So sánh các hệ thống biểu hiện PROTEIN tái tổ hợp

Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved
Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik. 2010. Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press
1

PROTEIN TÁI TỔ HỢP
PROTEIN VÀ CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP
Nghiên cứu về hệ enzyme đã mở ra cánh cửa cho việc xác định các protein có khả
năng ứng dụng trong điều trị bệnh. Khi đã được xác định, những protein này cần được
nghiên cứu kỹ, bao gồm việc biểu hiện protein ở các sinh vật mẫu nhờ sử dụng các kỹ
thuật DNA. Một số protein sẽ trở thành thuốc chữa bệnh và một lượng lớn các protein
này ở dạng tinh sạch sẽ có cầu lớn.
Khi một gene được nhân dòng, protein mã hóa bởi nó có thể được sản xuất với số
lượng lớn khá dễ dàng. Một số protein tái tổ hợp như vậy được trình bày trong bảng 1.
Các phân tử có bản chất không phải là protein, có kích thước nhỏ hơn, lại cần cả nửa tá
các protein (enzyme) lần lượt xúc tác tổng hợp nên chúng.
Việc biểu hiện một gene để sản xuất lượng lớn protein gặp nhiều vấn đề rắc rối
hơn so với việc sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm. Càng có nhiều bản sao của một
gene trong một tế bào thì mức độ biểu hiện sản phẩm của gene càng cao. Do đó, việc đưa
gene vào một plasmid có nhiều bản sao trong mỗi tế bào sẽ cho năng suất sản phẩm cao
hơn. Tuy nhiên, plasmid có số bản sao lớn lại thường không ổn định và thường thất thoát,
đặc biệt trong các mẻ nuôi cấy ở quy mô công nghiệp có mật độ cao. Một phương pháp
để ngăn chặn sự thất thoát plasmid là đưa gene ngoại sinh cài vào nhiễm sắc thể của tế
bào chủ. Cái giá của sự ổn định gene ngoại sinh là số lượng của gene trong mỗi tế bào giờ
chỉ là 01. Các nhà khoa học đã cố gắng để đưa nhiều bản sao của một gene ngoại sinh
nằm liên tiếp nhau vào nhiễm sắc thể tế bào chủ. Tuy nhiên sự có mặt của nhiều bản sao
một gene lại tạo ra sự không ổn định do sự tái tổ hợp giữa các trình tự DNA tương đồng.
Bảng 1. một số protein tái tổ hợp
Protein Chức năng
Erythropoetin Thúc đẩy hình thành tế bào hồng cầu trong
việc điều trị bệnh thiếu máu
Yếu tố đông máu VIII (factor VIII) Giúp hình thành cục máu đông ở những

bệnh nhân bị bệnh máu khó đông
Filgrastim và sargramostim (các yếu tố tủy
thúc đẩy hình thành tế bào máu)
Làm tăng bạch cầu sau khi xạ trị hay ghép
tạng
Isulin Chữa trị bệnh đái tháo đường (diabetes)
Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved
Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik. 2010. Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press
2

Interferon (alpha) Trị bệnh viêm gan B và C, bệnh mụn rộp ở
cơ quan sinh dục, một số ung thư bạch cầu
và ung thư khác
Interferon (beta) Điều trị các chứng sơ cứng. Clerosis
Interferon (gamma) Điều trị u hạt
Interleukin-2 Tiêu diệt tế bào ung thư
Samato tropin Điều trị bệnh thiếu hụt hormone sinh
trưởng
t-PA (protein hoạt hóa plasminogen mô) Làm tan cục máu đông để ngừa và giảm tác
hại của cơn đau tim.

BIỂU HIỆN CÁC PROTEIN CỦA SINH VẬT NHÂN CHUẨN Ở VI KHUẨN
Việc thành bại khi biểu hiện một gene tái tổ hợp phụ thuộc vào một số yếu tố.
Hiển nhiên là các gene từ vi khuẩn thường được biểu hiện thành công khi đưa một vector
nhân dòng (cloning vector) mang gene vào trong các tế bào vi khuẩn, miễn là chúng nằm
sau các promoter vi khuẩn thích hợp. Các plasmid đặc biệt chuyên dụng cho việc biểu
hiện gene (expression vector) thường được sử dụng để tăng cường biểu hiện gene. Chúng
có một promoter mạnh điều khiển sự biểu hiện của gene chuyển vào. Các vector biểu
hiện cũng mang các gene kháng kháng sinh cho phép chọn lọc vector và do đó chọn lọc
protein tái tổ hợp. Ngoài ra, chúng phải có vùng khởi đầu sao chép (origin of replication)

thích hợp với tế bào chủ.
Việc biểu hiện các protein của sinh vật nhân chuẩn thường rắc rối hơn. Mặc dù
các tế bào nhân chuẩn có thể được sử dụng để biểu hiện các protein này, vi khuẩn lại dễ
nuôi và dễ thực hiện các thao tác gene hơn. Do vậy, luôn có nhu cầu biểu hiện các protein
từ sinh vật nhân chuẩn ở các tế bào vi khuẩn. Bởi vì các promoter của sinh vật nhân
chuẩn không hoạt động ở tế bào vi khuẩn nên cần phải cung cấp một promoter vi khuẩn.
Ngoài ra, các vi khuẩn không thể cắt các đoạn intron ra khỏi mRNA; do đó người ta phải
sử dụng quy trình chuẩn để nhân dòng gene từ cDNA tổng số không chứa intron. Trong
thực tế, gene ở dạng cDNA được sử dụng rộng rãi, cả trong hệ thống biểu hiện tế bào
nhân chuẩn, không chỉ để tránh rắc rối trong việc xử lý mRNA mà còn bởi vì lượng DNA
ít hơn rất nhiều nên dễ thao tác hơn.
Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved
Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik. 2010. Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press
3

Thậm chí nếu một gene tái tổ hợp được phiên mã nhiều, việc dịch mã để tạo ra
protein tương ứng có thể bị hạn chế ở giai đoạn tổng hợp protein. Các phân tử mRNA
được dịch mã với hiệu quả khác nhau, liên quan đến một số yếu tố:
(a) lực của tương tác giữa ribosome và vị trí bám của ribosome
(b) Độ bền của mRNA và/hoặc cấu trúc bậc hai của mRNA
(c) Việc sử dụng các codon (codon usage)
Ngoài các vector biểu hiện chuẩn, các vector tinh vi được tạo ra để tối ưu những
khía cạnh khác của việc biểu hiện protein. Trong chương này chúng ta sẽ thảo
luận về việc sử dụng các vector dịch mã và các vector dung hợp để làm tăng
cường tổng hợp một protein tái tổ hợp từ một gene chuyển.

VECTOR BIỂU HIỆN DỊCH MÃ
Ribosome vi khuẩn bám vào mRNA thông qua việc nhận biết vị trí bám
ribosome (ribosome binding site-RBS - ở vi khuẩn được biết như là trình tự
Shine-Dalgarno). RBS bắt cặp bổ sung với trình tự AUUCCUCC trên phân tử

rRNA 16S của tiểu phần bé ribosome. Trình tự RBS càng giống với trình tự bảo
thủ ( UAAGGAGG) thì sự lắp ráp ribosome vào mRNA càng hiệu quả và chặt
chẽ. Nói chung, nó làm tăng hiệu quả của quá trình khởi đầu dịch mã. Ngoài ra để
việc dịch mã xảy ra tối ưu, RBS phải được thiết kế nằm đúng khoảng cách tới bộ
ba mã khởi đầu, AUG.
Vector biểu hiện (expression vector) được thiết kế để tối ưu việc biểu
hiện gene ở mức độ phiên mã. Tuy nhiên, vector biểu hiện dịch mã (translation
expression vector) có thể được thiết kế để tối đa hóa quá trình khởi đầu dịch mã.
Những vector này mang một trình tự RBS bảo thủ và một mã bộ ba khởi đầu
ATG ở vị trí tối ưu (cách 8 bp) về phía sau của RBS. Gene cần chuyển vào được
chèn vào vị trí tạo dòng gối lên bộ ba mã khởi đầu. Enzyme giới hạn NcoI rất
thuận tiện bởi vì nó nhận biết trình tự C/CATGG, bao gồm cả ATG. Do đó có thể
chèn một gene vào sao cho codon ATG trùng với ATG của vector biểu hiện dịch
mã. Gene được cắt bằng NcoI ở đầu 5’ của nó và bằng một enzyme giới hạn thuận
tiện khác ở đầu 3’ của nó. Nếu cần thiết, Một vị trí cắt của NcoI nhân tạo có thể
được đưa vào gene thông qua đột biến điểm định hướng bằng PCR.
Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved
Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik. 2010. Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press
4

Vector biểu hiện dịch mã cũng mang một gene chọn lọc thuận tiện, thường
là kháng ampicillin hay một kháng sinh khác nào đó, và một promoter khỏe có thể
điều khiển ở mức phiên mã. Sau vị trí đưa gene vào là hai hay ba trình tự kết thúc
phiên mã khỏe để ngăn việc phiên mã các gene plasmid.
Mặc dù các vector biểu hiện phiên mã có thể tối ưu việc khởi đầu dịch mã,
chúng không kiểm soát được các yếu tố khác, thuộc về đặc tính của các trình tự
mỗi gene, đã liệt kê ở phần trước. Cấu trúc bậc hai của phân tử mRNA có thể có
ảnh hưởng đáng kể tới mức độ dịch mã. Nếu mRNA gấp lại sao cho RBS và/hoặc
bộ ba mã khởi đầu bị khóa, khi đó quá trình dịch mã sẽ bị cản trở. Đặc biệt, trình
tự của vài codon đầu trong trình tự mã hóa phải được kiểm tra khả năng bắt cặp

với vùng xung quanh RBS. Nếu cần thiết thì các bazơ ở vị trí thứ 3 (Bazơ suy
biến) có thể được thay đổi để loại trừ khả năng bắt cặp như vậy. Đạt được tình
trạng dịch mã tích cực là chìa khóa trong việc làm bền mRNA bởi vì bất cứ
mRNA nào không được dịch mã mạnh đều trở thành đối tượng của việc phân hủy
mRNA, điều này làm giảm năng xuất của protein tương ứng.

CÁC ẢNH HƯỞNG CỦA THIÊN HƯỚNG SỬ DỤNG CODON
Khi gene từ một sinh vật được biểu hiện ở các tế bào chủ khác, vấn đề
phức tạp có thể xảy ra từ việc sử dụng các codon để dịch mã. Do mã bộ ba có hiện
tượng thoái hóa nên một amino acid có thể được mã hóa bởi nhiều mã bộ ba. Như
vậy, mặc dù trình tự amino acid trong một phân tử protein là cố định, vẫn có sự
lựa chọn khác nhau về các mã bộ ba cho nó. Trong thực tế, các sinh vật khác nhau
ưa chuộng các codon khác nhau mã hóa cho cùng một amino acid. Ví dụ, amino
acid lysine được mã hóa bởi AAA hay AAG. Ở E. coli, AAA được sử dụng trong
75% trường hợp và AAG chỉ được sủ dụng trong 25% trường hợp. Ngược lại,
Rhodobacter lại sử dụng cặp codon này theo thiên hướng đối lập và sử dụng AAG
trong 75% trường hợp cần mã hóa cho lysine, mặc dù E. coli và Rhodobacter đều
là vi khuẩn gram âm.
Các mã bộ ba được đọc bởi tRNA. Khi một tế bào hiếm khi sử dụng một
mã bộ ba nào đó, nó có lượng ít hơn tRNA dùng để đọc codon hiếm đó. Do đó
nếu một gene có nhiều condon AAA được đưa vào trong một tế bào hiếm khi sử
Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved
Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik. 2010. Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press
5

dụng AAA để mã hóa lysine, sẽ xảy ra hiện tượng thiếu hụt tRNA so với nhu cầu
và làm chậm quá trình tổng hợp protein lại.
Như vậy để tối ưu hóa việc sản xuất protein tái tổ hợp, thiên hướng sử
dụng codon phải được cân nhắc. Mặc dù tốn rất nhiều thời gian và công sức, các
gene có thể được thay đổi trong trình tự DNA để thay đổi rất nhiều các bazơ ở vị

trí thứ 3 trong các codon thoái hóa. Việc này được thực hiện bằng việc tổng hợp
nhân tạo và lắp ráp (đột biến điểm định hướng và fusion PCR). Các gene đã được
tối ưu hóa cho các các sinh vật chủ mới có thể tăng năng suất biểu hiện lên 10 lần
do tốc độ ribosome kéo dài chuỗi polypeptide tăng lên. Cách tiếp cận này đã
thành công đối với các độc tố côn trùng, có nguồn gốc từ Bacillus thuringiensis,
khi chuyển gene vào thực vật.
Một hướng tiếp cận tốn ít công sức và kỹ thuật sâu hơn để giải quyết thiên
hướng sử dụng codon khác nhau là cung cấp các tRNA hiếm. Các codon hiếm
nhất không được sử dụng bởi vì thiếu hụt nguồn cung các tRNA tương ứng. Ví
dụ, các codon hiếm nhất ở E. coli như AGG và AGA, đều mã hóa cho arginine và
chỉ chiếm lượng tương ứng là 0,14% và 0,21%. argU gene mã hóa cho tRNA đọc
được cả AGA và AGG. Nếu gene này được đưa vào trong một plasmid của tế bào
chủ E. coli, sẽ không còn hiện tượng thiếu hụt nguồn cung tRNA để đọc các
codon hiếm nữa và protein tái tổ hợp có thể được tạo ra. Các plasmid mang gene
cho tất cả các tRNA tương ứng với các codon hiếm đã được bán rộng rãi trên thị
trường. Những plasmid này có đoạn khởi đầu sao chép p15A giúp nó tương thích
với hầu hết các vector biểu hiện, những vector thường có đoạn khởi đầu sao mã
ColE1.

TRÁNH CÁC TÁC DỤNG GÂY ĐỘC CỦA VIỆC BIỂU HIỆN NHIỀU
PROTEIN TÁI TỔ HỢP
Mặc dù luôn mong muốn đạt năng xuất cao, việc sản xuất một lượng lớn
protein tái tổ hợp có thể làm phương hại đến tế bào chủ. Ở vi khuẩn, khi quá
nhiều protein được tạo ra trong thời gian ngắn chúng sẽ hình thành các thể vùi
(inclusion bodies). Đây là những tinh thể đậm đặc của các protein cuộn gấp sai
không thể hoạt động chức năng. Do đó các hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp
Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved
Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik. 2010. Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press
6

có các đặc tính kiểm soát khi nào và bao nhiêu protein tái tổ hợp sẽ được tạo ra.
Hai hệ thống biểu hiện thông thường là pET và pBAD ở E. coli. Các hệ thống
biểu hiện này có cơ chế để bật hay tắt quá trình tổng hợp protein tái tổ hợp, và hệ
thống pBAD cũng có thể kiểm soát lượng protein được biểu hiện.
pET vector có promoter lai T7/lac, vị trí đa nhân dòng (multi cloning site),
và trình tự kết thúc T7. Việc phiên mã từ promoter lai T7/lac đòi hỏi phải có T7
RNA polymerase. Tế bào E. coli chủ có gene mã hóa cho T7 RNA polymerase
được đưa vào nhiễm sắc thể bằng công nghệ gene, nhưng protein kìm hãm lac
operon, lacI, ức chế biểu hiện gene này. Khi IPTG được thêm vào, nó cảm ứng
việc giải phóng lacI ra khỏi operator của lac operon và quá trình phiên mã được
bắt đầu. T7 RNA polymerase sau đó được tạo ra và bám vào promoter lai T7/lac,
và protein tái tổ hợp được sản xuất.
Hệ thống pBAD dựa vào arabinose operon. Nó được cảm ứng bởi
arabinose, chất mà sẽ gắn vào protein điều hòa AraC. AraC đã hoạt hóa rời vị trí
O2 (xem hình 10.5 ở tài liệu gửi kèm) và bám vào vị trí I. Việc này làm hoạt hóa
sự phiên mã của gene được chuyển. Hệ thống pBAD được điều hòa bởi lượng
arabinose thêm vào môi trường nuôi cấy. Nếu cần rất nhiều protein tái tổ hợp,
nhiều arabinose sẽ được thêm vào. Tuy nhiên nếu protein tái tổ hợp là độc đối với
tế bào chủ, lượng ít hơn arabinose sẽ được thêm vào, và có ít protein tái tổ hợp
hơn được tạo ra. Hiệu ứng này dựa vào môi trường nuôi cấy chứ không phải dựa
vào tế bào chủ. Mỗi tế bào sản xuất protein tái tổ hợp theo kiểu „tất cả hoặc không
có gì “. Nồng độ arabinose thấp không hoạt hóa tất cả các tế bào trong môi trường
nuôi cấy, trong khi nồng độ arabinose cao lại làm việc đó“.

LÀM TĂNG ĐỘ BỀN CỦA PROTEIN
Các protein khác nhau khác biệt rất lớn về độ bền. Đời sống của một
protein trong tế bào phụ thuộc vào tốc độ các protease nội bào phân hủy nó.
Không kể cấu trúc 3D tổng thể của phân tử protein, có hai yếu tố ảnh hưởng đến
tốc độ phân hủy một phân tử protein. Các yếu tố này được tin là có thể làm thay
đổi khả năng nhận biết các protein của các bộ máy phân hủy.

Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved
Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik. 2010. Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press
7

(a) Đặc điểm và thành phần các amino acid đầu N có ảnh hưởng lớn đến
thời gian bán hủy của protein. Mặc dù ban đầu tất cả các polypeptide
đều bắt đầu bằng methinonine ở đầu N, rất nhiều protein được cải biến
sau đó. Do vậy thành phần amino acid đầu N của phân tử protein khác
nhau rất lớn. Quy luật đầu N được thể hiện trong bảng 2.
(b) Sự có mặt của một số trình tự nằm trong phân tử protein làm cho nó
kém bền đi rất nhiều. Trình tự PEST gồm 10 đến 60 amino acid giàu
proline (P), glutamic acid (E), serine (S) và threonine (T). Trình tự
PEST tạo thành một vùng (domain) dễ dàng nhận biết bởi các
protease.
Việc thay đổi trình tự amino acid đầu N của các protein tái tổ hợp là công việc
khá đơn giản. Một đoạn DNA tổng hợp nhân tạo mã hóa cho trình tự amino acid
đầu N mới có thể được đưa vào bằng các kỹ thuật cơ bản, ví dụ như PCR. Hiệu
quả của việc cải biến đầu N này đã được chứng minh với enzyme beta-
galactosidase tái tổ hợp. Việc thay đổi trình tự PEST mà không phá hỏng cấu trúc
và chức năng của phân tử protein thường khó khăn hơn. Mặc dù, về mặt lý thuyết,
việc làm này có thể làm tăng mạnh độ bền và năng suất của protein tái tổ hợp.

Bảng 2: Quy luật đầu N đối với độ bền của phân tử protein
Amino acid đầu N Thời gian bán hủy (phút)
Met. Gly, Ala, Ser, Thr, Val 120
Ile, Glu, Tyr 30
Gln, Pro 10
Leu, Phe, Asp, Lys, Arg 2-3

Trong một vài trường hợp, các protein, mà bình thường sẽ bền nếu cuộn

gấp đúng, lại cuộn gấp sai. Các protein cuộn gấp sai kết tụ thành thể vùi có thể
quan sát được bằng kính hiển vi. Thể vùi thường được hình thành khi các protein
tái tổ hợp tan kém hoặc được tạo ra quá nhanh. Một phương pháp để tránh việc
kết tụ của protein tái tổ hợp là cung cấp các chaperone phân tử giúp cuộn gấp các
protein tái tổ hợp chính xác. Các chaperone bám vào các protein tái tổ hợp ngay
Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved
Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik. 2010. Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press
8

khi nó mới được tổng hợp và giữ nó ở dạng không cuộn gấp cho đến khi quá trình
dịch mã hoàn tất. Sau đó các protein có thể cuộn gấp đúng hình dạng vốn có.

CẢI THIỆN KHẢ NĂNG TIẾT PROTEIN TÁI TỔ HỢP
Sau khi protein tái tổ hợp được tổng hợp ở trong E. coli, nó có thể ở trong
tế bào chất, ở gian bào giữa màng trong và màng ngoài (periplasm) hay được tiết
ra môi trường nuôi cấy. Việc tiết qua màng trong, màng sinh chất, được quy định
bởi trình tự amino acid tín hiệu kỵ nước đầu N của phân tử protein mới được tổng
hợp. Trình tự tín hiệu sẽ được cắt đi sau khi quá trình xuất bào kết thúc bởi
peptidase tín hiệu hay peptidase cắt đầu dẫn (leader peptidase). Mặc dù các vi
khuẩn như E. coli xuất ít loại protein, vẫn tồn tại các hệ thống tiết giúp xuất bào
các protein qua cả hai màng vào trong môi trường nuôi cấy.
Rõ ràng nó dễ dàng hơn khi tinh sạch một protein tiết so với một protein
trong tế bào chất cùng với đa phần là rất nhiều protein của tế bào chủ. Mặt khác,
nhiều protein kém bền trong môi trường ngoại bào và/hoặc tiếp xúc với không
khí. Nói chung các protein như vậy thường không được sử dụng trong công nghệ
sinh học do chúng khó khăn để tinh sạch và sử dụng. Hầu hết các protein và
enzyme được chọn cho các ứng dụng thực tế đều khá bền khi ở ngoài tế bào. Mục
tiêu chuẩn là sắp xếp cho chúng được tiết để giúp tách và tinh sạch. Có vài cách
tiếp cận để giải quyết yêu cầu này:
(a) Một trình tự tín hiệu được gắn vào gene cần chuyển. Kết quả là protein tái tổ

hợp sẽ có một trình tự tín hiệu đầu N khi mới được tổng hợp. Trình tự này sẽ
quy định việc tiết vào gian bào bằng hệ thống tiết chung. Tế bào vi khuẩn sau
đó sẽ được thu hoạch và xử lý loại bỏ hay thay đổi tính thấm của màng ngoài
nhằm giải phóng protein tái tổ hợp.
Rắc rối chủ yếu là lượng lớn protein tái tổ hợp có thể làm quá tải hệ thống tiết
và kết tụ thành dạng thể vùi. Một lượng lớn protein tái tổ hợp có thể tích tụ
trong tế bào chất cùng với trình tự tín hiệu vẫn đính trên đó. Việc tiết đôi khi
được tăng cường mạnh bởi việc nâng hàm lượng các protein của hệ thống tiết
(Sec proteins). Các bản sao thêm của các gene sec có thể được đưa vào và cho
Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved
Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik. 2010. Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press
9

biểu hiện trên các plasmid để làm tăng lượng protein. Các chủng E. coli đột
biến cũng đã được phát triển để tăng tiết protein.
(b) Protein tái tổ hợp có thể được dụng hợp với một protein thường được tiết của
vi khuẩn. Protein bám maltose của vi khuẩn E. coli được tiết một cách hiệu
quả vào gian bào và là protein mang được ưa chuộng cho các protein tái tổ
hợp. Protein mang sau đó sẽ được cắt ra khỏi protein tái tổ hợp nhờ protease.
Kỹ thuật này đặc biệt hữu dụng cho các peptide ngắn, bao gồm nhiều loại
hormone và yếu tố sinh trưởng (growth factor), những chất mà thường kém
bền khi đứng một mình.
(c) Gene quan tâm có thể được biểu hiện ở vi khuẩn gram dương, như Bacillus, là
những vi khuẩn không có màng ngoài. Kết quả là protein tái tổ hợp được tiết
thẳng ra ngoài môi trường nuôi cấy. Mặc dù tiện lợi, di truyền học về Bacillus
còn chưa được nghiên cứu tường tận như về E. coli. Tế bào động vật có thể là
một sự thay thế bởi vì chúng chỉ có một màng sinh chất, và như vậy có thể tiết
trực tiếp protein tái tổ hợp vào môi trường.
(d) Việc tiết qua cả hai màng của vi khuẩn gram âm như E. coli có thể thực hiện
được nhờ các hệ thống tiết chuyên biệt. Hầu hết trong số các hệ thống tiết này

được sử dụng tự nhiên để tiết các độc tố bởi các chủng vi khuẩn gây bệnh. Do
vậy hệ thống tiết loại I xuyên qua cả hai màng trong và ngoài và được sử
dụng để tiết hemolysin bởi các chủng E. coli gây nhiễm trùng đường tiết niệu.
hệ thống tiết loại II chỉ xuyên qua màng ngoài. Do vậy việc tiết ra ngoài môi
trường cần một hệ thống tiết chung ( ví dụ như hệ thống Sec) để xuất protein
qua màng trong trước. Thường thì quá trình hai bước này được sử dụng bởi
Pseudomonas để tiết exotoxin A.
Các chủng E. coli biến đổi gene để triển khai các hệ thống xuất thay đổi này đang
được đưa vào sử dụng. Trong những trường hợp này, cần phải thay đổi protein
được tiết sao cho nó được nhận biết bởi hệ thống xuất được lựa chọn. Cải biến
gene với các trình tự tín hiệu thích hợp cho phép protein được nhận biết và được
xuất bào.


Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved
Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik. 2010. Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press
10

VECTOR BIỂU HIỆN PROTEIN DUNG HỢP
Việc nối hai trình tự mã hóa của hai protein lại với nhau đúng khung đọc sẽ tạo ra
một protein dung hợp. Kết quả là, một polypeptide đơn dài hơn được tạo ra trong quá
trình dịch mã. Nếu protein đầu tiên (đầu N) là protein tiết thì protein dung hợp cũng sẽ là
protein tiết. Do đó có thể tiết protein tái tổ hợp bằng việc dung hợp với một protein tiết
khác.
Vevtor protein dung hợp là một plasmid cho phép gene quan tâm dung hợp với
gene mã hóa cho một protein mang thích hợp. Lựa chọn này giúp tinh sạch protein tái tổ
hợp dễ dàng hơn. Ngoài ra, vector đó phải có một trình tự bám của ribosome giống với
trình tự bảo thủ cho phép việc dịch mã hiệu quả. Một trong các ví dụ điển hình nhất là
protein MalE của E. coli. Đây là protein thường được tiết vào gian bào, nơi nó vận
chuyển maltose từ màng ngoài tới màng trong. Gắn ái lực vào giá thể nhựa có amylose sẽ

giúp tinh sạch MalE dễ dàng.
Gene quan tâm được đưa vào sau và cùng khung đọc của trình tự mã hóa cho
MalE. Giữa các trình tự mã hóa là một vị trí cắt của một protease, cho phép protein dung
hợp được cắt ra sau khi dịch mã. Một promoter mạnh cũng được cung cấp để tối đa hóa
việc tạo ra protein. Sau khi biểu hiện protein, tất cả protein quan tâm sẽ được thu hoạch
từ gian bào. Nó sẽ được cho chảy qua một cột amylose để bắt giữ MalE dung hợp. Để
giải phóng gene quan tâm khỏi cột, một protease thích hợp được thêm vào. Cuối cùng,
protease được loại bỏ khỏi mẫu protein tái tổ hợp bằng một cột bám đặc hiệu với nó.
Có nhiều hệ thống biểu hiện protein dung hợp khác được sử dụng, lợi dụng việc
bám đặc hiệu của His6, FLAG, hay GST để hỗ trợ việc tinh sạch protein (xem thêm
chương trước). Có một hệ thống tiết protein tái tổ hợp dung hợp tinh vi khác sử dụng
enzyme beta-lactamase gian bào. Beta-lactamase domain bám vào borate. Điều này cho
phép gắn protein dung hợp thông qua giá thể nhựa gắn phenyl-boronate và đẩy protein
dung hợp ra khỏi cột bằng borate hòa tan.

BIỂU HIỆN PROTEIN BẰNG CÁC TẾ BÀO NHÂN CHUẨN
Mặc dù các tế bào vi khuẩn biểu hiện thành công rất nhiều protein từ tế bào nhân
chuẩn, vẫn có những trường hợp protein tái tổ hợp được biểu hiện tốt nhất ở các tế bào
nhân chuẩn. Một số protein nhân chuẩn không bền hay bất hoạt sau khi được biểu hiện ở
Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved
Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik. 2010. Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press
11

vi khuẩn. Điều này đặc biệt đúng với những protein cần sự biến đổi sau dịch mã
(posttranslational modification).
Có nhiều loại biến đổi sau dịch mã ở nhân chuẩn xảy ra sau khi chuỗi polypeptide
đã được tạo ra. Chúng bao gồm:
(a) Biến đổi hóa học tạo thành amino acid mới trong chuỗi polypeptide.
(b) Hình thành cầu nối disulfide giữa hai gốc cysteine đúng (ví dụ insulin).
(c) Đường hóa (glycosylation), là quá trình thêm gốc đường vào các vị trí nhất định

trên phân tử protein. Rất nhiều protein trên bề mặt tế bào được đường hóa và sẽ
không lắp ráp chính xác lên màng hay hoạt động chức năng được nếu thiếu thành
phần đường.
(d) Gắn thêm nhiều loại nhóm chức khác nhau như các chuỗi acid béo, các nhóm
acetyl, phosphate và sulfate.
(e) Cắt tiền chất protein. Việc này có thể xảy ra ở vài bước như được minh họa bởi
insulin. Việc cắt bỏ này có thể liên quan đến việc tiết, cuộn gấp đúng và/hoặc hoạt
hóa protein.
Các enzyme cần cho quá trình cải biến và xử lý thường vắng mặt trong tế bào vi
khuẩn, nên cần phải biểu hiện chúng trong tế bào nhân chuẩn. Các enzyme xử lý sau
dịch mã có liên quan thường hiện diện ở một loạt sinh vật bậc cao; do đó rất ít trường
hợp cần biểu hiện protein tái tổ hợp ở đúng sinh vật đó. Ở đây chúng ta quan tâm đến
việc sản xuất protein ở tế bào nuôi cấy. Tuy nhiên, người ta có thể biến đổi gene của
toàn bộ một động vật hay thực vật để sản xuất protein tái tổ hợp. Thuận lợi tiếp theo
trong việc sử dụng hệ thống biểu hiện protein của sinh vật nhân chuẩn loại bỏ được
nguy cơ nhiễm tạp các protein vi khuẩn. Mặc dù được tinh sạch, các protein vi khuẩn
tồn dư với lượng rất nhỏ sẽ gây độc hay sẽ kích hoạt hệ thống miễn dịch của sinh vật
nhân chuẩn, gây sốt.
Các vector con thoi (shuttle vector) được thiết kế để di chuyển gene qua lại giữa
các nhóm sinh vật khác nhau. Bởi vì thao tác gene ở tế bào nhân chuẩn khó khăn hơn
nên hầu hết các vector biểu hiện ở nhân chuẩn là vector con thoi. Những vector như
vậy cho phép việc cải biến gene diễn ra ở vi khuẩn, thường là E. coli, và cho phép
chuyển vào các sinh vật khác để biểu hiện gene. Chúng ta sẽ xem xét tế bào nấm men,
côn trùng và động vật có vú như là những hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp.
Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved
Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik. 2010. Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press
12

BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN
Nấm men Saccharomyces cerevisiae được sử dụng như một sinh vật nhân chuẩn

mẫu trong nghiên cứu sinh học phân tử. Bộ gene của nấm men đã được giải trình tự
và nhiều gene đã được nghiên cứu đặc điểm. Dưới góc độ công nghệ sinh học, vài
yếu tố tạo thành ưu thế của nấm men trong việc biểu hiện một số protein nhân chuẩn
tái tổ hợp.
(a) Nấm men có thể nuôi dễ dàng cả ở quy mô nhỏ lẫn các nồi lên men sinh học lớn.
(b) Sau nhiều ngàn năm sử dụng để lên men rượu bia và bánh mỳ, nấm men được
công nhận là sinh vật an toàn với con người. Chúng có thể được dùng để biểu hiện
các protein dùng trong y học mà không cần sự chấp thuận thêm của các nhà quản
lý.
(c) Nấm men tiết rất ít protein. Do vậy nếu biến đổi gene để nó có thể sản xuất một
protein tái tổ hợp tiết ra môi trường thì việc tinh sạch sẽ dễ dàng.
(d) Nấm men có thể được chuyển gene vào dễ dàng nhờ nhiều phương pháp khác
nhau sau khi đã phân hủy thành tế bào bằng enzyme hay các chất hóa học, hay tạo
lỗ nhờ sung điện.
(e) Nấm men có plasmid 2 micron tự nhiên để làm cơ sở cho việc thiết kế các vector
biểu hiện.
(f) Nhiều promoter của nấm men đã được nghiên cứu kỹ và có thể dùng để kiểm soát
việc biểu hiện protein tái tổ hợp.
(g) Mặc dù là sinh vật nhân chuẩn đơn bào nguyên thủy, nấm men vẫn thực hiện
nhiều quá trình biến đổi protein sau dịch mã đặc trưng cho sinh vật nhân chuẩn,
như thêm các gốc đường (quá trình glycosylation). Tuy nhiên nấm men chỉ đường
hóa các protein tiết.
Protein tái tổ hợp có thể thiết kế để được tiết bởi nấm men. Thêm một trình tự tín hiệu
tiết vào đầu N sẽ ra tín hiệu cho tế bào tiết protein tái tổ hợp. Trình tự tín hiệu được
sử dụng là từ gene mã hóa cho yếu tố giới tính alpha (mating factor alpha), một
protein thường được tiết. Peptidase cắt tín hiệu của nấm men nhận biết trình tự Lys-
Arg và cắt đoạn peptide tín hiệu khi protein đã đi qua màng. Do vậy cần đặt hai
codon mã hóa cho Lys-Arg ngay phía trước trình tự mã hóa protein tái tổ hợp để đảm
bảo protein tái tổ hợp có trình tự đầu N đúng.
Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved

Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik. 2010. Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press
13

Có nhiều vector sử dụng cho nấm men đã được tạo ra và thương mại hóa. Chúng
có thể được chia thành 3 loại chính:
(a) Các vector plasmid được sử dụng nhiều nhất. Chúng là các vector con thoi đặc
trưng nấm men mà có thể nhân lên ở E. coli cũng như ở nấm men. Hệ thống sao
chép thường bắt nguồn từ plasmid vòng 2 micron của nấm men.
(b) Các vector dung nhập vào nhiễm sắc thể nấm men. Do các plasmid có thể mất đi,
đặc biệt trong các mẻ môi trường nuôi cấy lớn, nên ứng dụng vector dung nhập sẽ
làm tăng sự ổn định của gene ngoại lai. Điều bất lợi là chỉ một bản sao của gene
chuyển có mặt, trừ khi các cấu trúc lặp lại liên tiếp được sử dụng. Những trình tự
lặp liên tiếp này lại không ổn định vì xảy ra trao đổi chéo. Trong thực tế, cách tiếp
cận này hiếm khi được áp dụng.
(c) Nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo. Cấu trúc này được sử dụng để nhân dòng và
nghiên cứu một vùng lớn của bộ gene sinh vật nhân chuẩn. Tuy nhiên, chúng
không thuận tiện để sử dụng như là các vector biểu hiện.
Protein hỗn hợp cho người bây giờ đã được sản xuất nhờ nấm men Saccharomyces
cerevisiae. Chúng bao gồm insulin, yếu tố đông máu XIIIa, vài yếu tố sinh trưởng và
protein virus (từ HIV, viêm gan B, C, v.v.) được sử dụng như là các vacine hay trong
chuẩn đoán.
Mặc dù nhiều protein tái tổ hợp đã được biểu hiện thành công ở nấm men, năng
suất của chúng thường thấp. Các khó khăn bao gồm:
(a) Sự thất thoát plasmid biểu hiện trong quá trình sinh trưởng trong các nồi lên men
lớn.
(b) Các protein được cho là sẽ được tiết thường bị giữ lại ở khoảng giữa màng và
thành tế bào chứ không thoát ra ngoài môi trường.
(c) Quá trình đường hóa protein thường quá đà và sản phẩm protein tái tổ hợp thường
có quá nhiều gốc đường để có thể hoạt động đúng.

BIỂU HIỆN PROTIEN Ở TẾ BÀO CÔN TRÙNG
Các tế bào động vật có vú khá mỏng manh và có các đòi hỏi dinh dưỡng phức tạp.
Điều này làm cho việc nuôi cấy chúng khó khăn và đắt đỏ so với tế bào nấm men hay vi
khuẩn. Tuy nhiên tế bào côn trùng khá khỏe và có thể được nuôi cấy trong các môi
Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved
Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik. 2010. Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press
14

trường đơn giản hơn các tế bào động vật. Kết quả là, các hệ thống biểu hiện dựa vào côn
trùng đã được phát triển. Những hệ thống này có thêm thuận lợi là có thể tiến hành các
biến đổi sau dịch mã giống với các hệ thống ở tế bào động vật có vú.
Các vector được sử dụng trong các tế bào vi khuẩn hầu hết đều có nguồn gốc từ
một họ virus có tên là baculovirus, họ mà chỉ xâm nhiễm côn trùng (và các động vật
không xương có họ hàng như lớp nhện và giáp xác). Baculovirus có kiểu hình thành hạt
virus dị thường dạng polyhedrons (đa diện). Một số tế bào bị xâm nhiễm giải phóng ra
các hạt virus đơn có thể xâm nhiễm các tế bào lân cận trong cùng cơ thể côn trùng.
Nhưng khi côn trùng bị chết, các hạt virus được giải phóng gắn vào một chất nền protein.
Protein chất nền được gọi là polyhedrin, và cấu trúc polyhedron bảo vệ các hạt virus khi
chúng ở ngoài môi trường. Khi được nuốt bởi các côn trùng khác, polyhedrin bị dung giải
nhờ quá trình tiêu hóa và polyhedron tách ra. Quá trình này giúp giải phóng các hạt virus
có thể xâm nhiễm các tế bào côn trùng mới.
Gene mã hóa polyhedrin có một promoter khỏe, và giai đoạn muộn của quá trình
dịch mã, protein polyhedrin được tạo ra với lượng rất lớn. Do polyhedrin không thật sự
cần thiết cho việc xâm nhiễm của virus vào tế bào côn trùng nuôi cấy, polyhedrin
promoter có thể được sử dụng để biểu hiện các protein tái tổ hợp. Trình tự mã hóa cho
polyhedrin được loại bỏ và thay bằng cDNA mã hóa cho protein tái tổ hợp quan tâm.
Có rất nhiều loại baculovirus khác nhau, và loại thường được sử dụng nhiều nhất
là MNPV (multi nuclear polyhedrosis virus). Virus này xâm nhiễm rất nhiều tế bào côn
trùng và sinh sôi tốt ở nhiều dòng tế bào côn trùng nuôi cấy. Một dòng tế bào phổ thông
được sử dụng để nhân virus này lên là từ loài sâu fall armyworm (sâu keo-Spodoptera

frugiperda). Sản lượng của polyhedrin-và cũng là sản lượng của protein tái tổ hợp sử
dụng polyhedrin promoter thường đặc biệt cao trong các dòng tế bào này.
Do vector biểu hiện là một virus, quá trình xây dựng được thực hiện qua hai giai
đoạn. Ở giai đoạn thứ nhất, một vector ”chuyển” được sử dụng để mang cDNA của gene
cần chuyển. Vector chuyển (transfer vector) là một plasmid của E. coli mang một đoạn
DNA của MNPV virus, đoạn mà ban đầu mang cả trình tự mã hóa polyhedrin và các trình
tự liền kề chặn hai đầu (flanking region). Trình tự mã hóa cho polyhedrin sau đó được
thay bằng trình tự tạo dòng đa điểm (multi cloning site). Khi gene ngoại lai được cài vào,
nó chịu sự điều khiển của polyhedrin promoter. Việc xây dựng tính đến thời điểm này
Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved
Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik. 2010. Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press
15

được thực hiện ở E. coli. Ở giai đoạn hai, đoạn chứa gene quan tâm được chuyển vào
DNA của baculovirus do đó thay thế gene polyhedrin. Để thực hiện được điều này, tế bào
côn trùng được chuyển cả vector chuyển và DNA của MNPV vào. Hiện tượng trao đổi
chéo giữa các trình tự tương đồng sau đó sẽ tạo ra cấu trúc DNA của baculovirus mang
gene quan tâm sau polyhedrin promoter.
Bởi vì quy trình này đôi khi tạo ra các kết quả không như mong muốn, các vector
khác dùng cho tế bào côn trùng đã được thiết kế. Một trong số các khả năng là dùng một
vector con thoi mà có thể nhân lên như một plasmid ở E. coli và một virus ở tế bào côn
trùng. Thể lai plasmid-baculovirus như vậy gọi là bacmid. Nó bao gồm gần như toàn bộ
bộ gene của baculovirus được chèn thêm một đoạn của plasmid từ E. coli. Đoạn này bao
gồm một trình tự khởi đầu sao chép, một gene chọn lọc và vị trí nhân dòng gene đa điểm
(MCS) cắt giới hạn. Đoạn được chèn vào thế chỗ cho gene polyhedrin của baculovirus.
Gene chuyển được đưa vào vị trí MCS và tạo nên một bacmid tái tổ hợp. Bacmid sau đó
được tách, tinh sạch và chuyển vào tế bào côn trùng, nơi mà nó có thể được nhân lên như
một virus.
Baculovirus tái tổ hợp này sau đó có thể được cho xâm nhiễm các dòng tế bào
nuôi cấy để tổng hợp ra protein tái tổ hợp mong muốn sau vài ngày. Đã có vài trăm

protein của sinh vật nhân chuẩn đã được sản xuất thành công nhờ hệ thống
baculovirus/côn trùng. Phần đông trong số này được xử lý và cải biến đúng sau dịch mã.

QUÁ TRÌNH ĐƯỜNG HÓA (glycosylation)
Nhiều protein của sinh vật nhân chuẩn được đường hóa sau dịch mã. Đó là quá
trình mà chúng được gắn thêm các gốc là dẫn xuất của đường. Quá trình đường hóa là
cần thiết cho chức năng của một số protein.
Một thuận lợi khi biểu hiện protein tái tổ hợp của sinh vật nhân chuẩn ở tế bào
côn trùng là chúng có một hệ thống/con đường đường hóa. Con đường đường hóa sau
dịch mã tại các amino acid arginine ở động vật có vú và côn trùng là giống nhau khi thêm
gốc manose. Tuy nhiên các con đường chuyển hóa khác lại khác nhau. Tuy vậy, được
đường hóa một phần còn hơn không. Hiện nay đã có các dòng tế bào côn trùng khác đã
được cải biến gene để biểu hiện toàn bộ con đường đường hóa ở động vật có vú.

Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved
Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik. 2010. Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press
16

BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở TẾ BÀO ĐỘNG VẬT CÓ VÚ
Một số gene động vật cần chuyển có thể cần được biểu hiện ở tế bào động vật có
vú. Để thực hiện được điều này các vector con thoi tồn tại cho phép di chuyển gene
chuyển từ vi khuẩn tới tế bào động vật. Như thường lệ, những vector như vậy chứa trình
tự khởi đầu sao chép và một gene kháng kháng sinh cho phép chọn lọc ở vi khuẩn.
Những vector này cũng phải sở hữu một trình tự khởi đầu sao chép hoạt động ở tế bào
động vật. Thường thì trình tự này được lấy từ một virus xâm nhiễm tế bào động vật như
SV40 (simian virus 40). Các promoter virus thường được sử dụng bởi vì chúng mạnh, tạo
ra nhiều protein tái tổ hợp. Các promoter thay thế từ các gene của động vật có vú được
biểu hiện mạnh (như gene mã hóa cho metallothionein, somatotropin, hay actin) có thể
được sử dụng. Vị trí nhân dòng đa điểm cắt nằm sau một promoter mạnh. Do gene của
động vật thường được tạo dòng từ cDNA, vector cũng phải cung cấp một trình tự tín hiệu

polyadenylation ( ví dụ tín hiệu đuôi-tail signal) ở đầu 3’ của gene được chuyển vào.
Một số gene chọn lọc có thể được sử dụng với tế bào động vật. Rất ít các kháng
sinh giết tế bào động vật. Tuy nhiên kháng sinh genetecin, còn có tên G418, giết tế bào
động vật qua việc khóa quá trình dịch mã. G418 có liên quan tới các kháng sinh như
neomycin và kanamycin được sử dụng cho vi khuẩn. Gene npt (NeoR) mã hóa cho
neomycin phosphotransferase, thêm một nhóm phosphate vào neomycin, kanamycin, và
G418, kháng sinh bất hoạt những kháng sinh này. Do vậy, npt có thể được sử dụng để
chọn lọc tế bào động sử dụng G418 hay các tế bào vi khuẩn sử dụng neomycin hay
kanamycin.
Do thiếu kháng sinh cho tế bào động vật có vú, các tế bào nhân chuẩn đột biến
mất một enzyme nào đó đôi khi được sử dụng cho mục đích chọn lọc. Khi đó, plasmid
mang một bản sao còn hoạt động của gene đột biến. Phương pháp không mấy thuận tiện
này được sử dụng cả ở tế bào nấm men và tế bào động vật. Ở nấm men, các gene có vai
trò trong việc tổng hợp amino acid đã được sử dụng. Ở tế bào động vật, gene DHFR, mã
hóa cho dihydrofolate reductase đôi khi được sử dụng. Enzyme này cần cho việc tổng
hợp cofactor thiết yếu folic acid và bị ức chế bởi methotrexate. Các tế bào động vật
thiếu gene DHFR được sử dụng, và gene DHFR còn hoạt động được đưa vào vector con
thoi. Xử lý với methotrexate sẽ ức chế DHFR và do đó chọn ra được các tế bào biểu hiện
Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved
Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik. 2010. Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press
17

mạnh gene DHFR trên vector chuyển vào. Nồng độ methotrexate có thể được nâng dần
lên để chọn lọc số lượng các vector tái tổ hợp trong các tế bào.
Một phương pháp thay thế khác dùng một gene trao đổi chất như một chỉ dấu
chọn lọc trội. Enzyme glutamine synthetase bảo vệ tế bào khỏi các chất độc tương tự
amino acid, methionine sulfoximine. Mức độ kháng phụ thuộc vào lượng bản sao của
gene glutamine synthetase. Do đó các tế bào có mang nhiều plasmid có thể được chọn lọc
ngay cả khi gene nguyên bản vẫn hoạt động trên nhiễm sắc thể.

BIỂU HIỆN NHIỀU TIỂU PHẦN PROTEIN Ở TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
Nhiều protein của động vật có vú bao gồm nhiều tiểu đơn vị, những đơn vị này
phải được lắp ráp trong tế bào. Điều này làm cho việc biểu hiện tái tổ hợp các protein này
phức tạp hơn. Nếu các tiểu phần protein khác nhau được biểu hiện ở các tế bào khác nhau
sau đó được trộn vào nhau thường không tạo ra protein còn hoạt động. Trong trường hợp
này, người ta cần biểu hiện nhiều hơn một polypeptide trong cùng một tế bào. Điều này
có thể được làm theo ba cách khác nhau:
(a) Hai vector riêng biệt được sử dụng, mỗi vector mang gene mã hóa một tiểu phần.
(b) Một vector được sử dụng mang cả hai gene tách biệt mã hóa cho hai tiểu phần,
mỗi gene chịu sự điều khiển của một promoter riêng.
(c) Một vector duy nhất được sử dụng mang một ”operon” giả trên đó hai gene được
biểu hiện với cùng một promoter. Quá trình phiên mã tạo ra một mRNA
polycistronic duy nhất mang cả hai gene. Các tế bào nhân chuẩn thường chỉ dịch
mã khung đọc mở đầu tiên trên mRNA. Tuy nhiên, một số virus động vật nhất
định có trình tự IRESs (internal ribosomal entry sites) cho phép dịch mã nhiều
trình tự mã hóa trên cùng một mRNA. Lưu ý rằng phân tử mRNA đó được dịch
mã 2 lần bởi hai ribosome khác nhau bám vào hai vị trí khác nhau (đầu 5’ bình
thường và vị trí IRES). Quá trình này khác với dịch mã mRNA polycistronic ở vi
khuẩn, nơi mà một ribosome duy nhất chạy dọc phân tử mRNA qua tất cả các
khung đọc mở có trên đó.



Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved
Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik. 2010. Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press
18

SO SÁNH CÁC HỆ THỐNG BIỂU HIỆN
Mỗi hệ thống biểu hiện có điểm mạnh và điểm yếu riêng khi so sánh các tiêu chí
như chi phí, tốc độ, khả năng đường hóa, khả năng cuộn gấp đúng sau dịch mã hay khả

năng kiểm soát việc biểu hiện. Cho đến nay, các tế bào vi khuẩn là phương tiện rẻ nhất và
nhanh nhất để biểu hiện protein tái tổ hợp, nhưng chúng không thể đường hóa được
protein hay giúp các protein từ động vật có vú cuộn gấp đúng. Tế bào động vật có vú
giúp protein tái tổ hợp trong đó cuộn gấp và đường hóa thỏa đáng nhưng việc duy trì
chúng lại đắt đỏ. Do đó, việc xác định dùng hệ thống biểu hiện nào để biểu hiện protein
tái tổ hợp phụ thuộc vào protein và các đặc tính riêng của nó.
Bảng 3: So sánh các hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp
Tiêu
chí
Tên hệ thống biểu hiện
Tốc độ biểu
hiện
Động vật
chuyển gen
Thực vật
chuyển gene
Tế bào
động vật
Tế bào côn
trùng
Nấm men

Vi
khuẩn
Giá cả Động vật
chuyển gen
Thực vật
chuyển
gene
Tế bào côn

trùng
Nấm men

Vi
khuẩn
Khả năng
đường hóa
Vi khuẩn Nấm men Thực vật
chuyển
gene
Tế bào côn
trùng
Động vật
chuyển
gen
Tế bào
động
vật
Khả năng
giúp protein
cuộn gấp
đúng
Vi khuẩn Nấm men Thực vật
chuyển
gene
Tế bào côn
trùng
Động vật
chuyển
gen

Tế bào
động
vật
Khả năng
kiểm soát
việc biểu hiện
Động vật
chuyển gen
Thực vật
chuyển gene
Tế bào côn
trùng
Nấm men Vi khuẩn =
Tế bào động vật
Tệ nhất


T
ốt nhất