Kỹ thuật vô trùng và lên men

KỸ THUẬT VÔ TRÙNG VÀ
CÁC PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN
Ths. Bùi Hồng Quân
09.09.25.24.19/09.17.27.26.25
Email:
Website: www.buihongquan.tk
GBD giữ gìn màu xanh cho quê hương, xây dựng tương lai từ chất lượng cuộc sống


KỸ THUẬT VÔ TRÙNG
Kỹ thuật vô trùng diệt sạch các tế bào và bào tử
của vi sinh vật trong môi trường ban đầu
Khử trùng
Tẩy trùng
Sát trùng

Ths. Bù
Bùi Hồ
Hồng Quân

2


PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG
Vật lý
Hóa học
Sinh học

Ths. Bù
Bùi Hồ
Hồng Quân

3


Phương pháp vật lý
Cơ
Nhiệt
Quang
Bức xạ

Ths. Bù
Bùi Hồ
Hồng Quân

4


Phương pháp hóa học
Cồ n
Oxide ethylene: khử trùng dụng cụ plastic
Phenol
Formaline

Ths. Bù
Bùi Hồ
Hồng Quân

5

Cơ sở khoa học
Vô trùng tương đối
Vô trùng tuyệt đối

Ths. Bù
Bùi Hồ
Hồng Quân

6


VÔ TRÙNG TƯƠNG ĐỐI
Vô trùng tương đối là vô trùng những vi sinh vật
gây ảnh hưởng nghiêm trọng
Cơ sở: lấn át và cạnh trang trong sinh học
Sử dụng: trong quá trình lên men truyền thống
và quá trình thu nhận sinh khối vi sinh vật dùng
trong chăn nuôi hoặc trong quá trình chế biến
tiếp theo

Ths. Bù
Bùi Hồ
Hồng Quân

7


LÊN MEN KHÔNG VÔ TRÙNG
Để cho quá trình lên men diễn ra có kết quả thì cần phải
ngăn cản sự phát triển của các cơ thể lạ

Trong việc sản xuất sinh khối (như sinh khối nấm men,
sinh khối vi khuẩn, tảo) thường tiến hành lên men
không vô trùng
Sự phát triển của các cơ thể lạ bị ngăn cản mạnh mẽ
bằng cách tạo ra những điều kiện nuôi sao cho chủng
sản xuất có thể sinh trưởng trội hơn. Ví dụ: nhờ cơ chất
đặc hiệu hay pH môi trường
Ths. Bù
Bùi Hồ
Hồng Quân

8


VÔ TRÙNG TUYỆT ĐỐI
Tiêu diệt toàn bộ vi sinh vật gây tạp, môi trường
không chứa mầm mống vi sinh vật
Áp dụng: thu nhận sản phẩm tinh khiết, cụ thể
phần lớn là sản phẩm bậc hai

Ths. Bù
Bùi Hồ
Hồng Quân

9


LÊN MEN VÔ TRÙNG
Nhiệm vụ thanh trùng là tiêu diệt hết vi sinh vật
có mặt trong môi trường (do có sẵn từ trong

thành phần như nước, nguyên liệu, không khí và
trên bề mặt các thiết bị tiếp xúc với môi trường)
Những vi sinh vật này còn sống sót sẽ phát triển
cạnh tranh với chủng sản xuất, làm hỏng quá
trình lên men
Các vi sinh vật thường có sức bền với nhiệt, một
số có mặt trong nguyên liệu dưới dạng bào tử.
Muốn diệt chúng phải gia nhiệt tới 120oC–
121oC trong vài chục phút
Ths. Bù
Bùi Hồ
Hồng Quân

10


KHỬ TRÙNG BẰNG NỒI HẤP
Trong lên men từng mẻ các thiết bị sau khi làm vệ sinh được khử
trùng bằng hơi nóng tới 120oC – 130oC. Sau đó mới cho môi
trường lỏng vào các nồi lên men khử trùng môi trường cùng với
cả hệ thống khuấy và các đoạn đường ống, van tiếp cận
Việc gia nhiệt cao có thể dẫn đến sự phá hủy các thành phần dinh
dưỡng mẫn cảm với nhiệt và caramen hóa các nguồn đường cũng
như xảy ra các phản ứng melanoid giữa đường với amino acid
hoặc các vitamin bị phá hỏng
Những thành phần mẫn cảm với nhiệt có khi phải khử trùng
riêng, sau đó mới trộn lẫn hoặc khử trùng theo phương pháp khác
như lọc qua phin vô trùng
Ngoài cách khử trùng theo phương pháp hơi nước gián đoạn này,
người ta còn dùng phương pháp khử trùng bằng hơi liên tục bằng

cách cho môi trường chảy qua thiết bị khử trùng chuyên dụng ở
nhiệt độ 140oC trong vài phút
Ths. Bù
Bùi Hồ
Hồng Quân

11


KHỬ TRÙNG MÔI TRƯỜNG NUÔI
CẤY BỀ MẶT
Môi trường nuôi cấy bề mặt thường là những hợp chất
rắn (cám, bột và các chất dinh dưỡng)
Trong sản xuất công nghiệp môi trường rắn được khử
trùng bằng hơi nóng trong thiết bị chuyên dùng với áp
suất dư, đạt nhiệt độ 104oC – 110oC
Thanh trùng bằng hơi nóng có thể qua hai giai đoạn:
– Giai đoạn đầu nâng nhiệt độ tới 100oC và đảo khối môi
trường liên tục trong 15 – 20 phút
– Giai đoạn sau nâng nhiệt độ tới 110oC khoảng 60 – 90 phút và
cứ sau 15 phút lại đảo môi trường 3 – 5 phút

Ths. Bù
Bùi Hồ
Hồng Quân

12


KHỬ TRÙNG MÔI TRƯỜNG LỎNG

NUÔI CẤY CHÌM
Khử trùng nồi lên men và hệ thống đường ống tiếp xúc
với môi trường bằng hơi nóng
Cho dịch môi trường đã pha chế vào nồi (lượng dịch
bằng ¾ thể tích nồi và phải tính thêm phần nước ngưng
khi cho hơi trực tiếp vào môi trường)
Gia nhiệt tới nhiệt độ thanh trùng
Giữ ở nhiệt độ này trong khoảng thời gian thanh trùng
cần thiết
Làm nguội dịch ở ngay trong nồi bằng cách cho nước
vào vỏ hoặc ống xoắn trao đổi nhiệt cùng với hệ thống
khuấy làm việc
Ths. Bù
Bùi Hồ
Hồng Quân

13


KHỬ TRÙNG MÔI TRƯỜNG LỎNG
NUÔI CẤY
Để tránh biến đổi thành phần dinh dưỡng
của môi trường nên chỉ tiến hành ở nhiệt độ
110oC – 120oC trong khoảng thời gian 1 –
1,5 giờ từ lúc đạt được nhiệt độ tới hạn
Ngoài ra có thể tiến hành thanh trùng liên
tục ở nhiệt độ cao hơn (140oC – 145oC) và
giữ ở thời gian ngắn hơn (5 – 15 phút) ở
nhiệt độ này
Ths. Bù

Bùi Hồ
Hồng Quân

14


KHỬ TRÙNG BẰNG HÓA CHẤT
Đối với những chất kém bền nhiệt dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao
thì việc khử trùng có thể bằng cách lọc qua phin lọc hoặc bằng
các hóa chất diệt khuẩn
Sử dụng các hóa chất diệt khuẩn cần phải cân nhắc kỹ về tính gây
độc cho vi sinh vật nuôi cấy, cho người sử dụng sản phẩm cũng
như về vệ sinh an toàn lao động
Một số hóa chất được dùng để khử trùng trong một số trường hợp
ngoại lệ như ethylenoxyl, propiolacton rất thích hợp cho việc khử
trùng các chất kém bền nhiệt (enzyme)
– Ethylenoxyl hỗn hợp với không khí theo tỷ lệ 3 – 8% sẽ gây nổ, vì vậy
khi dùng phải trộn lẫn với CO2 hoặc N2
– Vì vậy khử trùng bằng hóa chất ít được sử dụng trong công nghệ lên men

Ths. Bù
Bùi Hồ
Hồng Quân

15


CUNG CẤP KHÍ
Không khí dùng để cung cấp oxy đựơc khử trùng
bằng cách lọc khử trùng

Nguyên liệu lọc thường dùng là bông đá, bông
thủy tinh hoặc bông
Hiện nay trong công nghệ vi sinh phổ biến là các
loại màng lọc
Lọc khử trùng có thể sử dụng để làm sạch không
khí
Ths. Bù
Bùi Hồ
Hồng Quân

16


CUNG CẤP KHÍ SẠCH CHO NUÔI
CẤY BỀ MẶT
Cung cấp khí sạch cho nuôi cấy bề mặt là một bộ
phận những máy điều hòa và làm sạch khí đặt ở
bên trên hoặc bên cạnh phòng nuôi cấy
Trong các xí nghiệp sản xuất quy mô lớn có thể
thiết kế để sử dụng khí tuần hoàn
Việc cung cấp khí sạch còn có bộ phận điều
nhiệt và điều ẩm để đảm bảo nhiệt độ và độ ẩm
tối ưu cho quá trình nuôi cấy tránh làm khô môi
trường
Ths. Bù
Bùi Hồ
Hồng Quân

17

CUNG CẤP KHÍ CHO QUÁ TRÌNH
NUÔI CẤY CHÌM
Không khí => lọc sơ bộ => máy nén => làm
nguội không khí => tách dầu mỡ => lọc tổng thể
=> lọc riêng =>cấp cho thiết bị lên men
Lọc sơ bộ: hai lớp lưới inox đặt trước và sau hai
đầu hộp hình trụ (giữa hai lớp lưới xếp mảnh sứ,
có tẩm dầu nhờn)
Phin lọc không khí cấu tạo theo hình trụ, bên
trong xếp vật liệu lọc (bông thủy tinh, bông mỡ
vải, amiang, màng lọc vi sinh,…)
Ths. Bù
Bùi Hồ
Hồng Quân

18


THANH TRÙNG KHÔNG KHÍ
TRONG SẢN XUẤT
Không khí trong phòng: không khí là vật chất có thể len lỏi vào tất
cả các vị trí, các khe trong máy móc thiết bị,…=> làm sao thanh
trùng?
Biện pháp:
– Đèn UV: Lắp ráp như đèn huỳnh quang
Ưu điểm: tiêu diệt nhanh, không để lại dấu vết
Nhược điểm: không tiêu diệt được bào tử, sự tiêu diệt vi sinh vật bị cản trở

– Formalin: Xử lý trước khi làm thí nghiệm

Ưu điểm: rẻ, nhanh, hạn chế được nhược điểm của việc sử dụng đèn UV
Nhược điểm: độc hại, còn lưu lại trong không khí => Huấn lyện giống quen
dần với formalin

– Màng lọc: Thùng nuôi cấy (tủ cấy vô trùng)
Điều kiện: thực hiện trước khi nuôi cấy
Ưu điểm: ít tốn điện, đầy không khí một phí, hút không khí một phía

Ths. Bù
Bùi Hồ
Hồng Quân

19


PHÒNG VÔ TRÙNG
Phòng vô trùng, phòng cấy, tủ cấy vô trùng
Phòng vô trùng thổi khí vô trùng tạo áp suất ao
bên trong phòng (người thực hiện: phả qua
phòng riêng tắm và mặc quần áo chuyên biệt phủ
toàn thân)

Ths. Bù
Bùi Hồ
Hồng Quân

20


KIỂM TRA MỨC ĐỘ SẠCH CỦA

KHÔNG KHÍ
Hệ thống cung cấp không khí: bắt buộc phải qua
kiểm tra vi sinh vật định kỳ
Phương pháp kiểm tra: kiểm tra vi sinh vật
không khí trong phòng thí nghiệm

Ths. Bù
Bùi Hồ
Hồng Quân

21


CÁC PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN
Trong quá trình thu nhận các sản phẩm sinh học nói chung
và các chế phẩm diệt sâu hại nói riêng, tùy từng đối
tượng vi sinh vật mà người ta áp dụng các phương pháp
lên men khác nhau
Các phương pháp lên men gồm:
– Nuôi không liên tục
Nuôi cấy chìm
Nuôi cấy bề mặt
Nuôi cấy xốp

– Nuôi cấy liên tục
Ths. Bù
Bùi Hồ
Hồng Quân

22

NUÔI KHÔNG LIÊN TỤC
Phương pháp nuôi không liên tục (batch culture) hay còn gọi là
nuôi gián đoạn
Vi sinh vật sinh trưởng đến khi một thành phần chủ yếu của môi
trường dinh dưỡng bị giới hạn
Culture (giống) chuyển từ pha lũy thừa sang pha cân bằng
Sinh trưởng gắn liền với sự thay đổi kéo dài của điều kiện nuôi,
sự giảm chất dinh dưỡng và sự tăng khối lượng tế bào
Trong quá trình đó trạng thái sinh lý của tế bào cũng thay đổi
Việc tạo thành sản phẩm mong muốn liên quan với một trạng thái
sinh lý nhất định trong pha sinh trưởng
Không thể duy trì được trạng thái này trong một thời gian dài
Phương pháp nuôi gián đoạn thường được sử dụng cho sự lên
men vô trùng
Dễ dàng về mặt kỹ thuật
Ths. Bù
Bùi Hồ
Hồng Quân

23


NUÔI KHÔNG LIÊN TỤC – NUÔI CHÌM
Dùng cho cả vi sinh vật kị khí và hiếu khí
Đối với nuôi vi sinh vật kị khí trong quá trình nuôi không cần
sục khí, chỉ thỉnh thoảng khuấy trộn
Vi sinh vật hiếu khí thì phải sục khí liên tục
Là phương pháp hiện đại đã được dùng trong khỏang nửa

cuối thế kỷ XX
Kết quả lớn đối với công nghệ vi sinh
Nuôi chìm hay nuôi cấy bề mặt sâu dùng trong môi trường
dịch thể
Chủng vi sinh vật cấy vào môi trường được phân tán khắp
mọi điểm và chung quanh bề mặt tế bào được tiếp xúc với
dịch dinh dưỡng
Đặc điểm này đòi hỏi trong suốt quá trình nuôi cấy phải
khuấy và cung cấp oxy bằng cách sục khí liên tục
Ths. Bù
Bùi Hồ
Hồng Quân

24


Phương pháp nuôi cấy chìm được dùng phổ
biến trong công nghệ vi sinh
Men bánh mì
Protein đơn bào
Các chế phẩm vi sinh làm phân bón
Thuốc trừ sâu
Các enzyme
Các acid amin
Vitamin, các chất kháng sinh, các chất kích thích
sinh học,…
Ths. Bù
Bùi Hồ
Hồng Quân

25