giải hấp phụ bằng ethanol hoặc aceton. Một nhựa
Macroporous có thể được tái sử dụng sau khi xử lý đơn giản: ngâm và rửa với
methanol, ethanol, khi cần thiết, ngâm với acid hydroclric 1M và natri
hydroxyd 1M và sau đó rửa sạch với nước cất cho pH trung tính. Bảo quản
trong methanol hoặc ethanol và rửa nước cất trước khi sử dụng. Ở giai đoạn
đầu rửa giải, tạp chất ưa nước (chẳng hạn như axit amin,...) có thể được tách
bằng cách rửa giải với một thể tích nước qua cột sắc ký. Một nhựa Macroporous
thường được dùng là bước xử lý ban đầu trước khi kết hợp với các phương pháp
khác như sắc ký cột silicagel, HSCCC hay HPLC. Kể từ cuối những năm 1970,
nhựa Macroporous đã được áp dụng trong việc chiết xuất và phân lập các chất
có nguồn gốc thiên nhiên [15].
11
1.4.4. Nhựa Macroporous D101
Hình 1.4. Hình ảnh hạt nhựa Macroporous D101.
Bảng 1.1. Một số đặc điểm kỹ thuật của nhựa Macroporous D101.
Tiêu chí
Tính phân cực
Kích thước hạt (mm)
Độ ẩm (%)
Tỉ trọng (g/mL)
Đường kính lỗ xốp trung bình (nm)
Diện tích bề mặt (m2/g)
Độ xốp (%)
Thể tích lỗ xốp (mL/g)
Thông số kỹ thuật
Không phân cực
0,3-1,25
65-75
1,03-1,07
9-10
500-550
50-60
1,18-1,24
Một số điều kiện hấp phụ và giải hấp phụ với nhựa Macroporous D101:
1) Nhiệt độ tối đa: 150oC.
2) Tốc độ dòng chảy hấp phụ: 1- 4BV/h.
3) Tốc độ dòng chảy giải hấp phụ : 0,6 - 2BV/h.
4) Thể tích giải hấp phụ: 2 - 3BV.
5) Dung môi giải hấp phụ: dung dịch nước hoặc ethanol với các nồng độ
khác nhau.
12
Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
Quả cây Dành dành được thu hái ở huyện Hải Hậu, tỉnh Nam Định vào
tháng 10 năm 2015, phơi khô, tách bỏ vỏ, phơi khô.
Nhựa Macroporous D101: không phân cực, diện tích bề mặt 500550m2/g, đường kính lỗ xốp 9-10nm (Trung Quốc).
2.1.2. Thiết bị
a. Máy móc:
- Tủ sấy Memmert (Đức).
- Cân kỹ thuật điện tử Adam equipment model QT 200 (Mỹ).
- Cân phân tích sartorius TE214S (Đức).
- Máy cất quay chân không Büchi B - 490 và R - 220 (Thụy Sỹ).
- Máy khuấy từ Heidolph MR3001 (Đức).
- Máy đo nhiệt độ nóng chảy Mettler Toledo (Thụy Sỹ).
- Máy HPTLC CAMAG (Thụy sỹ).
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu (Nhật Bản) bao gồm: bộ
phận loại khí DGU - 14A, bơm cao áp LC - 10ADVP, buồng chứa
cột CTO - 10AVP, bộ điều khiển SCL - 10AVP, detector dãy diod
quang SPD - M10AVP và phần mềm Class vp 6.14.
b. Dụng cụ:
- Bình chiết ngấm kiệt 2L.
- Cột thủy tinh đường kính 3cm, chiều cao 40cm, có khóa điều chỉnh
tốc độ dòng chảy.
- Cốc thủy tinh loại 100mL, 250mL, 500mL, 1000mL.
- Bình định mức 10mL, 20mL, 50mL.
13
- Pipet 1mL, 2mL, 5mL, 10mL.
- Ống đong 10mL, 50mL, 300mL, 500mL.
- Đĩa petri.
- Bình hút ẩm.
- Màng lọc cellulose acetat 0,45μm (Satorius).
c. Hóa chất:
Bảng 2.1. Danh mục các dung môi hóa chất.
TT
Tên hóa chất
Tiêu chuẩn, nguồn gốc
1
Aceton
Trung Quốc
2
Acetonitril
HPLC, Đức (Merck)
3
Acid formic
Trung Quốc
4
Acid hydrocloric
Trung Quốc
5
Acid sulfuric đặc
Trung Quốc
6
Bản mỏng Silicagel GF254
Đức (Merck)
7
Ethanol 96%
Trung quốc
8
Ethyl acetat
Trung Quốc
9
Methanol
Trung Quốc
10
Natri hydroxyd
Trung Quốc
11
Nước cất
Việt Nam
12
n – hexan
Trung Quốc
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu phân lập iridoid toàn phần từ quả Dành dành sử dụng
nhựa Macroporous D101
Nghiên cứu chiết xuất iridoid từ quả Dành dành.
Nghiên cứu xử lý dịch chiết Dành dành.
Nghiên cứu hấp phụ và giải hấp phụ iridoi với nhựa Macroporous D101.
14
2.2.2. Nghiên cứu phân lập geniposid từ iridoid toàn phần
Nghiên cứu phân lập geniposid, kiểm tra độ sạch và xác định cấu trúc
sản phẩm.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp chiết xuất iridoid từ quả Dành dành
Tham khảo tài liệu [3] và qua thực nghiệm, chiết xuất iridoid theo
phương pháp ngấm kiệt được tiến hành như sau:
- Chuẩn bị dược liệu: Dược liệu Dành dành sấy ở tủ sấy 60o C đến
độ ẩm <8,5%. Nghiền, rây qua rây 1mm. Cân bột Dành dành cho
vào cốc có mỏ.
- Làm ẩm dược liệu: Trộn bột dược liệu với thể tích dung môi bằng
50% khối lượng dược liệu trong cốc có mỏ, để trong 3giờ.
- Ngâm trung gian: Cho từ từ dược liệu vào bình chiết ngấm kiệt
từng lớp một, nén nhẹ nhàng, san bằng trên bề mặt khối bột. Đặt
một tấm giấy lọc và các vật đè lên trên. Thêm dung môi đến không
khí thoát ra hết và dịch chiết bắt đầu chảy ra. Khóa van, thêm dung
môi ngập dược liệu 2 - 3cm. Ngâm trong 24giờ.
- Rút dịch chiết: Mở khóa cho dịch chiết chảy từng giọt vào bình
hứng. Thường xuyên thêm dung môi để ngập mặt dược liệu 2 3cm. Tốc độ rút dịch khoảng 1 - 3mL/phút.
2.3.2. Phương pháp xử lý dịch chiết quả Dành dành
Tiến hành xử lý dịch chiết theo một trong 2 phương pháp:
a. Phương án A: Dịch chiết quả Dành dành được cô quay dưới áp suất giảm
đến cắn. Cắn thô được hòa tan thành 400mL với nước cất. Dung dịch
nước được để trong tủ lạnh 8oC trong 24giờ. Lọc qua giấy lọc, bỏ cắn
lọc, thu dịch lọc. Dịch lọc thêm nước thành 400mL được dịch chiết xử
lý theo phương án A.
15
b. Phương án B: Dịch chiết quả Dành dành được cô quay dưới áp suất giảm
đến cắn. Hòa tan lại thành 200mL với nước cất. Dung dịch nước được
lắc 3 lần, mỗi lần với 100mL n - hexan. Gạn lấy lớp nước, bổ sung thành
400mL với nước cất.
2.3.3. Phương pháp xử lý và xác định tỉ lệ nhựa Macroporous D101 sử dụng:
a. Chuẩn bị cột nhựa Macroporous D101:
Cân nhựa Macroporous D101. Ngâm nhựa Macroporous D101 trong
ethanol 96% trong 24giờ. Sau đó lần lượt ngâm trong dung dịch HCl 5%
và NaOH 5% trong 4giờ. Rửa sạch nhựa Macroporous D101 đến pH
trung tính bằng nước cất. Ngâm nhựa trong nước cất [13]. Cho nhựa
Macroporous D101 đã xử lý lên cột sắc ký.
b. Xác định tỉ lệ hạt nhựa Macroporous D101 sử dụng:
- Chuẩn bị cột nhựa Macroporous D101 sử dụng 100g hạt nhựa
(1BV tương đương 200mL).
- Chuẩn bị 2000mL dịch chiết đã xử lý theo phương án A mục 2.3.2.
- Cho dịch chiết đã xử lý hấp phụ lên cột. Điều chỉnh tốc độ dịch
chảy ra 2BV/h.
- Cách mỗi 0,5BV định tính iridoid trong dịch sau cột bằng sắc ký
lớp mỏng. Khi vết sắc ký có vết iridoid, ngừng hấp phụ, xác định
thể tích dịch hấp phụ. Từ đó lựa chọn tỉ lệ hạt nhựa Macroporous
D101 so với dược liệu.
2.3.4. Phương pháp phân lập iridoid từ dịch chiết đã xử lý
a. Chiết ngấm kiệt dược liệu như mục 2.3.1
b. Xử lý dược liệu theo mục 2.3.2 phương án A được dịch chiết đã xử lý.
c. Hấp phụ và giải hấp phụ iridoid sử dụng cột nhựa Macroporous D101:
- Thêm dịch chiết đã xử lý lên cột nhựa Macroporous D101. Điều
chỉnh tốc độ dòng 2BV/h.
16
- Rửa giải với 3BV nước cất qua cột nhựa Macroporous D101. Điều
chỉnh tốc độ dòng 3BV/h.
- Rửa giải iridoid từ cột nhựa Macroporous D101 với ethanol nồng
độ thích hợp. Điều chỉnh tốc độ dòng 2BV/h. Sau mỗi BV dịch
rửa giải, định tính iridoid trong dịch sau cột bằng sắc ký lớp mỏng.
BV (bed volume) = h×𝜋 × 𝑟 2 .
Với BV: thể tích ứng với chiều cao cột nhựa chiếm chỗ (mL).
h: Chiều cao của phần nhựa trên cột sắc ký (cm).
𝜋 × 𝑟 2 : Diện tích thiết diện ngang cột (cm2).
d. Dịch rửa giải được cất quay dước áp suất giảm đến cắn. Sấy cắn ở tủ sấy
60oC trong 3giờ. Thu được iridoid thô.
e. Iridoid thô được tinh chế như sau:
- Hòa iridoid thô vào 300mL aceton nóng, cô quay dước áp suất
giảm đến 100mL, để nguội rồi cho vào tủ lạnh 8oC trong 24giờ
cho kết tinh.
- Lọc qua giấy lọc, lấy tủa, rửa tủa bằng 5mL aceton 2 lần. Sấy tủa
ở tủ sấy 60oC trong 6giờ. Thu được iridoid tinh chế.
2.3.5. Phương pháp phân lập geniposid từ iridoid tinh chế
Tiến hành:
- Hòa tan hoàn toàn iridoid tinh chế được với dung môi aceton nóng.
Cất quay dưới áp suất giảm dung dịch trên đến 100mL, để nguội
cho vào tủ lạnh khoảng 8oC trong 24giờ cho kết tinh.
- Lọc qua giấy lọc, lấy tủa, rửa bằng lượng nhỏ aceton, sấy ở tủ sấy
60oC trong 24giờ thu sản phẩm.
- Kết tinh lại nhiều lần.
2.3.6. Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm
a. Phương pháp HPLC
