Các hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.18 MB, 50 trang )

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Nghiên cứu về hệ enzyme đã mở ra cánh cửa cho việc xác định các
protein có khả năng ứng dụng trong điều trị bệnh. Một số protein đã được
nghiên cứu và hiện đã được tạo thành thuốc chữa bệnh sử dụng trong y học. Khi
đã được xác định, những protein này cần được nghiên cứu kỹ, bao gồm việc
biểu hiện protein ở các sinh vật mẫu nhờ sử dụng các kỹ thuật DNA.
Việc biểu hiện một gene để sản xuất lượng lớn protein gặp nhiều vấn đề
rắc rối hơn so với việc sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm. Càng có nhiều bản
sao của một gene trong một tế bào thì mức độ biểu hiện sản phẩm của gene càng
cao. Do đó, việc đưa gene vào một plasmid có nhiều bản sao trong mỗi tế bào se
cho năng suất sản phẩm cao hơn. Tuy nhiên, plasmid có số bản sao lớn lại
thường không ổn định và thường thất thoát, đặc biệt khi nuôi cấy ở quy mô công
nghiệp có mật độ cao. Một phương pháp để ngăn chặn sự thất thoát plasmid là
đưa gene ngoại lai chèn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ. Hiện nay, các nhà
khoa học đã cố gắng để đưa nhiều bản sao của một gene ngoại sinh nằm liên tiếp
nhau vào nhiễm sắc thể tế bào chủ. Tuy nhiên sự có mặt của nhiều bản sao một
gene lại tạo ra sự không ổn định do sự tái tổ hợp giữa các trình tự DNA tương
đồng.
Việc biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật hiện đang được quan tâm
nghiên cứu vì những ưu điểm hơn so với các hệ thống biểu hiện khác như chúng
có thể sinh trưởng trên môi trường tương đối đơn giản, protein được tiết ra môi
trường nhiều hơn phần tích luỹ trong tế bào nên việc thu hồi và tinh sạch dễ thực
hiện, đặc biệt protein tái tổ hợp có nguồn gốc thực vật an toàn cho con người
hơn so với các protein có nguồn gốc từ các hệ thống nuôi cấy khác do các chất
nhiễm bẩn và virus thực vật không phải là tác nhân gây bệnh ở người.
2. Mục tiêu của chuyên đề
Chuyên đề nhằm mục tiêu tổng hợp, làm rõ hơn khả năng biểu hiện
protein tái tổ hợp ở một số hệ thống nuôi cấy, đặc biệt là các hệ thống nuôi cấy ở
1

thực vật, những thuận lợi và khó khăn khi sản xuất protein tái tổ hợp của từng
phương pháp, từng hệ thống biểu hiện.
3. Nội dung của chuyên đề
Chuyên đề sẽ được trình bày theo những nội dung chính sau
Chương 1. Sơ lược một số hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp
Chương 2. Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật

2

CHƯƠNG 1
SƠ LƯỢC MỘT SỐ HỆ THỐNG BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP
1. Sản xuất protein tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn E. coli
1.1. Đặc điểm của E. coli trong sản xuất protein tái tổ hợp
Escherichia coli là vi khuẩn gram âm, hiếu khí tùy ý, hình que, có kích
thước khoảng 0,3-1,0 x 1,0-6,0μm, di động, được tìm thấy khắp nơi trong tự
nhiên. Do chúng có khả năng phát triển rất mạnh (thời gian thế hệ khoảng 20
phút) và nhu cầu dinh dưỡng đơn giản nên được sử dụng trong công nghiệp và
các mục đích về y học. Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của E. coli là 37 oC, pH 6,0 7,0. Thành phần môi trường tối thiểu để E. coli phát triển là glucose 0,5%,
Na2HPO4 0,6%, KH2PO4 0,3%, NH4Cl 0,1%, NaCl 0,05%, MgSO4 0,012%,
CaCl2 0,001%. Ngoài ra, tùy theo loài E. coli khác nhau mà có những môi
trường chọn lọc khác nhau [75].

Hình 1.1. Hình thái tế bào E. coli
(a) Dưới kính hiển vi quang học, (b) Dưới kính hiển vi điện tử.
E. coli là tế bào chủ đầu tiên được sử dụng để tạo DNA tái tổ hợp sản xuất
các protein tái tổ hợp dùng làm thuốc phục vụ cho y học. Từ đầu thập niên 1990
đến nay, hầu hết người ta sử dụng E. coli làm chủng chủ để sản xuất các protein
tái tổ hợp phục vụ trong các lĩnh vực khác nhau của đời sống con người.

Tuy vậy, việc sử dụng E. coli cũng có một số ưu-nhược điểm nhất định so
với các hệ thống khác [25]. Nói chung, hệ thống E. coli có những ưu điểm sau:
3

thao tác gen đơn giản, hiệu suất biểu hiện cao, có thể đạt 50% tổng protein tế
bào; có thể lên men mật độ cao bằng môi trường nuôi cấy rẻ tiền và hệ thống
thiết bị đơn giản. Tuy nhiên, hệ thống này cũng có một số nhược điểm như: đối
với gen có nguồn gốc từ eukaryote thì cần tạo dòng bằng cách dùng cDNA thay
đổi codon hiếm ở gen ban đầu bằng codon phổ biến ở E. coli; cần phải tái gấp
cuộn để thu nhận protein có cấu hình tự nhiên vì đa số trường hợp protein tái tổ
hợp được tạo ra dưới dạng thể vùi trong E. coli; không có hệ thống glycosyl hóa;
có sự hiện diện của nhiều enzyme protease. Nhược điểm này có thể được khắc
phục bằng cách dùng chủng chủ E. coli đột biến không có protease.
1.2. Các chủng E. coli thường dùng trong sản xuất protein tái tổ hợp
Nhiều chủng E. coli khác nhau đã được nghiên cứu thiết lập để biểu hiện
protein tái tổ hợp bằng các vector biểu hiện khác nhau. Khi lập phương án sản
xuất protein tái tổ hợp trong E. coli cần lựa chọn hệ thống vector biểu hiện và
chủng chủ thích hợp cho protein mục tiêu. Sau đây là một số chủng E. coli tiêu
biểu sử dụng dụng cho mục đích biểu hiện [75].
a. E. coli BL21
Chủng chủ E. coli BL21[F-, ompT, hsdS (rB-, mB-), gal] là dạng đột biến
khuyết protease OmpT và Lon và là chủng chủ tốt nhất dùng để biểu hiện protein
tái tổ hợp dung hợp với GST bằng hệ thống vector biểu hiện pGEX. Tuy nhiên,
do có đặc tính biến nạp không tốt nên chủng này không được dùng cho mục đích
dòng hóa. Chủng E. coli DH5α là chủng mang alen recA1 giúp cho quá trình biến
nạp và lưu trữ plasmid pGEX nên được dùng cho mục đích tạo dòng thay cho E.
coli BL21 [13, 56].
b. E. coli BL21 (DE3) pLysS
Chủng E. coli BL21(DE3)[F-, ompT, hsdSB (rB-, mB-), gal, dcm(DE3)]

thường được dùng trong biểu hiện protein dung hợp với 6xHis bằng vector biểu
hiện pET. Hệ thống này cho phép biểu hiện vượt mức protein đồng thời hạn chế
tối đa hiện tượng phiên mã rò rỉ khi không có chất cảm ứng. DNA bộ gen của
chủng chủ này chứa gen T7 1 mã hóa T7 RNA polymerase có nguồn gốc từ
bacteriophage DE3 dạng tiềm tan. Gen T7 1 chịu sự điều khiển của promotor
4

lac. Gen lacI có khả năng tạo ra một lượng lớn repressor của lac operon (lacO)
tham gia kiểm soát âm sự phiên mã của T7 1.

Hình 1.2. Cơ chế biểu hiện gen bởi hệ thống vector pET trong tế bào E. coli
(DE3)pLysS

Sự ức chế phiên mã se được hóa giải nhờ IPTG làm bất hoạt lacO [68,
75]. Ngoài ra, chủng chủ này có thể được thiết kế chứa thêm plasmid pLysS gọi
là E.coli BL21(DE3)pLysS giúp tế bào chủ tổng hợp được một lượng nhỏ T7
lysozyme có vai trò làm bất hoạt T7 RNA polymerase. Vector pET có chứa T7
promotor nên các gen nằm ở phía sau promotor se được phiên mã nhờ hoạt tính
của T7 RNA polymerase của tế bào chủ. Như vậy chủng chủ này có đặc điểm
hạn chế tối đa sự tổng hợp protein từ hệ thống vector biểu hiện pET khi không
được cảm ứng. Cũng như một số chủng chủ BL21 khác, chủng chủ E. coli BL21
(DE3)pLysS (hoặc -pLysE) cũng bị đột biến khuyết sản phẩm protease OmpT
và Lon nên hạn chế tối đa sự thủy phân không mong muốn của protein tổng hợp.
c. E. coli M15 (pREP4)
E. coli M15 (pREP4) cho phép biểu hiện protein tái tổ hợp vượt mức bằng
hệ thống vector biểu hiện pQE. Chủng chủ này có mang plasmid pREP4 mang
gen lac I mã hóa cho repressor LacI có vai trò ức chế sự phiên mã của gen nằm
5

sau promotor T5 theo cơ chế kiểm soát âm khi không có chất cảm ứng. Chủng
chủ E.coli M15 (pREP4) có kiểu gen [Nals, Strs, Rifs, Thi-, Lac-, Ara+, Gal+,
Mtl-, F-, RecA+, Uvr+, Lon+]. Một chủng chủ khác có đặc điểm tương tự như
M15(pREP4) là SG13009 (pREP4). Ngoài ra, có thể dùng một số chủng chủ
khác để biểu hiện bằng hệ thống pQE như E. coli XL1 Blue, E. coli JM109, E.
coli TG1. Tuy nhiên, chỉ các chủng chủ có mang pREP4 cho hiệu quả biểu hiện
cao và tránh được hiện tượng rò rỉ phiên mã [97].
d. Chủng chủ Tuner
Các chủng chủ TunerTM là dạng đột biến làm mất gen lacY mã hóa cho
lac permease trong chủng khuyết protease BL21, được sử dụng cho các vector
pGEX, pET. Việc đột biến gen lac permease có tác dụng làm cho đồng bộ sự
tiếp nhận chất cảm ứng IPTG trong tất cả các tế bào trong quần thể. Khi thay đổi
nồng độ của IPTG, sự biểu hiện có thể được kiểm soát từ mức rất thấp đến mức
tối đa. Khi biểu hiện ở mức thấp, có thể làm tăng cường tính tan và hoạt tính của
các protein mục tiêu phức tạp [75].
e. Chủng chủ Rosetta
Các chủng chủ RosettaTM là dẫn xuất của các chủng Tuner nên chúng có
đầy đủ các đặc tính ưu việt của chủng đột biến lacY và của BL21 [75]. Tuy
nhiên chủng Rosetta còn có thêm đặc điểm khác là mang plamid pRARE, mã
hóa tRNAs cho các codon động vật, đây là những codon rất hiếm gặp trong E.
coli, do vậy có thể làm tăng cường tối đa sự biểu hiện. Plasmid pRARE được
chọn lọc trên chloramphenicol và có thể tương hợp với toàn bộ các vector thuộc
họ pET.
f. Chủng chủ Origami
Chủng chủ Origami là dẫn xuất từ K-12 đột biến cả hai gen mã hóa
thioredoxin reductase (trxB) và glutathione reductase (gor). Do vậy, chúng có
khả năng tăng cường sự hình thành các cầu nối disulfide trong tế bào chất.
Những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng Origami (DE3) làm tăng cường hoạt
tính của protein mục tiêu lên gấp 10 lần so với các chủng chủ thông thường mặc

dù tổng lượng protein biểu hiện trong cả quá trình là như nhau. Các chủng chủ
6

Origami có thể tương thích với các plasmid kháng ampicillin và thích hợp cho
việc sử dụng với các vector pET-43.1, pET-44 và pET-32 [75].
g. Chủng chủ Origami B
Chủng chủ Origami B kết hợp tính năng gấp cuộn protein của E. coli
Origami và sự kiểm soát biểu hiện chính xác của các chủng Tuner. Các chủng
này mang bộ gen khuyết các protease của BL21 và tương thích với các plasmid
kháng ampicillin [75].
h. Chủng chủ Rosetta-gami
Chủng chủ Rosetta-gami là dẫn xuất từ chủng Origami và mang plasmid
pRARE mã hóa cho các tRNAs hiếm trong chủng K-12 đột biến trxB/gor để
tăng cường sự hình thành các cầu nối disulfide trong tế bào chất. Các chủng này
có thể tương hợp với các vector kháng ampicillin như pET-43.1, pET-44 và
pET-32.
i. Chủng chủ AD494
Chủng chủ AD494 có dẫn xuất từ chủng đột biến trxB K-12, làm tăng
cường sự hình thành các cầu nối disulfide trong tế bào chất. Chủng đột biến trxB
được chọn lọc bằng karamycin do vậy nên có thể dùng với các marker bla kháng
ampicillin [75].
1.3. Các hệ thống vector biểu hiện trong E. coli
1.3.1. Hệ thống pGEX biểu hiện protein dung hợp với GST
Tất cả các vector pGEX đều có đặc điểm chung là có chứa tac promotor
(Ptac) điều khiển sự biểu hiện vượt mức của gen theo cơ chế kiểm soát âm được
cảm ứng bằng IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside) hoặc các chất tương đồng về
cấu trúc. Họ vector

pGEX có gồm tất

cả 13 vector tương tự

như vector pGEX-

2TK.

7

Hình 1.3. Sơ đồ hệ thống vector biểu hiện pGEX 2TK
Trong họ vector pGEX, có 9 vector có vùng MCS rộng, chứa đến 6 vị trí
cắt giới hạn của các enzyme, giúp dễ dàng trong việc dòng hóa. Vector pGEX2TK có vị trí MCS rất khác biệt so với các vector khác trong họ vector pGEX,
được thiết kế cho phép phát hiện các protein đã biểu hiện bằng cách đánh dấu
trực tiếp in vitro. Vùng MCS này nằm về phía sau của trình tự nhận biết của
kinase được ly trích từ cơ tim [4].
GST (Glutathione S-Transferase) là họ enzyme có thể chuyển nhóm S của
glutathione vào những cơ chất như nitro và các hợp chất của halogen, làm cho
chúng bị khử độc tính [74]. Hệ thống pGEX biểu hiện protein tái tổ hợp dung
hợp với GST. Trung tâm cơ chất của GST có ái lực cao đối với glutathione. Đặc
tính này giúp việc thu nhận dễ dàng protein tái tổ hợp ở dạng dung hợp với GST.
GST còn có vai trò trong sự phát hiện protein dung hợp với GST bằng phương
pháp so màu dựa vào hoạt tính của GST trên cơ chất tạo sản phẩm có màu như
CDNB (1-chloro-2-dinitrobenzene) hoặc bằng phương pháp miễn dịch dựa trên
kháng thể đặc hiệu của GST. Hệ thống gen dung hợp GST đã được ứng dụng
thành công trong nhiều lĩnh vực như trong miễn dịch học phân tử [5], trong sản
xuất vắc xin (đối với các protein có kích thước phân tử nhỏ khi dung hợp với
GST thành kích thước lớn hơn làm tăng tính kháng nguyên), trong nghiên cứu
tương tác protein-protein, hoặc tương tác protein-DNA [27, 44].
1.3.2. Hệ thống pET biểu hiện protein dung hợp với 6xHis

Hệ thống vector biểu hiện pET cho phép dòng hóa và biểu hiện protein tái
tổ hợp ở dạng dung hợp với một homooligohistidine (6xHis) trong tế bào E.coli.
Sự biểu hiện của gen mục tiêu được kiểm soát bởi promotor T7 và nhờ hoạt tính
của T7 RNA polymerase của tế bào chủ được biến đổi bởi phage T7. Vector
biểu hiện này chứa đoạn DNA mã hóa oligo-histidine gọi là thẻ His (His-tag),
8

đoạn này có thể chứa 6 hoặc 8 hoặc 10 amino acid. Tùy theo plasmid mà His-tag
có thể dung hợp ở đầu N hay đầu C hay nằm ở giữa protein dung hợp với vai trò
hỗ trợ việc tinh chế protein mục tiêu và còn giúp cho sự phát hiện protein mục
tiêu ở dạng dung hợp nhờ kháng thể chuyên biệt với His-tag. Protein tái tổ hợp
chứa 6xHis có thể được thu hồi với độ tinh sạch trên 90% bằng cách hấp phụ lên
cột sắc ký Ni2+-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA), nhờ tương tác giữa 6xHis và Ni 2+
sau đó ly giải ở pH thấp hoặc dùng chất kìm hãm cạnh tranh là imidazone[68,
75].

Hình 1.4. Cấu trúc vector biểu hiện pET 43-1a(+)

9

Hình 1.5. Tương tác giữa protein dung hợp chứa 6xHis và giá thể gắn Nikel

1.3.3. Hệ thống biểu hiện dung hợp với MBP - Hệ thống pMAL
Trong hệ thống này, gen mã hóa protein mục tiêu được chèn vào vector
pMAL từ gen malE, mã hóa cho protein kết gắn maltose, MBP (Maltose
Binding Protein). Hệ thống này sử dụng promotor mạnh Ptac để biểu hiện một
lượng lớn protein dung hợp, sau đó được thu nhận bằng sắc ký ái lực dựa vào ái
lực đặc trưng của MBP với amylose [73]. Hệ thống pMAL có khả năng biểu

hiện cả ở tế bào chất và chu chất với mức độ biểu hiện cao (100 mg / L) trong E.
coli và làm tăng tính tan của protein dung hợp [74].

Hình 1.6. Sơ đồ biểu hiện và thu nhận các protein có gắn thẻ MBP
1.3.4. Hệ thống IMPACT biểu hiện protein dung hợp với CBP
Đặc điểm nổi bật của hệ thống IMPACT (Intein Mediated Purification
with an Affinity Chitin-binding) là tính năng tự cắt các đoạn protein dung hợp
(intein) trong thu nhận và tinh chế protein tái tổ hợp (phân tử intein từ
Sac.cerevisiae VM1) [72]. Phân tử intein này được biến đổi để có thể thực hiện
phản ứng tự cắt liên kết peptide khi được cảm ứng ở 4 oC với các tác nhân thiol
như DTT (1,4-Dithiothreitol), β-Mercaptoethanol hoặc cysteine. Trong hệ thống
10

này gen mã hóa intein thường nằm ở đầu 3’ của gen mục tiêu, tiếp theo là đoạn
gen mã hóa cho vùng gắn chitin, chitin-binding domain (CBD), kích thước 5
kDa từ Bacillus circulan. Khi được nạp vào cột chitin, protein dung hợp với
CBP se được giữ lại. Sau khi thực hiện phản ứng cắt của intein ở 4 oC bởi DTT
hoặc β-Mercaptoethanol, protein mục tiêu được ly giải khỏi cột.

Hình 1.7. Sơ đồ biểu hiện và tinh chế sử dụng hệ thống gắn thẻ Chitin
2. Sản xuất protein tái tổ hợp trong tế bào nấm men
2.1. Những đặc điểm chung của hệ biểu hiện trong nấm men
Nấm men là một cơ thể vi sinh vật nhân chuẩn đơn giản, nhưng chúng
mang đầy đủ các đặc điểm của một cơ thể và là một mô hình tiêu biểu cho cấu
trúc tế bào. Chính vì sự đơn giản trong cấu trúc mà nấm men được nghiên cứu rất
kỹ về mặt di truyền. Tế bào nấm men có dạng hình elip hoặc hình tròn, một số
loài có dạng phân nhánh. Nấm men có thể tồn tại ở trạng thái đơn bội hoặc lưỡng
11

bội. Tế bào đơn bội có kích thước khoảng 4μm, còn tế bào lưỡng bội có kích
thước khoảng 6 μm. Nấm men có hai giới tính là a và α. Các tế bào đơn bội sinh
sản qua nguyên phân bằng cách nảy chồi. Khi hai nòi đơn bội kết hợp với nhau
tạo thành nòi lưỡng bội mang giới tính a/α trên môi trường nghèo nitơ thì các tế
bào bắt đầu giảm phân tạo thành 4 bào tử sinh dưỡng, hai bào tử có giới tính a, hai
bào tử có giới tính α [2].
Có 4 loại promoter mạnh đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi để
tổng hợp protein ngoại lai trong nấm men đó là [83]: Promoter hệ đường phân,
ví dụ như promoter của gen mã hóa cho alcohol dehydrogenase I (ADHI);
Promoter điều hòa quá trình trao đổi chất galactose, đây là một promoter được
điều khiển chặt che có liên quan đến chuyển hóa galactose; Promoter điều hòa
quá trình hoạt động của nhóm photphat như promoter POH5; Promoter bị ức chế
bởi glucose, ví dụ như ADH2.
Vector biểu hiện trong nấm men gồm có hai nhóm: Nhóm không có khả
năng tự sao chép trong tế bào (YIp- Yeast integrating plasmid) là nhóm plasmid
tích hợp bằng cách trao đổi chéo vào gen của nấm men ở những vùng tương đồng
và nhóm có khả năng tự sao chép trong tế bào. Nhóm có khả năng tự sao chép
trong tế bào được chia thành ba nhóm nhỏ: Nhóm plasmid episom YEp (YEpYeast episomal plasmid), nhóm plasmid tái bản YRp (YRp- Yeast replicating
plasmid) và nhóm plasmid chứa tâm động YCp (YCp- Yeast centromere plasmid)
[85].
Tất cả các plasmid này chỉ có khả năng mang các đoạn gen ngoại lai có
kích thước tối đa là 20 kb. Hầu hết các plasmid tự sao chép đều là dạng plasmid
con thoi, chúng có trình tự mang các dấu chuẩn chọn lọc để phù hợp cho sinh
trưởng và chọn lọc trong cả tế bào E. coli và nấm men. Thông thường các vector
nấm men đều chứa tâm sao chép của E. coli là vùng Ori, vùng này có tác dụng
làm tăng số bản sao trong E. coli và đồng thời chứa các dấu chuẩn chọn lọc
trong E. coli như chứa gene kháng kháng sinh: Gen kháng Ampicillin kí hiệu là
amp (AmpR), gen kháng tetracycline kí hiệu tet (TetR). Các vector nấm men
thường chứa các gen URA3, HIS 3, LEU 2, TRP 1, LYS 2. Đây chính là các dấu

12

chuẩn chọn lọc trong các dòng nấm men tái tổ hợp, chúng có khả năng bổ sung
cho những đột biến khuyết dưỡng tương ứng [83].
2.2. Những ưu điểm của hệ biểu hiện nấm men
Nấm men có những thuận lợi trong biểu hiện các gene ngoại lai có nguồn
gốc từ sinh vật nhân chuẩn.
Nấm men là một sinh vật nhân thực, nên môi trường bên trong tế bào
thích hợp cho việc hình thành các cấu trúc tương tự như cấu trúc tự nhiên của
protein ngoại lai. Đây là một vấn đề rất thuận lợi cho việc biểu hiện các gene có
nguồn gốc từ các tế bào nhân thực. Trong cấu trúc của DNA còn chứa những
đoạn trình tự không mã hóa cho amino acid. Những đoạn trình tự này phải được
loại đi để tạo thành phân tử mARN chính trước khi chúng được dịch mã sang
protein. Chính điều này đảm bảo cho protein có được trình tự cũng như cấu trúc
không gian tương tự như protein tự nhiên [2].
Nấm men có khả năng glycosyl hóa, đảm bảo cho protein có khả năng tan
và đảm bảo cấu trúc toàn vẹn để thực hiện chức năng sinh học của chúng [98].
Nấm men có khả năng tiết protein ngoại lai ra môi trường rất hiệu quả.
Một mặt có thể sử dụng các trình tự tín hiệu tiết của bản thân gene đưa vào trong
cơ thể vật chủ, hoặc cũng có thể sử dụng trình tự tín hiệu tiết của tế bào nấm
men. Hệ vector thiết kế dùng trong việc biểu hiện protein ngoại lai ở nấm men
ngày càng được cải biến theo hướng tăng cường các trình tự tín hiệu tiết [39].
2.3. Hệ biểu hiện Pichia pastoris
Ban đầu, khi mới nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp ở nấm men,
người ta thường biểu hiện trong Saccharomyces cerevisiae với nhiều gene được
nhân dòng từ nhiều nguồn. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, sự biểu hiện là
rất thấp và năng suất không đáng kể. Đặc biệt, nhiều protein tái tổ hợp bị
glycosyl hoá quá mức với hơn 100 gốc mannoza trong các chuỗi bên
oligosaccharide liên kết N. Mannoza thừa thường làm biến đổi chức năng và làm

protein tái tổ hợp có tính kháng nguyên. Ngoài ra, các protein được thiết kế để
tiết ra ngoài thường bị giữ lại trong tế bào, do đó làm tăng thời gian và chi phí
để tinh sạch. Chính vì những lý do này nên các nhà khoa học đã nghiên cứu và
13

lựa chọn loài nấm men Pichia pastoris để sản xuất các protein tái tổ hợp sau này
[80].
P. pastoris là nấm men được Koichi Ogata phát hiện vào năm 1969, có
khả
năng sử dụng methanol làm nguồn cacrbon và nguồn năng lượng. Trong những
năm 1970, P. pastoris được ứng dụng để sản xuất protein đơn bào. Đến những
năm 1980, cùng với sự phân lập thành công gene aox, P. pastoris trở thành vật
chủ nhân chuẩn để biểu hiện gen ngoại lai hiệu quả [12]. Ưu điểm lớn nhất của
việc biểu hiện protein ngoại lai trong P. pastoris là vật chủ này có khả năng tiết
protein ngoại lai ra môi trường và tiết chủ yếu protein đích, còn các protein của
tế bào chỉ được tiết ra ở mức độ rất thấp. Điều này rất thuận lợi cho quá trình thu
hồi sản phẩm mà không cần quá trình tách protein ngoại lai khỏi tế bào. P.
pastoris có thể sinh trưởng trong điều kiện nuôi cấy liên tục trong một thời gian
dài và có khả năng lên men với mật độ tế bào cao. Môi trường nuôi cấy không
đắt tiền, chỉ bao gồm nguồn cacbon như glycerol và methanol, biotin, muối,
nước. Chúng có thể sinh trưởng trên môi trường pH tương đối thấp và sử dụng
nguồn cacbon là methanol mà hầu hết các vi sinh vật khác không sử dụng được.
Do vậy, P. pastoris nuôi cấy ít mẫn cảm với nhiễm của vi sinh vật từ bên ngoài.
P. pastoris có khả năng tổng hợp lượng lớn protein ngoại lai trong peroxisome,
thuận tiện cho việc vận chuyển và tiết protein. Ngoài ra, P. pastoris không là tác
nhân gây bệnh, không chứa virus trong tế bào và còn có một promoter mạnh có
thể kiểm soát chặt che được bằng nguồn cacbon [11].
2.3.1. Promoter AOX1
Việc biểu hiện các gene ngoại lai trong P. pastoris được điều khiển hiệu

quả và chặt che bởi promoter AOX1. Promoter này được kiểm soát ở mức độ
cao trong tế bào sinh trưởng trên môi trường glucose, glycerol và một số nguồn
carbon khác, nhưng được cảm ứng mạnh me bởi methanol [12]. Bước đầu tiên
trong quá trình trao đổi methanol ở P. pastoris là sự oxy hóa methanol nhờ
alcohol oxidase (AOX), sử dụng oxy phân tử làm chất nhận điện tử và tạo thành
hydrogenperoxid (H2O2) và formaldehyde. Để tránh độc tố của H2O2, sự trao đổi
14

methanol diễn ra bên trong một bào quan chuyên biệt của tế bào là peroxisome,
do đó peroxisome cô lập sản phẩm độc khỏi phần khác của tế bào [40].
Hệ gene của P. pastoris chứa 2 gene alcohol oxidase là aox1 vào aox2.
Các vùng mã hóa protein của 2 gene này chiếm 92% gene và chúng tương đồng
nhau đến 97% nucleotide. Tuy nhiên, gene aox1 chịu trách nhiệm chủ yếu về
hoạt tính AOX trong tế bào (gần 85%) [104]. Sự biểu hiện AOX1 được điều hòa
chặt che ở mức độ dịch mã và được kiểm soát bởi cả cơ chế tiêu cực/tích cực và
cảm ứng. Enzyme AOX1 có ái lực thấp với oxy, nhưng bù vào đó là promoter
AOX1 kiểm soát gene aox1 biểu hiện và tạo ra một lượng lớn enzyme AOX1
[36]. Thực tế, enzyme AOX có thể chiếm đến 30% protein tổng số của tế bào
khi sinh trưởng trên môi trường có methanol [32]. Promoter AOX1 là promoter
mạnh, vì vậy có thể được sử dụng để kiểm soát sự biểu hiện của các protein tái
tổ hợp ở mức độ cao [21]. Hơn nữa, promoter này có thể tự ngừng hoạt động khi
nguồn carbon không bị giới hạn như glycerol và glucose ức chế promoter ở mức
độ sau dịch mã và giảm đến mức tối thiểu khả năng biểu hiện của các đột biến
trong quá trình tạo sinh khối [12].
2.3.2. Chủng biểu hiện
Phần lớn các chủng được sử dụng để biểu hiện protein tái tổ hợp đều bị
gây đột biến gene his4 và đều có nguồn gốc từ chủng dại NRRL-Y 11430
(Northern Regional Research Laboratories, Peoria, IL). Những chủng này không
có khả năng tổng hợp histidinol dehydrogenase. Chúng sinh trưởng được trên

môi trường giàu chất dinh dưỡng, nhưng trong môi trường cơ bản cần bổ sung
thêm histidine. Do vậy, gene his4 của P. pastoris được xem là một chỉ thị nhận
biết chủng chứa vector biểu hiện sau biến nạp do vector biểu hiện chứa gene
his4 bình thường.
Xét về khả năng sinh trưởng trên môi trường methanol thì các chủng P.
pastoris có 3 kiểu hình là Mut+, Muts, Mut- [12]. Chủng có cả 2 gene aox1 và
aox2 có khả năng sinh trưởng trên môi trường methanol mạnh như chủng dại có
kiểu hình Mut+, ví dụ chủng GS115 (his4 – không có hoạt tính histidinol
dehydrogenase). Chủng bị loại bỏ phần lớn gene aox1 sinh trưởng chậm trên môi
15

trường methanol có kiểu hình Muts (Methanol utilization slow), ví dụ chủng
KM71 (his4 aox1 ∆::ARG4). Chủng bị loại bỏ hoàn toàn cả 2 gene aox1 và aox2
không có khả năng sinh trưởng trên môi trường methanol có kiểu hình là Mut-, ví
dụ chủng MC 100-3 (his4 arg4 aox1 ∆::ARG4 aopx2∆::Phis4). Tất cả các chủng
này vẫn có khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp tốt nhờ có promoter AOX1. Tuy
nhiên, các chủng Mut- rất mẫn cảm với nồng độ methanol dư thừa cao. Do vậy, sự
thay đổi đột ngột các mức độ methanol dư thừa thường dẫn đến mất hoạt tính
AOX và thậm chí tế bào có thể chết. Để khắc phục nhược điểm này, các chủng
Mut- có thể được nuôi cấy theo mẻ (fed-batch), hoặc sử dụng chủng Muts không
mẫn cảm với nồng độ methanol dư thừa cao bởi vì tốc độ tiêu thụ methanol của
chúng thấp. Ngoài ra, nồng độ các chất khác của tế bào như proteinase cũng se
tăng theo mật độ tế bào. Điều này đặc biệt ảnh hưởng đến các protein tiết trong
nuôi cấy tế bào mật độ cao, bởi vì sự phân hủy tế bào se giải phóng proteinase vào
môi trường nuôi cấy dẫn đến các protein tiết se bị phân hủy nhanh chóng. Do vậy,
sử dụng chủng biểu hiện bị loại bỏ bớt gen mã hóa các proteinase se giảm sự phân
hủy protein tiết. Chủng SMD1163 (his4 pep4 prb4),SMD1165 (his4 prb1) và
chủng SMD1168 (his4 pep4) là các chủng khuyết proteinase có thể được sử dụng
để biểu hiện một số loại protein tiết nhất định [15].

*. Một số chủng P. pastoris được sử dụng để biểu hiện protein tái tổ hợp

Chủng
Y-11430
GS115
GS190
GS200
SMD1168
SMD1165
SMD1163

Kiểu gen
Dại
His4
Arg4
His4 arg4
∆pep4::URA his4 ura3
His4 prb1
Pep4 his4 prb1

Chú thích: Gene pep mã hóa proteinase A trong không bào. Protein này
cần thiết cho sự hoạt hóa các proteinase không bào khác như carboxypeptidase
Y và proteinase B. Đột biến gene pep4 se làm giảm hoạt tính của proteinase A
và carboxypeptidase Y và giảm mạnh hoạt tính của proteinase B. Gen prb1 mã
16

hóa proteinase B. Đột biến gene prb1 thì chỉ hoạt tính proteinase B bị giảm.
Ngược lại, nếu đột biến 2 gene pep4 prb1 thì cả 3 protease se giảm hoạt tính
[41].

2.3.3. Vector biểu hiện gen
Nhiều vector biểu hiện dành cho P. pastoris đã được thiết kế và đều có 5
yếu tố sau [11, 41]: (1) Promoter AOX1 (5’AOX1) là một đoạn trình tự có chiều
dài gần 1 kb, cho phép protein được biểu hiện mạnh trong Pichia và định hướng
plasmid tích hợp với hệ gene nấm men tại locus AOX1. Ngoài ra còn có trình tự
nằm sau trình tự kết thúc phiên mã ở đầu 3’ của gene aox1 cũng có tác dụng
định hướng plasmid tích hợp với hệ gene nấm men tại vị trí locus aox1.
(2) Một hoặc nhiều vị trí đa nối (MCS) cho phép chèn gene mong muốn
vào vector biểu hiện.
(3) Trình tự kết thúc dịch mã có nguồn gốc từ gene aox1 của P. pastoris
(TT) là trình tự dài khoảng 260 bp, cho phép kết thúc quá trình dịch mã và sự
thêm đuôi poly A ở mARN hiệu quả.
(4) Gene chỉ thị chọn lọc (his4) là một gene nguyên vẹn của Pichia mã
hóa cho histidinol dehydrogenase, dài khoảng 2,4 kb và được sử dụng để bổ
sung cho các chủng Pichia bị đột biến gene his4.
(5) Một trình tự cần thiết
cho sự sao chép và tồn tại của
plasmid

trong

vi

khuẩn

(Ampicillin và ColE1 origin).
Amp là gene kháng ampicillin
cho phép chọn lọc tế bào mang
vector tái tổ hợp. ColE1 cho
phép plasmid tái tổ hợp sao chép

và tồn tại trong tế bào vi khuẩn.
Đầu 5’ promoter AOX1:
nucleotide base 1-948
Vị trí mồi 5’ AOX1: nucleotide
855-875

17

Tín hiệu tiết (nhân tố α) (S): nucleotide 949-1218
Vị trí mồi α: nucleotide 1152-1172
Vùng đa nối: nucleotide 1192-1241
Vị trí mồi đầu 3’ AOX1: nucleotide 1327-1347
Đoạn kết thúc dịch mã 3’AOX1 (TT): nucleotide 1253-1586
Khung đọc mở (ORF) HIS4: nucleotide 4514-1980
Đoạn 3’ AOX1: nucleotide 4870-5626
ColE1 origin: bases 6708-6034
Gene kháng Ampicillin: nucleotide 713-6853
Hình 1.8. Bản đồ vector biểu hiện pPIC9 ngoại lai trong nấm men P. pastoris

Ngoài ra, vector biểu hiện còn có trình tự chuyên biệt kích thích tiết
protein tái tổ hợp ra môi trường nuôi cấy như trình tự PHO1 của gene mã hóa
cho phosphatase trong P. pastoris hoặc trình tự của gene mã hóa cho nhân tố
giới tính α của S. cerevisiae đã được sử dụng thành công [20].
Để sử dụng promoter PAOX1 cho việc biểu hiện protein tái tổ hợp, có 4
vector biểu hiện phổ biến là pHIL-D2, pPIC3.5, pHIL-S1 và pPIC9. Vector
pHIL-D2 và pPIC3.5 được sử dụng để biểu hiện protein nội bào, còn pHIL-S1
và pPIC9 được sử dụng để biểu hiện protein tiết. Trong đó, vector pPIC9 được
sử dụng rộng rãi để biểu hiện các protein.
2.3.4. Tích hợp gen ngoại lai vào hệ gen P. pastoris

Cách đơn giản nhất để vector biểu hiện được tích hợp vào hệ gene P.
pastoris là mở vòng vector biểu hiện bằng enzyme hạn chế ở một vị trí đã được
thiết kế sẵn trên gene đánh dấu his4 hoặc trên đoạn promoter AOX1. Khi vector
mở vòng se tạo thành các đầu DNA và chính các đầu tận cùng DNA này se kích
thích sự tái tổ hợp tương đồng dẫn đến sự trao đổi chéo đơn và tích hợp vector
vào locus tương đồng [12].

18

Hình 1.9. Sự tích hợp vector biểu hiện vào hệ gene P.pastoris tại locus his4 [11]

Hình 1.9 cho thấy sự tích hợp vector biểu hiện vào hệ gene P. pastoris.
Việc tích hợp được thực hiện bằng sự trao đổi chéo đơn giữa gene his4 trên
vector và locus his4 của hệ gene P. pastoris nhờ sự mở vòng vector biểu hiện
bằng enzyme hạn chế (SalI hoặc StuI) cắt trình tự tương ứng đã được thiết kế
nằm trên gene his4. Kết quả là promoter PAOX1 và gene mong muốn được tích
hợp vào hệ gen của P. pastoris tại locus HIS4. Lúc này thể biến nạp có hiểu hình
His+. Vì locus aox1 hoặc aox1:: ARG4 không liên quan đến sự tái tổ hợp này
nên kiểu hình Mut+ của chủng sau khi tái tổ hợp xảy ra giống với kiểu hình
trước khi tái tổ hợp.
2.3.4. Quá trình tiêt protein ngoai bào

P. pastoris

Các protein sau khi được tổng hợp ra thường trải qua quá trình biến đổi
sau dịch mã. Trong quá trình này, các protein được hoàn thiện về mặt cấu trúc,
hình thành các trung tâm hoạt động và tạo nên cấu trúc bền vững của protein.
Các protein tạo ra sau quá trình chế biến có thể được giữ lại trong tế bào chất
hoặc được tiết ra ngoài tế bào. Những protein được tiết ra ngoài tế bào gọi là

protein ngoại bào. Quá trình tiết của protein ngoại bào đòi hỏi phải có một trình
19

tự tiết gồm các acid amin đặc biệt hay còn gọi là tín hiệu dẫn ở đầu tận cùng N
để giúp cho protein có thể đi qua màng tế bào. Tùy thuộc vào tín hiệu dẫn khác
nhau mà protein có thể được vận chuyển đến các bào quan khác nhau hoặc được
tiết khỏi tế bào. Ở P. pastoris, trình tự tiết cho protein ngoại lai đã được sử dụng
rất có hiệu quả trong một số vector biểu hiện, nhờ đó mà một lượng lớn protein
ngoại lai đã được tiết ra ở mức độ cao, ví dụ như tín hiệu dẫn α-MF prepro gồm
khoảng 89 acid amin có nguồn gốc từ S. cerevisiae [57]. Tín hiệu này giúp
protein đi qua màng của mạng lưới nội chất dễ dàng. Trong khi chuyển vào lưới
nội chất, trình tự tiết α-MF prepro của protein se được loại bỏ khỏi sản phẩm
dịch mã sơ cấp và protein được tiết ra môi trường là các protein hoàn chỉnh. Quá
trình này đòi hỏi 3 loại enzyme phân hủy protein là: (1) peptidase cắt 19 amino
acid ở vùng pre; (2) endopeptidase được mã hóa bởi gen KEX2 se cắt amino
acid Lys và Arg ở đầu tận cùng C nối giữa α-MF prepro với protein ngoại lai;
(3) enzym dipeptide amino peptidase, sản phẩm của gen STE13, se loại bỏ gốc
Glu-Ala từ đầu tận cùng N của protein ngoại lai. Đồng thời trong khi đi vào lưới
nội chất protein ngoại bào còn trải qua sự biến đổi khác như quá trình glycosyl
hóa. Đối với P. pastoris, quá trình glycosyl hóa chuỗi polypeptide xảy ra ở nhóm
hydroxyl của Serin và Threonin. Ở động vật có vú, chuỗi oligosaccarid được gắn
bao gồm nhiều loại đường khác nhau như N-acetylgalactosamine, galactose
(Gal) và acid syalic (NeuAc). Còn ở sinh vật nhân chuẩn bậc thấp như P.
pastoris thì chuỗi oligosaccarid được gắn vào chỉ có duy nhất gốc đường
mantose.
Sau khi được chế biến trong mạng lưới nội chất, protein se được vận
chuyển đến thể Golgi, tại đây chúng se được bao gói trong các túi tiết và dung
hợp với màng tế bào để tiết ra ngoài [1].
3. Sản xuất protein tái tổ hợp trong tế bào côn trùng

Các tế bào động vật có vú khá mỏng manh và có các đòi hỏi dinh dưỡng
phức tạp. Điều này làm cho việc nuôi cấy chúng khó khăn và đắt đỏ so với tế
bào nấm men hay vi khuẩn. Tuy nhiên tế bào côn trùng khá khỏe và có thể được
20

nuôi cấy trong các môi trường đơn giản hơn các tế bào động vật. Vì vậy, các hệ
thống biểu hiện dựa vào côn trùng đã được phát triển. Những hệ thống này có
thêm thuận lợi là có thể tiến hành các biến đổi sau dịch mã giống với các hệ
thống ở tế bào động vật có vú [31].
Các vector được sử dụng trong các tế bào côn trùng hầu hết đều có nguồn
gốc từ một họ virus có tên là baculovirus, họ mà chỉ xâm nhiễm côn trùng (và
các động vật không xương có họ hàng như lớp nhện và giáp xác). Baculovirus
có kiểu hình thành hạt virus dị thường dạng polyhedrons (đa diện). Một số tế
bào bị xâm nhiễm giải phóng ra các hạt virus đơn có thể xâm nhiễm các tế bào
lân cận trong cùng cơ thể côn trùng. Nhưng khi côn trùng bị chết, các hạt virus
được giải phóng gắn vào một chất nền protein [42, 46]. Protein chất nền được
gọi là polyhedrin, và cấu trúc polyhedron bảo vệ các hạt virus khi chúng ở ngoài
môi trường. Khi được nuốt bởi các côn trùng khác, polyhedrin bị dung giải nhờ
quá trình tiêu hóa và polyhedron tách ra. Quá trình này giúp giải phóng các hạt
virus có thể xâm nhiễm các tế bào côn trùng mới.
Gene mã hóa polyhedrin có một promoter khỏe, và giai đoạn muộn của
quá trình dịch mã, protein polyhedrin được tạo ra với lượng rất lớn. Do
polyhedrin không thật sự cần thiết cho việc xâm nhiễm của virus vào tế bào côn
trùng nuôi cấy, polyhedrin promoter có thể được sử dụng để biểu hiện các
protein tái tổ hợp. Trình tự mã hóa cho polyhedrin được loại bỏ và thay bằng
cDNA mã hóa cho protein tái tổ hợp quan tâm [50].
Có rất nhiều loại baculovirus khác nhau, và loại thường được sử dụng
nhiều nhất là MNPV (multi nuclear polyhedrosis virus). Virus này xâm nhiễm
rất nhiều tế bào côn trùng và sinh sôi tốt ở nhiều dòng tế bào côn trùng nuôi cấy.

Một dòng tế bào thường được sử dụng để nhân virus này lên là loài sâu fall
armyworm (sâu keo-Spodoptera frugiperda). Sản lượng của polyhedrin-và cũng
là sản lượng của protein tái tổ hợp sử dụng polyhedrin promoter thường đặc biệt
cao trong các dòng tế bào này [54].
Do vector biểu hiện là một virus nên quá trình biến nạp được thực hiện
qua hai giai đoạn. Ở giai đoạn thứ nhất, một vector ”chuyển” được sử dụng để
21

mang cDNA của gene cần chuyển. Vector chuyển là một plasmid của E. coli
mang một đoạn DNA của MNPV virus, đoạn mà ban đầu mang cả trình tự mã
hóa polyhedrin và các trình tự liền kề chặn hai đầu (flanking region). Trình tự
mã hóa cho polyhedrin sau đó được thay bằng trình tự tạo dòng đa điểm (multi
cloning site). Khi gene ngoại lai được cài vào, nó chịu sự điều khiển của
polyhedrin promoter. Việc xây dựng tính đến thời điểm này được thực hiện ở E.
coli. Ở giai đoạn hai, đoạn chứa gene quan tâm được chuyển vào DNA của
baculovirus do đó thay thế gene polyhedrin. Để thực hiện được điều này, tế bào
côn trùng được chuyển cả vector chuyển và DNA của MNPV vào. Hiện tượng
trao đổi chéo giữa các trình tự tương đồng sau đó se tạo ra cấu trúc DNA của
baculovirus mang gene quan tâm sau polyhedrin promoter [77].
Bởi vì quy trình này đôi khi tạo ra các kết quả không như mong muốn, các
vector khác dùng cho tế bào côn trùng đã được thiết kế. Một trong số các khả
năng là dùng một vector con thoi mà có thể nhân lên như một plasmid ở E. coli
và một virus ở tế bào côn trùng. Thể lai plasmid-baculovirus như vậy gọi là
bacmid. Nó bao gồm gần như toàn bộ bộ gene của baculovirus được chèn thêm
một đoạn của plasmid từ E. coli. Đoạn này bao gồm một trình tự khởi đầu sao
chép, một gene chọn lọc và vị trí nhân dòng gene đa điểm (MCS) cắt giới hạn.
Đoạn được chèn vào thế chỗ cho gene polyhedrin của baculovirus. Gene chuyển
được đưa vào vị trí MCS và tạo nên một bacmid tái tổ hợp. Bacmid sau đó được
tách, tinh sạch và chuyển vào tế bào côn trùng, nơi mà nó có thể được nhân lên

như một virus.
Baculovirus tái tổ hợp này sau đó có thể được cho xâm nhiễm các dòng tế
bào nuôi cấy để tổng hợp ra protein tái tổ hợp mong muốn sau vài ngày. Đã có
vài trăm protein của sinh vật nhân chuẩn đã được sản xuất thành công nhờ hệ
thống baculovirus/côn trùng. Phần đông trong số này được xử lý và cải biến
đúng sau dịch mã.
Nhiều protein của sinh vật nhân chuẩn được đường hóa sau dịch mã. Đó
là quá trình mà chúng được gắn thêm các gốc là dẫn xuất của đường. Quá trình
đường hóa là cần thiết cho chức năng của một số protein.
22

Một thuận lợi khi biểu hiện protein tái tổ hợp của sinh vật nhân chuẩn ở tế
bào côn trùng là chúng có một hệ thống/con đường đường hóa. Con đường
đường hóa sau dịch mã tại các amino acid arginine ở động vật có vú và côn
trùng là giống nhau khi thêm gốc manose. Tuy nhiên các con đường chuyển hóa
khác lại khác nhau. Hiện nay đã có các dòng tế bào côn trùng đã được cải biến
gene để biểu hiện toàn bộ con đường đường hóa ở động vật có vú [50].
Tuy nhiên, các côn trùng thường không gắn galactoza hay sialic acid tận
cùng vào các glycoprotein liên kết N. Vì vậy, hệ thống baculovirus không thể sử
dụng để sản xuất một số glycoprotein động vật có vú quan trọng. Ngoài ra, trong
nhiều trường hợp, một protein tái tổ hợp không được xử lý chính xác từ tiền chất
có kích thước lớn và bất hoạt thành dạng hoạt động trong tế bào côn trùng.
4. Sản xuất protein tái tổ hợp trong tế bào động vật có vú
Các hệ thống biểu hiện trong tế bào động vật có vú có vai trò quan trọng
để sản xuất các protein tái tổ hợp với đầy đủ các biến đổi sau dịch mã. Các tế
bào có nguồn gốc từ thận khỉ xanh châu Phi (COS), thận chuột hamter non
(BHK) và thận phôi người (HEK-239) được sử dụng để biểu hiện gene tạm thời
để tạo nhanh một lượng nhỏ protein tái tổ hợp. Các tế bào buồng trứng chuột
hamster Trung Quốc (CHO) thường được sử dụng để biểu hiện ổn định và sản

xuất lượng lớn các protein tái tổ hợp [7].
Một vector biểu hiện của động vật có vú thường chứa một vùng khởi đầu
sao chép nhân chuẩn, thường là từ một virus động vật (virus khỉ SV40). Các
trình tự promotor điều khiển các gene nhân dòng và gene đánh dấu chọn lọc,
cùng với các trình tự kết thúc phiên mã đều phải của nhân chuẩn và thường sử
dụng virus người (cytomegalovirus, SV40, virus hecpes đơn hình) hoặc từ các
gene của động vật có vú (-actin, metallothionein, thymidin kinase, hormone sinh
trưởng bò). Sự biểu hiện của một gene quan tâm được tăng cường bằng cách
thêm một intron giữa promotor và vùng nhân dòng (caset). Một intron lai (chứa
các vị trí cắt nối cho và nhận từ hai gene khác nhau) có hiệu quả trong nhiều
dòng tế bào khác nhau. Các trình tự cần cho việc chọn lọc và nhân bản của
23

vector biểu hiện của động vật có vú trong E. coli thường có nguồn gốc từ một
vector nhân dòng chuẩn của E. coli như pBR322 [10, 31].

Hình 1.10. Cấu trúc vector biểu hiện ở động vật có vú

Đa số các vector biểu hiện trong tế bào động vật có vú thường mang một
gene quan tâm duy nhất mã hoá cho một polypeptide có chức năng mong muốn.
Tuy nhiên, hai vector biểu hiện khác nhau, mỗi vector mang một gene hoặc
DNA của một trong các tiểu phần và một gene đánh dấu chọn lọc khác nhau, có
thể được đồng chuyển nhiễm vào trong tế bào chủ. Tuy nhiên, thường xảy ra
hiện tượng mất một trong hai vector đối với tế bào chuyển nhiễm kép. Ngoài ra,
số lượng bản sao của hai vector thường không bằng nhau, vì vậy một tiều phần
được tạo ra nhiều hơn tiểu phần còn lại và sản lượng của sản phẩm cuối cùng
giảm xuống [35, 50].

24

Hình 1.11. Hệ thống biểu hiện hai vector

Để khắc phục, người ta đã sử dụng một vector duy nhất mang hai gene
nhân dòng, được đặt dưới sự điều khiển của các promotor và các tín hiệu
polyadenyl hoá độc lập (vector caset kép). Tuy nhiên, nhìn chung việc thiết kế
một vector biểu hiện có hiệu quả của động vật có vú mất rất nhiều thời gian và
yêu cầu để đạt được quá trình sản xuất protein tối ưu.

25

Các hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp

Tài liệu liên quan

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về