Đánh giá một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất oxostephanin từ thân, lá cây củ dòm (stephnia dielsiano y c wu)

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
---- ----

LÊ THIÊN KIM
MÃ SINH VIÊN: 1101276

ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ YẾU TỐ
ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH
CHIẾT XUẤT OXOSTEPHANIN
TỪ THÂN, LÁ CÂY CỦ DÒM
(STEPHANIA DIELSIANA Y.C. WU)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
---- ----

LÊ THIÊN KIM
MÃ SINH VIÊN: 1101276

ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ YẾU TỐ
ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH
CHIẾT XUẤT OXOSTEPHANIN
TỪ THÂN, LÁ CÂY CỦ DÒM
(STEPHANIA DIELSIANA Y.C. WU)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:

1. PGS. TS. Nguyễn Quốc Huy
2. TS. Hoàng Quỳnh Hoa
Nơi thực hiện
1. Bộ môn Thực vật

HÀ NỘI – 2016


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Quốc Huy

và TS. Hoàng Quỳnh Hoa, người thầy, người cô đã hướng dẫn, tạo điều kiện học tập,
nghiên cứu tốt nhất, cũng như động viên khích lệ em trong suốt quá trình thực hiện
đề tài.

Em xin cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược
Hà Nội, Thầy Trần Văn Ơn, Thầy Nghiêm Đức Trọng, Chị Phạm Thị Linh Giang;
các chị kỹ thuật viên: Chị Thoa, Chị Hiền, Chị Hạnh, đã giúp đỡ em, dạy nhiều kinh
nghiệm quý báu trong thời gian em làm thực nghiệm tại Bộ môn. Bên cạnh đó, em

cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô và anh chị kỹ thuật viên tại Bộ môn Dược
liệu, đã tạo điều kiện cho em sử dụng bể chiết siêu âm, giúp em hoàn thành nội dung
nghiên cứu. Cảm ơn Bác Sâm và Bác Lan, hai người đã giúp cháu có được mẫu

nghiên cứu cho đề tài này.
Đặc biệt, em xin cảm ơn Chị Nguyễn Thị Thùy Linh, tớ cám ơn cậu: Bạn Đinh
Xuân Chung, đã hỗ trợ, giúp đỡ và cung cấp những tài liệu quý giá cho em/tớ trong

suốt thời gian qua. Có hai người bên cạnh, khóa luận của em/tớ mới có thể hoàn
thành được đúng thời hạn.

Cuối cùng, Con xin cảm ơn ba mẹ đã sinh thành, nuôi nấng và cho con một
môi trường giáo dục thật tốt. Xin cảm ơn hai chị yêu của em: Chị Hà và Chị Tâm; và

bạn Nam Anh, đã luôn bên cạnh em/tớ trong suốt thời gian qua. Đây là động lực để
em vững tin và bước đi trên con đường nghiên cứu khoa học.
Thưa thầy cô, các anh chị và các bạn, mặc dù đã cố gắng nhưng chắc chắn

báo cáo khóa luận của em chắc chắn còn nhiều khiếm khuyết. Đây là tâm huyết và
cũng là thứ em tự hào nhất cho tới thời điểm này. Em kỳ vọng rằng khóa luận của em
có thể đến với những bạn nghiên cứu khoa học khác thật trọn vẹn. Do đó, em rất

mong nhận được ý kiến phê bình, nhận xét của thầy cô trong bộ môn, các anh chị và
các bạn để em có thể hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 5 tháng 5 năm 2016

Sinh Viên

Lê Thiên Kim


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ .....................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................................3
1.1. LOÀI STEPHANIA DIELSIANA Y.C. WU ..............................................................3
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố ............................................................................3
1.1.2. Thành phần hoá học .............................................................................................4
1.1.3. Tác dụng sinh học và công dụng........................................................................7
1.1.3.1. Tác dụng sinh học và độc tính.........................................................................7
1.1.3.2. Công dụng..........................................................................................................8

1.2. OXOSTEPHANIN.......................................................................................................9
1.2.1. Công thức phân tử, tính chất vật lý....................................................................9
1.2.2. Một số nghiên cứu về oxostephanin ............................................................... 10
1.3. TỔNG QUAN VỀ CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU ................................................. 11
1.3.1. Khái niệm ........................................................................................................... 11
1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới chất lượng dịch chiết............................................ 11
1.3.2.1. Những yếu tố thuộc về dược liệu ................................................................. 11
1.3.2.2. Những yếu tố thuộc về dung môi ................................................................. 12
1.3.2.3. Những yếu tố thuộc về kỹ thuật.................................................................... 13
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 16
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ.......................................................................... 16
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu ................................................................................... 16
2.1.2. Thiết bị và hóa chất........................................................................................... 17
2.1.2.1. Thiết bị máy móc và dụng cụ thí nghiệm .................................................... 17
2.1.2.2. Hóa chất .......................................................................................................... 18
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU.................................................................................... 18
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................... 18
2.3.1. Thẩm định phương pháp định lượng oxostephanin trong dược liệu bằng
HPTLC khi áp dụng để định lượng oxostephanin trong dịch chiết dược liệu ..... 18
2.3.1.1. Phương pháp định lượng oxostephanin trong dược liệu bằng HPTLC.. 18


2.3.1.2. Thẩm định phương pháp định lượng oxostephanin bằng HPTLC áp dụng
cho định lượng oxostephanin trong dịch chiết......................................................... 20
2.3.2. Đánh giá một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất oxostephanin từ
thân, lá cây Củ dòm (Stephania dielsiana Y.C. Wu) .............................................. 23
2.3.2.1. Lựa chọn các yếu tố và xây dựng mô hình khảo sát.................................. 23
2.3.2.2. Xử lý dịch chiết và tính toán kết quả........................................................... 26
2.3.2.3. Xử lý số liệu .................................................................................................... 26
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .............................. 29

3.1. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT KẾT QUẢ ................................ 29
3.1.1. Thẩm định phương pháp định lượng oxostephanin trong dược liệu bằng
HPTLC khi áp dụng để định lượng oxostephanin trong dịch chiết dược liệu ..... 29
3.1.1.1. Độ đặc hiệu..................................................................................................... 29
3.1.1.2. Tính tuyến tính................................................................................................ 30
3.1.1.3. Độ thích hợp hệ thống ................................................................................... 31
3.1.1.4. Độ đúng........................................................................................................... 32
3.1.2. Đánh giá một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất oxostephanin từ
dược liệu thân, lá cây Củ dòm.................................................................................... 33
3.1.2.1. Kết quả chiết xuất và định lượng oxostephanin trong dịch chiết các mẫu
nghiên cứu..................................................................................................................... 33
3.1.2.2. Xử lý số liệu và đánh giá mối quan hệ các yếu tố khảo sát tới kết quả .. 36
3.2. BÀN LUẬN ............................................................................................................... 41
3.2.1. Thẩm định phương pháp định lượng oxostephanin trong dược liệu bằng
HPTLC .......................................................................................................................... 41
3.2.2. Đánh giá một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất oxostephanin từ
dược liệu thân, lá cây Củ dòm.................................................................................... 43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................................... 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
EtOH

Ethanol

FV

Độ tin cậy (Fidelity value)

HPTLC

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (High Performance Thin Layer
Chromatography)

HPLC

High performance liquid chromatography

MeOH

Methanol

NXB

Nhà xuất bản

oxo

oxostephanin

pp.

Page

STT

Số thứ tự

DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng

STT
Bảng 1.1
Bảng 1.2

Các alcaloid đã được phân lập từ loài Stephania dielsiana
Y.C. Wu
Đặc điểm một số phổ của oxostephanin

Trang
5-6
9-10

Ví dụ về độ phân cực (thông qua hằng số điện môi Ɛ), độ
Bảng 1.3

nhớt (ƞ), sức căng bề mặt (δ) và khả năng hòa tan các chất

12-13

của một số loại dung môi
Bảng 1.4
Bảng 2.1
Bảng 2.2

Ưu, nhược điểm của một số phương pháp chiết xuất thường
gặp
Tỷ lệ thêm chuẩn trong các dung dịch chấm sắc ký

Cỡ rây (kim loại) của các rây phân loại kích thước bột được
dùng trong đề tài

14-15
22
23

Các kích thước lựa chọn để nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng
Bảng 2.3

của kích thước dược liệu đến quá trình chiết xuất

24

oxostephanin
Bảng 2.4

Danh sách mã hóa mẫu thực nghiệm theo điều kiện chiết
xuất

26

Bảng 2.5

Mã hóa các yếu tố khảo sát (factors)

Bảng 3.1

Nồng độ oxostephanin chuẩn và diện tích pic đáp ứng

30

Bảng 3.2

Giá trị diện tích pic, chiều cao pic và Rf của các vết

31

Bảng 3.3

Kết quả khảo sát độ đúng

32

Bảng 3.4

Dãy chuẩn và hệ số tương quan của các dãy chuẩn
oxostephanin

27-28

33-34

Hàm lượng oxostephanin trung bình trong dịch chấm sắc
Bảng 3.5

ký, % trung bình oxostephanin trong cắn và chiết được từ
dược liệu của 27 mẫu thử

35

Bảng 3.6
Bảng 3.7
Bảng 3.8

Bảng 3.9

Bảng 3.10
Bảng 3.11

Kết quả phân tích phương sai bằng phần mềm R đối với
lượng oxostephanin thu được khi chiết xuất dược liệu
Giá trị R2 thu được khi dùng lệnh lm và Summary
So sánh hàm lượng oxostephanin thu được theo các giá trị
trong từng nhóm biến số
Kết quả phân tích phương sai bằng phần mềm R đối với hàm
lượng oxostephanin trong cắn dịch chiết dược liệu
Bảng tóm tắt kết quả so sánh hàm lượng oxostephanin trong
cắn dịch chiết giữa các cặp giá trị của từng biến số
Giá trị diện tích pic của mẫu chuẩn 0,09 mg/ml

36
37
37

39

40
42

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Tên hình ảnh

STT

Trang

Hình 1.1

Hình ảnh loài Stephania dielsiana Y.C. Wu

4

Hình 1.2

Cấu trúc hóa học của oxostephanin

9

Hình 2.1
Hình 2.2
Hình 2.3
Hình 2.4
Hình 3.1
Hình 3.2
Hình 3.3
Hình 3.4

Vườn trồng và thân, lá cây Củ dòm tại xã Tản Lĩnh, Ba
Vì, Hà Nội
Hệ thống máy sắc ký HPTLC hãng CAMAG
Rây sử dụng cho máy xay và rây sử dụng cho phân loại
kích thước bột
Giao diện phần mềm R
Kết quả chồng pic của mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu
trắng
Mỗi liên hệ giữa nồng độ và diện tích pic của 6 mẫu
chuẩn (A) và 5 mẫu chuẩn (B)
Công thức tính trị số R2
Biểu đồ so sánh hàm lượng oxostephanin giữa các kích
thước dược liệu

16
17
23
28
29

31
36
38

Biểu đồ so sánh hàm lượng oxostephanin giữa các cặp
Hình 3.5

giá trị biến số trong từng nhóm dung môi và phương
pháp chiết

39


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bình vôi (Stephania Lour.), là một chi lớn trên thế giới thuộc họ Tiết dê
(Menispermaceae) từ lâu đã được sử dụng phổ biến trong nhiều bài thuốc để chữa các
bệnh như đau đầu, mất ngủ,... [11]. Củ dòm hay Củ gà ấp (Stephania dielsiana Y.C.
Wu) là một loài Bình vôi được ghi trong Sách đỏ Việt Nam [34]. Người dân địa
phương tại Ba Vì thường dùng củ, thân và lá để điều trị tê thấp đau nhức, đau dạ dày.
Oxostephanin là một alcaloid quan trọng đã được phát hiện trên loài S. dielsiana,
[10], [15]. Năm 2014, oxostephanin đã được thiết lập chất đối chiếu có độ tinh khiết
99,90% [27] và được đề xuất phương pháp định tính và định lượng [15], [25], [30].
Sử dụng phương pháp này khảo sát hàm lượng hoạt chất oxostephanin trên các bộ
phận dùng khác nhau (củ, thân, lá) của loài Củ dòm cho thấy hàm lượng hoạt chất
oxostephanin trong thân và lá (có thể thu hái quanh năm) cao hơn đáng kể so với
trong củ của cây [25], [30].
Về tác dụng sinh học, oxostephanin đã được chứng minh có tác dụng ức chế cao
trên 05 dòng tế bào ung thư thử nghiệm: dòng tế bào ung thư buồng trứng (OVCAR8), ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư gan (HepG2), ung thư vú (MDA-MB-231) và
ung thư cuống phổi phế nang (H358) [16]. Những kết quả trên cho thấy tiềm năng
phát triển, ứng dụng của loài S. dielsiana và hoạt chất oxostephanin trong dược học
và y học.
Hướng tới ứng dụng phân đoạn giàu oxostephanin để phát triển các sản phẩm
từ dược liệu Củ dòm trong thực tiễn sản xuất, rất cần nghiên cứu các điều kiện của
quá trình chiết xuất, tuy nhiên qua tham khảo các tài liệu cho tới nay, hiện mới chỉ có
nghiên cứu tối ưu hóa quá trình chiết xuất alcaloid toàn phần từ củ của loài S.
dielsiana [43], chưa có nghiên cứu về quy trình chiết xuất hay đánh giá các yếu tố
ảnh hưởng tới hàm lượng oxostephanin chiết được trên đối tượng là thân và lá của
loài S. dielsiana.

Từ những lý do trên, đề tài “Đánh giá một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình
chiết xuất oxostephanin từ thân, lá cây củ Dòm (Stephania dielsiana Y.C. Wu)”
được thực hiện với 2 mục tiêu sau:


2

-

Thẩm định phương pháp định lượng oxostephanin trong dược liệu thân, lá cây

Củ dòm (Stephania dielsiana Y.C. Wu) bằng HPTLC khi áp dụng để định lượng
oxostephanin trong dịch chiết dược liệu.
-

Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố: kích thước dược liệu, dung môi và phương

pháp chiết xuất, đến quá trình chiết xuất oxostephanin từ thân, lá cây Củ dòm
(Stephania dielsiana Y.C. Wu).


3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. LOÀI STEPHANIA DIELSIANA Y.C. WU
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
Loài Stephania dielsiana Y.C. Wu thuộc chi Stephania Lour., họ Tiết dê
(Menisperaceae), bộ Hoàng Liên (Ranunculaceae), phân lớp Hoàng Liên
(Ranunculidae), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
[1], [6].

S. dielsiana Y.C. Wu có tên thường dùng là Củ dòm, tên khác là Bình vôi nhựa
tím, Cà tòm (dân tộc Tày - Tuyên Quang), Củ gà ấp [31], [34]. Củ dòm là dạng cây
dây leo nhỏ, sống nhiều năm. Rễ củ to. Thân leo cuốn dài khoảng 3 m. Thân non màu
tím hồng nhạt. Ngọn non, cuống lá và cuống cụm hoa có màu tím hồng [32], [34]. Lá
đơn màu xanh, mép nguyên, mọc so le. Cuống lá dài 5-6 cm. Phiến lá hình trứng nhọn
hoặc hình tim. Chóp lá sắc, gốc lá bằng hoặc hơi lõm. Gân 9-12 chiếc, tỏa tròn xuất
phát từ đỉnh của cuống lá. Cuống lá đính vào 1/5 đến 1/3 phiến lá tính từ gốc [15].
Hoa đơn tính khác gốc. Cụm hoa đực do 3-5 xim nhỏ hợp thành xim tán kép. Hoa
nhỏ, có cuống ngắn; đài 6, màu tím, xếp 2 vòng, cánh hoa 3, hình quạt tròn, màu vàng
cam. Cột nhị ngắn, bao phấn 6, dính thành đĩa 6 ô [12]. Cụm hoa cái gồm 7-8 đầu
nhỏ, cuống rất ngắn, xếp thành dạng đầu. Hoa nhỏ; đài 1, màu tím hồng; cánh hoa 2,
hình quạt tròn, màu vàng cam và có các vân tím; bầu hình trứng, đầu nhụy có 4-5
thùy dạng dùi [34].
Quả hình trứng đảo, hơi dẹt. Hạt hình trứng ngược cụt đầu, có lỗ thủng ở giữa,
trên lưng hạt có 4 hàng gai nhọn, cong [34].
Loài S. dielsiana Y.C. Wu phân bố nhiều ở Việt Nam và Trung Quốc. Tại Việt
Nam, loài này phân bố chủ yếu ở Lào Cai, Yên Bái, Tuyên Quang (Na Hang, Chiêm
Hóa), Bắc Kạn, Thái Nguyên (Đại Từ, Tam Đảo), Bắc Giang, Bắc Ninh, Quảng Ninh,
Hà Nội (Ba Vì), Quảng Nam (Trà My, Trà Mai, Trà Giác) [11], [12], [13], [31], [34],
[35].


4

1. Càng mang hoa, quả và lá
2. Hoa đực
3. Hoa cái
4. Hạt

Hình 1.1. Hình ảnh loài Stephania dielsiana Y.C. Wu [34]

1.1.2. Thành phần hoá học
Alcaloid là thành phần chính được quan tâm trong củ và thân lá của Củ dòm
(Stephania dielsiana Y.C. Wu). Tới nay, một số alcaloid được phân lập và nhận dạng
trong loài S. dielsiana có thể xếp vào 5 nhóm chính (Bảng 1.1): Benzylisoquinolin
(Nor-canelillin), Aporphin (Ayuthianin, Crebanin, Dehydrocrebanin, Dehydrostephanin,
Thailandin),

Liriodenin,
Hasubana

Magnoflorin,
(Aknadinin),

Oxocrebanin,

Oxostephanin,

Protoberberin

((-)

Stephanin,

corydalmin,

L-

tetrahydropalmatin), Morphinan (Cephamorphinanin, Sinoacutin, Sinomenin) [15],
[19], [27], [28], [44].
Ngoài ra, Củ dòm còn có flavonoid, tinh bột, đường khử tự do và một số chất

khác [10], [15].
Ở Việt Nam, đối với loài S. dielsiana đã phân lập được 3 alkaloid từ thân lá là:
L-tetrahydropalmatin [15], oxostephanin, thailandin [28].


5

Bảng 1.1. Các alcaloid đã được phân lập từ loài Stephania dielsiana Y.C. Wu

Công thức 17 alcaloid phân lập từ loài Stephania dielsiana Y.C. Wu
O

O

3a

2

3

O

4

5

2

H3C

7

O

OH

8

10

O
O

4'

CH3

CH3

H3C

Ayuthianin (2)

Crebanin (3)

3a

2

3

4

O

5
6

6b
6a

1

3

4
5

CH3

6

6b

O

7a

4
5

6
6a

1

NH

11b

11

8

10

3

6b

O

7

11a

11

3a

2

CH3

6a

11b

7a

O

N

1

7

11a

3a

2

N

11b

7

11a

9
10

8

7a

9

11

O

O

10

H3C

8
9

CH3

Dehydrocrebanin (4)

Dehydrostephanin (5)
O

3

4
6

6b

H3C

O

O

1
6a

11b
3

4
6b
6a

1
11b

+

N
H

CH3

7a

CH3

10

6
6a

1

N

7

11a
7a

O

11

8

O

7a

10

8
9

O

11
10

5

9

7

11a

4

11b

O

11

3

6b

O

7

11a

5
6

3a

2

N

3a

2

Liriodenin (6)

3a

2

5

H3C

8
9

9

O

Nor-canelillin (1)

HO

7

11
10

2'

CH3

H

11a

OH

5'

HO

11b

N

7a

7a

6'

O

6a

1

CH3

11

3'

O

O

N

7

NH
1'

O

6

6

6b

6a

11a

1

8

5

H

11b

6

4

5

1

3

3

4
6b

HO

3a

2

O

8
9

O

Magnoflorin (7)

H3C

CH3

Oxocrebanin (8)

CH3

Oxostephanin (9)


6

Công thức 17 alcaloid phân lập từ loài Stephania dielsiana Y.C. Wu
CH3

O

3a

2

3

O

4

3

6

6b

O

6a

1
11b

4

N

6

6b

O

CH3

6a

1

1

N

11

4

CH3

10

HO

16

12
15

7

13

7

11a
7a

11
8

10

9

9

8

7

9

O

O

O

CH3

CH3

O
O

CH3

H3C

Thailandin (11)

Aknadinin (12)

CH3

CH3
O
2

N

O

1

6

3

6

3

5

4

O

5

4

H3C
8

2

O

N
1

H

8

H
O

13

O

13

12

12

10

10

OH

CH3

(-) corydalmin (13)

L-tetrahydropalmatin (14)
2

CH3

3

2

10

13

16

12
13

N

17

9

N

14

H
6

O

7

8

H

CH3

Sinoacutin (15)

CH3

9
14

5

NH
17

6

8
7

O

HO
O

O

16

12
15

15

H3C

10

HO

HO

11

4

11

4

1

5

1

O

3

HO

O

11

11

CH3

CH3

9

CH3

9

O

CH3

17

6

8

N

14

5

O

11

Stephanin (10)

H3C

+

11b

7a

10

3

5

H

11a

2

O

3a

2

5

H3C

Sinomenin (16)

O
OH

CH3

Cephamorphinanin (17)

7

1.1.3. Tác dụng sinh học và công dụng
1.1.3.1. Tác dụng sinh học và độc tính
Đã có nhiều kết quả nghiên cứu về tác dụng sinh học của loài Củ dòm Stephania
dielsiana Y.C. Wu tại Việt Nam: tác dụng giảm đau, chống viêm, an thần, gây ngủ,
và tác dụng trên các tế bào ung thư:
Tác dụng giảm đau: dịch chiết nước S. dielsiana với liều 2,5 g và 5 g dược
liệu/kg thể trọng chuột có tác dụng giảm đau ngoại biên theo kiểu aspirin, không có
tác dụng giảm đau trung ương theo cơ chế tương tự morphin; với liều 50 mg/kg, tác
dụng giảm đau đến chậm từ 10-30 phút sau khi cho chuột uống [15]. Liều 5 g/kg và
10 g/kg chuột, tác dụng giảm đau rõ rệt (mô hình Koster-Turner) [24].
Tác dụng an thần, gây ngủ [24]:
-

Hoạt động của chuột giảm rõ rệt: 78,8 % với liều 2,5 g/kg chuột, và giảm khi

tăng liều. Đến liều 10 g/kg, chuột gần như nằm im, không hoạt động.
-

Kéo dài thời gian ngủ khi phối hợp với thiopentan (so với lô chỉ dùng

thiopentan) 3 lần với liều 1,25 g/kg chuột và 8 lần với liều 2,5 g/kg chuột.
Tác dụng chống viêm cấp [15]:
-

Trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin: dịch chiết loài S. dielsiana

ở liều 1,5 g và 3 g/kg chỉ có tác dụng sau 24 giờ, tác dụng chống viêm này chậm,
không giống tác dụng của indomethacin với liều 5 mg/kg;

-

Trên mô hình gây tràn dịch màng bụng: củ loài S. dielsiana với liều 1,5 g và 3

g/kg không có tác dụng.
Tác dụng chống viêm mạn: mô hình gây u hạt, với liều thí nghiệm 5 g/kg củ
loài S. dielsiana có tác dụng làm giảm u hạt, kết quả cho thấy Củ dòm có tác dụng
gần tương tự tác dụng chống viêm của prednisolon với liều 5mg/kg [15].
Tác dụng trên tế bào ung thư:
-

Phân đoạn SM2 (phân đoạn Diclomethan và Ethylacetat) từ củ loài nghiên cứu

có tác dụng ức chế tốt sự tăng trưởng của 6 dòng tế bào ung thư: tế bào ung thư dạ
dày (N87), tế bào ung thư buồng trứng (OVCAR-8), tế bào ung thư vú (MDA-MB231), tế bào ung thư cổ tử cung HeLa, tế bào ung thư gan (HepG2), tế bào ung thư


8

biểu mô cuống phổi và phế nang ở người (H358) với IC50 lần lượt là 10,27; 12,21;
18,24; 22,84; 26,18; 30,09 µg/ml. Trong khi đó phân đoạn SM1 (phân đoạn n-hexan)
chỉ có tác dụng ức chế yếu trên ba dòng tế bào ung thư N87, HepG2, HeLa với IC50
tương ứng là 35,73; 87,2; 94,6 µg/ml. Phân đoạn SM3 (phân đoạn nước) không có
tác dụng trên 6 dòng tế bào ung thư thử nghiệm [20].
-

Phân đoạn SM2 từ củ loài nghiên cứu tiếp tục được đem thử nghiệm in vivo sử

dụng mô hình gây khối u rắn Sarcoma180 trên chuột nhắt trắng chủng Swiss; đã làm
giảm tốc độ tăng trưởng (tỷ lệ gây thoái lui khối u dưới tác dụng là 35,7 %) và thể

tích khối u Sarcom180 so với chuột đối chứng (giảm 32,6 %). SM2 không ảnh hưởng
nhiều đến khả năng sống của chuột thí nghiệm. Tỷ lệ gây chết của SM2 là 6,7 %, thấp
hơn nhiều so với đối chứng ung thư không điều trị (10,0 %) và đối chứng dương 6MP
(Mercaptopurine) (70,0 %) [21].
Bên cạnh đó, Củ dòm cũng được nghiên cứu về độc tính cấp và độc tính bán
trường diễn:
-

Độc tính cấp: dịch chiết nước từ củ loài S. dielsiana, dùng theo đường uống

trên chuột nhắt trắng có LD50 là 22,2 g/kg thể trọng chuột [15].
-

Độc tính bán trường diễn: chưa phát hiện với liều 1g/kg thể trọng thỏ/ngày

theo đường uống trong 1 tháng [15].
1.1.3.2. Công dụng
Củ dòm (Stephania dielsiana Y. C. Wu) thường dùng làm thuốc chữa đau đầu,
sốt rét, phù thũng, đau lưng, chân tay mỏi nhức, đau bụng [1], [2]. Rễ củ dòm dùng
làm thuốc kiện vị, chỉ thống; trị phù thũng, giải độc, đau xương khớp [34].
Theo kết quả điều tra tri thức sử dụng loài nghiên cứu làm thuốc ở Ba Vì (Hà
Nội), chủ yếu người dân sử dụng củ loài Stephania dielsiana để chữa bệnh (FV =
100%) với cách dùng là sắc uống (FV = 100%). Trong đó, người dân cũng sử dụng
thân và lá loài nghiên cứu để chữa bệnh (với độ tin cậy FV = 85% và 80%) [19],
thường trong các bài thuốc chữa các chứng bệnh: tê thấp đau nhức (FV = 100%); đau
dạ dày (FV= 96,67%); thần kinh suy nhược (FV = 16,67%); chữa bệnh thận (FV =
11,67); chữa mất ngủ (FV = 5%) [15, (trang 105-109)].


9

Hiện nay, trên thị trường sản phẩm thực phẩm chức năng Viên Khớp 99 và sản
phẩm Viên Bổ Trợ 99 do Công ty TNHH MTV Dược Khoa sản xuất, đều dưới dạng
bào chế viên nang cứng có chứa dược liệu Củ dòm (Stephania dielsiana Y.C. Wu)
[46]. Ngoài ra, theo [17] viên nang cứng (Dielsin) có nguồn gốc từ phân đoạn
diclomethan và ethylacetat (ở pH: 4-5) của dịch chiết ethanol tuyệt đối của Củ dòm,
có tiêu chuẩn chất lượng và độ ổn định tốt, được chứng minh có tác dụng chống viêm,
giảm đau, không có độc tính cấp trên đường uống ở chuột nhắt trắng; được đề xuất
hướng sử dụng viên nang trong hỗ trợ chống viêm, giảm đau trong một số bệnh về
khớp, dạ dày.
1.2. OXOSTEPHANIN
1.2.1. Công thức phân tử, tính chất vật lý
O

3a

2

3

4
5
6

6b

O

6a

1

N

11b
7

11a
7a

O

11
10

8
9

O
CH3

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của oxostephanin
Oxostephanin

(1,2-methylenedioxy-8-methoxyoxoaporphin)

thuộc

nhóm

aporphin, có công thức phân tử là C18 H11 NO4 (Hình 1.2), tồn tại ở dạng tinh thể hình
kim, màu vàng, nóng chảy ở 160-162˚C [27].
Bảng 1.2. Đặc điểm một số phổ của oxostephanin [15], [27]
Loại phổ
MS
FTIR
UV-Vis

Đặc trưng phổ
MS (m/z) 306 [M+H]+ (C18H11NO4), M = 305
Phổ IRνmax (KBr , cm-1) 3443, 2905, 1661, 1592, 1576, 1469, 1407,
1310, 1284, 1199, 1047, 1014, 968, 945, 784
UVλmax (nm, Me0H) 217;249; 270; 358; 421


10

Đặc trưng phổ

Loại phổ
1 H-NMR

[500 MHz, CDCl3,  H (ppm)]: 7,53 (1H, s), 7,95 (1H, d,

J=5,5Hz) , 8,73 (1H, d, J=5,0Hz), 3,93 (3H, s), 7,27 (1H, dd,
NMR

J=7,5Hz), 7,78 (1H, t, J=7,5Hz), 8,27 (1H, dd, J=7,5), 6,46 (2H, s)
13 C-NMR

[125 MHz, CDCl3,  C (ppm)]: 151,75; 148,07; 103,15;

134,94; 123,58; 144,28; 145,92; 106,86; 180,22; 119,98; 161,17;
56,04; 112,61; 134,70; 119,05; 135,17; 121,40; 103,06
1.2.2. Một số nghiên cứu về oxostephanin
Về nguồn gốc: Trên thế giới, oxostephanin đã được ghi nhận tìm thấy trong
nhiều loài như: loài Mitrephora maingayi [39]; Stephania zippeliana [40]; và
Stephania japonica [42];... Năm 2010, lần đầu tiên, oxostephanin được phân lập và
xác định có trong loài Stephania dielsiana [15].
Năm 2014, từ thân lá và củ của loài Stephania dielsiana, Nguyễn Vũ Minh và
cộng sự [27], [29], đã thành công phân lập và tinh chế tạo được nguồn chất chuẩn
oxostephanin (độ tinh khiết 99,90 %) đủ tiêu chuẩn làm chất đối chiếu sử dụng trong
kiểm nghiệm và nghiên cứu dược liệu.
Về hàm lượng trong cây: Hoạt chất oxostephanin trong dược liệu Củ dòm đã
được xây dựng và thẩm định phương pháp định tính [10], [15], định lượng bằng
phương pháp HPLC [30], và định lượng bằng HPTLC [18], [25].
Các nghiên cứu đã chứng minh có sự thay đổi về hàm lượng oxostephanin phụ
thuộc vào bộ phận sử dụng, theo mùa thu hái, độ tuổi và nguồn gốc cây trồng (từ hom
hoặc từ hạt). Đặc biệt là hàm lượng oxostephanin trong các mẫu thân lá (0,4 % đến
1,7 %) cao hơn mẫu củ (0,1 % đến 0,34 %), cao nhất là mẫu thân lá non. Hàm lượng
trong các mẫu củ mùa đông (0,3392 %) và mùa thu (0,2773 %) cao hơn các mẫu mùa
xuân (0,0573 %) và mùa hè (0,0671 %). Như vậy, ngoài nguồn nguyên liệu củ vẫn
đang được sử dụng, phần thân lá cũng là nguồn nguyên liệu rất đáng chú ý. Khai thác
thân lá có nhiều ưu điểm so với củ vì có thể thu hái được quanh năm, đồng thời khi
thu hái lá, cây vẫn sống, không mất cả cây như khi thu hái củ [10], [25], [30].


11

Từ thực nghiệm, oxostephanin có thể chiết xuất bằng methanol, dicloromethan,

nhưng không tan trong nước cất. Trong khi đó, sau khi acid hóa, oxostephanin có thể
chiết tốt bằng ethanol hoặc methanol, nhưng ít tan trong nước, không tan trong
dicloromethan [10], [25], [27], [30].
Về tác dụng sinh học: Oxostephanin phân lập từ loài nghiên cứu có tác dụng
ức chế trên 05 dòng tế bào ung thư thử nghiệm: dòng tế bào ung thư buồng trứng
(OVCAR-8), ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư gan (HepG2), ung thư vú (MDAMB-231) và ung thư cuống phổi phế nang (H358) với giá trị IC50 theo thứ tự: 0,34 ±
0,02; 0,66 ± 0,06; 0,7 ± 0,05; 1,02 ± 0,04 và 1,84 ± 0,02 (µg/ml) [16].
1.3. TỔNG QUAN VỀ CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU
1.3.1. Khái niệm
Chiết xuất là quá trình dùng dung môi thích hợp để hòa tan các chất tan có trong
dược liệu, chủ yếu là các hoạt chất có tác dụng điều trị, sau đó tách chúng ra khỏi
phần không tan trong dược liệu [9]. Sản phẩm thu được của quá trình chiết xuất là
một dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi, được gọi là dịch chiết [14].
1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới chất lượng dịch chiết
Có 3 nhóm yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng dịch chiết là:
-

Những yếu tố thuộc về dược liệu;

-

Những yếu tố thuộc về dung môi;

-

Những yếu tố thuộc về kỹ thuật chiết xuất.

1.3.2.1. Những yếu tố thuộc về dược liệu
Chất lượng dược liệu liên quan trực tiếp đến chất lượng dịch chiết và thành
phẩm; phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như loài, giống, khí hậu, thổ nhưỡng, điều kiện

trồng, thu hái, ổn định, bảo quản,... [14].
Cấu tạo và thành phần dược liệu có liên quan đến khả năng giải phóng hoạt
chất cũng như tạp chất có chứa trong tế bào dược liệu khi chiết xuất. Các thành phần
này thay đổi tùy từng loại dược liệu và theo từng loại bộ phận được sử dụng.
-

Vách tế bào dược liệu: có bản chất cellulose, hemicellulose, protopectin,... do

có tính chất thẩm tích, nên cản trở quá trình khuếch tán hoạt chất trong chiết xuất


12

dược liệu. Đây là thành phần có ảnh hưởng nhiều nhất nhưng cũng dễ dàng xử lý
trong thực nghiệm bằng cách chia nhỏ dược liệu (phá vỡ vách tế bào) bằng phương
pháp phù hợp (cắt, xay, hoặc nghiền,...) [14].
-

Chất nguyên sinh: có tính chất bán thấm nghĩa là chỉ cho dung môi đi qua mà

không cho chất tan đi qua. Do đó, để chiết được các chất tan trong tế bào, phải phá
hủy chất nguyên sinh bằng cách làm đông vón bằng nhiệt (sấy hoặc phơi khô) hoặc
bằng cồn (cồn hơi hoặc cồn nóng) [14].
-

Một số tạp chất trong dược liệu: thường gặp khi chiết xuất dược liệu: bao gồm

pectin, gôm, chất nhày, tinh bột, chất béo, dầu mỡ, sáp, nhựa, enzym, và các chất hóa
học khác... là các sản phẩm của quá trình trao đổi chất, chất dự trữ hoặc chất thải của
cây. Các tạp này có thể có hoặc không có trong dược liệu, thường gây cản trở cho quá

trình chiết xuất [4], [14].
1.3.2.2. Những yếu tố thuộc về dung môi
Độ phân cực của dung môi liên quan đến khả năng hòa tan các chất, tỉ lệ thuận
với hằng số điện môi. Độ phân cực dung môi quyết định sự có mặt của các thành
phần sẽ có trong dịch chiết [5]. Nói chung, dung môi ít phân cực thì dễ hòa tan các
chất không phân cực và khó hòa tan các chất có nhiều nhóm phân cực. Ngược lại,
dung môi phân cực mạnh thì dễ hòa tan các chất có nhiều nhóm phân cực và khó hòa
tan các chất ít phân cực [4], [5], [14] .
Độ nhớt và sức căng bề mặt của dung môi: Dung môi có độ nhớt càng thấp và
sức căng bề mặt càng nhỏ thì dung môi càng dễ thấm vào dược liệu, tạo điều kiện
thuận lợi cho quá trình chiết xuất và ngược lại [14].
Bảng 1.3. Ví dụ về độ phân cực (thông qua hằng số điện môi Ɛ), độ nhớt (ƞ), sức
căng bề mặt (δ) và khả năng hòa tan các chất của một số loại dung môi [5]
Dung môi
Diethyl
ether

Ɛ

ƞ

δ (dyn/cm)

Khả năng hòa tan các chất
Monotecpen, các chất không phân cực

4,30

0,32

16,7

(chất béo, caroten, các sterol, các màu
thực vật (chlorophyl)


13

Dung môi

Ɛ

ƞ

δ (dyn/cm)

Chloroform

4,81

0,57

27,7

Ethanol

24,55

1,14

22,0

Methanol

33,00

0,60

23,0

Khả năng hòa tan các chất
Secquitecpen, ditecpen, cumarin,
quinon, alcaloid có tính base yếu
Glycozid, alcaloid, flavonoid, các hợp
chất phenol, nhựa, acid hữu cơ, tanin
Glycozid, alcaloid, flavonoid, các hợp
chất phenol, nhựa, acid hữu cơ, tanin
Glucozid, tanin, các đường, các hydrat

Nước

80,10

1,00

72,7

cabon phân tử vừa (pectin, nhựa, gôm,
chất nhầy, protein thực vật, muối vô
cơ).

1.3.2.3. Những yếu tố thuộc về kỹ thuật
Nhiệt độ chiết xuất: Nhiệt độ tăng thì hệ số khuếch tán tăng và độ nhớt dung
môi giảm, do đó tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất. Nhiệt độ tăng có thể
gây bất lợi như: phá hủy một số chất kém bền ở nhiệt độ cao, tăng độ hòa tan của tạp,
hao hụt dung môi dễ bay hơi,...[14].
Thời gian chiết xuất: Thời gian chiết xuất ngắn không đủ để chiết kiệt hoạt chất
nhưng thời gian chiết xuất quá dài dịch chiết sẽ bị lẫn nhiều tạp chất trong quá trình
chiết xuất [14].
Mức độ chia nhỏ (hay độ mịn) dược liệu: Cần phải lựa chọn độ mịn dược liệu
tùy thuộc từng loại dược liệu sao cho phù hợp với phương pháp chiết xuất, và dung
môi,... để tối đa hiệu suất và tăng tốc độ chiết xuất [14]. Nguyên liệu càng được chia
nhỏ (cắt, xay, hoặc nghiền,...), tỉ lệ của số tế bào nguyên vẹn so với số tế bào bị “vỡ”
giảm, quá trình hòa tan đơn giản tăng và thời gian khuếch tán chất tan vào dịch chiết
giảm, thời gian thẩm thấu qua vách giảm làm cho quá trình chiết nhanh hơn. Tuy
nhiên, càng chia nhỏ nguyên liệu, tính chọn lọc của quá trình càng giảm, dịch chiết
càng có nhiều tạp chất làm cho lượng cao chiết nhiều lên, thành phần phức tạp và khó
tách các chất hơn [4].
Khuấy trộn: bằng cách khuấy trộn sẽ tăng tốc độ khuếch tán [14].


14

Phương pháp chiết xuất:
-

Các phương pháp chiết xuất được phân loại dựa vào nhiều yếu tố [23]:

o Dựa vào nhiệt độ có phương pháp chiết nóng (như chiết hồi lưu), chiết nguội.
o Dựa vào chế độ làm việc có phương pháp chiết gián đoạn (ngâm và ngấm kiệt);

bán liên tục và liên tục.
o Dựa vào chiều chuyển động tương hỗ giữa hai pha, có các phương pháp: ngược
dòng, xuôi dòng, chéo dòng.
o Dựa vào áp suất làm việc có các phương pháp: áp suất thường, áp suất giảm (áp
suất chân không), áp suất cao (chiết có áp lực).
o Dựa vào những biện pháp kỹ thuật đặc biệt, có các phương pháp: phương pháp
chiết có hỗ trợ sóng siêu âm, phương pháp chiết hỗ trợ sóng viba, phương pháp
tạo dòng xoáy,...
-

Một số phương pháp chiết xuất phổ biến hiện nay (sử dụng trong quy mô công

nghiệp và pilot) và ưu nhược điểm các phương pháp được trình bày trong Bảng 1.4.
Bảng 1.4. Ưu, nhược điểm của một số phương pháp chiết xuất thường gặp [8], [23]
Phương

Ưu điểm

pháp

Nhược điểm
- Năng suất thấp, thao tác thủ

Ngâm lạnh

- Đơn giản, dễ thực hiện;
- Thiết bị đơn giản, rẻ tiền.

công;
- Tốn dung môi, không chiết kiệt

được hoạt chất, tốn thời gian
chiết.
- Năng suất thấp, lao động thủ

Ngấm kiệt

- Dược liệu được chiết kiệt.

công;
- Tiến hành phức tạp hơn phương
pháp ngâm.

Chiết nóng

- Tăng lượng chất khuếch tán vào - Tăng tạp, hao hụt dung môi để
dịch chiết;

bay hơi;


15

Phương

Ưu điểm

pháp

Nhược điểm

- Phá hủy được một số tạp cản trở - Phá hủy một số chất không bền
chiết xuất.

ở nhiệt độ cao;
- Yêu cầu có thiết bị và dụng cụ
phù hợp.

- An toàn với những chất kém bền
Chiết

ở nhiệt độ cao;

nguội

- Giảm khả năng hòa tan của tạp
chất.

Chiết xuất
bán liên
tục

- Tốc độ khuếch tán của chất tan
vào dung môi diễn ra chậm hơn
nên thời gian chiết kéo dài.
- Hệ thống cồng kềnh, vận hành

- Dịch chiết đậm đặc;

phức tạp;

- Dược liệu được chiết kiệt.

- Thao tác thủ công, không tự
động hóa.

- Năng suất cao, tiết kiệm thời
gian và dung môi;
Chiết xuất
liên tục

- Không phải lao động thủ công;
- Dịch chiết đậm đặc;
- Là phương pháp hiện sử dụng

- Thiết bị cấu tạo phức tạp, đắt
tiền;
- Vận hành phức tạp.

phổ biến nhất trong công nghiệp.
- Phá hủy cấu trúc tế bào, tăng sự
Chiết xuất
có hỗ trợ
của siêu
âm

hòa tan của chất tan vào dung
môi;
- Tiết kiệm thời gian;
- Thường dùng chuẩn bị mẫu thay
cho ngâm lạnh và chiết Sohxlet

cổ điển.

- Dịch chiết nhiều tạp chất;
- Khả năng xuyên thấu kém;
- Sử dụng quy mô phòng thí
nghiệm.


16

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu
Nguyên liệu nghiên cứu là thân và lá loài Bình vôi mã số B2, thu hái vào tháng
1 năm 2016 tại vườn trồng tại xã Tản Lĩnh – huyện Ba Vì – thành phố Hà Nội. Loài
nghiên cứu đã được giám định tên khoa học là Stephania dielsiana Y.C. Wu, họ Tiết
dê (Menispermaceae); tiêu bản được lưu giữ tại Phòng tiêu bản, Bộ môn Thực vật,
Trường Đại học Dược Hà Nội với số hiệu mẫu: HNIP/18223/16 (cây đực) và
HNIP/18224/16 (cây cái) (Phụ lục 1)

Hình 2.1. Vườn trồng và thân, lá cây Củ dòm tại xã Tản Lĩnh, Ba Vì, Hà Nội
Xử lý nguyên liệu: Dược liệu sau khi thu hái được rửa sạch, phơi khô trong
bóng râm. Khi bóp lá giòn vụn (khô tương đối), dược liệu được thái nhỏ và sấy khô
ở 55˚C trong tủ sấy tĩnh đến khi thân giòn vụn. Dược liệu được bảo quản trong túi PE
kéo mép, trong điều kiện dưới 25 oC, tránh ánh sáng.