KHẢO sát THÀNH PHẦN hóa học của LOÀI nấm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA HÓA HỌC
BỘ MÔN HÓA HỌC HỮU CƠ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LOÀI
NẤM CORDYCEPS NEOVOLKIANA

GVHD: ThS. Lê Thị Thu Hương
ThS. Dương Thúc Huy
SVTH: Lê Tấn Lộc
MSSV: K38.106.069

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2016


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA HÓA HỌC
BỘ MÔN HÓA HỌC HỮU CƠ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LOÀI
NẤM CORDYCEPS NEOVOLKIANA

GVHD: ThS. Lê Thị Thu Hương
ThS. Dương Thúc Huy
SVTH: Lê Tấn Lộc
MSSV: K38.106.069

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2016


NHẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................

LỜI CẢM ƠN

Bằng tất cả sự trân trọng và lòng biết ơn, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến với:
Cô Lê Thị Thu Hương và thầy Dương Thúc Huy – thầy cô đầy tâm huyết và
nhiệt tình. Thầy, cô không những chỉ dạy cho em kiến thức chuyên môn cùng với những
kinh nghiệm nghiên cứu quý báu mà còn giúp đánh thức niềm say mê nghiên cứu khoa
học của em trong suốt thời gian được cô hướng dẫn.
Tất cả quý Thầy cô khoa Hóa, trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh
đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt thời gian em theo học và hoàn
thành khóa luận.
Các anh chị học viên cao học và các bạn sinh viên bộ môn Hóa Hữu cơ, khoa
Hóa học, trường Đại học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã động viên, giúp đỡ trong
suốt quá trình thực hiện đề tài.
Và cuối cùng con xin cảm ơn gia đình – chỗ dựa vững chắc về tinh thần trong
suốt thời gian con theo học và thực hiện đề tài ở trường Đại học Sư Phạm Thành phố Hồ
Chí Minh.

i


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ i
MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii
MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU ........................................... iv
DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC PHỔ.............................................................................v
LỜI MỞ ĐẦU .............................................................................................................. vi
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .........................................................................................1
1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHI CORDYCEPS.....................................................1

1.1.1 Định nghĩa và phân loại chi Cordyceps .........................................................1
1.1.2 Hoạt tính các hợp chất có trong chi Cordyceps .............................................1
1.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CỦA CÁC LOÀI NẤM THUỘC CHI
CORDYCEPS ...............................................................................................................1
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM....................................................................................7
2.1 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ ..................................................................................7
2.1.1 Hóa chất .........................................................................................................7
2.1.2 Thiết bị...........................................................................................................7
2.2 NGUYÊN LIỆU ....................................................................................................7
2.3 QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM ............................................................................7
2.3.1 Rửa tủa trên phân đoạn cao A1 .....................................................................8
2.3.2 Sắc ký cột trên phân đoạn cao A3 .................................................................8
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................10
3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT T3 ..........................................................10
3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT TT1 ........................................................12
CHƯƠNG 4 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................................15
4.1 KẾT LUẬN ..........................................................................................................15
4.2 KIẾN NGHỊ .........................................................................................................15
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................16
PHỤ LỤC
ii


MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13

C-NMR

: Carbon Nuclear Magnetic Resonance

1

H-NMR

: Proton Nuclear Magnetic Resonance

Ac

: Acetone

AcOH

: Acetic acid

C

: Chloroform

COSY

: Homonuclear shift correlation spectroscopy

d

: Mũi đôi (Doublet)

dd

Mũi đôi đôi (Doublet of duoblet)

DMSO

: Dimethyl sulfoxide

EA

: Ethyl acetate

H

: Hexane

HMBC

: Heteronuclear Multiple Bond Coherence

HSQC

: Heteronuclear Single Quantum Correlation

J

: Hằng số tương tác spin-spin

m

: Mũi đa (Multiplet)

Me

: Methanol

NMR

: Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)

ppm

: Part per million

s

: Mũi đơn (Singlet)

t

: Mũi ba (Triplet)

UV

: Tia cực tím (ultra violet)

iii


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU

Hình 1.1: Polysaccharide được xác định bởi Yu và cộng sự, 2009................................ 3
Hình 1.2: Các hợp chất được cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps .......................... 4

Hình 3.1: Khung Ergostane ..........................................................................................10
Hình 3.2: Tương quan HMBC của phần aglycon của hợp chất T3 .............................. 11
Hình 3.3: Cấu trúc của hợp chất T3 .............................................................................12
Hình 3.4: Cấu trúc của hợp chất TT1 ...........................................................................13
Hình 4.1: Cấu trúc của hợp chất T3 và hợp chất TT1 ................................................. 15
Sơ đồ 2.1: Quy trình cô lập hợp chất T3 và TT1 ........................................................... 9
Bảng 2.1 : Phân đoạn trên cao methanol thô .................................................................. 8
Bảng 3.3: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất T3, ergosterol 3-O-β-D-glucopyranoside,
TT1 và ergosterol ..........................................................................................................14

iv


DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC PHỔ

Phụ lục 1. Phổ 1H-NMR của hợp chất T3 trong dung môi DMSO-d 6
Phụ lục 2. Phổ 13C của hợp chất T3 trong dung môi DMSO-d 6
Phụ lục 3. Phổ HSQC của hợp chất T3 trong dung môi DMSO-d 6
Phụ lục 4. Phổ HMBC của hợp chất T3 trong dung môi DMSO-d 6
Phụ lục 5. Phổ COSY của hợp chất T3 trong dung môi DMSO-d 6
Phụ lục 6. Phổ 1H-NMR của hợp chất TT1 trong dung môi CDCl 3

v


LỜI MỞ ĐẦU

Cùng với sự phát triển của Y học nói chung và Y học dân tộc nói riêng thì xu
hướng hiện nay là quay về các sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ tự nhiên, vừa mang lại
hiệu quả cao và vừa ít tác dụng phụ. Nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên đã và đang

đóng góp những thành tựu quý báu cho ngành Hóa học cũng như ngành Sinh học và Y
dược học. Sự kết hợp những chứng cứ khoa học từ lĩnh vực nghiên cứu các hợp chất
thiên nhiên và hoạt tính sinh học đã góp phần củng cố và phát triển nền Y học cổ truyền.
Từ thời xa xưa loài nấm thuộc chi Cordyceps được xem là nguồn nguyên liệu
quý, bài thuốc quý trong y học để giúp con người chữa bệnh. Phổ biến nhất là loại nấm
Cordyceps sinensis (còn được gọi là Đông Trùng Hạ Thảo). Những nghiên cứu gần đây
cho biết các polysaccharide hiện diện trong C. sinensis thể hiện đa dạng các hoạt tính
sinh học như kháng oxi hóa, ức chế miễn dịch và chống xơ vữa động mạch, các
nucleoside mang đa tác dụng trên macrophage và cordycepin có hoạt tính ức chế sự phát
triển khối u và ức chế miễn dịch. Vì thế, loài nấm này thu hút rất nhiều nhà nghiên cứu
những năm gần đây dựa trên giá trị dinh dưỡng và dược học của nó. Tuy nhiên, nguồn
cung cấp tự nhiên của các loài nấm này giảm dần bởi vì môi trường sống khắc nghiệt và
sự khai thác quá mức nguồn nguyên liệu. Gần đây, một vài loài nấm thuộc chi
Cordyceps được chiết tách và nuôi cấy trong phòng thí nghiệm[25]. Tuy nhiên một số
nguyên cứu gần đây chứng tỏ có sự khác nhau về thành phần và hàm lượng các hợp chất
hóa học giữa nấm tự nhiên và nấm nuôi cấy.
Xuất phát từ những ứng dụng Y học quý giá và kế thừa những kết quả nghiên
cứu trong và ngoài nước trên chi Cordyceps, chúng tôi tiến hành nghiên cứu thành
phần hóa học của loài nấm Cordyceps neovolkiana.

vi


Khóa Luận Tốt Nghiệp

Lê Tấn Lộc
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHI CORDYCEPS

1.1.1 Định nghĩa và phân loại chi Cordyceps
Các loài nấm thuộc chi Cordyceps gồm có C. sinensis, C. militaris, C. pruinosa
và C. ophioglossoides là nguồn nguyên liệu quý trong dược học. Thành phần dược liệu
là loài nấm khô thuộc chi Cordyceps phát triển trên ấu trùng. Trong đó, phổ biến nhất
là loài nấm Cordyceps sinensis, được gọi với tên Đông Trùng Hạ Thảo (Tiếng Trung
Quốc, Dong-Chong-Xia-Cao hay Tochukaso, tiếng Nhật). Tên gọi trên bắt nguồn từ sự
thay đổi theo mùa của nó. Vào mùa đông, ấu trùng nhiễm nấm sẽ chuyển thành sâu
sống trong đất được gọi là Đông Trùng. Khi sang hè, stroma phát triển trên đầu của ấu
trùng có hình dáng giống cỏ nên được gọi là Hạ Thảo. Ở Trung Quốc, đây là vị thuốc
có nguồn gốc hàng ngàn năm. [22]
1.1.2 Hoạt tính các hợp chất có trong chi Cordyceps
Thành phần hóa học của chi Cordyceps được tìm thấy gồm có cordycepin (30deoxyadenosin) và dẫn xuất, ergosterol, polysaccharide, glycoprotein và peptides có
chứa thành phần aminoisobutyric acid. Các hợp chất này có các hoạt tính sinh học như
kháng

ung

thư,

kháng

đột

biến

(anti-metastatic),

ức

chế

miễn

dịch

(immunomodulatory), kháng oxy hóa, kháng viêm, diệt sâu bọ (insecticidal), kháng
khuẩn, hạ lipit trong máu, hạ đường huyết, chống lão hóa, bảo vệ hệ thần kinh và thận.
Những nghiên cứu gần đây cho biết các polysaccharide hiện diện trong C. sinensis thể
hiện đa dạng các hoạt tính sinh học như : chống oxy hóa, ức chế miễn dịch, chống xơ
vữa động mạch, các nucleoside mang đa tác dụng trên macrophage và cordycepin có
hoạt tính ức chế sự phát triển khối u và ức chế miễn dịch.
1.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CỦA CÁC LOÀI NẤM THUỘC CHI
CORDYCEPS
Các

hợp

chất

như

Cordycepin

(3’-deoxyadenosine),

3’-amino-3’-

deoxyadenosine, homocitrullyl aminoadenosine, adenine, cordycepic acid và

D-

mannitol đã được cô lập từ các loài nấm thuộc chi Cordyceps từ những năm 1950
1


Khóa Luận Tốt Nghiệp

Lê Tấn Lộc

(Cunningham và cộng sự, 1950 [6]; Chatterjee và cộng sự, 1957 [3]; Kredich và Guarino,
1961 [16]; Kaczka và cộng sự, 1964 [10]; Liu và cộng sự 1989 [20]).
Một nghiên cứu gần đây chứng tỏ có sự khác nhau về thành phần và hàm lượng
các hợp chất hóa học giữa nấm tự nhiên và nấm nuôi cấy. Nấm nuôi cấy chứa hàm
lượng của polysaccharide, adenine và adenosine cao hơn so với các loài nấm tự nhiên.
Li và cộng sự

[17, 18]

cũng tìm thấy nấm C. sinensis nuôi cấy có hàm lượng nucleoside

cao hơn loài tự nhiên.
Ergosterol hiện diện trong C. sinensis được xác định bởi sắc ký bảng mỏng điều
chế (Li và Li 1991; Li và cộng sự 2004)

[19]

. Boros và cộng sự (1994)

[2]

công bố

ophiocordin (54), một hợp chất kháng nấm và kháng khuẩn được cô lập từ C.
ophioglossoides (Kneifel và cộng sự 1977

[12]

) có cấu trúc của balanol từ Verticillium

balanoides.
Bioxanthracenes (55-67) được cô lập từ C. pseudomilitaris (Isaka và cộng sự,
2001

) Ngoài ra các hợp chất cordypyridones A-D (68-71) cũng được cô lập từ loài

[8] .

nấm trên bởi cùng nhóm tác giả (Isaka và cộng sự, 2001 [9]).
Các hợp chất chứa vòng 10 carbon cepharosporolides C, E và F (71-73), cùng
với

cordycepin,

pyridine-2,

6-dicarboxylic

acid

và

2-carboxymethyl-4-(30-

hydroxybutyl) furan (73-74) được cô lập từ C. militaris bởi Rukachaisirikul và cộng sự
(2004) [24]. Krasnoff và cộng sự (2005) [15] công bố cicadapeptins I và II (các peptides
chứa thành phần aminoisobutyric acid) và myriocin (kháng nấm) (51-53) từ C.
heteropoda.
Một glycoprotein với thành phần N-acetylgalactosamine [Gal-β(1→3)-Gal-NAcol galactosyl-β(1→3)-N-acetyl-galactosaminitol] được cô lập từ C. ophioglossoides
(Kawaguchi và cộng sự 1986)

. Các polysaccharide cũng được cô lập bởi nhiều

[11]

nhóm tác giả. Bốn exopolysaccharides có khối lượng phân tử từ 50 kDa đến 2260 kDa
được cô lập từ C. militaris bởi Kim và cộng sự (2003b, c) [12-14]. Yu và cộng sự (2004a,
b) cũng công bố bốn polysaccharides từ C. militaris [29-30]. Ngoài ra còn nhiều công bố
khác nghiên cứu về polysaccharide từ nấm Cordyceps như Chun và cộng sự, 2003
Methacanon và cộng sự, 2005
2006

[27]

; Yu và cộng sự, 2007

[21]

; Wu, Sun và Pan, 2006

[31]

; Cheung và cộng sự, 2009

[5]

;

[26]

; Xiao và cộng sự,

[4]

. Các nghiên cứu chỉ
2


Khóa Luận Tốt Nghiệp

Lê Tấn Lộc

dừng ở xác định thành phần các monosaccharide và khối lượng phân tử cũng như hoạt
tính sinh học. Một nghiên cứu gần đây được thực hiện bởi Yu và cộng sự, 2009 [23] sử
dụng nhiều phương pháp xác định cấu trúc của polysaccharide từ Cordyceps militaris.
-(1→3)-

→
→
[ 4-α-D-Man-(1→4)-α-D-Man-(1→4)-α-D-Man-(1 ]n

→
β-D-Gal-(1→
[ 6)-β-D-Gal-(1 ]3 4)-α-D-Glc

Hình 1.1: Polysaccharide được xác định bởi Yu và cộng sự, 2009.
Gần đây, Yang và cộng sự

[28]

đã cô lập cordysinins A-E cùng với 46 hợp chất

đã biết khác từ nấm Cordyceps sinensis nuôi cấy: ergosterol (6), (17R)-17methylincisterol (7), ergosterol peroxide (8), ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one (9),
fungisterol (10), hỗn hợp β-sitosterol (11) và stigmasterol (12), hỗn hợp của βsitosterol 3-O-acetate (13) và stigmasterol 3-O-acetate (14), 4,4-dimethyl-5α-ergosta8,24(28)-dien-3β-ol

(15),6

3-O-ferulylcycloartenol

(16),

daidzein

(17),

p-

hydroxybenzoic acid (18), vanillic acid (19), orobol (20), uracil (21), genistein (22), Dmannitol (23), p-methoxybenzoic acid (24), 3-hydroxy-2-methyl-4-pyrone (25),
acetovanillone (26), p-hydroxyphenylacetic acid (27), cyclo(L-Pro-L-Val) (28),
syringic acid (29), cyclo(L-Phe-L-Pro) (30), cyclo(L-Pro-L-Tyr) (31), 2-furancarboxylic
acid (32), p-methoxyphenol (33), glycitein (34), salicylic acid (35), methyl phydroxyphenylacetate (36), thymine (37), nicotinic acid (38), ergosteryl-3-O-β-Dglucopyranoside (39), flazin (40), 3′,4′,7-trihydroxyisoflavone (41), succinic acid (42),

perlolyrine (43), 1-methylpyrimidine-2,4-dione (44), protocatechuic acid (45), 3,4dihydroxyacetophenone (46), 4-hydroxyacetophenone (47), 2-deoxy-D-ribono-1,4lactone (48), 1-acetyl-β-carboline (49), và adenosine (50).

3


Khóa Luận Tốt Nghiệp
H

Lê Tấn Lộc
H2N

O
N

NH
N

O
HO

H
H

O
Cordycinin A (1)

N

N
N

N

HO

N

N

N
H

H
H

HO

H

HO

CH3

H

CH3
OH

OH
OH

Cordycinin D (4)

Cordycinin C (3)

OCH3

N
H

N
H

Cordycinin E (5)

Cordycinin B (2)

H

H

O
H

H

O

O

H

O

H

H

HO

HO

HO

ergosterol peroxide (8)

O
(17R)-17-methyl incisterol (7)

ergosterol (6)

f ungisterol (10)

stigmasterol (12)
CH2

H
O

H

H

H

H

H

H

H
HO

ß-sitosterol (11)

HO

H
O

H

H

H

H

ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one (9)

H

H

H

O

HO

O

O

stigmasterol 3-O-acetate (14)

ß-sitosterol 3-O-acetate (13)

4,4-dimethyl-5a-ergosta-8,24(28)-dien-3ß-ol (15)

H
O

HO

O

O

O

O

OH

O

H
HO

O

O
3-O-f erulylcycloartenol (16)
O
O

HO

OH

HO

O

OH

OH

HO

OH
vanillic acid (19)

O

H
N

O

O
OH

HN
uracil (21)

O
OH
genistein (22)
O

O
OH

OH
OH

OH

HO
OH

O

OH

orobol (20)
OH

p-hydroxybenzoic acid (18)

daidzein (17)

OH

D-mannitol(23)

O
p-methoxybenzoic acid (24)

O
3-hydroxy-2-methyl-4-pyrone (25)

Hình 1.2: Các hợp chất được cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps
4


Khóa Luận Tốt Nghiệp

Lê Tấn Lộc
O
CH3

O

O

O

O

OH
H3C

HO

O

O
HO
acetovanillone (26)

O

H
O
cyclo-(L-Pro-L-Val) (28)

p-hydroxyphenylacetic acid (27)

HN

HO

HN
OH

N

N

O
cyclo(L-Phe-L-Pro) (30)

syringic acid (29)

O
HO

N

O

OH

O

O

HO

N
H

O

O

O
p-methoxyphenol (33)

2-furancarboxylic acid (32)

cyclo(L-Pro-L-Tyr) (31)
HO

OH

H3CO

OH

OH
HO

O

HN

O

H
N
H

O

O
methyl p-hydroxyphenylacetate (36)

OH

O
HO

OH

thymine (37)

H

HO
O

OH
O

HO

O

H
N

H
OH

O
O

ergosterol 3-O-ß-D-glucopyranoside (38)

O

H
N

O

O

N
nicotinic acid (40)

O

OH
3',4',7-trihydroxyisoflavone (41)

CH3

O

O
N

HO

3,4dihydroxyacet
ophenone (46)

OH
N
H

O

N

HO
OH

OH
flazin (39)

OH

OH

N

O
HO

1-methylpyrimidine-2,4-dione
(44)

protocatechuic acid (45)

NH2

H
N

N
H

HO
N

O
O

H
N

N
H
Aib-1

O

Aib-2

Hyp-1

H
N

N
O

O

N

N

CO2H OH
O

HO
NH2

OH
HN

HO
adenosine (50)

O
H
N
CH3

cicadapeptin I (51) and cicadapeptin II (52)
N
NH2 OH

OH

O

N

N

R2

O

OH

NH2

51: R1 = CH3, R2 = H
52: R1 = H, R2 = CH3

HO

2-deoxy-D-ribono1,4-lactone (48)

OH

N
H

OH

O

Leu/Ile R
1
O

O

O

O

OH

Gln

Val
Hyp-2

O
succinic acid (42)

perlolyrine (43)
CH3
O
4-hydroxyacetophenone (47)
OH

OH

O

HOH2C

salicylic acid (35)

glycitein (34)

O
NH
O

HO
ophiocordi (54)

1-acetyl-ß-carboline (49)

HOOC
OH

53: Myriocin

O

Hình 1.2: Các hợp chất được cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps (tiếp)
5


Khóa Luận Tốt Nghiệp

H3CO
8

8a

7
6

H3CO

OH
9 9a

10a 10 4a
5

Lê Tấn Lộc

H3CO

H3CO

OH

3

R1

4 3

H3CO

CH3
11

5

5'

10'
4' 3'
1' O

10

5

OH

5'

H3CO

CH3

H3CO

CH3

OH
R2

R2
H3CO

1 O
4 3

1 O

1 O
4

OH

4'

3'
1' O

OCH3 OH

OCH3 OH

63

61 : R2 = OH
62 : R2 = H

55 : R1 = OH, R2 = OH
56 : R1 = OAc, R2 = OH
57 : R1 = OAc, R2 = OAc
58 : R1 = OH, R2 = H
59 : R1 = OAc, R2 = H4
60 : R1 = H, R2 = H

H3CO

CH3

4'

3'
1' O

OCH3 OH

OH

10'

5'

H3CO

CH3

CH3

H3CO

OH

OH
O
O
H3CO

H3CO

CH3
R1

CH3
66 : R1 = OH
67 : R1 = H

OH

H3CO

R1

CH3
O
OCH3 OH
64 : R1 = OH
65 : R1 = H

OH
17 O
2

H
11 12
10

7
8

9
15

N
1

6

O

4

OH

9

7
8

2

O

N
1

H
N

H

H

4
13 O

N

H

OCH3
O

2
13 O

O

H

73

13 O

N

13 14

O

N

H

H

O

OH

OH
O

N

H
OR1

N
1 OCH3

14
72

OCH3

N

6

4
3

OH

14
70 : X = OH
71 : X = H

69
OCH3

5

O

15

14

68
O

H

X

5

OH
13

O

N

H

3

OCH3

OH

8

13 O

OH

H
74 : R1 = H
75 : R1 = CH3

14 R2
76 : R2 = HgX
77 : R2 = OH
78 : R2 = p-bromobezoyloxy

14

OH
80

81

79

Hình 1.2: Các hợp chất được cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps (tiếp)
6

Khóa Luận Tốt Nghiệp

Lê Tấn Lộc
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

2.1 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
2.1.1 Hóa chất
 Silica gel 0,04-0,06 mm, Himedia dùng cho cột sắc kí.
 Sắc kí bản mỏng loại Kieselgel 60F

254

(20×20), Merck.

 Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: hexane, ethyl acetate, acetic
acid, chloroform, acetone, methanol, ethanol, và nước cất.
 Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bảng mỏng: sử dụng
vanillin/H 2 SO 4 .
2.1.2 Thiết bị
 Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu.
 Các cột sắc kí.
 Máy cô quay chân không.
 Bếp cách thuỷ.
 Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm.
 Cân điện tử.
 Các thiết bị ghi phổ 1H-NMR (500 MHz),

13

C-NMR (125 MHz) và 2D-NMR

tại phòng Phân tích Trung tâm trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí
Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh.
2.2 NGUYÊN LIỆU
Loài nấm Cordyceps neovolkiana được cung cấp từ TS. Đinh Minh Hiệp – Ban
quản lý khu Nông nghiệp công nghệ cao thành phố Hồ Chí Minh.
2.3 QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM
Sinh khối nấm tươi 3.5 kg được làm sạch, để khô, nghiền nhỏ thu được bột khô
(700.0 g). Sau đó, bột khô được ngâm dầm trong ethanol ở nhiệt độ phòng. Lấy dịch cô
quay thu hồi dung môi ở áp suất thấp thu được cao ethanol thô (200.0 g).

7


Khóa Luận Tốt Nghiệp

Lê Tấn Lộc

Cao ethanol thô sẽ được hòa tan nhiều lần trong methanol. Tách riêng phần kết
tủa (70.0 g). Phần dịch methanol thô còn lại 130.0 g. Sau đó tiến hành sắc ký cột cao
methanol thô với hệ dung môi với độ phân cực tăng dần thu được các loại cao tương
ứng như bảng 2.1.
Bảng 2.1: Các phân đoạn của cao methanol thô
Hệ dung môi

Cao

H:EA 9:1
H:EA 8:2

A1 (1.56 g)
A2 (5.0 g)

H:EA 7:3

A3 (3.1 g)

H:EA 5:5

A4 (10.0 g)

H:EA 7:3
H:EA 9:1
EA:Me 5:5
Me 100%

A5 (3.0 g)
A6 (10.0 g)
A7 (30.0 g)
M (56.0 g)

2.3.1 Rửa tủa trên phân đoạn cao A1
Từ phân đoạn cao A1 (1.56 g) trích riêng phần dầu DA1 (660.0 mg) và phần tủa
TA1 (0.9 g), sau đó tủa TA1 được rửa bằng acetone nhiều lần thu được hợp chất TT1
(700.0 mg).
2.3.2 Sắc ký cột trên phân đoạn cao A3
Phân đoạn cao A3 (3.1 g) được tiến hành sắc ký cột với hệ dung môi
H:EA:AcOH (4:1:0.2) thu được các phân đoạn A3.1 (150.0 mg), A3.2 (70.0 mg), A3.3
(256.0 mg), A3.4 (360.0 mg), A3.5 (210.0 mg), A3.6 (300.0 mg).
Tiếp tục tiến hành sắc ký cột trên phân đoạn A3.4 (360.0 mg) với hệ dung môi

C:Me

(5:0.1)

thu

được

hợp

chất

T3

(10.0

mg).

8


Lê Tấn Lộc

Khóa Luận Tốt Nghiệp
Sinh khối nấm
3.5 kg

- Ngâm dầm trong ethanol
- Cô quay thu hồi dung môi
Cao ethanol Thô

200.0 g

- Hòa tan trong Methanol
Cao methanol

Tủa

130.0 g

70.0 g

- SKC (sắc ký cột)
H:EA
[9:1 – 0:10]

EA:Me
[5:5]

Me
100%

A1

A2

A3

A4

A5

A6

A7

M

1.56 g

5.0 g

3.1 g

10.0 g

3.0 g

10.0 g

30.0 g

56.0 g

SKC H:EA:AcOH
4:1:0,2
Dầu
DA1

Tủa TA1
0.9 g

A3.1

A3.2

A3.3

A3.4

A3.5

A3.6

150.0 mg

70.0 mg

256.0 mg

360.0 mg

210.0 mg

300.0 mg

Rửa bằng Ac
nhiều lần

C:Me
5:0.1

TT1

T3

700.0 mg

10.0 mg

Sơ đồ 2.1: Quy trình cô lập hợp chất T3 và TT1
9


Khóa Luận Tốt Nghiệp

Lê Tấn Lộc

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT T3
Hợp chất T3 (10.0 mg) thu được được từ phân đoạn A3.4 có các đặc điểm như
sau:
 Chất bột vô định hình màu trắng.
 Bắt UV, hiện hình với thuốc thử vanillin/H 2 SO 4 cho vết màu tím.
 Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) Phụ lục 1.

 Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) Phụ lục 2.
 Phổ HSQC (DMSO-d 6 ) Phụ lục 3.
 Phổ HMBC (DMSO-d 6 ) Phụ lục 4.
 Phổ COSY (DMSO-d 6 ) Phụ lục 5.

 Biện luận cấu trúc hợp chất phổ T3
Phổ 1H-NMR cho thấy 6 tín hiệu của các nhóm methyl H 3 -18 (δ H 0.57, s), H 3 -19
(δ H 0.88, s), H 3 -26 (δ H 0.79, d, J = 7.0 Hz), H 3 -27 (δ H 0.80, d, J = 6.5 Hz), H 3 -28 (δ H
0.86, d, J = 7.0 Hz), H 3 -21 (δ H 1.00, d, J = 6.5 Hz). Trong đó nhóm H 3 -18 chuyển dịch
về vùng từ trường rất cao đặc trưng cho khung sườn ergostane. [1]
28
22

21
12
19

1
2
3

11

13
9

10
4

H

5

18

20
H

17
14

26
23

24

16

25
27

8 H 15
7

6

Hình 3.1 Khung Ergostane
Phổ 1H-NMR cho thấy sự hiện diện của 4 proton olefin H-6 (δ H 5.52), H-7 (δ H
5.33), H-22 (δ H 5.17) và H-23 (δ H 5.23). Phân tích sự chẻ mũi của 2 proton olefin H-22
(δ H 5.23, dd, J 1 = 15.5 Hz, J 2 = 7.0 Hz) và H-23 (δ H 5.17, dd, J 1 = 15.0, J 2 = 8.0) cho
10


Khóa Luận Tốt Nghiệp

Lê Tấn Lộc

thấy sự ghép trans của 2 proton alkene này và đồng thời chúng ở lân cận 2 nhóm
methine. Phân tích phổ HMBC cho thấy proton nhóm methyl H 3 -26 (δ H 0.80) có tương
quan với các carbon tại C-24 (δ C 42.0), C-25 (δ C 32.5) và C-27 (δ C 19.5). Bên cạnh đó
proton nhóm methyl H 3 -27 (δ H 0.79) có tương quan với các carbon tại C-24 (δ C 42.0), C25 (δ C 32.5) và C-26 (δ C 19.7). Điều này giúp xác định carbon C-27 (δ C 19.5) và C-26
(δ C 19.7) cùng gắn trên carbon C-25 (δ C 32.5). Ngoài ra proton alkene H-23 tương quan
HMBC với carbon tại δ C 32.5 (C-25) và 2 proton alkene H-22 (δ H 5.17), H-23 (δ H 5.23)
cho tương quan HMBC với carbon C-24 (δ C 42.0). Cùng với đó, proton H 3 -21 (δ H 1.00)
có sự tương quan HMBC với carbon tại C-20 (δ C 42,5), C-17 (δ C 55.0), và C-22 (δ C
135.3). Điều này giúp xác định cấu trúc của dây hidrocarbon tại C-17.
Trên nhân B, proton nhóm methyl H 3 -19 (δ H 0.88) có tương quan HMBC với các
carbon tại C-5 (δ C 141.0), C-9 (δ C 45.4) và C-10 (δ C 37.0). Ngoài ra trên phổ HMBC cho
thấy proton olefin H-7 (δ H 5.33) tương quan với carbon tại C-9 (δ C 45.4) và đồng thời
proton H-6 (δ H 5.52) tương quan HMBC các carbon C-5 (δ C 141.0) và C-10 (δ C 37.0)
giúp xác định cấu trúc của vòng B.
H

CH3

H3C

CH3

H
CH3

OH

H

H

A

D

C

B

O
O

HO
HO

CH3

H
H

H
HO

H

H

Hình 3.2: Tương quan HMBC của phần aglycon của hợp chất T3
Trên phổ 13C-NMR xuất hiện 1 tín hiệu carbon acetal C-1’ (δ C 100.9) cùng với 5

tín hiệu carbon khác của 1 đơn vị đường glucopyranose. Đơn vị đường glucopyranose
liên kết với phần aglycon tại C-3 được xác định nhờ sự tương quan cho thấy sự tương tác
giữa H-1’ (δ H 4.23) và C-3 (δ C 75.6). Đồng thời hằng số ghép giữa H-1’ và H-2’ là J =
11


Khóa Luận Tốt Nghiệp

Lê Tấn Lộc

7.5 Hz, chứng tỏ hai proton này ở vị trí nhị trục và giúp xác định đơn vị đường β-Dglucopyranose. Phổ HSQC, HMBC kết hợp với phổ COSY giúp xác định các vị trí còn
lại của phần đường β-D-glucopyranose.
Từ những dữ liệu phổ trên và so sánh với dữ liệu phổ của ergosterol 3-O-β-Dglucopyranoside [31]. Hợp chất T3 được xác định là ergosterol 3-O-β-D-glucopyranoside.
H

CH3

H3C

CH3

H

CH3

OH

H
H

O
O

HO
HO

H
H

H
HO

H

H

Hình 3.3: Cấu trúc của hợp chất T3
3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT TT1
Hợp chất TT1 (700.0 mg) thu được được từ phân đoạn A1 có các đặc điểm như
sau:
 Chất bột vô định hình màu trắng.
 Bắt UV, hiện hình với thuốc thử vanillin/H 2 SO 4 cho vết màu tím.
 Phổ 1H-NMR (DMSO-d 6 ) Phụ lục 6.
 Biện luận cấu trúc hợp chất phổ TT1
Phổ 1H-NMR cho thấy 6 tín hiệu của nhóm methyl H 3 -18 (δ H 0.63, s), H 3 -19 (δ H
0.95, s), H 3 -26 (δ H 0.83, d, 7.5 Hz), H 3 -27 (δ H 0.84, d, 7.0 Hz), H 3 -28 (δ H 0.92, d, 6.5
Hz), H 3 -21 (δ H 1.03, d, 6.5 Hz). Trong đó nhóm H 3 -18 chuyển dịch về vùng từ trường rất
cao đặc trưng cho khung sườn ergostane. [1]
So sánh dữ liệu phổ 1H-NMR của TT1 với T3 cho thấy dữ liệu phổ của hai hợp
chất này là hoàn toàn tương đồng với nhau ngoại trừ sự biết mất của phân tử đường β-Dglucopyranose trong vùng từ 3.00 ppm đến 5.00 ppm và proton H-3 dịch chuyển về vùng

từ trường thấp. Điều này chứng tỏ rằng hợp chất TT1 là phần aglycon của hợp chất T3.
12


Khóa Luận Tốt Nghiệp

Lê Tấn Lộc

Từ những dữ kiện phổ trên và so sánh với dữ liệu phổ của ergosterol [7], hợp chất
T1 được kết luận là ergosterol.
H

CH3

H3C

CH3

H

HO

CH3

H
H

Hình 3.4: Cấu trúc của hợp chất TT1

13

Khóa Luận Tốt Nghiệp

Lê Tấn Lộc

Bảng 3.1: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất T3, ergosterol 3-O-β-Dglucopyranoside[1],TT1 và ergosterol[7]

N

T3

(*)

δ H , J (Hz)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15

16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
1’
2’
3’
4’
5’
6’A
6’B

3.56 (m)

5.52 (m)
5.33 (m)

0.57 (s)
0.86 (s)
1.00 (d, 6.5)
5.17

(dd, 15.0, 8.0)
5.23
(dd, 15.5, 7.0)

0.80 (d, 7.0)
0.79 (d, 6.5)
0.87 (d, 7.0)
4.23 (d, 7.5)
2.98 (m)
3.07 (m)
3.12 (m)
3.00 (m)
3.63 (m)
3.40 (m)

δC
37.7
30.0
75.6
37.7
140.0
119.4
116.0
141.0
45.4
37.0
22.6
38.4
42.4
53.8

21.0
27.9
55.0
11.8
15.9
36.7
20.5
135.3
131.5
42.0
32.5
19.7
19.6
17.3
100.9
73.5
76.7
70.1
76.7
61.1
61.1

Ergosterol 3-O-β-D(**)
glucopyranoside
δ H , J (Hz)
δC
38.0
30.6
4.06 (m)
76.8

38.0
140.2
6.64 (m)
120.1
6.46 (m)
117.0
141.0
46.4
37.5
21.3
39.3
43.0
54.8
23.4
28.7
55.8
0.66 (s)
12.2
0.95 (s)
16.4
40.8
1.09 (d, 6.8)
21.4
5.24
136.1
(dd, 15.6, 7.6)
5.30
132.5
(dd, 15.6, 7.6)
43.1

33.4
0.88 (d, 6.8)
19.9
0.89 (d, 6.8)
20.1
0.99 (d, 6.8)
17.9
5.05 (d, 7.3)
102.6
4.06 (m)
75.3
4.29 (m)
78.5
4.29 (m)
71.7
3.99 (m)
78.2
5.30 (m)
62.9
4.58 (m)
62.9

TT1

(***)

(***)

Ergosterol

δ H , J (Hz)

δ H , J (Hz)

3.64 (m)

3.63 (m)

5.57 (m)
5.38 (m)

5.57 (m)
5.39 (m)

0.63 (s)
0.95 (s)

0.82 (s)
0.84 (s)
2.26 (m)
1.04 (d)

1.03 (d, 6.5)
5.17
(dd , 15.0, 7.5)
5.23
(dd, 15.5, 7.5)

0.83 (d, 7.5)
0.84 (d, 7.0)

0.92 (d, 6.5)

5.17 (dd)
5.21 (dd)

0.91 (d)
0.94 (d)
0.86 (d)

(*)

ghi trong DMSO; (**)ghi trong C5D5N5 (***)ghi trong CDCl3

14


Khóa Luận Tốt Nghiệp

Lê Tấn Lộc

CHƯƠNG 4 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

4.1 KẾT LUẬN
Từ loài nấm Cordyceps neovolkiana, tiến hành điều chế thu được cao ethanol thô.
Cao ethanol thô được hòa tan nhiều lần trong methanol, tách riêng phần kết tủa và dịch
methanol thô. Sau đó tiến hành các phương pháp sắc ký cột và sắc ký bảng mỏng trên cao
methanol thô thu được 2 hợp chất T3 và TT1 được xác định lần lượt là ergosterol 3-O-βD-glucopyranoside

và ergosterol.
H

CH3

H3C

H

CH3

H

CH3

H3C

CH3

CH3

H

CH3

OH

H
H

O
O

HO
HO

H
H

H
HO

HO

H
H

H

H

T3

TT1

Hình 4.1: Cấu trúc của hợp chất T3 và hợp chất TT1
4.2 KIẾN NGHỊ
Vì điều kiện về thời gian và vật chất không cho phép, nên trong phạm vi của đề tài
này, chúng tôi chỉ khảo sát trên phân đoạn cao A1, A3. Trong thời gian sắp tới, nếu có
điều kiện chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát trên các phân đoạn cao còn lại. Đồng thời chúng
tôi sẽ tiến hành thử nghiệm một số hoạt tính sinh học ở các loại cao và hợp chất đã cô lập
được.

15


Khóa Luận Tốt Nghiệp

Lê Tấn Lộc
TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]

Ahmad V. U., Basha A., “Spectroscopic data of steroid glycosides: Cholestanes,

ergostanes, withanolides, stigmastane", Springer, New York, USA, pp. 359–522, 2006.
[2]

Boros C., Hamilton S. M., Katz B., Kulanthaivel P., “Comparison of balanol from

Verticillium balanoides and ophiocordin from Cordyceps ophioglossoides”, J. Antibiot.
(Tokyo), 47, 1010–1016, 1994.
[3]

Chatterjee R., Srinivasan K. S., Maiti P. C., “Cordyceps sinesis (Berkeley)

Saccardo: structure of cordycepic acid”, J. Am. Pharm. Assoc. Am. Pharm. Assoc.
(Baltimore), 46, 114–118, 1957.
[4]

Cheung JK1, Li J., Cheung AW., Zhu Y., Zheng KY., Bi CW., Duan R., Choi

RC., Lau DT., Dong TT., Lau BW., Tsim KW., “Cordysinocan, a polysaccharide isolated
from cultured Cordyceps, activates immune responses in cultured T-lymphocytes and
macrophages: signaling cascade and induction of cytokines”, J Ethnopharmacol., 124(1),
61-8, 2009.
[5]

Chun K. Lob, Jerry K. H. Cheungb, Shang Q. Zhub, Karl W. K. Tsimb, “A

polysaccharide isolated from Cordyceps sinensis, a traditional Chinese medicine, protects
PC12 cells against hydrogen peroxide-induced injury, Life Sciences 73, 2503–2513”,
2003.
[6]

Cunningham K. G., Manson W., Spring F. S., Hutchinson S. A., “Cordycepin, a

metabolic product isolated from cultures of Cordyceps militaris (Linn.) Link”, Nature,
166, 949, 1950.
[7]

Huneck S., Yoshimura I., “Intendification of lichen substance”, Springer, Berlin,

391, 1997.
[8]

Isaka M., Kongsaeree P., Thebtaranonth Y., “Bioxanthracenes from the insect

pathogenic fungus Cordyceps pseudomilitaris BCC 1620. II. Structure elucidation.” , J.
Antibiot. (Tokyo), 54, 36–43, 2001.

16