Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học củ trà hoa vàng ở thái nguyên

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HÀ LY
MÃ SINH VIÊN: 1101318

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,
THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ
TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA
TRÀ HOA VÀNG Ở THÁI NGUYÊN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HÀ LY
MÃ SINH VIÊN: 1101318

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,
THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ
TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA
TRÀ HOA VÀNG Ở THÁI NGUYÊN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Hoàng Quỳnh Hoa
2. DS. Ngô Thị Thảo
Nơi thực hiện:
Bộ môn Thực Vật –

Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2016


LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn và kính trọng sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Hoàng
Quỳnh Hoa- Bộ môn Thực Vật, Trường Đại học Dược Hà Nội và DS. Ngô Thị
Thảo- người thầy đã truyền cho tôi tình yêu khoa học, dìu dắt tôi từ những ngày
đầu làm nghiên cứu khoa học, cũng là người trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ
bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới:
-

PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh – Phòng Quản lý khoa học, Trường Đại
học Dược Hà Nội, DS. Phạm Thị Linh Giang và DS. Nguyễn Thị Thùy
Linh, người đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ, giải đáp thắc mắc, khó khăn
mà tôi gặp phải trong quá trình thực hiện khóa luận.

-

Các thầy cô giáo và các chị kỹ thuật viên bộ môn Thực Vật đã luôn giúp đỡ
và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực
nghiệm.

-

Ban Giám Hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo, các cán bộ nhân viên
trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy bảo và giúp đỡ tôi trong
suốt 5 năm học tại đây.

-

Các bạn sinh viên khóa 66 cùng nghiên cứu và làm đề tài ở bộ môn Thực vật
đã giúp đỡ, động viên tôi trong thời gian nghiên cứu khoa học tại bộ môn.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn
khích lệ, giúp đỡ và cổ vũ tôi trong suốt thời gian qua.
Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Nguyễn Thị Hà Ly


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANG MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ .......................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 2
1.1.

Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật chi Camellia L. ..................................2

1.1.1. Vị trí phân loại của chi Camellia L. ...........................................................2
1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Camellia L. ......................................................2
1.1.3. Phân bố .......................................................................................................2
1.1.4. Một số loài Trà hoa vàng ở Việt Nam ........................................................3
1.2.

Thành phần hóa học .......................................................................................4

1.2.1. Nhóm alcaloid trong Camellia L. ...............................................................4
1.2.2. Nhóm tanin (các polyphenol) trong Camellia L. .......................................4
1.2.3. Nhóm tinh dầu trong Camellia L. ..............................................................5
1.3.

Về tác dụng sinh học .....................................................................................6

1.3.1. Tác dụng chống oxy hóa ............................................................................6
1.3.2. Tác dụng chống ung thư .............................................................................6
1.4.

Một số phương pháp định lượng polyphenol ................................................7

1.5. Vài nét về phương pháp bán định lượng bằng sắc ký lớp mỏng bằng phần
mềm VideoScan .......................................................................................................8
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 9
2.1.

Nguyên liệu, thiết bị ......................................................................................9

2.1.1.

Nguyên liệu .............................................................................................9

2.1.2.

Thiết bị ....................................................................................................9

2.1.3.

Dung môi, hóa chất .................................................................................9

2.2.

Nội dung, phương pháp nghiên cứu ............................................................10

2.2.1.

Nghiên cứu đặc điểm hình thái .............................................................10


2.2.2.

Nghiên cứu thành phần hóa học ...........................................................11

2.2.3.

Nghiên cứu một số tác dụng sinh học ...................................................19

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................................ 23
3.1.

Kết quả nghiên cứu ......................................................................................23

3.1.1.

Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật .................................................23

3.1.2.

Kết quả nghiên cứu hóa học .................................................................27

3.1.3.

Kết quả nghiên cứu tác dụng sinh học in vitro .....................................35

3.2.

BÀN LUẬN .................................................................................................36

3.2.1.

Về thực vật ............................................................................................36

3.2.2.

Về thành phần hóa học..........................................................................37

3.2.3.

Về tác dụng sinh học .............................................................................39

KẾT LUẬN ............................................................................................................. 40
ĐỀ XUẤT ............................................................................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
AOAC

Association of Official Analytical Chemists - Hiệp hội các nhà
hoá phân tích chính thống

DPPH

1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl

DĐVN

Dược điển Việt Nam

EGCG

Epigalo catechin gallat

ELISA

Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay - Phương pháp hấp thụ
miễn dịch liên kết với enzyme

GC

Gas Chromatography - Sắc ký khí

HPLC

High Performance Liquid Chromatography - Sắc ký lỏng hiệu
năng cao

HPTLC

High Performance Thin Layer Chromatography - Sắc ký lớp
mỏng hiệu năng cao

IC50

Inhibit Cellular Proliferation by 50% - Nồng độ ức chế 50% sự
phát triển của tế bào

IUCN

International Union for Conservation of Nature and Natural
Resources - Liên minh Quốc tế Bảo tồn Thiên nhiên và Tài
nguyên Thiên nhiên

OD

Optical Density - Mật độ quang

Rf

Retention factor - Hệ số lưu giữ

RSB

Sulforhodamine B

RSD

Relative Standard Deviation - Độ lệch chuẩn tương đối

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

TLC

Thin Layer Chromatography - Sắc ký lớp mỏng

VQG

Vườn Quốc gia


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Danh mục một số loài Trà hoa vàng ở Việt Nam ..................................... 3
Bảng 2.1. Đặc điểm hình thái mô tả các loài trong chi Camellia sp. ..................... 10
Bảng 2.2. Xây dựng dãy dung dịch chuẩn acid gallic ............................................ 16
Bảng 3.1. Kết quả định tính .................................................................................... 27
Bảng 3.2. Giá trị Rf và màu sắc các vết trên sắc ký đồ .......................................... 28
Bảng 3.3. Độ hấp thụ của dãy chuẩn ...................................................................... 29
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp trên mẫu nghiên cứu ....... 30
Bảng 3.5. Kết quả xây dựng đường chuẩn EGCG .................................................. 32
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu lá Trà hoa vàng Thái Nguyên ...... 33
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp ........................................... 34

Bảng 3.8. Kết quả bán định lượng EGCG .............................................................. 34
Bảng 3.9. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử ................................. 35
Bảng 3.10. Kết quả ức chế tế bào ung thư in vitro của lá Trà hoa vàng Thái
Nguyên .................................................................................................................... 36
Bảng 3.11. Một số đặc điểm tương đồng về hình thái của Camellia euphlebia và
Trà hoa vàng Thái Nguyên ..................................................................................... 37


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Công thức cấu tạo một số loại catechin ................................................... 5
Hình 2.1. Sơ đồ các bước tiến hành định lượng polyphenol toàn phần .................. 17
Hình 3.1. Hình thái mẫu Trà hoa vàng Thái Nguyên ............................................. 23
Hình 3.2. Vi phẫu lá Trà hoa vàng Thái Nguyên .................................................... 25
Hình 3.3. Vi phẫu thân Trà hoa vàng Thái Nguyên ............................................... 26
Hình 3.4. Sắc ký đồ của chuẩn EGCG và mẫu thử hiện màu bằng thuốc thử vanilin
- H2SO4 ở ánh sáng thường ..................................................................................... 28
Hình 3.5. Hình ảnh quét phổ của dung dịch chuẩn acid gallic nồng độ 50 µg/ml . 29
Hình 3.6. Đường chuẩn acid gallic ......................................................................... 30
Hình 3.7. Kết quả chồng pic của mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu trắng ..................... 31
Hình 3.8. Sắc ký đồ dãy chuẩn EGCG.................................................................... 32
Hình 3.9. Đường chuẩn EGCG ............................................................................... 32
Hình 3.10. Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại trên mẫu lá Trà hoa vàng Thái Nguyên . 33
Hình 3.11. Sắc ký đồ khảo sát độ đúng của phương pháp ...................................... 33
Hình 3.12. Đồ thị sự phụ thuộc Tỷ lệ gốc tự do bị trung hòa theo nồng độ mẫu thử35


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chi Trà (Camellia L.) là một chi lớn trong họ Chè (Theaceae), rất nổi tiếng
với cây Trà xanh (C. Sinensis (L.) O. Ktze) đã được sử dụng trong cuộc sống từ rất
lâu đời vai trò làm thức uống và thực phẩm chức năng hoặc làm thuốc với các tác
dụng sinh học tốt [37]. Bên cạnh đó, trong chi Camellia L. còn có rất nhiều loài
khác cũng có hoạt tính sinh học rất đáng quan tâm như tác dụng chống oxy hóa, tác
dụng chống ung thư, tác dụng kháng nấm, kháng virus, v.v. [47]. Trà hoa vàng là
một nhóm trong số các loài thuộc chi Camellia L. với màu vàng đặc trưng của hoa.
Đây là nguồn gen vô cùng quý hiếm của chi Camellia L. chỉ gặp ở miền Bắc Việt
Nam và Nam Trung Quốc [11].
Ở Việt Nam, Trà hoa vàng lần đầu tiên được người Pháp phát hiện ở miền
Bắc vào năm 1910 [11]. Tuy nhiên, cho đến những năm gần đây, Trà hoa vàng mới
được quan tâm nghiên cứu và khai thác để sử dụng. Mặc dù vậy, các nghiên cứu về
thành phần hóa học và tác dụng sinh học của các loài Trà hoa vàng còn rất hạn chế.
Cho đến nay, các nghiên cứu về Trà hoa vàng mới chỉ tập trung chủ yếu vào phần
thực vật với việc tìm ra các loài Trà hoa vàng mới ở Việt Nam. Ước tính có khoảng
30 loài Trà hoa vàng đã được công bố có ở Việt Nam, tập trung chủ yếu ở miền Bắc
(VQG. Tam Đảo) hoặc một số khu vực miền Nam (VQG. Cát Tiên, VQG. Bù Gia
Mập) [31], [32], [34]. Tuy nhiên, vẫn còn một số khu vực cũng phát hiện có Trà hoa
vàng nhưng chưa được nghiên cứu như ở Ba Chẽ (Quảng Ninh) hoặc Yên Ninh
(Thái Nguyên), v.v.
Từ thực tế đó, đề tài “ Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học
và tác dụng sinh học của Trà hoa vàng ở Thái Nguyên” được thực hiện nhằm đạt
được các mục tiêu sau:
- Mô tả đặc điểm hình thái và cấu tạo giải phẫu của cây Trà hoa vàng Thái
Nguyên.
-

Xác định thành phần hóa học của mẫu nghiên cứu, định lượng thành phần

hóa học chính trong lá của mẫu nghiên cứu.

-

Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa và tác dụng độc tế bào ung thư in vitro

của lá mẫu nghiên cứu.


2

Chương 1. TỔNG QUAN

1.1.

Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật chi Camellia L.

1.1.1. Vị trí phân loại của chi Camellia L.
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan công bố năm 2009 [22], chi Trà hoa
vàng (Camellia L.) có vị trí phân loại như sau:
Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta).
Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida).
Phân lớp: Sổ (Dilleniidae).
Bộ: Trà (Theales).
Họ: Trà (Theaceae).
1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Camellia L.
Theo các tài liệu Từ điển thực vật thông dụng của Võ Văn Chi [7], sách Trà hoa
vàng của Trần Ninh [11] chi Camellia L. có đặc điểm:
Cây bụi hoặc cây nhỏ, thường xanh, cành nhẵn hay có lông. Lá thường có
cuống, đơn, mọc so le, không có lá kèm; chóp lá nhọn, có đầu nhọn hoặc kéo dài
thành đuôi; gốc lá hình nêm hẹp, nêm rộng, tròn hay hình tim; mép có răng cưa
nhọn hoặc tù. Hoa đều, lưỡng tính, kích thước lớn hoặc nhỏ, mọc đơn độc ở nách lá

hoặc đầu cành. Hoa màu đỏ, trắng hoặc vàng. Cuống hoa ngắn hoặc gần như không.
Lá bắc 2 - 10, mọc xoắn trên cuống hoa. Cánh hoa 4 - 19, hợp một phần ở gốc cùng
với vòng nhị ngoài. Nhị nhiều, dính với nhau ở phía gốc, vòng nhị phía trong rời
nhau, chỉ nhị dài. Bầu trên, 1 - 5 ô, vòi nhụy 1 - 5, dạng sợi, rời hoặc dính nhau; bầu
và vòi nhụy nhẵn hay phủ lông mịn. Quả nang, hình cầu dẹt hoặc hình trứng, khi
khô chẻ ô từ trên xuống thành 3, 4 hay 5 mảnh; có trụ hay không; vỏ quả dày hay
mỏng, hóa gỗ. Hạt 1 đến nhiều hạt trong mỗi ô, hình cầu, nửa cầu hay hình nêm, vỏ
hạt màu nâu, nâu hạt dẻ nhạt hoặc nâu hồng, phủ lông hay nhẵn.
1.1.3. Phân bố
Trên thế giới, chi Camellia L. có khoảng 280 loài, phân bố chủ yếu ở nhiệt đới
và á nhiệt đới, có nguồn gốc ở khu vực miền đông và miền nam châu Á, từ dãy
Himalaya về phía đông tới Nhật Bản và Indonesia. Cho tới nay, có rất nơi trên thế
giới có các loài thuộc chi này. Đó là các nước ở châu Á (Ấn độ, Bangladesh, Đài


3

Loan, Hàn Quốc, Indonesia, Iran, Malaysia, Myanmar, Nepal, Nhật Bản, Sri-lanka,
Trung Quốc, Việt Nam); châu Âu (Thổ Nhĩ Kỳ, Liên Xô cũ); châu Phi (Burundi,
Ethiopia, Kenya, Maritius, Nam Phi, Uganda); khu vực Nam Mỹ (Argentina, Brazil,
Ecuador, Peru) và châu Đại Dương (Australia, New-Ghine) [11], [39].
Ở Việt Nam, chi Camellia L. có khoảng 77 loài, phân bố từ Bắc vào Nam (Yên
Bái, Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Quảng Ninh, Lâm Đồng, Bình Phước, v.v) [32], [33],
[34].
1.1.4. Một số loài Trà hoa vàng ở Việt Nam
Danh mục một số loài Trà hoa vàng ở Việt Nam [13], [14], [16], [17], [29],
[31], [32], [33], [34], [41], [43], [50], [51], [52], [53], [54], [55], [56], [57] được
trình bày trong Bảng 1.1. Đặc điểm hình thái của các loài này được trình bày trong
Bảng 1và Bảng 2, Phụ lục 2.
Bảng 1.1. Danh mục một số loài Trà hoa vàng ở Việt Nam

STT
1
2
3
4
5

Tên loài
Camellia bugiamapensis Orel, Curry, Luu & Q.D
Camellia capitata Orel
Camellia cattienensis Orel
Camellia crassiphylla Ninh et Hakoda

6
7
8
9
10

Camellia Chrysantha (Hu) Tuyama
Camellia chrysanthoides Hung T. Chang
Camellia dalatensis V.D.Luong, Ninh & Hakoda
Camellia dilinhensis Tran & Luong

11
12
13
14
15
16

17

Camellia dormoyana (Pierre) Sealy
Camellia euphlebia Merr. ex Sealy
Camellia flava (Pitard) Sealy
Camellia fleuryi (A. Chev.) Sealy
Camellia gilberti (A.Chev.) Sealy
Camellia hakodae Ninh, Tr

Camellia cucphuongensis Ninh & Rosmann

Camellia dongnaiensis Orel

Camellia hirsuta Hakoda et Ninh

Tên thường gọi
Trà bù gia mập
Trà đầu
Trà cát tiên
Trà vàng lá dày
Trà mi Cúc
Phương
Trà hoa vàng
Trà mi đà lạt
Trà mi di linh
Trà hoa vàng
đồng nai
Trà vàng đo môi
Trà gân
Chè sốp

Trà vàng Ginbéc
Trà vàng Hakoda
Trà vàng nhiều
lông


4

18
19

Camellia inusitata Orel, Curry & Luu

20
21
22
23
24
25

Camellia luteopallida Luong, T.Q.T. Nguyen & Luu
Camellia ninhii Luong & Le
Camellia oconoriana Orel, Curry & Luu
Camellia petelotii (Merr.) Sealy
Camellia phanii Hakoda et Ninh
Camellia sonthaiensis Luu, Luong, Q.D. Nguyen &
T.Q.T. Nguyen
Camellia tamdaoensis Hakoda et Ninh
Camellia tienii Ninh, Tr
Camellia tonkinensis (Pit.) Cohen-Stuart

26
27
28

1.2.

Camellia luteocerata Orel

Trà mi cành dẹt
Trà hoa vàng
trắng

Trà âu-con- nơ
Trà vàng Pêtêlô
Trà vàng phan
Trà sơn thái
Trà vàng tam đảo
Hải đường vàng

Thành phần hóa học

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của chi
Camellia L. Các thành phần hoá học chính có hoạt tính sinh học cao thường gặp
trong Camellia L. là nhóm alcaloid (cafein, theobromin, theophylin, adenin,
guanin); các polyphenol và tinh dầu (metyl salicylat, citronellol, v.v). Ngoài ra,
trong lá của các loài Camellia L. còn có các nhóm flavonoid (kaempferol,
quercetin), saponin triterpenoid (camelliasid A, B), acid hữu cơ (acid oxalic, acid
nicotinamic, acid ascorbic,v.v), protein, acid amin, pectin và đường khử. Bên cạnh
lá, trong hạt của Camelilia L. còn có các acid béo palmitic, stearic, oleic, linoleic,

myristic và arachidic [17]. Trong các nhóm chất này, ba nhóm chất đầu luôn được
coi là các thành phần quan trọng nhất quyết định tính chất của trà.
1.2.1. Nhóm alcaloid trong Camellia L.
Đối với Trà xanh (C. sinensis (L.) O. Ktze), thành phần quan trọng nhất
trong lá Trà xanh là alcaloid nhân purin, chẳng hạn như cafein, nó quyết định chất
lượng của trà và không biến đổi trong quá trình chế biến. Ngoài ra, trong Trà xanh
còn có theophylin, theobromin, xanthin [17], [39].
1.2.2. Nhóm tanin (các polyphenol) trong Camellia L.
Nhóm tanin (các polyphenol) được coi là quan trọng thứ hai trong trà. Tanin
có ở chi Camellia L. thuộc loại tanin ngưng tụ (pyrocathechic), được tạo thành do
sự ngưng tụ từ các đơn vị flavan - 3 - ol như catechin. Lượng chất polyphenol toàn
phần có thể được định lượng bằng phương pháp HPLC [23].


5

Đối với lá Trà xanh (C. sinensis (L.) O. Ktze), tanin chiếm 15-30%, sau khi
chế biến thì nó trở thành vị chát. Đây là nhóm bị biến đổi khi chế biến trà. Các
polyphenol trong lá là loại polyphenol trung bình, gồm một lượng nhỏ acid gallic,
chiếm 48% [38]. Từ Trà xanh Nhật bản, đã phân lập được các chất polyphenol là
epicatechin (EC), galocatechin (GC), epicatechin gallat(ECG), epigallocatechin
gallat (EGCG) (Hình 1.1.). Đây là những chất được quan tâm nhiều nhất do có
nhiều tác dụng sinh – dược học đáng chú ý như: giúp ổn định huyết áp, giảm nguy
cơ đột quỵ và bệnh tim mạch, bảo vệ da khỏi tác dụng của tia UV. Trong các thành
phần này, EGCG là thành phần polyphenol chủ yếu, làm giảm các nguy cơ bệnh tim
mạch và ung thư, chiếm khoảng 48 - 55% polyphenol toàn phần trong lá Trà xanh
[11], [17], [38].
Đây cũng là định hướng chính của đề tài này khi nghiên cứu thành phần hóa
học với việc định tính, định lượng polyphenol và EGCG có trong mẫu nghiên cứu.
1.2.3. Nhóm tinh dầu trong Camellia L.

Tinh dầu cất được từ lá tươi của Trà xanh vào mùa xuân là 0,014% và mùa
hè là 0,007%. Thành phần chủ yếu trong tinh dầu Trà xanh là hexenal, hexenol và
các aldehyd. Ngoài ra, còn có một lượng nhỏ các chất butyraldehyd,
isobutyraldehyd và isovaleraldehyd, cùng với n-hexyl, benzyl, phenylethylalcon,
geraniol, linalool, acetophenon và citral [17].

Hình 1.1. Công thức cấu tạo một số loại catechin


6

1.3.

Về tác dụng sinh học

1.3.1. Tác dụng chống oxy hóa
Nhiều nghiên cứu đã khẳng định khả năng chống oxy hóa của trà là do hoạt tính
của các hợp chất polyphenol [23], [36], [37], [38], [45], [49]. Lá của loài Camellia
chrysantha (Hu) Tuyama có tác dụng chống oxy hóa mạnh, thể hiện qua khả năng
trung hòa gốc tự do [38]. Các chất được xác định trong lá của loài Camellia
chrysantha (Hu) Tuyama có tác dụng trung hòa gốc tự do là: epicatechin, vitexin,
isovitexin, quercetin-7-O-β-D-glucopyranoside và kaempferol [36]. Tác dụng chống
oxy hóa của polyphenol thu được từ lá Trà xanh đã được đánh giá theo khả năng
bảo quản dầu hạt cải và khi so sánh với các chất có tính chống oxy hóa đã biết như
acid ascorbic và tocopherol [34]. Một nghiên cứu khác chỉ ra rằng, polyphenol chiết
xuất từ lá Trà xanh thứ phẩm có tác dụng chống oxy hóa rất rõ rệt và mạnh hơn
nhiều so với acid ascorbic và tocopherol [38].
Nghiên cứu của Lixia Song và cộng sự đánh giá khả năng chống oxy hóa của
polyphenol trong 6 mẫu Trà hoa vàng thu hái ở Trung Quốc: C. impressinervis, C.
euphlebia, C. microcarpa, C. nitidissima, C. tunghinensis và C. chrysantha theo mô

hình DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl), được
phân tích bằng phương pháp HPLC cho thấy có phản ứng rõ rệt giữa các thành phần
catechin trong trà với DPPH thể hiện rõ khi mà các đỉnh tương ứng tồn tại trong sắc
ký đồ ban đầu của các chiết xuất ban đầu biến mất sau khi thêm DPPH [49].
1.3.2. Tác dụng chống ung thư
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng Trà xanh với thành phần chủ yếu là các
polyphenol và đặc biệt là EGCG có khả năng ức chế sự phát triển của một số dòng
tế bào ung thư ở người. Một số công trình nghiên cứu đã chứng minh tác dụng kìm
hãm của polyphenol trong trà lên sự hình thành, phát triển và di căn của khối u. Tác
dụng này chủ yếu là do hiệu quả chống oxy hóa cao và chống tăng sinh khối u của
các hợp chất polyphenol trong trà [9], [20], [40], [41], [43]. Các cơ chế chính giải
thích tác dụng ức chế sự phát triển tế bào u của EGCG được đề cập là: (1) tác dụng
ngăn cản chu kỳ phân chia tế bào, dừng chu kỳ phân chia tế bào ở các pha G1, G2;
(2) thúc đẩy quá trình chết tế bào theo chương trình [26]. Viện Lý Hóa – Viện Hàn
lâm khoa học Liên Xô (cũ) đã đã sử dụng những hợp chất flavonoid hoặc


7

polyphenol có độc tính thấp như những chất chống oxy hóa để nghiên cứu lâm sàng
điều trị một số dạng ung thư và cho rằng cơ chế chống khối u của flavonoid không
chỉ do khả năng chống oxy hóa mà còn tác dụng tổng hợp do khả năng phản ứng đa
dạng của phân tử flavonoid. Dịch chiết polyphenol trong trà xanh có tác dụng ức
chế sự phát triển tế bào của dòng tế bào ung thư phổi LU -1 và dòng tế bào ung thư
gan Hep – G2, tác dụng rõ nhất trên dòng LU – 1 với giá trị IC50 là 3, 84 µM của
EGCG Trà xanh. Bước đầu phát hiện sự tăng hoạt độ của enzym caspase – 3 trên
dòng tế bào LU -1 được bổ sung EGCG Trà xanh vào môi trường nuôi cấy [47].
Như vậy, các loài trong chi Trà Camellia L. với những nghiên cứu hiện có đã thể
hiện tác dụng nổi bật là chống oxy hóa và ức chế sự phát triển của tế bào ung thư.
Vì vậy, trong phạm vi nghiên cứu, chúng tôi tiến hành thử tác dụng chống oxy hóa

và tác dụng ức chế sự phát triển tế bào ung thư in vitro của mẫu Trà hoa vàng Thái
Nguyên.
1.4.

Một số phương pháp định lượng polyphenol
Hàm lượng polyphenol toàn phần có thể xác định bằng nhiều kỹ thuật khác

nhau: quang phổ hồng ngoại, sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC), sắc ký lỏng
kết hợp với khối phổ (LC-MS), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [26].
Năm 2010, một nhóm nghiên cứu và phát triển công nghệ hóa sinh đã tiến
hành định lượng polyphenol tổng số của 16 mẫu trà (8 mẫu tươi và 8 mẫu khô) bằng
phương pháp đo quang, sử dụng thuốc thử Folin - Denis.
Năm 2013, Bộ khoa học và công nghệ Việt Nam đã đưa ra tiêu chuẩn quốc gia
TCVN 9745 - 1:2013 (ISO 14502 - 1:2005) quy định phương pháp xác định hàm
lượng polyphenol toàn phần trong Trà xanh và Trà đen bằng phương pháp đo màu
sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu [4].
Với Trà hoa vàng, do chưa có phương pháp nào được công bố chính thức để
định lượng polyphenol toàn phần nên trong phạm vi nghiên cứu, chúng tôi áp dụng
phương pháp định lượng theo TCVN 9745 - 1:2013.
Nguyên tắc: Polyphenol có trong mẫu trà được chiết bằng methanol 70% ở
60oC. Định lượng polyphenol tổng trong trà bằng phương pháp đo quang, dùng
thuốc thử Folin- Ciocalteu. Thuốc thử này chứa acid phospho-vonframic, phản ứng
xảy ra theo cơ chế oxy hóa- khử. Nhóm hydroxyl trong pholyphenol dễ bị oxy hóa,


8

sản phẩm của phản ứng có màu xanh lam của vonfram và molypden, có độ hấp thụ
cực đại ở bước sóng 765 nm. Xây dựng đường chuẩn dựa trên acid gallic [4], [30],
[45].

Cơ chế phản ứng
Na2WO4 / Na2MO4 (màu vàng) => (Phenol - MoW11O40)-4 (màu xanh)
Mo+6 + e-1 => Mo+5 (màu xanh)
Mo+5 + e-1 => Mo+4 (màu xanh)
ØOH => ØȮ + H+1 +e-1
ØO-1 => ØȮ + e-1
Phản ứng xảy ra nhanh ở pH kiềm và xảy ra chậm hơn ở pH acid [45].
1.5.

Vài nét về phương pháp bán định lượng bằng sắc ký lớp mỏng bằng

phần mềm VideoScan
Khái niệm bán định lượng: Bán định lượng là xác định một các gần đúng hàm
lượng của một chất, kết quả bán định lượng rơi vào khoảng giữa của một kết quả
định lượng và một kết quả định tính [21].
Khi bán định lượng các chất bằng TLC, độ chính xác của kết quả phụ thuộc
nhiều vào kỹ thuật xác định và lượng giá vết trên sắc ký đồ. Nếu sử dụng kỹ thuật
xử lý ảnh sắc ký với camera kỹ thuật số thì độ chính xác của kết quả phần lớn phụ
thuộc vào phần mềm xử lý dữ liệu hình ảnh.
Phần mềm xử lý ảnh VideoScan là một phần mềm có hạn chế về độ chính xác
khi đọc kết quả dữ liệu ảnh. Vì vậy, khi sử dụng phần mềm này để xử lý ảnh sắc ký
đồ thì chỉ có thể xác định được sơ bộ hàm lượng các chất trong mẫu phân tích (bán
định lượng).


9

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu, thiết bị

2.1.

2.1.1. Nguyên liệu
Các mẫu Trà hoa vàng thu hái tại Yên Ninh (Thái Nguyên) ngày 31/12/2015
được giám định tên khoa học và lưu giữ mẫu tại bộ môn Thực vật – Trường Đại học
Dược Hà Nội.
Mã số tiêu bản: HNIP/18162/16.
- Mẫu để nghiên cứu đặc điểm hình thái và làm tiêu bản mẫu khô: mẫu tươi mang
cành, lá, hoa
- Mẫu để nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng sinh học: mẫu lá tươi, làm sạch,
sấy khô, nghiền nhỏ
2.1.2. Thiết bị
Thiết bị nghiên cứu đặc điểm thực vật:
-

Kính lúp soi nổi Leica EZ4

-

Máy ảnh kỹ thuật số Canon EOS 60D + Canon 100mm f2.8 Macro

Thiết bị nghiên cứu thành phần hóa học:
 Máy cô quay Buchi.
 Máy đo quang Hitachu U-1900
 Bản mỏng silicagel GF 254 Merck
 Hệ thống máy sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao CAMAG gồm: máy chấm sắc ký
Linomat 5, buồng triển khai ADC2, mấy nhúng thuốc thử CAMAG, buồng phát
hiện TLC Visualizer, phần mềm phân tích winCATS và VideoScan.
 Các dụng cụ thủy tinh: cốc có mỏ, bình định mức, ống nghiệm, pipet chính xác

các loại, đũa thủy tinh, phễu thủy tinh, bình gạn.
Thiết bị nghiên cứu tác dụng sinh học:
- Đĩa 96 giếng nhựa (Corning, USA), máy đọc ELISA 96 giếng (Bio-rad).
2.1.3. Dung môi, hóa chất
-

Chất chuẩn Epigallo catechin gallat (EGCG) 96,54%, Viện Kiểm Nghiệm thuốc
Trung ương.

-

Chất chuẩn acid gallic 97%, Trung tâm kiểm nghiệm Thành phố Hà Nội

-

Dung môi: methanol, aceton, chloroform, acid formic, nước cất.


10

-

Thuốc thử: vanilin - dung dịch acid sulfuric.

-

FBS của GIBCO, Invitrogen,; TCA(Sigma, Mỹ), SRB (Sigma, Mỹ), DPPH
(Sigma, Mỹ)

-

Acid ascorbic (Sigma, Mỹ), Ellipticine (Sigma, Mỹ),

-

Các hóa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, GIBCO, Invitrogen v.v.
Các hoá chất và thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dược

Điển Việt Nam IV.
Các dòng tế bào ung thư: do GS. TS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và
GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp: ung thư phổi, ung thư
vú, ung thư gan, ung thư trực tràng, ung thư da.

2.2.

Nội dung, phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái
2.2.1.1. Phân tích hình thái
Mô tả phân tích đặc điểm hình thái của các mẫu nghiên cứu theo phương
pháp mô tả phân tích [2], [6]. Trong nghiên cứu các đặc điểm được mô tả thuộc các
nhóm: Dạng sống, thân, lá, hoa (Bảng 2.1).
Bảng 2.1. Đặc điểm hình thái mô tả các loài trong chi Camellia sp.
Stt Cơ quan

Các đặc điểm mô tả

1.

Dạng sống

Dạng sống, chiều cao

2.

Thân

Hình dạng thân già, bề mặt cành non

3.

Lá

Cách mọc của lá, cuống lá, hình dạng phiến, hình dạng mép, số
cặp gân chính, kích thước, bề mặt trên, bề mặt dưới
Kiểu cụm hoa, số hoa mỗi cụm, lá bắc, đài (hình dạng, bề mặt),

4.

Hoa

tràng (hình dạng, tràng phụ), bộ nhị (số lượng, hình dạng, kích
thước, liền/rời), bộ nhụy (hình dạng kích thước lá noãn, vòi
nhụy).


11

2.2.1.2. Giám định tên khoa học
Tên khoa học được xác định dựa trên khóa phân loại và mô tả loài trong các

tài liệu về thực vật trong nước và các tài liệu ngoài nước. Các mẫu sau khi tra khóa
được so sánh đối chiếu với các tiêu bản tại các phòng tiêu bản của Viện Sinh thái và
Tài nguyên sinh vật, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
2.2.2. Nghiên cứu thành phần hóa học
2.2.2.1. Định tính các nhóm chất trong ống nghiệm
a. Định tính các thành phần trong dịch chiết ether dầu hỏa
Cân khoảng 5 g bột dược liệu cho vào bình chiết soxhlet. Chiết bằng 50 ml
ether dầu hỏa đến khi dung môi trong bình chiết không màu. Dịch chiết đem cất thu
hồi bớt dung môi. Dịch chiết đậm đặc thu được dùng để làm các phản ứng định tính
chất béo, tinh dầu và sterol.
Định tính chất béo:
Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy lọc, hơ khô thấy để lại vết mờ trên giấy.
Định tính sterol (phản ứng Liebermann – Burchardt):
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết ether dầu hỏa. Bốc hơi dung môi đến
cắn. Thêm 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho cắn tan hết, nghiêng 450. Cho từ từ theo
thành ống 0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Ở mặt tiếp
xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện vòng màu tím đỏ, lớp dưới có màu hồng, lớp
trên màu xanh lá.
b. Định tính các thành phần có trong dịch chiết cồn
Cân khoảng 5 g dược liệu vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 50 ml cồn 900,
đun sôi cách thủy vài phút. Dịch chiết được lọc và cô còn khoảng 10 ml để làm các
phản ứng định tính flavonoid, coumarin, acid amin.
Định tính coumarin
-

Phản ứng mở đóng vòng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml dịch

chiết cồn, ống 1 thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%, ống 2 để nguyên. Sau đó đun
sôi cách thủy cả 2 ống nghiệm trong vài phút. Để nguội rồi quan sát thấy ống 1 có
màu vàng hoặc tủa đục màu vàng, ống 2 trong. Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống

12

2 ml nước cất, lắc đều rồi quan sát, thấy ống 1 trong suốt, ống 2 có tủa đục. Acid
hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc thì ống 1 trở lại đục như ống 2.
-

Phản ứng diazo hóa: cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết cồn, thêm vào đó 2

ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thủy đến sôi, để nguội. Nhỏ vài giọt thuốc thử
diazo (mới pha), thấy xuất hiện tủa màu đỏ gạch.
Định tính flavonoid
-

Phản ứng Cyanidin (phản ứng Shinoda): Cho 1ml dịch chiết cồn vào ống

nghiệm, thêm một ít bột magnesi kim loại, nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3 - 5 giọt).
Để yên một vài phút, dung dịch chuyển từ màu vàng sang đỏ.
-

Phản ứng với kiềm:

Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%, thấy
xuất hiện tủa vàng. Thêm 1 ml nước cất, tủa tan và màu vàng của dung dịch tăng
lên.
Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên giấy lọc, hơ khô rồi để trên miệng lọ amoniac đặc thấy
màu vàng của dịch chiết tăng lên. Nhỏ 1 giọt khác làm chứng.
-

Phản ứng với FeCl3: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết cồn, thêm vài giọt

dung dịch FeCl3 5%, thấy xuất hiện tủa xanh đen.
Định tính acid amin
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết cồn, thêm vài tinh thể ninhydrin thấy xuất
hiện màu xanh tím
c. Định tính các thành phần trong dịch chiết nước
Lấy 1 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 20 nước cất, đun
sôi cách thủy trong vài phút, để nguội, lọc lấy dịch chiết để định tính nhóm đường
khử, acid hữu cơ và tanin.
Định tính đường khử
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết nước, thêm 0,5 ml thuốc thử Fehling A
và 0,5 ml thuốc thử Fehling B. Đun sôi cách thủy vài phút thấy xuất hiện tủa đỏ
gạch.
Định tính acid hữu cơ
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết nước, thêm vài tinh thể natri carbonat
thấy xuất hiện bọt khí


13

Định tính tanin
Lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml dịch chiết nước để làm các phản ứng
sau:
-

Ống 1: thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5%, thấy xuất hiện tủa màu hoặc tủa
màu xanh đen hoặc xanh nâu nhạt.

-

Ống 2: thêm 2 giọt chì acetat 10%, thấy xuất hiện tủa bông

-

Ống 3: thêm 5 giọt gelatin 1%, thấy xuất hiện tủa bông trắng.

Ngoài ra, chúng tôi còn tiến hành định tính tanin catechic trong mẫu nghiên cứu
bằng phản ứng đặc trưng: Lấy 0,2 g bột dược liệu, thêm 10 ml methanol, đun cách
thủy đến sôi, để nguội, lọc. Lấy 1ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml dung
dịch vanilin 1% và 1 ml dung dịch HCl đậm đặc thấy xuất hiện màu đỏ đậm.
Định tính saponin (phản ứng tạo bọt): cho vào ống nghiệm 0,1 g bột dược liệu,
thêm 5 ml nước cất. Lắc mạnh trong 5 phút, để yên. Nếu còn bọt bền vững sau 15
phút thì sơ bộ kết luận dược liệu có chứa saponin.
d. Định tính các nhóm chất khác
Định tính alcaloid
Lấy 5 g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 15 ml dung dịch
H2SO4 1N, đun đến sôi trong vài phút. Để nguội, lọc dịch chiết vào bình gạn, kiềm
hóa bằng dung dịch amoniac 6N đến pH = 9 – 10 (thử bằng giấy quỳ hoặc chỉ thị
màu vạn năng). Chiết alcaloid base bằng ether hoặc cloroform 3 lần, mỗi lần 5 ml.
Dịch chiết ether hoặc cloroform được gộp lại, lắc với acid sulfuric 1N hai lần, mỗi
lần 5 ml. Gộp các dịch chiết nước, cho vào 3 ống nghiệm, mối ống 1ml, nhỏ vào
từng ống nghiệm 2-3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:
-

Ống 1: thuốc thử Mayer, cho tủa màu trắng đến vàng.

-

Ống 2: thuốc thử Bouchardat, cho tủa nâu đến đỏ nâu.

-

Ống 3: thuốc thử Dragendorff, cho tủa cam đến đỏ.

Định tính anthranoid: (phản ứng Borntraeger):
Cho vào ống nghiệm 0,5 g bột dược liệu, thêm 5 ml dung dịch H2SO4 1N, đun
sôi trực tiếp trên nguồn nhiệt, lọc dịch chiết còn nóng vào bình gạn, để nguội rồi lắc
với 5 ml ether hoặc cloroform. Lấy 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 1 ml dung
dịch NaOH 10%, lắc nhẹ thấy lớp nước có màu đỏ sim.


14

Định tính glycosid tim
Lấy 5 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 50 ml cồn 25%
rồi ngâm 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ, loại tạp bằng dung
dịch chì acetat 30% đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat. Chuyển toàn bộ
dịch lọc vào bình gạn, lắc với cloroform 2 lần, mỗi lần 8 ml. Gộp dịch chiết
cloroform vào cốc có mỏ, loại nước bằng natrisulfat khan. Dịch chiết được chia vào
các ống nghiệm, cô cách thủy đến cắn để làm các phản ứng sau:
- Phản ứng Liebermann – Burchardt: cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 1
ml anhydrid acetic, lắc đều cho cắn tan hết, nghiêng 450. Cho từ từ theo thành ống
0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Ở mặt tiếp xúc giữa hai
lớp chất lỏng xuất hiện vòng màu tím đỏ, lớp dưới có màu hồng, lớp trên màu xanh
lá.
- Phản ứng Baljet: cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5 ml cồn 900, lắc
đều cho cắn tan hết. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha đến khi thấy xuất hiện
màu đỏ cam. Làm song song với một ống chứng không có cắn, ống thử có màu đỏ
cam đậm hơn ống chứng.

- Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm chứa cắn ở trên 0,5 ml cồn 900, lắc
đều cho cắn tan hết. Nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung
dịch NaOH 10%, lắc đều thấy xuất hiện màu đỏ cam. Làm song song với một ống
chứng không có cắn, ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng.
2.2.2.2. Định tính EGCG bằng sắc ký lớp mỏng
Nguyên liệu: mẫu lá Trà hoa vàng sấy khô ở 45oC, xay nhỏ.
Chiết xuất: Cân 0,5 g mẫu, làm ẩm bằng methanol, chiết với 10 ml methanol
bằng phương pháp chiết siêu âm trong 30 phút. Lọc lấy dịch chiết, cất thu hồi dung
môi dưới áp suất giảm đến còn 1 ml thì dùng để chấm sắc ký.
Chuẩn bị mẫu chuẩn EGCG trong methanol nồng độ 1 mg/ml.
Lựa chọn điều kiện triển khai sắc ký
- Bản mỏng: bản mỏng TLC silica gel 60 F254 (Merck) hoạt hóa ở 110oC trong
30 phút. Kích thước bản mỏng 20 × 10 cm.
-

Đưa mẫu lên bản mỏng: mẫu được tiêm lên bản mỏng bằng máy Linomat 5.

Vị trí tiêm mẫu cách mép dưới bản mỏng 8 mm, cách mép dung môi 3,0 mm.


15

Khoảng cách giữa vết ngoài cùng và mép ngoài bản mỏng 15,0 mm. Độ dài băng
chấm 8,0 mm.
-

Thể tích tiêm mẫu 3 µl.

-

Điều kiện chạy TLC:
+ Điều kiện môi trường: nhiệt độ 26oC; độ ẩm tương đối 65%.
+ Thể tích dung môi bão hòa: 25,0 ml; dung môi khai triển: 10,0 ml.
+ Thời gian bão hòa dung môi: 20 phút.
+ Thời gian bão hòa bản mỏng: 3 phút.
+ Khoảng cách dịch chuyển của pha động: 75,0 mm.
Khảo sát sắc ký với một số hệ dung môi sau:
 Hệ 1: Chloroform – methanol – aicd formic (6:3:1)
 Hệ 2: Chloroform – aceton – acid formic (5:5:1)
 Hệ 3: n- Butanol – aceton – acid acetic (5:5:3)
Lựa chọn hệ dung môi và điều kiện phát hiện tốt nhất để đánh giá kết quả và

sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo.
Đánh giá: Mẫu thử được coi là có EGCG khi trên sắc ký đồ của mẫu thử, tại
vị trí Rf của EGCG chuẩn có vết với màu sắc giống như mẫu chuẩn.
2.2.2.3. Định lượng Polyphenol toàn phần
Nguyên tắc: Dựa trên phương pháp định lượng polyphenol toàn phần trong
Trà xanh theo TCVN 9745 - 1:2013 (ISO 14502 - 1: 2005), tiến hành định lượng
polyphenol toàn phần trong mẫu nghiên cứu bằng phương pháp đo quang với chất
chuẩn là acid gallic. Do mẫu nghiên cứu là Trà hoa vàng, không giống với đối
tượng Trà xanh trong TCVN 9745 - 1: 2013 và một số tài liệu cho thấy rằng sản
phẩm của phản ứng với polyphenol có độ hấp thụ cực đại khác với TCVN 9745 - 1:
2013 [4], [30], [45], nên khi tiến hành định lượng cần xác định bước sóng hấp thụ
cực đại của sản phẩm và độ lặp lại của phương pháp để cho kết quả chính xác.
Tiến hành:
Chuẩn bị dung môi và thuốc thử
-

Dung môi chiết (Methanol / nước): cho 700 ml methanol vào bình định

mức 1 vạch 1l, pha loãng bằng nước đến vạch.


16

Thuốc thử: pha loãng dung dịch thuốc thử Folin- Ciocalteu 10 lần ngay

-

trước khi tiến hành phản ứng.
Dung dịch Na2CO3 7,5%: Cân 37,5 ± 0,01 gam natri carbonat (Na2CO3)

-

cho vào bình định mức 1 vạch 500 ml. Thêm nước ấm đến nửa bình, lắc để hòa tan,
để nguội đến nhiệt độ phòng và pha loãng bằng nước cho đủ thể tích.
Dung dịch chuẩn gốc acid gallic nồng độ chính xác khoảng 1000 µg/ml: Cân

-

chính xác khoảng 0,110 ± 0,001 gam acid gallic chuẩn 97% cho vào bình định mức
một vạch 100 ml. Hòa tan bằng nước và pha loãng đến đủ thể tích.
Dung dịch chuẩn gallic: dùng pipet chính xác chuyển các thể tích dung dịch

-

chuẩn gốc gallic vào bình định mức 1 vạch 100 ml và pha loãng bằng nước theo
Bảng 2.2.
Bảng 2.2. Xây dựng dãy dung dịch chuẩn acid gallic
Dung dịch chuẩn

Thể tích dung dịch

Nồng độ lý thuyết của dung dịch

acid gallic

chuẩn gốc (ml)

chuẩn pha loãng (µg/ml)

C10

1,0

10

C20

2,0

20

C30

3,0

30

C40

4,0

40

C50

5,0

50

C60

6,0

60

Chuẩn bị mẫu thử:
Tiến hành lặp lại 6 lần với mẫu nghiên cứu.
-

Lấy một lượng nhỏ mẫu để xác định hàm ẩm bằng cân hàm ẩm.

-

Chiết polyphenol toàn phần trong mẫu nghiên cứu: Cân chính xác khoảng

0,3000 g bột dược liệu cho vào ống chiết 10 ml, thêm 5 ml dung môi chiết, đun
cách thủy ở 600C trong 10 phút, trộn đều trên máy votex trong 5 phút, ly tâm với tốc
độ 3500 vòng/ phút trong 10 phút, thu dịch chiết lần 1. Bổ sung thêm 5 ml dung

môi, lặp lại thao tác trên, thu dịch chiết lần 2. Gộp dịch chiết 2 lần. Pha loãng dịch
chiết 100 lần để làm mẫu thử.
Tiến hành phản ứng theo sơ đồ Hình 2.1


17

Dãy chuẩn

Mẫu thử

Mẫu trắng

1 ml dung dịch chuẩn

1 ml dung dịch thử

1 ml nước

acid gallic ở các nồng
độ

Thêm 5 ml thuốc thử đã pha loãng
Lắc, để yên 5 phút
Thêm 4 ml dung dịch Na2CO3 7.5%
Lắc đều
Để yên 60 phút ở nhiệt độ phòng
Quét phổ chuẩn và đo mật độ quang ở bước sóng cực đại
Hình 2.1. Sơ đồ các bước tiến hành định lượng polyphenol toàn phần
Xử lý kết quả

Quét phổ của mẫu chuẩn acid gallic ở nồng độ 50 µg/ml.
Dựng đường chuẩn tuyến tính acid gallic, tính hệ số tương quan r2.
Xác định độ dốc đường chuẩn và giá trị giao điểm với trục tung của đồ thị.
Hàm lượng polyphenol toàn phần wT được tính bằng công thức sau:
(Dmẫu - Dgiao điểm) x Vmẫu x d x 100
wT =
Schuẩn x mmẫu x 10 000 x wDM,mẫu
Trong đó:
Dmẫu là mật độ quang của mẫu thử
Dgiao điểm là mật độ quang tại điểm đường chuẩn giao với trục tung
Schuẩn là độ dốc của đường chuẩn
mmẫu là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam
Vmẫu là thể tích dịch chiết mẫu trước khi pha loãng, tính bằng mililit (ml)
d là hệ số pha loãng mẫu trước khi phản ứng
wDM, mẫu là hàm lượng chất khô của mẫu (%).