Khảo sát thành phần hóa học của loài nấm cordyceps neovolkiana

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA HÓA HỌC
BỘ MÔN HÓA HỌC HỮU CƠ


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA
LOÀI NẤM CORDYCEPS NEOVOLKIANA

GVHD: ThS. Dương Thúc Huy
SVTH: Nguyễn Khánh Toàn
MSSV: K38.106.133

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2016


LỜI CẢM ƠN

Trên con đường đi đến bến bờ của sự thành công không thể thiếu những
người lái đò tận tụy. Thành công của em ngày hôm nay là cả một quá trình phấn đấu
rèn luyện với sự hỗ trợ của những con người hết sức quan trọng.
Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Dương Thúc Huy –
người lái đò đầy tâm huyết và nhiệt tình nhất, tấm gương nghiên cứu khoa học.
Thầy không những chỉ dạy cho em kiến thức chuyên môn cùng với những kinh
nghiệm nghiên cứu quý báu mà còn giúp đánh thức niềm say mê nghiên cứu khoa
học của em trong suốt thời gian được thầy hướng dẫn.
Tất cả quý Thầy Cô khoa Hóa, trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí
Minh đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt thời gian em theo
học và hoàn thành khóa luận.
Các anh chị học viên cao học và các bạn sinh viên bộ môn Hóa Hữu cơ, khoa

Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã động viên, giúp đỡ trong suốt quá
trình thực hiện đề tài.
Các bạn sinh viên khóa 38, 39 chuyên ngành hóa hữu cơ, cùng các bạn sinh
viên khoa Hóa trường Đại Học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình cộng
tác, giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu.
Và cuối cùng con xin cảm ơn gia đình đã luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất về
vật chất lẫn tinh thần để con có thể hoàn thành tốt khóa luận của mình.


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU
DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC PHỔ
LỜI MỞ ĐẦU
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .................................................................................... 1
1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHI CORDYCEPS ................................................ 1
1.1.1 Định nghĩa và phân loại chi Cordyceps .................................................... 1
1.1.2 Hoạt tính các hợp chất có trong chi Cordyceps ........................................ 1
1.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CỦA CÁC LOÀI NẤM THUỘC CHI
CORDYCEPS .......................................................................................................... 2
CHƯƠNG 2: NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM ............................................ 7
2.1 HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ .................................................................................... 7
2.1.1. Hoá chất .................................................................................................... 7
2.1.2. Thiết bị ...................................................................................................... 7
2.2 NGUYÊN LIỆU ................................................................................................ 7
2.3 QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM ........................................................................ 8
2.3.2 Sắc kí cột trên phân đoạn cao A3.4........................................................... 9
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 11

3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT TT4 ................................................... 11
3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT T2 ..................................................... 14
4.1 KẾT LUẬN ..................................................................................................... 16
4.2 ĐỀ XUẤT........................................................................................................ 16
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 17
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13

C-NMR

: Carbon Nuclear Magnetic Resonance

1

H-NMR

: Proton Nuclear Magnetic Resonance

d
dd

: Mũi đôi (Doublet)
Mũi đôi đôi (Doublet of doublet)

DMSO

: Dimethyl sulfoxide

EA

: Ethyl acetate

H

: Hexane

HMBC

: Heteronuclear Multiple Bond Coherence

HSQC

: Heteronuclear Single Quantum Correlation

J

: Hằng số tương tác spin-spin

m

: Mũi đa (Multiplet)

Me

: Methanol

NMR

: Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)

ppm

: Part per million

s

: Mũi đơn (Singlet)

t

: Mũi ba (Triplet)

UV

: Tia cực tím (ultra violet)


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU

 DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Polysaccharide được xác định bởi Yu và cộng sự, 2009 ............................ 3
Hình 1.2 Các hợp chất cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps................................ 4
Hình 1.3 Các hợp chất cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps (tiếp) ...................... 5
Hình 1.4 Các hợp chất cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps (tiếp) ...................... 6
Hình 3.1. Khung sườn sterol .................................................................................... 11
Hình 3.2 Tương quan HMBC trên nhân B của hợp chất TT4 (trái) và cấu trúc

ergosterol (phải)........................................................................................................ 12
Hình 3.3 Cấu trúc của hợp chất T2 .......................................................................... 15
Hình 4.1 Hai hợp chất cô lập được từ cao ethanol của mẫu nấm Cordyceps
neovolkiana............................................................................................................... 16
 DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1 Quy trình cô lập hợp chất TT4 và T2
 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1 Phân đoạn trên cao methanol thô
Bảng 3.1 Dữ liệu phổ của TT4 và cerevisterol
Bảng 3.2 Dữ liệu phổ của T2 và ergosterol peroxide


DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC PHỔ

Phụ lục 1. Phổ 1H-NMR của TT4 (a)
Phụ lục 2. Phổ 1H-NMR của TT4 (b)
Phụ lục 3. Phổ 13C-NMR của TT4
Phụ lục 4. Phổ HSQCcủa TT4
Phụ lục 5. Phổ HSQC giãn rộng của TT4
Phụ lục 6. Phổ HMBC của TT4
Phụ lục 7. Phổ HMBC giãn rộng của TT4
Phụ lục 8. Phổ COSY của TT4
Phụ lục 9. Phổ 1H-NMR của T2
Phụ lục 10. Phổ 1H-NMR giãn rộng của T2
Phụ lục 11. Phổ 13C-NMR của T2


LỜI MỞ ĐẦU

Từ lâu trong y học cổ truyền Trung Hoa và Tây Tạng người ta đã biết sử

dụng một số loài nấm thuộc chi Cordyceps để chữa bệnh. Được biết đến nhiều nhất
và có vai trò như một loại thần dược quý hiếm trong chi là loài Cordyceps sinensis
(còn gọi là đông trùng hạ thảo).
Chi Cordyceps với hơn 400 thuộc loài chi này có sự phân bố rộng khắp thế
giới và phần lớn sinh sống ở châu Á (Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên, Thái Lan
và Việt Nam).
Những nghiên cứu gần đây cho biết các polysaccharide hiện diện trong C.
sinensis thể hiện đa dạng các hoạt tính sinh học như kháng oxi hóa, ức chế miễn
dịch và chống xơ vữa động mạch, các nucleoside mang đa tác dụng trên
macrophage và cordycepin có hoạt tính ức chế sự phát triển khối u và điều hòa miễn
dịch. Vì thế, loài nấm này thu hút rất nhiều nhà nghiên cứu những năm gần đây dựa
trên giá trị dinh dưỡng và dược học của nó. Tuy nhiên, nguồn cung cấp tự nhiên của
các loài nấm này giảm dần bởi vì môi trường sống khắc nghiệt và sự khai thác quá
mức nguồn nguyên liệu. Gần đây, một vài loài nấm thuộc chi Cordyceps được chiết
tách và nuôi cấy trong phòng thí nghiệm. Một nguyên cứu gần đây chứng tỏ có sự
khác nhau về thành phần và hàm lượng các hợp chất hóa học giữa nấm tự nhiên và
nấm nuôi cấy. Nấm nuôi cấy chứa hàm lượng của polysaccharide, adenine và
adenosine cao hơn so với các loài nấm tự nhiên [27].
Xuất phát từ những ứng dụng Y học quý giá và kế thừa những kết quả
nghiên cứu trong và ngoài nước trên chi Cordyceps, chúng tôi tiến hành nghiên cứu
trên loài nấm Cordyceps neovolkiana.


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Khánh Toàn
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHI CORDYCEPS
1.1.1 Định nghĩa và phân loại chi Cordyceps

Các loài nấm thuộc chi Cordyceps gồm có C. sinensis, C. militaris, C.
pruinosa và C. ophioglossoides là nguồn nguyên liệu quý trong dược học. Thành
phần dược liệu là loài nấm khô thuộc chi Cordyceps phát triển trên ấu trùng. Trong
đó, phổ biến nhất là loài nấm Cordyceps sinensis, được gọi với tên Đông Trùng Hạ
Thảo (Tiếng Trung Quốc, Dong-Chong-Xia-Cao hay Tochukaso, tiếng Nhật). Tên
gọi trên bắt nguồn từ sự thay đổi theo mùa của nó. Vào mùa đông, ấu trùng nhiễm
nấm sẽ chuyển thành sâu sống trong đất được gọi là Đông Trùng. Khi sang hè,
stroma phát triển trên đầu của ấu trùng có hình dáng giống cỏ nên được gọi là Hạ
Thảo. Ở Trung Quốc, đây là vị thuốc có nguồn gốc hàng ngàn năm [24].
1.1.2 Hoạt tính các hợp chất có trong chi Cordyceps
Thành phần hóa học của chi Cordyceps được tìm thấy gồm có cordycepin
(30-deoxyadenosin) và dẫn xuất, ergosterol, polysaccharide, glycoprotein và peptide
có chứa thành phần aminoisobutyric acid. Các hợp chất này có các hoạt tính sinh
học như kháng ung thư, kháng đột biến (anti-metastatic), ức chế miễn dịch
(immunomodulatory), kháng oxy hóa, kháng viêm, diệt sâu bọ (insecticidal), kháng
khuẩn, hạ lipit trong máu, hạ đường huyết, chống lão hóa, bảo vệ hệ thần kinh và
thận. Những nghiên cứu gần đây cho biết các polysaccharide hiện diện trong C.
sinensis thể hiện đa dạng các hoạt tính sinh học như : chống oxy hóa, ức chế miễn
dịch, chống xơ vữa động mạch, các nucleoside mang đa tác dụng trên macrophage
và cordycepin có hoạt tính ức chế sự phát triển khối u và điều hòa miễn dịch. Vì thế,
loài nấm này thu hút rất nhiều nhà nghiên cứu những năm gần đây dựa trên giá trị
dinh dưỡng và dược học của nó. Tuy nhiên, nguồn cung cấp tự nhiên của các loài
nấm này giảm dần bởi vì môi trường sống khắc nghiệt và sự khai thác quá mức
nguồn nguyên liệu. Gần đây, một vài loài nấm thuộc chi Cordyceps được chiết tách
và nuôi cấy trong phòng thí nghiệm [27].

1


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Khánh Toàn

1.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CỦA CÁC LOÀI NẤM THUỘC CHI
CORDYCEPS
Các

hợp

chất

như

Cordycepin

(3’-deoxyadenosine),

3’-amino-3’-

deoxyadenosine, homocitrullyl aminoadenosine, adenine, cordycepic acid và

D-

mannitol đã được cô lập từ các loài nấm thuộc chi Cordyceps từ những năm 1950
(Cunningham và cộng sự, 1950 [6]; Chatterjee và cộng sự, 1957 [3]; Kredich và
Guarino, 1961 [18]; Kaczka và cộng sự 1964 [10], Liu và cộng sự 1989 [22]).
Một nguyên cứu gần đây chứng tỏ có sự khác nhau về thành phần và hàm
lượng các hợp chất hóa học giữa nấm tự nhiên và nấm nuôi cấy. Nấm nuôi cấy chứa
hàm lượng của polysaccharide, adenine và adenosine cao hơn so với các loài nấm tự
nhiên. Li và cộng sự [19,20] cũng tìm thấy nấm C. sinensis nuôi cấy có hàm lượng

nucleoside cao hơn loài tự nhiên.
Ergosterol hiện diện trong C. sinensis được xác định bởi sắc kí lớp mỏng
điều chế (Li và Li 1991; Li và cộng sự 2004) [21]. Boros và cộng sự (1994) [16]
công bố ophiocordin (54), một hợp chất kháng nấm và kháng khuẩn được cô lập từ
C. ophioglossoides (Kneifel và cộng sự 1977 [2]) có cấu trúc của balanol từ
Verticillium balanoides.
Bioxanthracenes (55-67) được cô lập từ C. pseudomilitaris (Isaka và cộng sự
2001 [8]). Ngoài ra các hợp chất cordypyridones A-D (68-71) cũng được cô lập từ
loài nấm trên bởi cùng nhóm tác giả (Isaka và cộng sự 2001 [9]).
Các hợp chất chứa vòng 10 carbon cepharosporolides C, E và F (71-73),
cùng với cordycepin, pyridine-2,6-dicarboxylic acid và 2-carboxymethyl-4-(30hydroxybutyl)furan (73-74) được cô lập từ C. militaris bởi Rukachaisirikul và cộng
sự (2004) [26]. Krasnoff và cộng sự (2005) [17] công bố cicadapeptins I và II (các
peptide chứa thành phần aminoisobutyric acid) và myriocin (kháng nấm) (51-53) từ
C. heteropoda.
Một glycoprotein với thành phần N-acetylgalactosamine [Gal-β(1→3)-GalN-Acol

galactosyl-β(1→3)-N-acetyl-galactosaminitol]

được

cô

lập

từ

C.

ophioglossoides (Kawaguchi và cộng sự 1986) [10]. Các polysaccharide cũng được
cô lập bởi nhiều nhóm tác giả. Bốn exopolysaccharides có khối lượng phân tử từ 50

kDa đến 2260 kDa được cô lập từ C. militaris bởi Kim và cộng sự (2003b, c) [132


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Khánh Toàn

15]. Yu và cộng sự (2004a, b) cũng công bố bốn polysaccharides từ C. militaris.
[31-32]. Ngoài ra còn nhiều công bố khác nghiên cứu về polysaccharide từ nấm
Cordyceps như Chun và cộng sự, 2003 [5]; Methacanon và cộng sự, 2005 [23]; Wu,
Sun, và Pan, 2006 [28]; Xiao và cộng sự, 2006 [29]; Yu và cộng sự, 2007 [33];
Cheung và cộng sự, 2009 [4]. Các nghiên cứu chỉ dừng ở xác định thành phần các
monosaccharide và khối lượng phân tử cũng như hoạt tính sinh học. Một nghiên
cứu gần đây được thực hiện bởi Yu và cộng sự, 2009 [25] sử dụng nhiều phương
pháp xác định cấu trúc của polysaccharide từ Cordyceps militaris.

-(1→3)-

→
→
[ 4-α-D-Man-(1→4)-α-D-Man-(1→4)-α-D-Man-(1 ]n

→
β-D-Gal-(1→
[ 6)-β-D-Gal-(1 ]3 4)-α-D-Glc
Hình 1.1 Polysaccharide được xác định bởi Yu và cộng sự, 2009.
Gần đây, Yang và cộng sự [30] đã cô lập cordysinins A-E (1-5) cùng với 46
hợp chất đã biết khác từ nấm Cordyceps sinensis nuôi cấy: ergosterol (6), (17R)-17methylincisterol (7), ergosterol peroxide (8), ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one (9),
fungisterol (10), hỗn hợp của β-sitosterol (11) và stigmasterol (12), hỗn hợp của βsitosterol 3-O-acetate (13) và stigmasterol 3-O-acetate (14), 4,4-dimethyl-5αergosta-8,24(28)-dien-3β-ol (15), 3-O-ferulylcycloartenol (16), daidzein (17), phydroxybenzoic acid (18), vanillic acid (19), orobol (20), uracil (21), genistein (22),
D-mannitol

(23), p-methoxybenzoic acid (24), 3-hydroxy-2-methyl-4-pyrone (25),

acetovanillone (26), p-hydroxyphenylacetic acid (27), cyclo(L-Pro-L-Val) (28),
syringic

acid

(29),

cyclo(L-Phe-L-Pro)

(30),

cyclo(L-Pro-L-Tyr)

(31),

2-

furancarboxylic acid (32), p-methoxyphenol (33), glycitein (34), salicylic acid (35),
methyl p-hydroxyphenylacetate (36), thymine (37), nicotinic acid (38), ergosteryl-3O-β-D-glucopyranoside (39), flazin (40), 3′,4′,7-trihydroxyisoflavone (41), succinic
acid (42), perlolyrine (43), 1-methylpyrimidine-2,4-dione (44), protocatechuic acid
(45), 3,4-dihydroxyacetophenone (46), 4-hydroxyacetophenone (47), 2-deoxy-Dribono-1,4-lactone (48), 1-acetyl-β-carboline (49), và adenosine (50).
3


Khóa luận tốt nghiệp
H

Nguyễn Khánh Toàn
H2N

O
N

NH
O
HO

H
H

O
Cordysinin A (1)

N

N

HO

N

N

N

N

N

N
H

H
H

HO

HO

H

CH3

H

H

OH

CH3
OH

OH

Cordysinin D (4)

Cordysinin C (3)

OCH3
Cordysinin B (2)

N
H

N
H

Cordysinin E (5)

H

O
H

H

O

O

H

O

H

H

HO

HO

Ergosterol peroxide (8)

O 17R -17Meth
yl incisterol (7)
(
)

Ergosterol (6)

H

Fungisterol (10)

H

H
O

O

H

H

H

H

H

Stigmasterol (12)
CH2

HO

ß -Sitosterol (11)

HO

H

H

H

H

H

Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one (9)

H

H

H
HO

O

HO

O

O

Stigmasterol 3-O-acetate (14)

ß -Sitosterol 3-O-acetate (13)

4,4-Dimethyl-5a-ergosta-8,24(28)-dien-3ß -ol (15)

H
O

HO

O

O

O

OH
O

O

H

HO

O

O

OH
3-O-Ferulylcycloartenol (16)
O

O

HO

p -Hydroxybenzoic acid (18)

Daidzein (17)

O

H
N

O

OH

HO

O

O

OH
HN

HO

OH
Vanillic acid (19)

O

OH

Uracil (21)

Orobol (20)

OH

O

OH

HO
OH

D-Mannitol(23)

OH

OH

OH
OH

O
Genistein (22)

O
OH

OH

O
p -Methoxybenzoic acid (24)

O
3-Hydroxy-2-methyl-4-pyrone (25)

Hình 2.2 Các hợp chất cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps
4

Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Khánh Toàn

O
CH3

O

O

O

O

OH
H3C

HO

O

O

p -Hydroxyphenylacetic acid (27)

Acetovanillone (26)

O

H
O
Cyclo-(L-Pro-L-Val) (28)

OH

HN

HO

HN

HO

N

N

O
Cyclo(L-Phe-L-Pro) (30)

Syringic acid (29)

O
HO

N

O

OH

O

O

HO

N
H

O

O
2Furancarboxylic acid (32)

Cyclo(L-Pro-L-Tyr) (31)
HO

OH

H3CO

OH
O
p -Methoxyphenol (33)

OH
HO

Salicylic acid (35)

Glycitein (34)

O

HN

O

H
N
H

O

O
Methyl p-hydroxyphenylacetate (36)

OH

O
HO

Thymine (37)

OH
H

HO

O

OH
O

HO

O

H
N

H
OH

O
O

Ergosterol 3-O-ß -D-glucoside (38)

O

H
N

O
OH

N

O

N
Nicotinic acid (40)

O

OH
3',4',7-Trihydroxyisoflavone (41)

O
HO

1-Methylpyrimidine-2,4-dione
(44)

H
N

N
H

HO

O

O

O

N

O
O

H
N

N
H
Aib-1

O

Aib-2

Hyp-1

H
N

N
O

O

N

N

CO2H OH
O

HO
NH2

OH
HN

HO
Adenosine (50)
O
H
N
CH3

Cicadapeptin I (51) and cicadapeptin II (52)
N
HOH2C

NH2 OH

OH

O

N

N

R2

O

OH

NH2

51: R1 = CH3, R2 = H
52: R1 = H, R2 = CH3

HO

2-Deoxy-D-ribono1,4-lactone (48)

OH

N
H

OH

O

Leu/Ile R
1

Gln

Hyp-2

O

OH

NH2

Val

Perlolyrine (43)
CH3
4-Hydroxyacetophenone (47)
OH

O

OH

Protocatechuic acid (45)

O

Succinic acid (42)

3,4Dihydroxyacet
ophenone (46)

HO
OH

N
H

O

CH3

O

O
N
O

N

HO
OH

OH
Flazin (39)

OH

O
NH
O

HO
Ophiocordi (54)

1-Acetyl-ß -carboline (49)

HOOC
OH

53: Myriocin

O

Hình 1.3 Các hợp chất cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps (tiếp)
5


Khóa luận tốt nghiệp

H3CO
8

8a

7
6

H3CO

OH
9 9a

10a 10 4a
5

Nguyễn Khánh Toàn

H3CO

H3CO

OH

3

R1

4 3

H3CO

CH3
11

5

5'

10'
4' 3'
1' O

5

CH3

10
OH

5'

H3CO

CH3

H3CO

CH3

OH
R2

R2
H3CO

1 O
4 3

1 O

1 O
4

OH

H3CO

CH3

4'

OH

10'

5'

3'
1' O

3'
1' O
OCH3 OH

OCH3 OH

OCH3 OH

63

61 : R2 = OH
62 : R2 = H

55 : R1 = OH, R2 = OH

56 : R1 = OAc, R2 = OH
57 : R1 = OAc, R2 = OAc
58 : R1 = OH, R2 = H
59 : R1 = OAc, R2 = H4
60 : R1 = H, R2 = H

H3CO

CH3

4'

H3CO

OH

OH
O
O
H3CO

H3CO

CH3
R1

66 : R1 = OH
67 : R1 = H

OH

H3CO

CH3
R1

CH3
O
OCH3 OH
64 : R1 = OH
65 : R1 = H

OH
17 O
2

H
11

12
10

7
8

9
15

N
1

6

4

H

X

5

OH
13

OH

9

7
8

2

O

N
1

H
N

H

H

4
O
13

69
N

H

OCH3
O

2
13 O

O

H

73

13 O

N

O

O

N

H

H

13 14

OH

OH
O

N

H
OR1

N
1 OCH3

14
72

OCH3

N

6

4
3

OH

14
70 : X = OH
71 : X = H

OCH3

5

O

15

14

68
O

O

N

O
H

3

OCH3

OH

8

13 O

OH

H
14 R2

R1 =

H
74 :
75 : R1 = CH3

80

R2

= HgX
76 :

77 : R2 = OH
78 : R2 = p -bromobezoyloxy

14

OH

81

79

Hình 1.4 Các hợp chất cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps (tiếp)

6


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Khánh Toàn

CHƯƠNG 2: NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

2.1 HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ
2.1.1. Hoá chất
 Silica gel 0,04-0,06 mm, Himedia dùng cho cột sắc kí.
 Sắc kí bảng mỏng loại Kieselgel 60F

254

(20×20), Merck.

 Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: hexane, ethyl acetate,
acetic acid, chloroform, acetone, methanol, ethanol, butanol và nước cất.
 Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bảng mỏng: sử dụng
vanillin/H 2 SO 4 .
2.1.2. Thiết bị
 Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu.
 Các cột sắc kí.
 Máy cô quay chân không.
 Bếp cách thuỷ.
 Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm.
 Cân điện tử.
 Các thiết bị ghi phổ 1H-NMR (500 MHz),

13

C-NMR (125 MHz) và

2D-NMR tại phòng Phân tích Trung tâm trường Đại học Khoa học Tự nhiên
thành phố Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí
Minh.
2.2 NGUYÊN LIỆU
Mẫu nấm Cordyceps neovolkiana được cung cấp từ TS. Đinh Minh Hiệp
(Ban quản lý khu nông nghiệp công nghệ cao) vào tháng 7 năm 2015 với khối
lượng 3.5 kg.

7


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Khánh Toàn

2.3 QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM
Sinh khối nấm tươi (3.5 kg) được làm sạch, để khô, nghiền nhỏ thu được bột
khô (700.0 g). Sau đó, bột khô được ngâm dầm trong ethanol ở nhiệt độ phòng. Lấy
dịch cô quay thu hồi dung môi ở áp suất thấp thu được cao ethanol thô (với khối
lượng 200.0 g).
Cao ethanol thô sẽ được hòa tan nhiều lần trong methanol, tiếp tục cô quay
thu hồi dung môi. Trong quá trình cô quay thu hồi dung môi, thấy xuất hiện kết tủa,
lọc riêng phần kết tủa (70.0 g). Phần dịch methanol thô còn lại 130.0 g. Sau đó tiến
hành sắc ký cột cao methanol thô với hệ dung môi với độ phân cực tăng dần thu
được các phân đoạn tương ứng như Bảng 2.1. Tiến hành sắc kí cột trên 2 phân đoạn
cao A1 và A3 thu được 2 chất là T2 và TT4.
Bảng 2.1 Phân đoạn trên cao methanol thô
Hệ dung môi

Cao

H:EA 9:1
H:EA 8:2
H:EA 7:3
H:EA 5:5
H:EA 7:3
H:EA 9:1
EA:Me 5:5
Me 100%

A1 (1.56 g)
A2 (5.0 g)

A3 (3.1 g)
A4 (10.0 g)
A5 (3.0 g)
A6 (10.0 g)
A7 (30.0 g)
M (56.0 g)

2.3.1 Sắc kí cột trên phân đoạn cao A1
Từ phân đoạn cao A1 (1.56 g) tách riêng phần dầu DA1 (660.0 mg) và phần
tủa TA1 (0.9 g), sau đó tủa TA1 được rửa bằng acetone. Tiếp tục lấy dịch rửa
(200.0 mg) thực hiện sắc ký cột với hệ dung môi H:EA:AcOH (4:1:0.2) thu được
hợp chất T2 có khối lượng 6.0 mg có dạng bột màu trắng.

8


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Khánh Toàn

2.3.2 Sắc kí cột trên phân đoạn cao A3.4
Cao A3 (3.1 g) được tiến hành sắc kí cột với hệ dung môi H:EA:AcOH
(4:1.0:0.2) thu được 6 phân đoạn kí hiệu từ A3.1 đến A3.6.
Phân đoạn A3.4 (360.0 mg) tiếp tục được sắc kí cột với hệ dung môi C:Me
(5:0.1) thu được hợp chất TT4 có khối lượng 15.0 mg có dạng bột màu trắng.

9


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Khánh Toàn
Sinh Khối Nấm
3.5 kg
- Ngâm dầm trong Ethanol
- Cô quay thu hồi dung môi
Cao Ethanol Thô
200.0 g
Hòa tan trong Methanol nóng
Cao Methanol
130.0 g

Tủa
70.0 g

- SKC (sắc ký cột)
H:EA
[9:1 – 0:10]

A1
1.56 g

A2
5.0 g

A3
3.1 g

A4
10.0 g

EA:Me
[5:5]

A5
3.0 g

Me
100%

A7
30.0 g

A6
10.0 g

M
56.0 g

SKC H:EA:AcOH
4:1:0,2

Dầu (DA1)
660.0 mg

Tủa TA1
900.0 mg

A3.1
150.0 mg

A3.2
70.0 mg

Rửa bằng Ac
nhiều lần

Dịch 660.0 mg

SKC H:EA:AcOH
4:1:0,2

A3.3
256.0 mg

A3.4
360.0 mg

A3.5
210.0 mg

A3.6
300.0 mg

C:Me
5:0,1

T2
(6.0 mg)

TT4
(15.0 mg)

Sơ đồ 2.1 Quy trình cô lập hợp chất TT4 và T2

10


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Khánh Toàn

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT TT4
 Hợp chất TT4 thu được từ phân đoạn A3.
 Dạng bột màu trắng, không UV.
 Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) và

13

C-NMR (125 MHz,

DMSO-d 6 ) được trình bày trong Bảng 3.1 (Phụ lục 1,2,3).
 Phổ HSQC, HMBC trong dung môi DMSO-d 6 (phụ lục 4, 5, 6, 7, 8).
 Biện luận cấu trúc hợp chất TT4 (1)
Phổ 1H-NMR cho thấy 6 tín hiệu của các nhóm methyl tại: δ H 0.54 (s, H 3 18), δ H 0.90 (s, H 3 -19), δ H 0.80 (d, H 3 -26), δ H 0.79 (d, H 3 -27), δ H 0.88 (d, H 3 -28),
δ H 1.00 (d, H 3 -21). Trong đó có một nhóm methyl chuyển dịch về vùng từ trường
rất cao tại δ H 0.54 (s, H 3 -18) đặc trưng cho khung sườn sterol.
28

22

21

26

18
12
19 11
1
2

HO

10
5

4

B
6

8

23

25

H
13

14

9

A

3

HC

24

20

H

27

17

D

16

15

7

Hình 3.1 Khung sườn sterol
Trên phổ 1H-NMR xuất hiện 2 tín hiệu ở vùng từ trường thấp của 2 proton

olefin tại δ H 5.24 (dd, J 1 = 15.5 Hz, J 2 = 7.0 Hz) và δ H = 5.20 (J 1 =15.5 Hz, J 2 =
8.0 Hz), phân tích sự chẻ mũi của 2 proton này cho thấy sự tồn tại của 2 proton
olefin ghép trans với nhau ở lân cận với 2 nhóm methine khác, qua đó xác định sự
tồn tại của nối đôi tại C-22, C-23 của khung sườn sterol. Phổ 1H-NMR còn cho thấy
sự hiện diện của nhóm oxymethine H-3 tại δ H 3.77 mũi multiplet đặc trưng cho H-3
khung sterol.

11


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Khánh Toàn

Phổ 13C-NMR kết hợp phổ HSQC giúp xác định 28 carbon của khung sườn
ergosterol. So sánh tất cả các tín hiệu carbon của hợp chất TT4 với ergosterol [6,
34] cho thấy có sự tương đồng của tất cả các tín hiệu, ngoại trừ tín hiệu carbon của
nhân B, chứng tỏ sự thay đổi nhóm thế của TT4 so với ergosterol chỉ xảy ra trên
vòng B của hợp chất này. Phổ 13C-NMR còn cho thấy ngoài sự xuất hiện của liên
kết đôi tại C-22 và C-23, hợp chất TT4 còn mang một liên kết đôi khác tại C-7 (δ C
119.5) và C-8 (δ C 139.7) trên nhân B.
Trên nhân B, phổ HMBC cho thấy proton 5-OH (δ H 3.63) có sự tương quan
với carbon C-5 (δ C 74.5), C-6 (δ C 72.2) và C-10 (δ C 36.7), proton H 3 -19 (δ H 0.9, δ C
19.8) có sự tương quan với các carbon C-5 (δ C 74.5) và C-10 (δ C 36.7). Ngoài ra
proton 6-OH (δ H 4.50), 5-OH (δ H 3.63) cho tương quan HMBC với C-5, giúp xác
định các vị trí C-5 và C-6 liên kết với oxygen. Bên cạnh đó, tương quan HMBC của
H-7 (δ H 5.10) tới C-5 và C-6 giúp củng cố vị trí của liên kết đôi tại C-7. Từ những
dữ kiện phổ phân tích trên và so sánh với dữ liệu phổ của cerevisterol [1] hợp chất
TT4 được xác định là cerevisterol. Đây là lần đầu tiên cerevisterol được tìm thấy
trong chi Cordyceps.

28

12
1
2
A
HO

3

4

5

20
H

11 13 17D
16
9 C 14

19
10

18

B

8

6

7

H

28

22

21

26
23

24

26

18
19 11

15

1
2

10
5

B

8

25

23

H
13
14

9

A

3

HC

24

20

12

27

HO

OH

22

21

25

H

27

17

D

16

15

7

4
6

OH

Hình 3.2 Tương quan HMBC trên nhân B của hợp chất TT4 (trái) và cấu trúc
ergosterol (phải)

12


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Khánh Toàn

Bảng 3.1 Dữ liệu phổ của TT4 và cerevisterol
Vị
trí

TT4 (1)

Cerevisterol (2)

δC
δ H (ppm)
(ppm)
1
33.4
2
31.2
3
3.77 (m)
66.0
3.87 (m)
4
36.7
5
74.5

6
3.34 (m)
72.2
3.62 (m)
7 5.25 (dd, 15.5, 7.0) 119.5
5.14 (m)
8
139.7
9
54.2
10
36.5
11
22.6
12
40.2
13
43.0
14
51.4
15
21.4
16
27.8
17
55.4
18
0.54 (s)
12.1
0.45 (s)

19
0.91 (s)
19.5
0.90 (s)
20
42.0
21
1.00 (d, 6.5)
21.0
0.87 (d, 6.5)
22 5.20 (dd, 15.5, 8.0) 131.5
5.10 (m)
23 5.24 (dd, 15.5, 7.0) 135.4
5.20 (m)
24
42.3
25
32.5
26
0.8 (d, 6.5)
17.8
0.69 (d, 6.3)
27
0.79 (d, 6.5)
19.8
0.65 (d, 6.9)
28
0.89 (d, 7.0)
17.3
0.77 (d, 6.6)

(1)
(2)
ghi trong DMSO; ghi trong CDCl 3
δ H (ppm)

δC
(ppm)
32.5
30.2
67.0
39.1
75.7
72.9
117.3
143.1
42.9
36.8
22.4
38.7
44.0
54.5
22.7
27.7
55.8
11.9
18.0
40.2
19.3
131.8
135.3

42.6
32.8
19.6
20.8
17.2

13


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Khánh Toàn

3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT T2
 Hợp chất T2 thu được từ phân đoạn A1.
 Dạng bột màu trắng, không UV.
 Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl 3 ) và

13

C-NMR (125 MHz,

CDCl 3 ) được trình bày trong bảng 3.1 (Phụ lục 9, 10, 11).
 Biện luận cấu trúc hợp chất T2 (2)
Phổ 1H-NMR hợp chất T2 cũng cho thấy sự xuất hiện của 6 nhóm tín hiệu –
CH 3 đặc trưng của khung sườn sterol tại δ H 0.84 (s, H 3 -18), δ H 0.88 (s, H 3 -19), δ H
0.82 (d, H 3 -26), δ H 0.80 (d, H 3 -27), δ H 0.91 (d, H 3 -28), δ H 0.99 (d, H 3 -21). Ngoài ra
phổ 1H-NMR cũng cho thấy sự hiện diện của nối đôi tại C-22 và C-23 của khung
sườn ergosterol tại δ H 5.20 (J 1 = 15.5, J 2 = 7.5) và δ H 5.15 (J 1 = 15.5, J 2 = 8.0), và
tín hiệu H-3 đặc trưng của khung sterol tại δ H 3.97.

Phổ

13

C-NMR cho thấy sự tồn tại của 28 carbon của khung ergosterol. So

sánh dữ liệu phổ của hợp chất T2 với ergosterol và hợp chất TT4 cho thấy có sự
tương đồng giữa các tín hiệu ở nhân A, C, D và dây hydrocarbon, chứng tỏ sự thay
đổi nhóm thế chỉ xảy ra trên nhân B của hợp chất này.
Tiếp tục phân tích phổ 1H-NMR, 2 tín hiệu proton alkene H-6 (δ H 6.50) và
H-7 (δ H 6.20) cho thấy 2 proton này ghép cis với nhau bởi hằng số ghép J = 8.5 Hz
và ở vị trí β so với oxygen. So sánh phổ 13C-NMR của (2) với ergosterol thấy có sự
biến mất của 2 cặp carbon tứ cấp alkene ở vị trí C-5 và C-8 cùng với sự xuất hiện
của 2 cặp carbon tứ cấp liên kết với oxi tại C-5 (δ C 82.3) và C-8 (δ C 79.6) giúp xác
định thay đổi cấu trúc của nhân B của hợp chất T2.
Từ những dữ kiện phổ phân tích trên và so sánh với dữ liệu phổ của
ergosterol peroxide [12], hợp chất T2 được xác định là ergosterol peroxide.

14


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Khánh Toàn
28
22

21
12
19

1
2

11
H

9
10

O
O

HO

3

4

5

18

13

20
H

17
14

8 H
7

16

26
23

24

25
27

15

6

Hình 3.3 Cấu trúc của hợp chất T2

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ của T2 và ergosterol peroxide
Vị
trí
1
2
3
4
5
6
7

8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
(3),(4)

T2 (3)
δ H (ppm)

3.97 (m)

6.20 (d, 8.5)
6.50 (d, 8.5)

0.84 (s)
0.88 (s)
0.99 (d, 6.5)
5.15 (dd, 15.5, 8.0)
5.20 (dd, 15.5, 7.5)

0.82 (d, 7.0)
0.80 (d, 7.0)
0.91 (d, 6.5)

δC
(ppm)
34.9
30.3
66.6
37.1
82.3
135.6
130.9
79.6
51.3
36.2
20.8
39.5
44.7
51.8
23.6
28.8
56.4

13.0
18.3
39.9
21.0
132.5
135.4
42.9
33.2
18.3
20.1
17.7

Ergosterol peroxide (4)
δC
δ H (ppm)
(ppm)
34.7
30.2
3.97 (m)
66.5
37.0
79.5
6.24 (d, 8.4)
130.8
6.50 (d, 8.4)
135.5
82.2
51.7
37.0
20.7

39.4
44.6
51.1
23.4
28.7
56.2
0.82 (s)
12.9
0.88 (s)
18.2
39.8
1.00 (d, 6.5)
20.9
5.14 (dd. 15.3, 7.8)
132.3
5.22 (dd, 15.3, 7.0)
135.2
42.8
33.1
0.82 (d, 6.3)
19.7
0.83 (d, 6.5)
20.0
0.91 (d, 6.8)
17.6

ghi trong CDCl 3

15

Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Khánh Toàn

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

4.1 KẾT LUẬN
Trong khóa luận này, chúng tôi đã bước đầu tiến hành khảo sát thành phần
hóa học cao ethanol của mẫu nấm Cordyceps neovolkiana được cung cấp bởi TS.
Đinh Minh Hiệp.
Thực hiện các phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp với sắc ký cột trên
silica gel pha thường, đã cô lập được hai hợp chất đó là: Cerevisterol (TT4) và
ergosterol peroxide (T2).

H

H
H

H

H

HO
OH

O
O

H

HO
OH

TT4

T2

Hình 4.1 Hai hợp chất cô lập được từ cao ethanol của mẫu nấm Cordyceps
neovolkiana
4.2 ĐỀ XUẤT
Vì điều kiện về thời gian và vật chất không cho phép, nên trong phạm vi của
đề tài này, chúng tôi chỉ khảo sát trên phân đoạn A1 và A3. Trong thời gian sắp tới,
nếu có điều kiện chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát trên các phân đoạn còn lại. Đồng
thời chúng tôi sẽ tiến hành thử nghiệm một số hoạt tính sinh học ở các loại cao và
hợp chất đã cô lập được.

16


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Khánh Toàn
TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1]

Aminul Haque. Md., Hossain M. S., Rahman M. Z., Rahman M. R., Hossain

Md. S., Mosihuzzaman M. M., “Isolation of Bioactive Secondary Metabolites
from, the Endophytic Fungus of Ocimum basillicum”, Department of Chemistry,
129, 2005.
[2]

Boros C., Hamilton S. M., Katz B., Kulanthaivel P., “Comparison of balanol

from Verticillium balanoides and ophiocordin from Cordyceps ophioglossoides”, J.
Antibiot. (Tokyo), 47, 1010–1016, 1994.
[3]

Chatterjee R., Srinivasan K. S., Maiti P. C., “Cordyceps sinesis (Berkeley)

Saccardo: structure of cordycepic acid”, J. Am. Pharm. Assoc. Am. Pharm. Assoc.
(Baltimore), 46, 114–118, 1957.
[4]

Cheung JK1, Li J., Cheung AW., Zhu Y., Zheng KY., Bi CW., Duan R., Choi

RC., Lau DT., Dong TT., Lau BW., Tsim KW., “Cordysinocan, a polysaccharide
isolated from cultured Cordyceps, activates immune responses in cultured Tlymphocytes and macrophages: signaling cascade and induction of cytokines”, J
Ethnopharmacol., 124(1), 61-8, 2009.
[5]

Chun K. Lob, Jerry K. H. Cheungb, Shang Q. Zhub, Karl W. K. Tsimb, “A

polysaccharide isolated from Cordyceps sinensis, a traditional Chinese medicine,
protects PC12 cells against hydrogen peroxide-induced injury, Life Sciences 73,
2503–2513”, 2003.
[6]

Cunningham K. G., Manson W., Spring F. S., Hutchinson S. A.,

“Cordycepin, a metabolic product isolated from cultures of Cordyceps militaris
(Linn.) Link”, Nature, 166, 949, 1950.
[7]

Huneck S., Yoshimura I., Intendification of lichen substance, Springer,

Berlin, 391, 1997.
[8]

Isaka M., Kongsaeree P., Thebtaranonth Y., “Bioxanthracenes from the

insect pathogenic fungus Cordyceps pseudomilitaris BCC 1620. II. Structure
elucidation.”, J. Antibiot. (Tokyo), 54, 36–43, 2001.

17


Khóa luận tốt nghiệp
[9]

Nguyễn Khánh Toàn

Isaka M., Tanticharoen M., Kongsaeree P., Thebtaranonth Y., “Structures of

cordypyridones A-D, antimalarial N-hydroxy- and N-methoxy-2-pyridones from the
insect pathogenic fungus Cordyceps nipponica.”, J. Org. Chem., 66, 4803–4808,
2001.

[10]

Kaczka E. A., Trenner N. R., Arison B., Walker R. W., Folkers K.,

“Identification of cordycepin, a metabolite of Cordyceps militaris, as 3’deoxyadenosine”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 14, 456–457, 1964.
[11]

Kawaguchi N., Ohmori T., Takeshita Y., Kawanishi G., Katayama S.,

Yamada H., “Occurrence of Gal beta (1—3) GalNAc-Ser/Thr in the linkage region
of

polygalactosamine

containing

fungal

glycoprotein

from

Cordyceps

ophioglossoides”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 140, 350–356, 1986.
[12]

Kim D. S., Baek N.-I., Oh S. R., Jung K. Y., Lee I. S., Kim J. H., Lee H.-K.

(1997), Anticomplementary activity of ergosterol peroxide from Naematoloma

fasciculare and reassignment of NMR data, Archives of Phamacal Research, 20(3),
201-205.
[13]

Kim K. M., Kwon Y. G., Chung H. T., Yun Y. G., Pae H. O., Han J. A., Ha

K. S., Kim T. W., Kim Y. M., “Methanol extract of Cordyceps pruinosa inhibits
invitro and invivo inflammatory mediators by suppressing NF-kappaB activation”,
Toxicol. Appl. Pharmacol., 190, 1–8, 2003.
[14]

Kim S. W., Hwang H. J., Xu C. P., Sung J. M., Choi J. W., Yun J. W.,

“Optimization of submerged culture process for the production of mycelial biomass
and exo-polysaccharides by Cordyceps militaris C738”, J. Appl. Microbiol., 94,
120–126, 2003.
[15]

Kim S. W., Xu C. P., Hwang H. J., Choi J. W., Kim C. W., Yun J. W.,

“Production

and

characterization

of

exopolysaccharides

from

an

enthomopathogenic fungus Cordyceps militaris”, NG3. Biotechnol. Progr., 19,
428–435, 2003.
[16]

Kneifel H., Konig W. A., Loeffler W., Muller R., “Ophiocordin, an

antifungal antibiotic of Cordyceps ophioglossoides Arch.”, Microbiol., 113, 121–
130, 1977.

18