NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH VÌ PHÂN LẬP GEN CHAPERONIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐỊA PHƯƠNGTRỒNG Ở VÙNG TÂY NGUYÊN

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐINH THỊ NGỌC
ĐINH THỊ NGỌC

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH
VÌ PHÂN LẬP GEN CHAPERONIN LIÊN QUAN ĐẾN
TÍNH CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG
ĐỊA PHƯƠNGTRỒNG Ở VÙNG TÂY NGUYÊN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH
VÌ PHÂN LẬP GEN CHAPERONIN LIÊN QUAN ĐẾN
TÍNH CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG
ĐỊA PHƯƠNGTRỒNG Ở VÙNG TÂY NGUYÊN
CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN HỌC
MÃ SỐ: 60.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS CHU HOÀNG MẬU

Thái Nguyên - 2008

Thái Nguyên- 2008


M

1. Lý do ch n
ut

ng b ng và các t nh vùng núi phía B c, trong khi ngu n gen c a cây

U

các t nh khu v c Tây Nguyên n

tài
ng (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghi p ng n ngày, có giá

tr kinh t và hàm l

ng dinh d

ng cao. H t

ut

Tây Nguyên là vùng
th

ng kéo dài gây thi u n

leucin…), 12 %-25% lipit, và các vitamin (B1, B2, C,D, E, K…) c n thi t cho c

hàng n m gi m m nh trong ó có cây
các gi ng

ng v t. M t

r t o kh n ng c

nh nit không khí, vì v y tr ng

t và b o v môi tr
S n xu t

ut

c khác. S n l
Vi t Nam s n l

ut

ut

ng v n

ut

ng là có n t s n

ng góp ph n c i t o

ng

ut

ng trên th gi i

ng m i ch

ng n

t hàng tr m tri u t n/ n m. Trong

t tr m nghìn t n/ n m,

u ó ch ng t tình

c ta so v i khu v c v n còn m c th p.

quan tr ng là ch n t o

thúc

ys n

c nh ng gi ng không ch cho n ng

su t cao, ph m ch t t t mà còn ph i thích h p v i

gi ng nhau.

a hình có

n 3/4 là

i núi th

ng có mùa khô hanh

ng m a phân b không
hán và n ng nóng kéo dài.

ng là cây t

ng

u ki n ngo i

c nh và thu c vào nhóm cây ch u h n kém, công tác ch n t o các gi ng
ki u gen ch ng ch u ngày càng

Vi t Nam, ngu n gen c a cây

ng. Nh ng gi ng

l i có ch t l
ngo i c nh.

ut

ng có

c quan tâm nghiên c u [10], [18], [23].
ut

nh ng gi ng nh p n i, gi ng l i t o và gi ng
a ph

ut

ng

a ph

t bi n, còn có t p oàn các gi ng
ng có n ng su t th p, nh ng

ng h t t t và kh n ng ch ng ch u cao v i các
c tính ch u nóng, ch u h n c a các gi ng

u t

u ki n b t l i c a
ng này ã

c

nhi u nhà khoa h c quan tâm nghiên c u [18], [24], [31], [36]. Tuy nhiên, các tác
gi m i ch t p trung nghiên c u các gi ng

1

ut

ng tr ng

t ra cho ngành ch n gi ng

c

các t nh trung du,

ut

m hóa sinh và phân l p gen chaperonin liên quan

ut

ut

ng

a ph

ng tr ng

ng h t và tìm hi u gen liên quan

ng trong i u ki n sinh thái

ng
tài:

n tính

vùng Tây Nguyên”

n kh n ng ch u h n c a

khu v c Tây Nguyên.

u t ng tr ng t i khu v c Tây Nguyên.

- Nghiên c u kh n ng ch u h n, c s hóa sinh và phân l p gen liên quan
n kh n ng ch u h n c a m t s gi ng

ut

ng tr ng t i khu v c Tây Nguyên.

3. N i dung nghiên c u
- Phân tích
gi ng

ut

c

m hình thái, kh i l

ng và kích th

ch tc am t s

ng tr ng t i Tây Nguyên.

- Xác nh hàm l ng protein, lipit trong h t c a các gi ng

u t ng nghiên c u.

- Phân tích thành ph n axit amin trong protein h t c a các gi ng

ng r t a d ng và phong phú; ngoài

ng th

ng, có kh n ng ch ng ch u h n cao

- So sánh ch t l ng h t c a m t s gi ng

mi n B c, mùa

im nc mv i

ng. Vì v y, vi c ánh giá, tuy n ch n

2. M c tiêu nghiên c u

u gi a các vùng và gi a các th i k trong n m nên h n
ut

ut

ch u h n c a m t s gi ng

u ki n a hình khí h u.

Tây Nguyên…Nh ng n m g n ây di n bi n khí h u ngày càng ph c t p,

ng cây tr ng

ng có n ng su t và ch t l

nh m ánh giá ch t l
cây

n n ng su t, s n l

t Cao Nguyên này. T nh ng lý do trên chúng tôi ã ti n hành

“Nghiên c u

c ta có h sinh thái r t a d ng, khí h u gi a các vùng, mi n l i không

khô nóng

ut

làm v t li u ch n gi ng là yêu c u th c ti n
vùng

ng phát tri n m nh t i M , Brazil, Argentina, Trung Qu c và

nhi u n

hình s n xu t

ut

ng [20].

khi ó,

xu t

c tính quan tr ng n a c a cây

c tính quý còn ít

t v i hai mùa rõ r t, mùa m a và mùa khô, mùa khô
c tr m tr ng d n

th ng

i và

ng

c quan tâm.

ng ch a 30 % - 56% protein,

ch a nhi u lo i axit amin không thay th (lysin, tryptophan, metionin, cystein,

c ta c ng r t a d ng, có nhi u

ut

- Xác nh hàm l ng protein tan, ho t
-

c a proteaza giai

ánh giá kh n ng ch u h n c a các gi ng

ut

ng

ut

ng

n h t n y m m.
giai

n cây non

trong i u ki n h n nhân t o.
- Xác

nh hàm l ng prolin

giai o n cây non 3 lá

th i

m tr

c và sau

khi x lý b i h n.
- Nhân, tách dòng và
c a m t s gi ng

ut

c trình t gen chaperonin liên quan

ng tr ng t i Tây Nguyên.

2

n tính ch u h n


Ch

1.1.2. Giá tr kinh t c a cây

ng 1

ut

NG QUAN TÀI LI U

UT

1.1.1.

m sinh h c c a cây

c
ut

NG

t. V i u th ng n ngày, tr ng

c nhi u v trong

m, có th tr ng thu n, tr ng xen, luân canh g i v , tr ng
ut

thái khác nhau, vì v y sau lúa và ngô, cây

ng

ng có tên khoa h c là Glycine max (L) Merrill, có b nhi m s c th

2n = 40, thu c thân th o, h
ut

ng

ng là cây tr ng có giá tr kinh t cao, là cây công nghi p, cây th c

ph m, v a là cây c i c i t o
1.1. CÂY

ut

u (Fabaceae), h ph cánh b

ng có ngu n g c t các t nh phía B c và

tr ng trong n n nông nghi p nhi t
V m t dinh d

m (Papilionoidea).

ông B c Trung Qu c, các vùng

k c n c a C ng hòa liên bang Nga, Tri u Tiên và Nh t B n.Các gi ng

ut

ng

ut

c nhi u vùng sinh

ng có m t vai trò

c bi t quan

i.

ng, h t

ut

ng có thành ph n dinh d

ng cao ch a 30-

56% protein, 12-25% lipit và 20% gluxit [20], là ngu n axit amin, vitamin (B1, B2,
C, D, E) r t quan tr ng

iv i

i s ng c a con ng

i. Protein

ut

ng còn có

tác d ng h u hi u gi m cholesterol trong máu, gi m thi u nguy c các b nh liên
ang tr ng t i n

c ta

c du nh p t Trung Qu c t lâu

V hình thái, cây
R

ut

ut

i [13].

ng có r c c g m r cái và r bên, trên b r c a cây

nhi u n t s n ch a vi khu n Rhizobium japonicum có kh n ng c
tr i cung c p

m cho cây, có vai trò c i t o

Thân

quan

ng các b ph n chính là r , thân, lá, hoa và qu

ut

ut

n tim m ch, chúng c ng ng n c n s phát tri n các m m ung th , ng n ng a

b nh th n, b nh ti u

ng có

nh nit t khí

ut

c gi i khát, n

ng g m 3 lo i lá: lá m m, lá

n và lá kép (có 3 lá chét ôi khi có

ut

ng

c s d ng r t a d ng

u ph , ép thành d u

ut

c ch m ... áp ng nhu c u

ng,

m trong

i c ng nh gia súc.

nh ng qu c gia phát tri n, ng

i ta còn dùng

ut

ng vào các k ngh

khác nh bi n ch cao su nhân t o, m c in, s n, xà phòng, ch t t nhân t o, ch t
nhiên li u l ng, d u làm tr n trong k ngh hàng không.

4-5 lá chét).

Trong tr ng tr t, cây

Hoa m c thành chùm
ho c tím, hoa

u t

nách lá, m i chùm hoa có t 10-15 hoa, có màu tr ng

ng t th ph n hoàn toàn. Qu có th th ng ho c cong có

nhi u lông, m i qu ch a t 1-5 h t nh ng thông th
H t

u, n

kh u ph n n hàng ngày c a ng

thì thân ng sang màu vàng nâu.
Lá

ng.....

nh dùng tr c ti p h t khô ho c ch bi n thành
làm bánh k o, s a

t [9].

ng có hình tròn, thân non có màu xanh ho c tím, khi qu chín

ng, b nh x p x

Trong công nghi p, s n ph m t cây

ut

ng là 2-3 h t.

nâu, en, vàng, xanh. Kh i l

ut

ng có màu

ng c a cây

ut

ng ng

i ta chia làm 3 lo i:

Gi ng chín s m (75-85 ngày), gi ng chín trung bình (80-100 ngày), và gi ng chín
mu n (110-120 ngày). Th i gian sinh tr

ng là m t y u t quan tr ng

cây tr ng luân canh t ng v [28].

ng c

Rhizobium c ng sinh trên r cây. Nh kh n ng c
t tr ng

t

l a ch n

t, t ng n ng su t

nh N2 c a loài vi khu n

nh

m nên sau m i v thu

c c i thi n rõ r t, l

t ng và khu h vi sinh v t hi u khí trong

ng

m trong

ng t ng. Do ó, có l i

tr ng khác và sau khi thu ho ch toàn b thân lá, r , lá ph l i b m t
1.1.3. Tình hình s n xu t
Trên th gi i (tính

ut

ng trên th gi i và

n tháng 4/ 2006), có 78 n

tích là 91,3 tri u ha; n ng su t 22,9 t / ha, s n l
s n xu t

u t

ng

ng

ng

mc it o

t

i v i cây
t v a có tác

t.

Vi t Nam
c tr ng

ut

ng v i di n

t 236,1 tri u t n. Các n

c

u th gi i là: M , Brazil, Argentina và Trung Qu c

chi m kho ng 90-95% t ng s n l

3

ng còn có tác d ng c i t o
c là do ho t

d ng che ph ch ng xói mòn, v a là ngu n h u c giàu

ng h t r t a d ng t 20-400 mg/h t

n c vào th i gian sinh tr

ut

u này có

ho ch thành ph n hóa tính c a

ng không có n i nh mà ch có m t l p v bao quanh phôi và 2 lá

m m. H t có hình tròn ho c hình b u d c, tròn dài, tròn d t, v h t

các cây tr ng khác.

ng

ut

4

ng trên toàn th gi i [45].


Nh v y, có th th y
th gi i không ch do
còn

ng chi m m t v trí quan tr ng trong n n kinh t

c gieo tr ng trên di n tích l n

c s d ng r ng rãi

B ng 1.1. S n l

ut

ng

78 n

c, mà h t

ut

B ng 1.2: Di n tích, n ng su t, s n l

ng c a m t s n

(Theo Oil World);

c trên th gi i niên v 2006 – 2007

m

Th gi i

236,1

M

86,8

Brazil

59,0

Argentina

47,2

Paraguay

6,5

Trung Qu c

16,2

n

Ch tiêu
Di n tích (1000 ha)

n v tính: tri u t n

0,9

Liên bang Nga

0,7

2001

2002

2003

2004

2005

2006

124,1

140,3

158,6

165,6

182,5

203,6

185,8

ng (1000 t n)
Hi n nay cây

12,0

12,4

13,0

13,3

13,3

14,3

13,9

149,3

173,7

205,6

219,6

242,1

290,6

186,9

ut

ng

c tr ng

c 7 vùng nông nghi p trên c n

tích tr ng, n ng su t và s n l

a

ng

Di n tích

m

ut

ng su t

(1000 ha)

S nl

(1000 t n)

203,6

1430

291,5

67,3

16000

107,5

Vùng ông B c

48,4

1040

50,2

Vùng Tây B c

25,0

1150

28,7

c

ng b ng Sông H ng

Vùng B c Trung B

6,5

1220

7,9

Vi t Nam

0,3

Tây Nguyên

27,1

1570

42,5

Thái Lan

0,2

ông Nam B

5,3

1060

5,6

21,2

2100

44,5

ng b ng Sông C u long

0,4
c khác

0,8

ng 3.1 cho th y Tây Nguyên là vùng có di n tích tr ng
3 trong 7 vùng nông nghi p trên

c.Cùng v i s

tr ng chính nh cao su, cà phê, h tiêu, ca cao….thì cây
su t và s n l
th

ng

ut

ng ã không ng ng t ng,

m 2000 di n tích tr ng

203600 ha, n ng su t

ut

c bi t trong nh ng n m g n

ng là 124100 ha

n n m 2005 t ng lên

t t 12000 t /ha n m 2000 lên 14,300 t /ha n m 2005 và

ng t 147300 t n n m 2000 lên 290600 t n n m 2005 [21].

5

ng

(Kg/ha)

C n

Vi t Nam, trong vòng h n 20 n m qua (t 1985- 2006) di n tích, n ng

s nl

ng c a 7 vùng n m 2005

0,8

Các n

c,

ng [21].

B ng 1.3. Di n tích, n ng su t và s n l

Indonesia

Nigeria

ây:

c qua các n m

do i u ki n sinh thái c a m i vùng khác nhau nên có s khác bi t khá rõ v di n

3,5

Ukraine

ng c n

2000

ng su t (t /ha)
S nl

7,7

Canada

ut

(Ngu n: T ng c c Th ng kê, 2006)

ng

làm th c ph m và nguyên li u cho công nghi p.

ut

ng

chú tr ng và phát tri n trên vùng
M c dù, s n l

ng

ut

ut

ng l n th

ng tr

ng

a các lo i cây

ut

ng

ng ang

c

t này.
ng

n

c ta có t ng nh ng so v i các n

th gi i và trong khu v c n ng su t c a ta v n còn th p, và
m g n ây di n tích, n ng su t và s n l

6

ng

ut

ng c a n

c trên

c bi t trong nh ng
c ta gi m i áng


k . N m 2005 di n tích t 203600 ha gi m xu ng ch còn 185800 ha n m 2006 và
s nl

thi t: axit linoleic 50%, và

c bi t có 7% axit anpha linolenic là ngu n cung c p

ng gi m t 290600 t n n m 2005 xu ng còn 186900 t n n m 2006.

axit béo chu i m ch dài omega 3 quan tr ng cho c

Nguyên nhân chính là do

Hexaenoic Acid) và EPA (Eicosa Pentaenoic Acid ) [44].

u t th p, ch a có b gi ng phù h p, ch a áp

d ng k th t tiên ti n. Vì v y, nghiên c u c i ti n các
các gi ng

a ph

sinh thái
is

c

m nông sinh h c c a

ng và t o gi ng m i có n ng su t cao, thích nghi v i

nh ng vùng khác nhau b ng ph

áp ng

ng pháp truy n th ng k t h p v i hi n

c yêu c u c a th c ti n

tr ng v s phát tri n cây

u

n

1.1.4. Thành ph n hóa sinh h t
Trong h t

u t

u ki n

t ra và ó c ng là chi n l

c quan

c ta.

ut

Ch t l

ng lipit c a h t

ng r t t t, cho nên nó

trong công nghi p ch bi n th c ph m. H t
trong lipit,

u t

protein d tr và ch t l

ng có giá tr dinh d

56%, lipit 12-25%, gluxit 20%; có các mu i khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S, các

thành ngu n th c ph m quan tr ng cho ng
1.2. NGHIÊN C U V

các axit amin c b n isoleucin, leucin, lysin, metionin, phenylalanin,

H n

Protein là thành ph n ch y u trong h t
30%-55% kh i l
u t

ut

ng khô c a h t. D a vào h s l ng, ng

ng. Chúng chi m kho ng
i ta chia protein c a h t

ut

ng là: protein d tr (chi m 70% t ng s protein),

các enzim, các ch t c ch proteaza và lectin. Thành ph n c a protein g m có
albumin (9,5%), globulin tan trong n

c (75,8%), globulin ch tan trong NaCl là

nh t là

ut

ng,

ut

c xem là protein có ch t l

ng: Protein c a các lo i

u

,

ng t t nh t trong các lo i protein

th c v t. Chúng có ch a t t c các axit amin không thay th . H n n a protein c a
cây h

u còn có hàm l

v y, hàm l

ng lysin r t cao so v i protein t các lo i ng c c.Tuy

ng các axit amin có ch a g c SH (metionin, cystein) còn th p [8], [40].

Hàm l

ng lipit trong

ng khô, trong ó hàm l

u t

ng khá cao chi m kho ng 12-25% kh i

ng các axit béo no th p, kho ng 13%, không có

cholesterol, 30% là các axit béo ch a no m t n i ôi. L

7

ng

ng tr

ng c a h n

i v i th c v t là khái ni m dùng

UT

NG

n th c v t
ch s thi u n

n, làm nh h

ng

c do môi tr
n sinh tr

ng

ng và

phát tri n c a cây.
Thi u n
ng

c tr

c tiên nh h

ng

n s cân b ng n

n ch c n ng sinh lý nh quang h p, hô h p dinh d

cùng nh

n s sinh tr

c c a cây, t

ó nh

ng khoáng và cu i

ng phát tri n c a th c v t. Cây s ch t non ho c gi m s c

s ng, gi m n ng su t [19].

3%, glutelin - protein tan trong NaOH 0,2M là 11,7% [18], [25].
Thành ph n axit amin c a h t

ut

i và th c n cho gia súc [18].

gây nên trong su t quá trình hay t ng giai

ng thành 3 lo i: 11S - legumin, 7S - vixilin, 2S - albumin. Nh ng lo i

protein chính trong h t

nh làm cho

C TÍNH CH U H N C A CÂY

1.2.1. Khái ni m v h n và tác

tryptophan, valin...[20].

ng cao.Trong ó, hàm l

ng c a chúng là y u t quy t

vitamin A, B1, B2, D, E, F, các men, sáp, nh a, cellulose. Ngoài ra, h t
còn có

u

ng .

Tóm l i, h t

ng

c s d ng r ng rãi

ng còn có các lo i vitamin tan

c bi t là vitamin E = 200 mg/100g lipit [8], ngoài ra trong h t

kích thích sinh tr

ut

ut

DHA (Docosa

ng còn ch a m t s ch t khác nh hydrat cacbon, mu i khoáng, axit nucleic,

ng

ng có các thành ph n ã bi t tính theo t l protein 30-

ut

th nh

ng axit béo không no c n

Hi n t
trong môi tr
nóng hay tác

ng m t n

c có th do tác

ng, ho c là tác

ng th c p

ng s c p, là k t qu c a s thi u n
c gây ra b i nhi t

th p, s

c
t

ng c a mu i. H n c ng nh y u t ngo i c nh b t l i khác khi tác

ng lên c th th c v t s gây ra ph n ng c a c th . Tùy theo t ng loài, gi ng
mà m c

ph n ng c a c th c ng nh thi t h i do khô h n gây ra khác nhau:

m t s b ch t, m t s b t n th

ng nh ng c ng có m t s khác không b

ng. Kh n ng th c v t có th gi m thi u m c t n th
ra g i là tính ch u h n [19].

8

ng do thi u h t n

nh

c gây


Vi t Nam là m t n
a phân b không
hán có th x y ra

c có a hình a d ng và di n bi n khí h u ph c t p, l

ng

u gi a các vùng, mi n và gi a các th i k trong n m nên h n

b t k mùa nào, vùng nào. Di n tích có t i 3/4 lãnh th là

t canh tác c a các khu v c này th

i núi,

Kh n ng

c a t bào khi b m t n

ng c a

nghi t ó. Trong

các vùng khác nhau r t rõ r t. T t c các y u t trên chi ph i m nh m m c n

c ng m

thu nh n

cc a

t.

ch ng l i khô h n cây có th gi

không b m t

qua

c, gi m di n tích lá, rút ng n chu k s ng…Kh n ng duy trì áp su t th m th u n i
bào có tác d ng b o v ho c duy trì s c s ng c a t bào ch t khi b m t n
hai lo i h n do môi t
Tác

ng tác

ng

cây và gây m t n

a

ng là h n

c là y u t gi i h n

i v i cây tr ng, v a là s n

ph m kh i

u v a là s n ph m trung gian và cu i cùng c a các quá trình chuy n hoá

sinh h c. N

c là môi tr

S tác

ng

các ph n ng trao

ng c a h n, gây nên hi n t

i ch t x y ra [2].

cao hay do h n n

c làm cho n

n

kho ng 40-50% quang h p c a lá s b
Nh v y, nh h
cây tr ng c ng nh h

ng n

ình tr c n tr s sinh tr

ng c c oan c a h n
ng

c trong môi tr

ng quá

c trong t bào th t thoát ra ngoài nên kh i.

H n hán làm gi m m nh quang h p. Khi hàm l
b tc

giai

c trong lá còn
ng c a cây.

n sinh tr

ng nào c a

n các y u t c u thành n ng su t và s n l ng cây tr ng.

m tn

sâu s hút

c nh ng cây ch u h n th
cn

c

th

ng ch u tác

u t

c ch y u ph thu c vào b r .
t ho c r lan r ng v i s l

ng nói riêng, khi

ng m nh c a h n vì b r ch a phát tri n

9

ng, thi u n

giai
y

c gây r i lo n toàn b ph

th c v t, làm t ng ho c gi m hàm l

ng th c chuy n hóa

ng các ch t chuy n hóa nh :

ion K+, các lo i

c tích l y nh m ch ng l i vi c gi m m t n

ch t nguyên sinh và chúng có th t

ng lên v hàm

ng, axit h u c ...[2], [4], [30]. S t ng

h p và tích l y các ch t trên di n ra r t nhanh khi t bào m t n
s

t

c, các ch t hòa tan

c, t ng kh n ng gi n

cc a

ng tác v i lipit ho c protein màng ng n ch n

c a các gen, hàng lo t các gen ngh

n s bi u hi n

c ho t hóa t ng h p t o ra các ch t c n thi t

ch ng l i s khô h n [1].
c ta n m trong khu v c nhi t
ng gây nh h

ng

n sinh tr

i gió mùa h n là y u t t

ng, phát tri n c a cây tr ng, nh h

ng xuyên tác
ng x u

n

ng su t và ph m ch t c a chúng. Vì v y, vi c nghiên c u các c ch ch u h n s
là c s cho vi c c i thi n gi ng c ng nh t o ra

c các gi ng có tính ch ng ch u.
i ta

ng khác nhau: phân tích hóa sinh trong h t n y m m

nghiên c u a d ng enzym - amylaza và proteaza hàm l

ng protein tan, thành

ph n axit amim, prolin...
Các proteaza óng vai trò quan tr ng trong c th s ng và nh t là trong th i

ng có b r kh e, dài, m p, có s c xuyên

nh ng n i sâu trong

[19]. Th c v t nói chung, và cây

ng thi u

u ch nh áp su t th m th u [2].

Vai trò c a b r : kh n ng thu nh n n
tránh m t n

i v m t sinh lý, sinh hóa nh m

c. Có hai c ch b o v th c v t t n t i trên môi tr

c ó là vai trò c a b r và kh n ng

u ch nh t ng lên giúp cho t bào

t. B ng c ch nh v y, th c v t có th v

c tình tr ng h n c c b .

th c hi n theo nhi u h

1.2.2.1. C s sinh lý, sinh hóa c a tính ch u h n
không

c

ng m t

u ki n kh c

Khi nghiên c u v kh n ng ch ng ch u c a các cây tr ng l y h t ng

1.2.2. C s sinh lý, sinh hóa và sinh h c phân t c a tính ch u h n
Khi g p h n th c v t luôn có nh ng bi n

ct

s phá h y màng và các ph c protein [24]. Quá trình này liên quan

ng co nguyên sinh và làm cho cây b

héo. S co nguyên sinh các t bào di n ra khi n ng

u ki n khô h n ASTT

ng prolin, n ng

ng chính là: làm t ng nhi t

c do nóng h n. Nh ng th c v t t n t i trên môi tr

c nh ng phân t n

Thông th

t và h n không khí [1], [5].

n lên cây ch y u theo hai h

c trong cây. N

c [2]. Có

c tính quan tr ng

cân b ng v áp su t th m th u òi h i ph i có kh n ng ch ng l i

ng xuyên b h n nên thành ph n th nh

và kh n ng gi n

u ch nh áp su t th m th u (ASTT): là m t

ng l n

n cây non

còn y u.

k n y m m c a h t. Chúng r t a d ng. Thành ph n ph c t p c a các proteaza h t
c t o ra b i s

a d ng ch c n ng do chúng

m nhi m trong th i k n y m m.

Proteaza nói chung không ch tham gia vào phân gi i protein d tr trong h t, nh m
cung c p các axit amin cho th i k phát tri n

u tiên c a cây mà chúng còn tham gia

vào quá trình vi x lý phân t protein. Proteaza tham gia vào phân gi i các protein l

10

ho c b bi n tính khi g p
Tr n Th Ph

u ki n c c oan (l nh, m n, h n, tác

ng Liên (1999) khi nghiên c u so sánh ph

c a các gi ng

ut

ng c h c...) [18].

n di ho t tính proteaza

ng ch u nóng ch u h n khác nhau ã nh n xét r ng. Proteaza

trong quá trình h t n y m m c a h t

t t c các gi ng

ut

kh n ng ch u h n c a các gi ng lúa c n có liên quan
ng prolin. Khi g p h n, cây lúa c n gi m hàm l
prolin [24]. Nguy n Th Thúy H

n hàm l

ng protein và t ng hàm l

ng nghiên c u r t a

các gi ng

ut

ng

các gi ng

ut

ng có s gi m t ng h p protein và t ng c

li u

1.2.2. C s phân t c a tính ch u h n

t ng h p protein cho c th m i. X lý nhi t

tính proteaza

m t s gi ng ch u h n, không nh h

cao ch nh h
ng

Nguy n Th Kim Dung (2003) nghiên c u s bi n

ng ho t

o n h t n y m m c a các gi ng l c ã rút ra k t lu n, ho t
giai o n h t n y m m có xu h
9 ngày tu i [6]. C ng theo h
r ng

các giai

ng t ng t 1

7 ngày tu i, b t
proteaza có m i t

Nh ng thay

giai

giai

n

i ho t

c a proteaza và hàm l

n 9 ngày tu i, hàm l

các giai

nt 3

ng
n

ng protein tan và ho t

c nhi u tác gi quan

ng prolin khi cây g p h n.

Prolin là m t axit amin có vai trò quan tr ng trong s
ng th i là m t axit amin a n

ng n ch n s xâm nh p c a ion Na+ t

c cho t bào,

ng tác v i protein màng, ng n ch n s phá

h y c a màng và các ph c protein khác. Các k t qu nghiên c u

u cho th y khi cây

tr ng g p h n thì cây gi m t ng h p protein và t ng t ng h p prolin [26], [28].
Soulages và cs (2003) ã ch ng minh ngoài vai trò t ng c

ng

b t l i c a nhi t

lúa

ut

ng [ 38]. Theo inh Th Phòng (2001),

khi gây h n sinh lý b ng dung d ch sorbitol 5% hàm l

ng prolin c a các dòng ch n

l c t ng lên v

ng prolin liên quan

t xa so v i

i ch ng, s t ng hàm l

ng ch u h n [30]. Kh o sát ch t l
lúa c n

a ph

ng

n kh

ng h t và kh n ng ch u h n c a m t s gi ng

vùng núi phía B c, Chu Hoàng M u và cs ( 2005) ã nh n xét,

11

n c u trúc, ch c n ng c a các thành ph n trong t bào và các quá trình

x y ra trong m i vùng liên quan

n kh n ng ch u nóng, ch u h n, m n, phèn

c a th c v t.
Ph n ng c a th c v t tr

c nh ng tác

ng: nóng, h n r t a d ng nó ph

thu c vào nhi u y u t khác nhau, trong ó có ki u gen,

dài và tính kh c li t c a

i u ki n ngo i c nh. Bi u hi n c a quá trình này là vi c sinh t ng h p m t lo t các

th c v t ng

i ta ã có nh ng b

m c

giúp cho cây có kh n ng

phân t c a hi n t

ng nóng h n

c ti p c n khác nhau trên nhi u loài cây tr ng
c nghiên c u nhi u nh t là các protein s n

ph m bi u hi n gen [19]. Nhóm các protein

c

c bi t quan tâm bao g m:

protein s c nhi t, môi gi i phân t , LEA...
Protein s c nhi t (heat shock protein- HSP): HSP có
th c v t nh : lúa mì, m ch, lúa g o, ngô,

h u h t các loài

u nành, hành, t i…. chúng chi m

kho ng 1% protein t ng s trong lá c a các loài th c v t này. HSP

ng kh n ng ch u

h n thì chu i axit amin L – Prolin nhóm II còn có kh n ng ch ng l i các tác
i v i cây

quan

các giai o n phát tri n khác nhau.

u hòa ASTT trong

c có kh n ng gi và l y n

ng t ng h p prolin [26 ].

Kh n ng ch ng ch u c a sinh v t nói chung và c a th c v t nói riêng liên

thích ng. Khi i sâu vào nghiên c u

i hóa sinh khác do h n gây ra c ng
i hàm l

ng c a T nh S n La c ng ã nh n xét r ng: khi g p h n

ch t trong t bào, m t s hormon ho c ch t kích thích

ng quan thu n ch t ch [29].

tâm nghiên c u: nh s thay

t bào,

proteaza

c a proteaza trong

n 5 ngày tu i, sau ó gi m t 7

i này tuân theo quy lu t chung : t ng

u gi m

n ho t

ng nghiên c u này Nguy n Th Thu Ngà (2007), cho

n h t n y m m làm bi n

protein tan. S bi n

ng

n gi ng ch u nóng [18].

ng

ng ( 2006), khi nghiên c u v kh n ng ch u h n c a

d ng, có ho t tính cao, có kh n ng phân gi i hoàn toàn protein d tr t o nguyên

a ph

ng protein và hàm

khi t bào g p i u ki n c c oan nh : h n, nhi t

cao,

c a HSP có ch c n ng ng n c n ho c s a ch a s phá
r ng giá tr ng

ng v i s ch ng ch u nhi t

c t ng h p

mu i cao. S xu t hi n
y do stress nóng và m

cao. Trong các t bào th c v t HSP

t bào ch t t p trung thành các h t s c nhi t (HSG-Heat Shock Granules). Ng
cho r ng các HSP g n k t trên các ARN polymeraza

i ta

ng n c n s phiên mã t ng

h p mARN trong quá trình b stress nóng. Sau s c nóng các h t này phân tán và
liên k t dày

c v i các ribôxôm ho t

ng sinh t ng h p protein [19].

12

HSP có th chia làm 6 nhóm d a trên c s kh i l

ng phân t khác nhau:

110, 90, 70, 60, 20, 8,5 kDa. Trong ó có nhóm HSP70 và HSP 60 có nhi u

i

di n c a ch t môi gi i phân t (g i là chaperonin) HSP 8,5 kDa (Ubiquitin) có ch c
ng b o v cho t bào nh ng không ph i là môi gi i phân t . Ubiquitin có ho t

quan tr ng
CCTα

g n c ch t. Ch c n ng này g n li n v i s có m t c a 4 ti u

. Vì quá trình t o c u trúc không gian trong CCT không có s tham gia

c a protein d ng GroES, nên c ch t protein
ch

óng m

c gi l i trong kh i hình tr nh c

c bi t theo ki u b c thang c a các vùng CCT. Ngoài CCT còn có hai

tính proteaza v i ch c n ng phân gi i các protein không có ho t tính enzym.

nhóm nhân t cùng tác

Ubiquitin có MW r t th p, ít ch u nh h

protein. Trong ó nhóm nhân t A không óng vai trò trong công vi c

c a t bào khi g p y u t c c oan,

ng c a nhi t

c bi t là nhi t

nên có vai trò t s a ch a
cao [19].

protein khác nhau, nh ng chúng

n

nh chu i polypeptit khi ang t ng h p và t o c u trúc

không gian úng cho chúng, (2) T o l i c u trúc không gian c a protein sau khi v n
chuy n qua màng t bào, (3) L p ráp các chu i polipeptit vào ph c
b c 4, (4) MGPT

c t ng c

ng nh quá trình t ng h p trong

t o c u trúc

Các nhóm HSP 100, HSP 90

HSP 60 (chaperonin) là lo i protein c u t o t các ti u

n v có kh i l

1.2.3. Nghiên c u v tính ch u h n

và lipit r t cao,

m t nhóm môi gi i phân t m i. Chúng giúp cho vi c t o c u trúc không gian úng
c a protein trong khung t bào actin và tubulin trong t bào ch t. Chúng óng vai
trò quan tr ng trong qua trình hình thành thoi vô s c c a giai

n phân bào,

c

bi t là th i k phát tri n m m t h t. Chaperonin t bào ch t là m t ph c có kh i
ng phân t kho ng 90 kDa bao g m 8 ti u
(t

ng

n v có tên là α, , , , , , ,

ng v i CCT1- CCT8) và hình thành nên c u trúc vòng bi kép [16]. Trong

d ch chi t t bào các ti u

n v trong c u trúc không gian c a vòng bi có vai trò r t

13

ng

ut

ng có nhu c u v n

ó chính là do trong h t và cây

ut

ng có hàm l

t ng h p 1kg ch t khô c n 500 - 530 kg n
cc a

Nghiên c u v các

l c a ph c t (CCT), hay còn g i là ph c vòng ch a polypeptit-l c a ph c t (TriC) là

ut

ut

c cao h n
ng protein

c. Trong quá trình

ng c ng khá cao 50%, trong khi ó

ngô

ch là 30%, lúa là 26% [20 ].

60 kDa và c ng có ho t tính ATP-aza [24].
H CCT: Chaperonin c a t bào ch t, còn g i là chaperonin ch a polypeptit-

cây

Trong các cây tr ng l y h t thì cây

n y m m thì nhu c u v n
ng

ng, nh ng ph n l n chúng sinh ra khi

u ki n ngo i c nh b t l i nh h n, nóng, l nh. Ch c n ng chính c a

các lo i cây khác.

HSP 70 là nhóm MGPT có ho t tính ATP-aza và có tính b o th cao. Trong

u có tính b o th cao và có ho t tính ATP-

chúng là ng n ch n s co c m c a protein và tái ho t hoá các protein bi n tính [19].

do nhu c u c p thi t c a t bào, nh t là s c nhi t.

i u ki n c c oan HSP có th ng n ch n s co c m và k t t protein.

ng tác v i CCT nh ng l i tham gia vào

aza. M t s tìm th y trong t bào bình th
g p các

u ki n c c oan

MGPT có th chia thành m t s nhóm nh sau:

u ch nh

t o c u trúc không gian úng c a protein khi gi i phóng ra kh i CCT [18].

u có ch c n ng tham gia t o c u trúc không gian

úng cho protein trong t bào. Ph n l n các ch t MGPT có ho t tính ATP-aza, có
ch c n ng: (1) Gi

ng A và B tham gia vào c u trúc không gian úng c a

ho t tính c a CCT. Nó không tham gia t

Môi gi i phân t (MGPT): MGPT là m t nhóm g m nhóm g m nhi u lo i

nv:

c tính ch u h n c a cây

lý và di truy n ã cho th y r ng, các
hoá keo c a nguyên sinh ch t,
c a cây

ut

c

c tính này liên quan ch t ch

ng là tính tr ng a gen. Chúng th hi n

truy n c a t ng gi ng có kh n ng s d ng n
ng và phát tri n c a cây.

ng v ph

m c a quá trình trao

nh : v s phát tri n c a b r , tính chín s m t

tr

ut

n c vào

c

ng

ng di n sinh
n

c

nhi u khía c nh khác nhau
i, c ng nh b n ch t di

c ti t ki m trong quá trình sinh
m này,

ut

ng

c chia thành

hai nhóm [18].
- Nhóm ch u

cs m tn

- Nhóm ch u

c s thi u n

c trong t ng giai
c trong t t c giai

14

m

i ch t. Tính ch u h n

n phát tri n c a cây.
n phát tri n c a cây.


giai
nh ng giai
d n

n cây con khi g p h n,

ut

ng có th d v

t qua h n, còn

1602 nucleotit mã hóa cho 533 axit amin [17]. Nguy n Th Thu Hi n (2005), phân

n sau nh giai o n ra hoa, k t qu , h t chín s a mà g p h n thì s

l p

n n ng su t gi m áng k .
Trong nh ng n m g n ây các nhà khoa h c ã có nhi u thành công khi

nghiên c u sâu h n v tính ch u h n c a cây

ut

- 95 t lá và r cây

ut

u

c cDNA c a LEA nhóm D

ng khi b h n [36].

c tìm th y

l

ng l n trong m m

ut

ng d

i tác

ng c a nhi t

c 751bp liên quan

n kh n ng ch u h n t hai

ng và Cao B ng 4 [11].

ng là cây tr ng có giá tr kinh t cao, là cây công nghi p, cây

Vi t Nam, cây

u t

t.

c tr ng ph bi n

áng k , nh ng so v i các n
c ta còn

nhi u qu c gia trên th

ng chi m m t v trí quan tr ng trong n n nông
ng

ut

ng tuy có s t ng

c trên th gi i n ng su t c a các gi ng

ut

ng

m c th p.

1.3.2.Trong h t

ut

ng có các thành ph n ã bi t tính theo t l protein

30-56%, lipit 12-25%, gluxit 20%; có các mu i khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các

m 2004, nhóm nghiên c u g m Huang và cs c a Tr
nhiên và K thu t Pingtung,
mARN v i kích th

ut

th c ph m, v a là cây c i c i t o
gi i.

c u trúc d ng h t trong nguyên sinh ch t và trong nhân cùng v i

protein b bi n tính.[35].

h p proline

ng Kh

nghi p. Trong nh ng n m g n ây n ng su t và s n l

Jinn và các tác gi khác (1997) nghiên c u v sHSP nhóm 1 (15-18 kDa) ã
nh n th y, chúng t ng lên

ng vàng M

1.3.1.

c cDNA c a dehydrin t lá

c, ngoài ra các tác gi còn phân l p

ut

1.3. NH N XÉT CHUNG

ng.

Maitra và Cushman (1994) ã phân l p
ng khi b m t n

c gen dehydrin v i kích th

gi ng

ài Loan, ã phân l p

ng

c gen P5CS

i h c T
ut

c 2148bp [45]. Gen P5CS là nhân t gi i h n cho nh p

th c v t trong

vitamin A, B1, B2, D, E, F….Trong ó, hàm l

ng t

chúng là y u t quy t

t ng

tr ng cho ng

u ki n b t l i do h n và do m n gây nên [39].

1.3.3.

nh làm cho

u t

ng protein d tr và ch t l

i và th c n cho gia súc.
ut

ng là lo i cây có nhu c u v n

Nghiên c u c a Porcel và Cs (2005), ã ch ra r ng, gen mã hoá protein dehydrin

khác, thu c vào nhóm ch u h n kém. H n ã nh h

(LEA-DII) có vai trò v i kh n ng ch ng ch u c a

phát tri n c a cây

ut

ng.

Vi t Nam ã có m t s công trình nghiên c u phân l p các gen liên quan
n kh n ng ch u nóng, ch u h n c a cây
trình t gen chaperonin t gi ng

ut

ut

ng. Nghiên c u phân l p và

ng ch u nh Bonminori- Nh t

c

n v i kích

ng c a

ng tr thành ngu n th c ph m quan

ch u h n c a cây

ut
ut

c cao h n các lo i cây tr ng

ng l n

n quá trình sinh tr ng,

ng và làm gi m n ng su t, ch t l

ng. Nghiên c u v tính

ng ng

hóa sinh trong h t n y m m

i ta th c hi n theo nhi u h

ng khác nhau: phân tích

nghiên c u a d ng enzym - amylaza và proteaza hàm

ng protein tan, thành ph n axit amin...

i sâu vào nghiên c u

m c

phân t ,

th

c phân t 1,6 kb c a Nông V n

i và cs (1997) [12]. Nghiên c u c a Tr n Th

c nghiên c u nhi u nh t là các protein s n ph m bi u hi n gen. Nhóm các protein

Ph

ng Liên (1999) ã phân l p, xác

nh trình t gen chaperonin t bào ch t CCT

c

t gi ng

ut

ng

t bi n M103 v i kích th

amin. Trình t gen này có s thay
và 308 ( Ser

Ala), s thay

Tác gi kh ng

nh s thay

i axit amin 3 v trí 99 (Ser

Thr), 280 (Ser

Gly)

i này tuân theo quy lu t t ng kh n ng ch u nhi t.
i này là c n c lý gi i kh n ng ch u nóng c a gi ng

t bi n M103 [18]. Tr n Th Ph
chaperonin CCTδ t gi ng

c 1602 bp mã hóa cho 533 axit

ut

ng Liên và cs (2003), ã phân l p
ng

a ph

15

ng ch u

c gen

n Cúc Vàng, gen này g m

c bi t quan tâm bao g m: protein s c nhi t, môi gi i phân t , LEA...
1.3.4. Trên th gi i ã thành công trong vi c nghiên c u gen mã hóa protein

ut

ng và các trình t gen này ã

c công b trên ngân hàng gen th gi i.

T i Vi t Nam, ã có m t s tác gi nghiên c u v tính ch u h n và ã phân l p, gi i
trình t gen liên quan
trên các gi ng
ng

a ph

u t

n tính ch u h n c a cây

ut

ng, trong ó có chaperonin

ng khác nhau. Tuy nhiên, vi c nghiên c u các gi ng

ng c a các t nh

khu v c Tây Nguyên còn ít

16

c quan tâm chú ý.

u


Ch

- Máy phân tích axit amin t

ng 2

NGUYÊN LI U VÀ PH

ng - HP amino Quan SeriesII (Hewlett

Parkard, M )

NG PHÁP NGHIÊN C U

- Máy phân tích trình t gen ABI 3100 Genetic Analyzer (M )
2.1. NGUYÊN LI U

-B

2.1.1. Nguyên li u th c v t
Các gi ng

u t

- Pipetman các lo i (Gilson, Pháp)

ng

a ph

Kon Tum (ST), Ch mnga-

ng: Az mpa- Gia Lai (AZP), Sa Th y -

k L k (CNg) do Trung tâm Tài nguyên Di truy n

th c v t - Vi n Khoa h c Nông nghi p Vi t Nam cung c p.
Gi ng

a ph

ng Duy Linh- Lâm

Trung tâm Khuy n Nông t nh

ut

i ch ng HN9 do

ng nghiên c u

- Máy soi ADN (Bio-Rad, M )

Tên gi ng

Ký hi u

1

Duy Linh

DL

Gi ng

a ph

ng, Duy linh- Lâm

2

Sa Th y

ST

Gi ng

a ph

ng, Sa Th y- Kon Tum

3

mnga

CNg

Gi ng

a ph

ng, Ch mnga-

HN9

Gi ng

i trà

Ngu n g c

ôn5

Az mpa

AZP

Gi ng

- Máy li tâm l nh (
ng

c)

- Máy o pH (Metter Toledo, Th y S )
a

kL k

c tr ng ph bi n

c)

- Máy khu y tr n Voltex (

huy n Buôn

m nghiên c u: Các thí nghi m

c th c hi n t i Phòng thí nghi m

Di truy n h c và Công ngh gen, Khoa Sinh- KTNN, Tr
i h c Thái Nguyên. Các phân tích axit amin t

kl k
a ph

- N i kh trùng (Tomy- Nh t)
- Máy PCR (ABI System, M )

TT

HN9

- T s y (Anh)
- Cân i n t (Thu S )
- T l nh sâu – 850C (Sanyo, Nh t B n)

ng (DL) và gi ng

k L k cung c p.

B ng 2.1. Ngu n g c c a các gi ng

4

n nhi t (Techne, OSI, Anh)

c th c hi n t i Phòng thí nghi m tr ng

ng, Az mpa- Gia Lai

ng

ng và xác

i h c S ph m nh trình t gen

m Công ngh gen, Vi n Công ngh

sinh h c, Vi n Khoa h c và Công ngh Viêt Nam.
2.1.2. Hóa ch t, thi t b và

a

m nghiên c u

Hóa ch t: dùng cho các thí nghi m phân tích hoá sinh và sinh h c h c phân
t : g m các lo i hoá ch t mua c a các hãng Anh,

c, M , Trung Qu c: EDTA,

NG PHÁP NGHIÊN C U

2.2.1..Ph

ng pháp hoá sinh

2.2.1.1. Phân tích hóa sinh

(1) Xác

CTAB, TAE, Agarose…
Các hóa ch t thông d ng khác: axit citric, NaOH, NaCl, CH3COONa, ethanol
(70%, 100%), tris HCl 1M, chloroform, isoamyl alcohol, isopropanol, n

c kh ion,

NaH2PO4, Fe2( SO4), K3Fe( CN)6, CuSO4, ninhydrin…
Thi t b : Các thi t b chính

2.2. PH

c s d ng

phân tích hoá sinh và sinh h c

- Máy quang ph UV-Vis Cintra 40 (Australia)
- Máy i n di + b ngu n PowerPac 300 (Bio-Rad, M )

17

giai

n h t ti m sinh

ng lipit

D a vào tính ch t hoà tan c a lipit trong dung môi h u c
môi h u c

chi t rút, dung

c s d ng là petroleum ether [24].

M u em s y khô, bóc v , nghi n m n. Cân 0,05g m u cho vào m i ng
Eppendorf (3 ng Eppendorf / m u). Ti p theo, cho 1,5ml petroleum ether vào m i
ng, l c

phân t g m:

nh hàm l

o

u,

ng n l nh 4oC trong 24 gi , em ly tâm 12000 vòng/phút trong 20

phút, b d ch, l p l i thí nghi m 3 l n. Sau ó, s y khô m u còn l i trong epp
n khi kh i l

ng không

i r i cân m u. Hàm l

18

ng lipit

700C

c tính theo công th c:


Hàm l
Trong ó:
(2) Xác

ng lipit =

A− B
(%)
A

th i gian

c proteaza và hàm l

A: Kh i l

ng m u ban

B: Kh i l

ng m u sau khi lo i lipit

nh hàm l

u

(2) Xác

nh theo ph

ng pháp Lowry

Ho t

c mô t trong tài

l i 3 l n. Cho vào m i ng 1,5ml dung d ch

m photphat citrat ( pH=10 ),

b

Hàm l

o

o

trong t l nh 4 C qua êm, em ly tâm thu d ch

vòng/phút trong 20 phút r i thu l y d ch. Thí nghi m
ph UV

u

12000

nh ho t

H t n y m m bóc v l a, cân kh i l

nghi m. Thí nghi m

cl pl i3l n.

b

VH /mg =

c tính theo công th c :
AxHSPL
x 100%
m

ng protein (% kh i l

A : n ng

thu

nh hàm l

n: s
ng khô)

k: s

c khi o trên máy (mg /ml )

c tính d a trên

th

c tính theo công th c:

( n − k ) × D × HSPL
T ×m

o trên máy ng thí nghi m (mg/ml)

c xác

m: kh i l

thu phân pha l ng theo h

(3)

c x lý theo ph

ng d n s d ng máy phân tích axit amin t

ng pháp

nh tn ym m

ng protein tan
c xác

ánh gía kh n ng ch u h n

nh theo ph

giai

ng

c ngâm trong n

c 1h, sau ó

c

m

b ng dung d ch MS pha loãng 10 l n ch a sorbitol 7%. H t n y m m sau các

19

n cây non b ng ph

ng pháp ánh giá nhanh kh n ng ch u h n

ti n hành theo Lê Tr n Bình và cs (1998) [2].
u t

ng pháp Lowry

c mô t

ng pháp gây

h n nhân t o
Ph

(1) Chu n b m u

ng hàm l

ng protein tan

trong tài li u c a Ph m Th Trân Châu và cs (1998) [3].
2.2.2.

ng.

nh l

Hàm l

i v i các axit amin b c 1 và 9 - fluoreryl -

ánh giá kh n ng ch u h n thông qua phân tích m t s ch tiêu hóa

H t các gi ng

ng m u (mg)

T: th i gian enzym v i c ch t

nh trên máy HP - Amino Quant s d ng

i v i các axit amin b c 2. M u

o trên máy ng ki m tra (mg/ml)

D: s ml d ch chi t

ng m u (mg)

ng axit amin

metyl - cloroformat

giai

m

c s d ng làm thí

Trong ó:

ng và thành ph n axit amin trong h t

ortho-phtalADNehyt t o d n xu t

2.2.1.2

ng, nghi n nh , chi t b ng
4oc, d ch thu

HSPL: h s pha loãng
X : hàm l

m: kh i l

sinh

b ng

ng pháp Anson c i ti n theo mô

enzym proteaza

ng chu n xây d ng b ng tyrosin, và

HSPL: h s pha loãng

Hàm l

c

c ti n hành trên ng thí nghi m, ng ki m tra, o trên máy

c sóng 750 nm. Ho t

c sóng 750 nm v i thu c th Folin.
ng protein

nh theo ph

phosphat pH= 6,5 li tâm 12000 vòng/phút

Trong ó :

(3) Xác

ng

c a proteaza

enzym proteaza xác

quang ph

nh m c lên 5ml và o h p th quang ph trên máy quang

X%=

ut

nh ho t

t c a Nguy n V n Mùi ( 2001) [27].

Cân 0,05g m u ã nghi n nh , s y khô cho vào ng Eppendorf, m i m u l p

c

i ch ng là h t

xác

c không ch a sorbitol.

li u c a Ph m Th Trân Châu và cs (1998) [3].

D ch chi t

ng protein tan.

cl y

ng protein

Protein tan t ng s xác

b ng máy voltex,

1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày

20

giai

n cây non

c


H t

ut

ng n y m m gieo vào ch u (kích th

c 30cm x 30cm) ch a cát

vàng ã r a s ch, m i ch u tr ng 30 cây, m i gi ng tr ng 4 ch u. Thí nghi m

c

l p l i 3 l n trong i u ki n và ch

c

cho

m, khi cây

ut

ng

ng ch u h n c a các gi ng

ch u h n t

ng

ch m sóc nh nhau. Th i gian

ut

in

c 3 lá ti n hành gây h n nhân t o và ánh giá kh
ut

ng b ng cách xác

S cây héo: Tr s 1
S cây không b nh h
(4) Xác
và

nh ch s ch u h n t

nh t l thi t h i và ch s

S =

c d a trên 15 ch tiêu phân tích

1
sin α ( ab + b c + cd + ... + p a )

2

Trong ó:

nh t l cây s ng sót (%)

S: Ch s ch u h n t

S cây s ng
T l cây s ng sót =

i

c tính theo công th c

i.

(1) Xác

ng: Tr s 0.
ng

T ng s cây x lý

(%)

ng

i

a, b, c, … : Các ch tiêu theo dõi
: Góc t o b i 2 tr c mang tr s li n nhau

= 3600/15

15: S ch tiêu theo dõi
(2) Xác nh kh n ng gi n

=

W

c qua các giai

W

ft

W

fc

n x lý b i h n theo công th c

(5) Xác

nh m t s ch tiêu khác ch u tác

- Kh i l

(% )

ng t

khô, r i cân tr ng l

Trong ó:

- Xác
W(%): Kh n ng gi n

c c a cây sau khi x lý b i h n

Wft(g): Kh i l

ng t

i c a cây sau khi x lý b i h n (g)

Wfc(g): Kh i l

ng t

i c a cây không x lý (g)

nhi t

i c a r và thân lá: C t riêng r và thân lá, dùng gi y th m

ng t

nh kh i l
0

100 C r i xác

- Xác

ng c a h n

i trên cân phân tích.
ng khô c a r và thân lá: Các m u
nh kh i l

ng khô tuy t

c s y trong t s y

i.

nh t s ch u h n
T = Wr/Wtl

Trong ó :
(3) Xác

nh t l thi t h i do h n gây ra
a=

T: T s kh i l

c tính theo công th c

∑ ( N b) (%)
o

NC

Trong ó:

(6) Xác

ng c a r / thân lá khô

Wr: Kh i l

ng khô c a r (mg)

Wtl: Kh i l

ng khô c a thân lá (mg)

nh hàm l

ng prolin theo Bastes (1973) [33].

Tách chi t prolin: Nghi n 0,5 gram thân lá cây

a: T l thi t h i do h n gây ra (%);

ng tr

u t

ng ã x lý h n

b: Tr s thi t h i c a m i c p;

ng

c: Tr s thi t h i c a c p cao nh t;

d ch axit sunfosalisilic 3 %, li tâm 8000 vòng /phút trong 30 phút.Thu d ch làm thí

c h n, h n 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày trong c i chày x , thêm 10ml dung

No: S cây c a m i c p thi t h i;

nghi m. o h p th quang ph
Hàm l

N: T ng s cây x lý
Các tr s :

ng prolin
X%=

S cây ch t: Tr s 3

21

b

c sóng 520 nm.

c tính theo công th c:
AxHSPL
x 100%
m

22


Trong ó:

- Thêm 600µl isopropanol, l c nh ,
X : Hàm l

ng prolin (%)

A : N ng

thu

- Li tâm 5 phút, 13000 vòng/ phút, b d ch, úp xu ng gi y cho khô.
- B sung 300µl c n 70%, búng nh . Li tâm 5 phút, 13000 vòng/ phút, lo i
b c n (th c hi n 2 l n).

ng m u (mg)

- Làm khô ADN trong box b t qu t.

2.2.3. X lý k t qu và tính toán s li u
M i thí nghi m

c nh c l i 3 l n. S d ng toán th ng kê

th ng kê nh trung bình m u (x ) , ph
h s t

Xác
ch

xác

nh tr s

ng sai (σ2), và sai s trung bình m u ( S x ) ,

ng quan R… theo tài li u c a Chu V n M n và cs (2001) [22]. Các s li u

c x lý trên máy vi tính b ng ch

ng trình Excel v i m c ý ngh a α = 0,05 [32].

nh kho ng cách và thi t l p m i quan h gi a các gi ng

u t

ng b ng

ng trình NTSYS pc 2.02i.

2.2.4. Ph

M m

2.2.4.2. Ph

ng pháp tách chi t ADN t ng s t m m

T o b n gel agarose v i n ng
là TAE 1X. Tra m u và ch y

ng

ut

ng
ut

2.2.4.3. Ph

ng pháp nhân b n

c th c

i èn UV và ch p nh.

n ADN thu c gen mã hóa cho chaperonin

c hi u thu c gen chaperonin c a

ut

c i và chày x (c i chày ã

ut

c nhân b n

MC2: 5’- CGG GAT CCC TAC CTC ACA GTT ACA GTT ACA ATATCA TC

Thành ph n ph n ng

N ng

c kh ion vô trùng

- L y kho ng 200g m m

ng

B ng 2.2. Thành ph n ph n ng c a PCR

c 3 ngày tu i tách l y ph n thân m m r i em bao qu n

Quy trình tách chi t ADN t ng s

c th c hi n theo các b

ng ã

l nh

c vô trùng và

trong t

-850C

c sau:

nghi n nhanh trong

0

-85 C).

m r a, li tâm 15 phút, 12000 vòng/ phút, lo i b d ch n i.

c này làm 2 l n.
- Thêm 700µl

m dùng cho i n di

n th là 80V -100V, sau ó ADN

MC1: 5’- GCC ATA TGT CGG CAA TCG CGG CCC C
ng

t l nh sâu (-850C).

- B sung 0,8ml

thích h p. Dung d ch

n di v i hi u

c nhu m b ng ethidium bromide, soi d

ng pháp c a Gawel và CS (1991) [34].
ut

c kh ion.

ng pháp i n di ADN trên gel agarose

b ng k thu t PCR v i c p m i MC1 và MC2 do hãng Invitrogen cung c p

Quy trình tách chi t và làm s ch ADN t ng s t m m
hi n theo ph

- Hòa tan ADN trong 50 µl n

o n gen ADN

ng pháp sinh h c phân t

2.2.4.1. Ph

t l nh qua êm), ch có

d ch t a tr ng.

c khi o trên máy (mg /ml)

HSPL: H s pha loãng
m: Kh i l

t lên á (

m tách, mix nh ,

0

65 C trong 2h, sau ó l y ra

nhi t

Dung d ch

17,1

m cho Tap- plymerase

10 l n

2,5

DNTP

10mM

2

MC1

10pmol/µl

1

MC2

10pmol/µl

1

Khuôn ADN

100ng/µl

1

Tap- polymerase

5U/µl

T ng th tích

phòng 5 phút.
- Thêm 600µl cloroform:isoamyl alcohol ( 24:1 ), tr n

u 20 phút

- Li tâm 15 phút, 12000 vòng/phút. Hút c n th n 500µl d ch trong sang ng

ng (µl)

0,4
25µl

Chu k nhi t c a ph n ng PCR

c ti n hành theo ch

ng trình 94oC: 3

phút: (94oC: 1 phút, 55oC: 50 giây, 72 oC: 1phút 30 giây) l p l i 30 chu k : 72oC: 8
phút, 4oC: vô cùng.

eppendorf 1,5 ml m i ( b t a).

S n ph m PCR

23

c ki m tra b ng

24

n di trên gel agaroza (nh mô t

trên).


2.2.4.4. Ph

ng pháp tách dòng o n gen chaperonin

Tách dòng gen chaperonin

- B sung 150µl dung

c ti n hành b ng cách g n tr c ti p

n ph m

- Ti p

ch II,

c b sung 150µl dung

o nh b ng tay kho ng 3 l n.
ch III,

o nh b ng tay kho ng 3 l n.

PCR vào vet tách dòng Pjet 1.2 (Hãng Fermentas). Ph n ng g n có thành ph n

- Thêm 400µl chlorofom: isoamyl alcohol (24:1)

nh sau: H2O

- Ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 15 phút.

: 3,5µl

Dung dich

m cho T4 ligaza

: 1µl

S n ph m PCR: 3µl Vet Pjet 1.2

: 1,5µl

T4 Ligaza

: 1µl

T ng th tích
c ti n hành 12 ti ng

c bi n n p vào E. Coli DH5α. Các khu n
n ph m PCR
2.2.4.5. Ph

- Dùng pipet hút 400µl Natri axetat 3M, pH 5.2 và 1ml c n 100%.

- Ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 10 phút, lo i

c ch n l c trên môi tr

n ph m

c E.coli ch a vect tái t h p mang

0

- L y t bào kh bi n DH5α trong

l nh – 75 C

- Hòa c n ADN- plasmit trong 40 µl TE có ARNaza ( n ng

trên á 30 phút.

ch ph n ng g n (ligate) vào ng t bào kh bi n, sau ó
0

42 C, th i gian 1 phút 30 giây, sau ó

- B sung 300 µl môi tr

ng LB

0

200 v/p 37 C

ng LB

c

c E. Coli ch a plasmit c y vào 2ml môi tr

c ng v i ch t kháng sinh ampixilin (n ng

ng pháp thông
u cu i- ph

ng LB

100µg/ml). L c qua êm

ng

- L y 1,5 ml

b ng ph n m m Clustalx.

nhi t

ch nuôi c y vào ng eppendorf. Li tâm 5000 vòng/ phút trong

ch I, tr n

u b ng máy voltex.

25

nh

a Sanger
nhân trình

40C. Sau ó s n ph m nhân gen có g n hu nh quang

thu c n t bào.

- B sung 150 µl dung

ng nh t ó là xác

ng pháp enzym

n m i có g n hu nh quang và b hóa ch t chu n (kit)

370C, 200 vòng/ phút.

10 phút

ng

t gen b ng PCR v i Tap ADN polymeraza. Chu trình nhi t: 950C 36 giây, 50 0C 36

PRISM 3100 Avant Genetic Analizer. S li u nh n

ng pháp tách chi t ADN plasmit t vi khu n

- L y m t khu n

ki m tra

c bi n tính b ng nhi t và phân tích trên máy xác

m 370C qua êm

100µl/ml).

lo i ARN.

nh trình t gen b ng thi t b t

nh trình t ADN theo ph

giây, 72 0C 84 giây, k t thúc

ch a ampixilin (100µg/ml), Xgal và IPTG.
a c y vi khu n trong

ng pháp xác

tr c ti p thông qua ph n ng k t thúc
[41]. V i các

a môi tr

n nhi t 370C trong 1 gi

- i n di trên gel azaroza 1%

Xác

trên á 2 phút.

ng, sau ó nuôi l c t c

- C y tr i toàn b d ch t bào ã bi n n p trên m t

2.2.4.6. Ph

b

2.2.4.7. Ph

trong 1 gi .

- Gi

- Ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 10 phút, thu c n

-

trên á 30 phút.
- S c nhi t

- R a c n ADN- plasmit 1 l n b ng 600µl c n 70%.

Làm khô c n ADN – plasmit trong box c y.

ng LB ch a ampixilin, IPTG và Xgal.

ng pháp bi n n p ADN plasmit vào t bào E. coli ch ng DH5α

- Tr n 4µl dung

d ch n i thu c n

ADN- plasmit.
14 0C. Sau khi g n

nhi t

ADN-

plasmit t a – 200C ít nh t 2 gi .

:10µl

Quá trình g n

o nh

26

nh trình t ADN t

ng ABI

c x lý trên máy vi tính


Ch

ng 3

T QU VÀ TH O LU N
3.1.

ÁNH GIÁ CH T L

NG H T C A 5 GI NG

U T

NG

NGHIÊN C U
3.1.1.

c

m hình thái, kích th

c và kh i l

ng h t 5 gi ng

u t

ng

nghiên c u
K t qu phân tích
gi ng

ut

Ch mnga-

ng

c

a ph

m hình thái, kích th

ng: Duy Linh- Lâm

c và kh i l

ng 1000 h t c a 5

ng (DL), Sa Th y - Kon Tum (ST),

k L k (CNg), Az mpa- Gia Lai (AZP), và gi ng

trình bày trên b ng 3.1. B ng 3.1 cho th y h u h t các gi ng

i ch ng HN9
ut

ng

c

u có hình

Hình 3.1. H t c a 5 gi ng

tròn, màu h t có màu vàng và vàng nh t. Màu s c r n h t có màu nâu, nâu nh t và
en, ây là m t
Linh -Lâm

c tính quan tr ng trong vi c giám

gi ng này: h t dài d t lõm

c a 5 gi ng

DL
ST
CMG
NH9
AZP

Màu
v h t
Vàng
xanh
Vàng
nh t
Vàng
nh t
Vàng
Vàng
nh t

c

m chính c a

gi a, màu h t tr ng xanh, r n màu nâu nh t.

B ng 3.1. Màu s c, hình d ng, kích th

Gi ng

nh gi ng. Riêng gi ng Duy

ng có hình thái r t khác bi t so v i các gi ng khác,

ut

Màu

r nh t

Hình
d ng
h t

Nâu
Nâu nh t

c và kh i l

K t qu phân tích cho th y kh i l
ng t 65,26 (g) ± 0,34

ng theo th t t cao
3.1.2. Hàm l

c

R ng (mn)

Dài (mn)

Kh i l ng
1000 h t (g)

Dài d t

0,49±0,025

0,70 ±0,03

65,26 ± 0,34

Tròn

0,65± 0,01

0,78 ±0,02

135,86 ± 1,45

Tròn

0,70±0,032

0,76 ±0,01

119,95 ± 0,13

H t

c a 5 gi ng

ut

Nâu nh t

0,76 ±0,03

Tròn

0,62 ±0,01

0,79 ±0,01
0,73 ±0,02

145,34 ± 0,04
118,36 ± 1,55

ng

ng h t c a các gi ng

ut

u

ng nghiên c u

c s d ng

ng di n hóa sinh. K t qu phân tích hàm l
ng

ánh giá ch t
ng lipit và protein

c trình bày trong b ng 3. 2.

ng di n hóa sinh, ch t l

nh d a vào k t qu phân tích hàm l

ng h t c a các gi ng

ut

ng

c xác

ng protein, lipit và thành ph n axit amin trong

protein c a h t. B ng 3.2 cho th y hàm l

ng protein và lipit c a 5 gi ng

ng protein dao

ut

ng

ng trong kho ng t 33,12%

n 38,35%, k t qu này phù h p v i các tài li u ã công b [18], [24], [31]. Trong ó
DL và AZP là 2 gi ng có hàm l
có hàm l

ng protein cao nh t (38,35% và 37,87%), gi ng NH9

ng protein th p nh t (33,12%). Hàm l

ng protein c a 5 gi ng

c s p x p theo th t t ng d n là: NH9< ST< CNg< AZP< DL.

27

ng dao

ng g m có lipit, protein, hydratcacbon và các ch t khoáng. Trong

nghiên c u khá chênh l ch nhau, hàm l
Tròn

ut

n th p nh sau: HN9 >ST >CNg >AZP >DL.

ó protein và lipit là hai thành ph n quan tr ng

Trên ph

Nâu

ng 1000 h t c a 5 gi ng

n 145,34 (g) ± 0,04 , trong ó gi ng NH9 có kh i l

ng protein và lipit trong h t c a 5 gi ng
ut

ng h t trên ph

en

ng

1000 h t cao nh t 145,34±0,04 (g). Có th x p kh i l

ng h t

ng nghiên c u
Kích th

ut

DL : 2- ST : 3- CNg : 4 - NH9 : 5- AZP

28

ut

ng


Lipit là m t trong nh ng ch tiêu quan tr ng
k t qu phân tích

b ng 3.2 cho th y hàm l

ng trong kho ng t 12,26%

chúng tôi cho th y r ng các gi ng
ng lipit c a 5 gi ng

ng h t. T

3.1.3. Thành ph n axit amin trong protein h t c a 5 gi ng
Ch t l

ng lipit c a các gi ng nghiên c u dao

n 18,33%. NH9 là gi ng có hàm l

nh t (18,33%), gi ng DL có hàm l

cao. Hàm l

ánh giá ch t l

ng lipit cao

ng c a h t

ph

ut

và d a vào s c ký

ut

ng

a ph

ng có hàm l

ng lipit không

c s p x p theo th t t ng d n: DL<

ng

ng không nh ng ph thu c vào hàm l

ng pháp phân tích hàm l

h t c a 5 gi ng

ut

ng axit amin trong h t trên h máy HP- Amino Quant

, chúng tôi ã xác

nh

c hàm l

ng axit amin trong protein

ng.

AZP< CNg< ST < NH9.
Trong 5 gi ng

ut

ng nghiên c u, gi ng DL có hàm l

nh t (38,35%), nh ng hàm l

ng protein th p (33,12%) nh ng hàm l

B ng 3.2. Hàm l

ut

ng lipit l i cao (18,33%). Nh v y hàm

ng có m i t

ng quan ngh ch [18], [25].

ng protein và lipit c a h t 5 gi ng

Gi ng

Hàm l

ng protein

ut

Hàm l

ng (%TL khô
ng lipit

DL

38,35± 0,013

12,26± 0,013

ST

37,68± 0,018

16,37± 0,036

CNg

34,98± 0,032

14,67± 0,032

NH9

33,12± 0,020

18,33± 0,014

AZP

37,87± 0,013

12,53± 0,014

Trong các cây h
protein t ng s trong h t
v n có nh ng

ng protein cao

ng lipit l i th p nh t (12,26 %). Gi ng NH9 có hàm

ng protein và lipit trong h t

u, thì h t
ut

u t

ng có hàm l

Hình 3.2. S c ký

axit amin c a b t gi ng

ut

ng DL

Hình 3.3. S c ký

axit amin c a b t gi ng

ut

ng ST

ng protein cao nh t,

ng ch y u là protein d tr , tuy nhiên trong t bào

n polypeptit m i

c t ng h p, nh ng enzym nh proteaza,

amylaza….Các enzym này tham gia vào quá trình chuy n hóa các ch t nh : protein
d tr trong h t, tinh b t…cùng v i peptit là nh ng y u t tham gia vào quá trình
th m th u c a h t trong giai

n n y m m [18]. Vì v y, phân tích hàm l

protein và lipit trong h t là m t trong nh ng ch tiêu cho phép xác
ch ng ch u c a gi ng trên ph

ng di n hóa sinh.

29

ng protein

mà còn ph thu c vào thành ph n axit amin trong protein h t. B ng cách s d ng

ng lipit th p nh t (12,26%), k t qu nghiên c u
ng

ut

ut

ng

nh m c

30


K t qu phân tích thành ph n và hàm l
gi ng

ut

ng, chúng tôi thu

không phân tích
tính chung, k t qu

c trên máy t
c trình bày

ng axit amin trong protein h t c a 5

c 17 axit amin (3 axit amin còn l i, bình th
ng), trong ó hàm l

ng

ng cystein và cystin

c

b ng 3.3. Quá trình th y phân các m u nghiên

c u trong HCl s làm tryptophan b phân h y hoàn toàn, còn glutamin và asparagin
chuy n hóa thành axit glutamic và axit aspartic.
B ng 3.3. Hàm l
Axit amin

ng axit amin trong h t c a 5 gi ng

ut

ng (g aa/100g protein)

DL

ST

CNg

AZP

A. Aspartic

10.31

10.43

10.66

10.90

11.03

A.Glutamic

16.76

14.74

16.83

15.10

14.54

Serin

4.85

5.06

4.67

4.98

4.88

Histidin

3.29

3.38

3.17

3.55

3.46

Glycin

4.87

5.06

4.84

4.95

5.04

Treonin

4.12

4.33

4.09

4.39

4.28

Alanin

4.39

4.56

4.37

4.67

4.57

Arginin

7.23

7.48

7.07

7.13

7.42

Tyrozin

3.21

3.40

3.17

3.42

3.43

Cystein +Cystin

0.62

0.60

0.64

0.78

0.58

Valin

4.93

4.84

4.87

4.95

4.91

Metionin

0.96

0.91

1.03

0.93

0.87

Phenylalanin

5.52

6.02

5.65

5.82

5.81

Isoleucin

4.50

4.56

4.42

4.70

4.57

Leucin

7.58

7.96

7.65

7.91

7.86

0,78g/100gprotein). Gi ng CNg có hàm l

protein), th p nh t là gi ng AZP (0,87g/ 100g protein). Trong 5 gi ng

Hình 3.4. S c ký

Hình 3.5. S c ký
B ng 3.3 cho th y hàm l

Lysin

11.86

11.26

11.30

11.43

11.69

Prolin

4.98

5.42

5.56

4.39

5.07

t

(0,87g

ut

axit amin c a b t gi ng

ng CNg

ut

ng axit amin có ch a nhóm SH

ng HN9
u th p: metionin

n 1,03g/100g protein) còn cystein và cystin t

nghiên c u hàm l
hàm l

31

axit amin c a b t gi ng

(0,58g

n

ng metionin cao nh t (1,03g/100g
ut

ng

ng axit amin t ng s chênh l ch nhau không áng k , nh ng

ng m i lo i axit amin

t ng gi ng l i có s khác nhau.

32


ut

ng

c coi là lo i

u ch a proterin có ph m ch t t t nh t trong s

(2) Hàm l

ng protein trong h t c a các gi ng

u t

ng

các lo i protein th c v t. Các axit amin không thay th (treonin, valin, metionin,

Az mpa- Gia Lai (AZP), Sa Th y - Kon Tum (ST), Ch mnga-

phenylalanin, isoleuxin, leucin, lysin)

Duy Linh- Lâm

nghiên c u. Hàm l

u có trong thành ph n axit amin

ng prolin c a các gi ng

5,42g/100g, trong ó CNg có hàm l

ut

c

ng trong kho ng (4,39g

n

ng này cao nh t (5.56g/100gprotein), th p

nh t là gi ng NH9 (4,39g/100g protein). Hàm l

AZP là 2 gi ng có kh n ng ch u h n có hàm l

ng lysin cao nh t (11,86g-

i u này làm t ng giá tr c a

ut

ng v m t dinh d

(3) Lipit dao
hàm l

ng:

k L k (CNg),

ng t 33,12%

n

ng protein cao nh t (38,35% và

ng protein th p (33,12%).

ng trong kho ng t 12,53%

n 18,33 %. NH9 là gi ng có

ng lipit cao nh t (18,33%), hai gi ng AZP và DL có hàm l

ng lipit th p

nh t (12,26% và 12,53%).

ng

vì lysin v n là axit amin gi i h n trong g o và các lo i ng c c khác [18].

i ch ng HN9 dao

ó DL và AZP là 2 gi ng có hàm l

37,87%), gi ng NH9 có hàm l

ng lysin trong kho ng t (11.30g

n 11,86 g/100g protein), cao h n so v i các lo i ng c c, trong ó gi ng DL và

11,69g/1000g protein).

38,35%, trong

ng (DL) và gi ng

a ph

ut

ng

trên, trong ó có 7 lo i axit amin không thay th . Gi ng DL và AZP có hàm l

(4)

ã xác

nh

c 17 lo i axit amin có trong h t c a 5 gi ng

ng

lizin cao nh t (11,86g và 11,69g).
3.2. ÁNH GIÁ KH

N NG CH U H N C A 5 GI NG

3.2.1. Kh n ng ch u h n c a 5 gi ng

3.2.1.1. Ho t

ut

a proteaza và hàm l

UT

ng nghiên c u giai

NG

nh tn ym m

ng protein tan trong h t n y m m khi

x lý b i sorbitol 7%
Các proteaza óng vai trò quan tr ng trong c th s ng, nh t là trong th i k
n y m m c a h t. Khi h t n y m m, m t s proteaza

c t ng h p và ho t

ng

m nh, giúp cho quá trình phân gi i protein d tr di n ra m nh m nh m cung c p
các axit amin

t ng h p protein m i cho m m non phát tri n,

non có th sinh tr

ng phát tri n bình th

vi c tìm hi u v s bi n
Hình 3.6.S c ký
3.1.4. Nh n xét v

c

axit amin c a b t gi ng

ut

u t

ng

u nói chung và cây

ut

m b o cho cây

u ki n thi u n

c. Do v y,

proteaza và s phân gi i protein d tr trong

giai o n h t n y m m là m t trong nh ng c s

ng AZP

m hình thái, hóa sinh h t c a 5 gi ng

ánh giá tính ch u h n c a cây h

ng nói riêng.

Trong nghiên c u này chúng tôi ti n hành ánh giá kh n ng ch u h n c a 5

nghiên c u
(1) Các gi ng

u t

d ng h t khác nhau. Kh i l
65,26± 0,34(g)

ng ho t

ng trong

ng nghiên c u có kích th
ng 1000 h t c a 5 gi ng

c, kh i l
u t

ng dao

n 145,34± 0,04(g), trong ó gi ng NH9 có kh i l

145,34± 0,04(g), nh nh t là 2 gi ng

a ph

(118,36± 1,55g).

ng và hình
ng t

ng l n nh t

ng DL (65,24± 0,34g), và AZP

gi ng

ut

ng thông qua s bi n

giai o n h t n y m m d

i tác

ng v ho t

ng c a sorbitol n ng

t o áp su t th m th u cao, c nh tranh n
cn

c, gây ra s thi u n

ng protein

7%. Dung d ch sorbitol

c v i t bào h t làm cho h t không hút

c trong t bào. K t qu nghiên c u

trên b ng 3.4.

33

proteaza và hàm l

34

c trình bày


B ng 3.4 cho th y ho t
ng

u t ng d n và

tc c

proteaza và hàm l

ng protein c a 5 gi ng

u

i vào ngày n y m m th 7, sau ó gi m xu ng vào

ngày th 9. S có m t c a proteaza trong các h t d tr protein c a h t ang n y
m m là b ng ch ng v s tham gia c a chúng vào quá trình phân gi i các protein,

c quy lu t phân gi i proteaza t

Kim Dung (2003) [6], Nguy n Th Thu Ngà (2007), khi nghiên c u s bi n
ho t

proteaza

giai

B ng 3.4. Ho t

proteaza cao thì hàm l
th , trong 5 gi ng

u t

proteaza và hàm

ng bi u hi n r t khác nhau, gi ng có ho t

ng protein

u t

c phân gi i c ng t ng cao và ng

ng nghiên c u gi ng DL có ho t

ng protein cao nh t so v i các gi ng còn l i

c l i. C

proteaza và hàm

t t c các ngày tu i

c nghiên

Ho t

proteaza gi a 5 gi ng

ut

khác nhau v

c

m ph n

ST

NH9

AZP

1

0,61± 0,10

0,45± 0,02

0,53± 0,10

0,50± 0,02

0,59± 0,10

c a

VH /mg)

ng, ho c do s khác nhau v c u trúc gen mã hóa lo i enzym này d n

u
ns

phân gi i h t, nh ng không bào l n

c hình thành trong các t bào d tr , các

3

0,65± 0,10

0,63± 0,10

0,59± 0,02

0,57± 0,10

0,61± 0,04

5

0,78± 0,04

0,66± 0,10

0,61± 0,10

0,60± 0,02

0,75± 0,02

7

0,81± 0,20

0,69± 0,30

0,69± 0,03

0,67± 0,02

0,78± 0,03

9

0,72± 0,10

0,62± 0,10

0,65± 0,10

0,64± 0,06

0,68± 0,02

1

30,12± 0,29

21,12± 0,10

26,25± 0,27

20,79± 0,06

25,44± 0,12

3

30,16± 0,63

23,46± 0,20

29,07± 0,34

23,01± 0,34

30,80± 0,31

protein tan

5

34,48± 0,22

27,49± 0,21

30,90± 0,11

24,31± 0,06

31,15± 0,26

7

35,16± 0,01

31,00± 0,08

33,20± 0,53

27,93± 0,21

33,16± 0,01

9

31,24± 0,13

26,70± 0,32

29,99± 0,09

23,58± 0,02

27,99± 0,09

Y=27,20X+3,9

Y=34,61X4,84

Y=36,68X+6,89

R= 0,95

(R= 0,85 )

(R= 0,87)

(%)

phân gi i protein d tr gi a các gi ng c ng khác nhau. Protein d tr là ngu n
cung c p axit amin và nit cho m m phát tri n. Khi protein d tr trong h t b

Gi ng
CNg

ng

ng ch có th gi i

ng ki u gen c a các gi ng

s t
gi a ho t

ng quan (R)
c a proteaza

và protein

axit amin

c t o ra trong quá trình này

protein m i cho s sinh tr
ng protein

c s d ng

ng c a m m [18]. Ho t

proteaza càng cao thì hàm

ng th i có vai trò trong quá trình

K t qu nghiên c u v ho t
ut

c a proteaza và hàm l
ng

giai

ng protein cho th y

n h t n y m m là khác nhau.

Gi ng DL có kh n ng ch u h n t t nh t sau ó là gi ng AZP, CNg, ST và cu i

ng quan gi a s bi n

v ih s t

ng quan dao

Quá trình phân gi i protein d tr c a các cây h
ng ho t

giai o n h t n y m m c a 5 gi ng

u

proteaza và hàm l
ut

35

(R= 0,89)

3.2.1.2. Ho t

u gi ng nhau [18].
ng protein tan trong

ng có x lý sorbitol, chúng tôi nh n

ng ho t

(R= 0,75)

c a proteaza và hàm

ng protein ph thu c ch t ch vào ho t

ng t 0,75

proteaza

n 0,95. Trong ph m vi nghiên c u chúng

ng protein ph thu c tuy n tính vào ho t
a proteaza và hàm l

proteaza.

ng protein tan trong h t n y m m khi

không x lý b i sorbitol 7%
hi u rõ h n v s
trình h t n y m m, chúng tôi

cùng là gi ng NH9.

Khi nghiên c u v s bi n

Phân tích m i t

ng protein cho th y hàm l

tôi th y hàm l

ph c h i c a m m khi g p h n.

kh n ng ch u h n c a 5 gi ng

Y=35,01X+3,2 Y=27,03X+9,48

sinh t ng h p các

c hình thành do quá trình phân gi i protein d tr càng l n và

cung c p cho quá trình n y m m c a h t và

nh tn ym m

DL

proteaza

Hàm l

thích b ng s

giai

7%

Tu i m m
(ngày)

c u và th p nh t là gi ng NH9.
S khác nhau v ho t

ng protein tan

khi x lý b i sorbritol n ng

T k t qu nghiên c u chúng tôi nh n th y r ng, ho t

ng

n h t n y m m c a m t s gi ng l c [29].

c a proteaza và hàm l

các s n ph m peptit trong các bào quan ó [18].

ng protein c a 5 gi ng

ng t v i k t qu c a các tác gi . Nguy n Th

nh h

ng c a sorbitol lên ho t

proteaza trong quá

ng th i ti n hành nghiên c u cho h t n y m m trong

i u ki n th m m b ng dung d ch MS pha loãng 10 l n không có sorbitol. H t n y
m m sau các th i gian 1, 3, 5, 7 và 9 ngày
protein, k t qu

c trình bày trên b ng 3.6.

36

cl y

tách chi t proteaza và


B ng 3.5. Ho t

c a proteaza và hàm l

ng protein tan

giai

nh tn ym m

khi không x lý b i sorbritol
Tu i m m

Gi ng

(ngày)

DL

1

ST

0,41± 0,10

ut

(2) Trong giai o n h t n y m m 1,3,5,7 và 9 ngày tu i khi không x lý b i
sorbitol ho t

ng

và hàm l

CNg

0,35± 0,07

0,36± 0,04

NH9

proteaza và hàm l

ng protein

0,29± 0,02

0,39± 0,10

Ho t

3

0,53± 0,10

0,37± 0,03

0,38± 0,03

0,32± 0,10

0,43± 0,04

5

0,56± 0,01

0,44± 0,10

0,47± 0,10

0,35± 0,05

0,45± 0,02

VH /mg)

7

0,62± 0,20

0,48± 0,06

0,49± 0,04

0,37± 0,07

0,50± 0,03

ng protein trong h t n y m m khi x lý b i sorbitol 7%. Nh v y, áp

su t th m th u cao có nh h

ng r t rõ lên ho t

(3) Kh n ng ch u h n c a 5 gi ng

9

0,59± 0,06

0,45± 0,04

0,46± 0,03

0,34± 0,06

0,48± 0,02

1

24,12± 0,29

19,09± 0,10

22,25± 0,18

15,79± 0,04

22,44± 0,06

3.2.2. Kh n ng ch u h n c a 5 gi ng

ng

3

26,11± 0,63

20,06± 0,20

24,07± 0,02

16,01± 0,30

23,80± 0,19

protein tan

5

27,48± 0,22

23,13± 0,21

25,90± 0,04

18,23± 0,06

26,15± 0,05

s t
ho t

30,16± 0,11

25,32± 0,18

27,20± 0,26

20,00± 0,03

28,16± 0,11

25,24± 0,13

23,45± 0,14

24,99± 0,05

17,08± 0,20

26,09± 0,06

Phân tích nh h

Y=21,36x+15,34

Y=46,26X+2,87

Y=30,26X+11,38

Y=50,08X+1,27

Y=49,77X+2,93

giai o n cây non 3 lá trong

R= 0,74

(R= 0,99 )

(R= 0,94)

(R= 0,92)

(R= 0,95)

và protein

K t qu b ng 3.5 cho th y ho t
d n theo ngày tu i và

tc c

ngày th 9. Trong 5 gi ng

proteaza và hàm l

i vào ngày n y m m th 7, sau ó gi m xu ng vào
ut

ng, gi ng DL có ho t

protein cao h n so v i các gi ng còn l i
NH9. Qua k t qu thu

ng protein c ng t ng

proteaza và hàm l

t t c các ngày tu i, th p nh t là gi ng

c, chúng tôi nh n th y trong giai

1,3,5,7 và 9 ngày tu i khi không x lý b i sorbitol ho t
u th p h n so v i ho t

proteaza và hàm l

n h t n ym m

proteaza và hàm l

(1)

tc c

giai

n h t n y m m là

ut
ut

ng
ng

giai
giai

n cây non 3 lá
n cây non 3 lá d

ng c a h n

giai

gai

n h t n y m m, trong

ng r t rõ

c a proteaza và hàm l
i vào ngày th 7 b t

ng protein tan bi n
u gi m

giai

và AZP t ng cao nh t và th p nh t là gi ng
proteaza có m i t

nh tn ym m
u ki n b sung sorbitol n ng
i theo xu h

7%,

ng, phát tri n c a cây

ut

nh

c t l thi t h i do h n gây ra

c 5 gi ng

ng protein và

u

ng có s khác nhau và t ng theo th i gian gây h n. Gi ng có t l thi t h i th p
nh t là gi ng DL (h n 5 ngày là 11,67% ; h n 9 ngày 59,00%), và t l thi t h i cao
nh t là gi ng NH9 ( h n 5 ngày 26,67%; h n 9 ngày thi t h i 97,40%).
B ng 3.6. T l thi t h i giai

n cây non 3 lá c a 5 gi ng

Gi ng

ut

ng

n 5 ngày ( %)

u t ng nghiên c u (%)

H n 7 ngày ( %)

H n 9 ngày ( %)

DL

11,67

35,56

59,00

ST

20,00

58,89

88,00

CNg

14,44

43,33

75,56

NH9

26,67

64,00

97,89

AZP

12,20

38,90

64,40

ng quan thu n.

37

ng

ng nghiên c u (b ng 3.6). K t qu cho th y, t l thi t h i c a 5 gi ng

ng t ng d n và

n 9 ngày tu i, trong ó gi ng DL
i ch ng NH9. Hàm l

i tác

u ki n h n nhân t o thông qua tính t l cây héo và

t l cây ch t, chúng tôi ã xác
ut

n sinh tr

proteaza.

3.2.1.3. Nh n xét v kh n ng ch u h n

ho t

ng

ng

ng protein trong h t n y

m m khi x lý b i sorbitol 7%. Nh v y, áp su t th m th u cao có nh h
lên ho t

ng

u t

ng c a h n

7

c a proteaze

protein

3.2.2.1. T l thi t h i c a 5 gi ng

9
ng quan (R) gi a

proteaza.

khác nhau, gi ng DL có kh n ng ch u h n t t nh t sau ó là gi ng AZP, CNg, ST
và cu i cùng là gi ng NH9.

(%)

proteaza

AZP

proteaza

Hàm l

u th p h n so v i ho t

38


Tû lÖ thiÖt h¹i

B ng 3.7. T l cây s ng, kh n ng gi n

c và ch s ch u h n t

ng

i

120

c a 5 gi ng
100

c

80

60

m

ut

ng

DL

ST

CNg

NH9

AZP

% CKH sau h n 3 ngày

100,00

93,30

90,00

86,66

100,00

% CKH sau h n 5 ngày

86,66

73,30

76,66

66,70

83,30

% CKH sau h n 7 ngày

63,30

36,66

46,66

30,00

56,66

% CKH sau h n 9 ngày

30,00

13,00

16,66

12,66

26,66

% HP sau h n 5 ngày

75,00

37,50

57,14

30,00

60,00

% HP sau h n 7 ngày

35,70

20,52

25,00

14,28

29,40

% HP sau h n 9 ngày

23,80

14,00

16,00

8,00

18,18

T l r / thân, lá tr

21,06

20,00

14,69

13,71

14,96

T l r / thân, lá h n 5 ngày (%KLT)

42,52

28,21

16,57

21,40

34,16

T l r / thân, lá h n 7 ngày (%KLT)

55,00

22,10

24,14

20,68

28,05

T l r / thân, lá tr

47,10

33,33

34,42

26,90

38,38

39,67

23,52

36,03

17,35

38,83

40

20

0
5

7

DL

ST

9

CNg

Hình 3.7. T l thi t h i c a 5 gi ng

ut

3.2.2.2. T l cây s ng, kh n ng gi n
5 gi ng

ut

NH9

Sè ngµy h¹n

AZP

ng nghiên c u

5, 7, 9 ngày h n

c và ch s ch u h n t

ng

ic a

ng nghiên c u

Tính ch ng ch u c a cây tr ng nói chung và kh n ng ch u h n nói riêng là
tính tr ng a gen. Vì v y, chúng tôi ã kh o sát kh n ng ch u
ut

n

a các gi ng

ng thông qua theo dõi 15 ch tiêu v % cây không héo, % cây h i ph c, kh

n ng gi n

c, ch s ch u

nt

ng

i, t l r trên thân lá tr

c và sau khi x lý

Theo dõi thí nghi m cho th y sau khi x lý h n t i th i
ut

ng b t

ub

nh h

th p nh ng ngày h n ti p theo m c

nh h

l cây s ng và kh n ng gi n
sau th i

ng t ng lên rõ r t.

nh h

ng r t

c bi t, sau h n

u t ng. Gi ng DL sau 7 ngày h n có t

c cao nh t (63,30% và 29,07%), kh n ng ph c h i

m gây h n c ng cao h n, sau ó là gi ng AZP, th p nh t là gi ng NH9,

t l cây s ng ch

t 30,00%, kh n ng gi n

ngày t t c các gi ng

ut

ng nghiên c u

39

c

T l r / thân, lá h n 7 ngày (%KLT)

65,91

38,89

58,11

26,37

64,92

KNGN sau h n 5 ngày (%)

45,13

40,29

37,17

33,61

43,50

KNGN sau h n 7 ngày (%)

33,39

28,07

29,02

22,69

30,06

ng

i

8972,53 4447,87 5783,44 3529,76 7167,13

m h n 3 ngày cây

ng m t s cây b héo lá, nh ng m c

7 ngày t l cây héo và ch t c a các gi ng

c h n (%KLK)

T l r / thân, lá h n 5 ngày (%KLK)

Ch s ch u h n t

h n 3 , 5, 7 và 9 ngày, k t qu trình bày trên b ng 3.7.

c h n (%KLT)

t 21,05%. Sau khi x lý h n 12

u có t l ch t 100%.

% CKH (3,5 ,7 và 9 ngày) : % cây không héo sau 3, 5,7,9 ngày h n
% HP ( 5,7 và 9 ngày ) : % cây h i ph c sau 3,5,7,9 ngày h n
T s kh i l

ng gi a r t

i v i thân lá t

i (% KLT) tr

c h n, h n 5

ngày, h n 7 ngày (%)
T s kh i l

ng gi a r khô v i thân lá khô tr

c h n, h n 5 ngày, h n 7

ngày (%)
KNGN (5 và 7 ngày): Kh n ng gi n

40

c sau 5, 7 ngày h n (%)


T k t qu

ánh giá kh n ng ch u h n thông qua các ch tiêu nghiên c u

trên, chúng tôi ã tính toán

c ch s ch u h n t

ng

i c a các gi ng

ut

ng

n cây non 3 lá. Gi ng DL có ch s ch u h n cao nh t (Sn = 8972,53) sau

hàm l

ó là gi ng AZP (Sn = 7167,13), th p nh t là gi ng NH9 (Sn = 3529,76), nh ng
gi ng có ch s ch u h n t

l i. Kh n ng ch u h n

ng

giai

i l n thì có kh n ng ch u h n càng cao và ng
n cây non 3 lá c a 5 gi ng

theo th t : DL > AZP > CNg > ST > NH9. Nh v y,

ut

c

ng có th x p

c hai giai

nh tn y

m m và cây non gi ng DL có kh n ng ch u h n t t nh t.
3.2.2.3. ánh giá kh n ng ch u h n thông qua xác

ng prolin

giai

ng [37]. Vì v y, hàm l

có thêm c s

ng prolin

thân, lá trong

c h n; h n 3, 5 và 7 ngày giai
ng prolin
Hàm l

Gi ng
Tr

th i

th c v t

ánh giá kh n ng ch u h n.

ánh giá kh n ng ch u h n c a 5 gi ng

c u, chúng tôi ti n hành phân tích hàm l

B ng 3.8. Hàm l

ng prolin

m tr

ut

ng nghiên

u ki n h n nhân

n cây non 3 lá (b ng 3.8).

c và sau khi b h n

ng prolin (% kh i l

ng t

ut

ng b ng cách t ng nhanh hàm l

H n 5 ngày

H n 7 ngày

DL

0,46 ± 0,02

0,70 ± 0,03

0,99 ± 0,04

1,30 ± 0,10

ST

0,35± 0,02

0,56 ± 005

0,81 ± 0,08

1,03 ± 0,14

CNg

0,37 ± 0,07

0,63 ± 0,09

0,85 ± 0,23

1,13 ± 0,04

NH9

0,34 ± 0,01

0,47 ± 0,02

0,83 ± 0,10

0,88 ± 0,06

AZP

0,39 ± 0,03

0,71 ± 0,04

0,90 ± 0,02

1,14 ± 0,26

K t qu b ng 3.8 cho th y hàm l

ng prolin có s gia t ng theo th i gian b

h n, s gia t ng này có s khác nhau gi a các gi ng. Gi ng DL có hàm l

41

ng prolin

u t

ng sau khi b
c s thay

u ki n thi u n

c th c

ng axit amin prolin. Trong 5
ng prolin cao h n các

ng di n hóa sinh thì hai gi ng này có kh n ng

ch u h n t t nh t.
1,4
1,2
1

Tr

ch n

0,8

n 3 ngày

0,6

n 5 ngày
n 7 ngày

0,4
0,2
0
DL

H n 3 ngày

ng

ng. Theo m t s k t qu nghiên c u ã ti n hành trên

ng nghiên c u, gi ng DL và AZP có hàm l

i)

ch n

ng prolin c a các gi ng

ng có s ph n ng m t cách tích c c tr

ng khác nh lúa, thu c lá… cho th y trong

ng

u

ng prolin trong

u ki n khô h n có áp su t cao s t ng lên g p nhi u l n so

u ki n bình th

m: tr

c xem nh là m t ch t

i v i th c v t, hàm l

c xem là m t trong nh ng ch quan tr ng

ng

gi ng

ut

u ki n môi tr

it

ng prolin (% kh i l

lá và r cây s ng trong

ut

ic a
các

Hàm l

Trong s nh ng ch t có ch a nit thì prolin
hòa áp su t th m th u có vai trò quan tr ng

t o t i 4 th i

S t ng nhanh v hàm l

gi ng còn l i và nh v y v ph

o n cây non

v i s ng trong

c h n 0,39% h n 7 ngày là 1,14%. Gi ng NH9 có hàm l
c h n là 0,34% h n 7 ngày là 0,98% (ch t ng 2,58 l n).

h n ã ch ng t cây

v t ã ph n

nh hàm l

c h n là 0,46% h n 7 ngày là 1,30% (t ng 2,82 l n). Gi ng AZP có

ng prolin tr

prolin th p nh t, tr

i)

giai

ng cao nh t, tr

ST

CNg

NH9

AZP

Gi ng

Hình 3.8. Hàm l

ng prolin c a 5 gi ng nghiên c u

3.2.2.4. Nh n xét v kh n ng ch u h n
(1) Các gi ng

ut

gai

n cây non 3 lá

ng có s ph n ng khác nhau

t l cây s ng và kh n ng gi n

i v i h n, bi u hi n

c c a cây. Gi ng DL có ch s ch u h n t

ng

i cao nh t ( 8972,53), th p nh t là gi ng NH9 (3529,76). Kh n ng ch u h n
giai o n cây non 3 lá c a 5 gi ng

ut

ng có th x p theo th t t cao

nh sau: DL > AZP > CNg > ST > NH9.

42

n th p


(2) Hàm
gây h n và

ng prolin

thân, lá c a 5 gi ng nghiên c u t ng theo th i gian

u cao h n so v i

i ch ng NH9. Gi ng DL và AZP có hàm l

prolin cao nh t, gi ng NH9 có hàm l

ng

ng prolin th p nh t.

(3) K t qu nghiên c u v kh n ng ch u h n c a 5 gi ng
o n cây non 3 lá phù h p v i k t qu nghiên c u
3.2.3. M i quan h gi a 5 gi ng

ut

giai

ut

ng

giai

n h t n y m m.

ng d a trên s

bi u hi n c a các

tính tr ng
M i gi ng
ng c a môi tr
protein, hàm l

ut

ng có m t ki u gen quy nh m c ph n ng

ng lipit, hàm l

Chúng tôi ã xác

nh

ng axit amin, hàm l

ng (b ng 3.9) và s

ut

ng này b ng ch

hình cây (hình 3.11) mô t s phân nhóm c a 5 gi ng

ng trình NTSYS pc 2.02i.

B ng 3.9. H s khác nhau gi a 5 gi ng
DL

DL

0,000

ST

6,697

ST

CNg

Hình 3.9. S
ut

ng (%)
NH9

UT

AZP

4,756

2,012

0,000

8,161

8,175

4,548

3,857

5,175

1,157

ut

0,000

Ch mnga-

8,918

kh i lá m m, gi

ng có kh n ng ch u h n t t

giai

u có h s khác nhau cao h n trong c p v i gi ng

u này ph n ánh m c ph n ng

i v i h n c a các gi ng

nghiên c u là khác nhau và s khác nhau này là do ki u gen quy

k L k, Az mpa – Gia Lai và gi ng

ut

n

nh dung d ch

i

6M, CTAB 4%.

ng

nh. C p gi ng có

h s khác nhau th p nh t là AZP- CNg (1,157%), cao nh t là c p AZP- NH9
(8,918%). Hình 3.9 cho th y, 5 gi ng

ut

ut

ng phân b

2 nhóm chính: nhóm I là

gi ng DL, nhóm II phân thành 2 nhóm ph (nhóm ph I là gi ng AZP; nhóm ph II

-85°C cho

g m ba gi ng ST, NH9, CNg).

CÂY

ng

i ch ng NH9. M m

n khi s d ng. M m

tách chi t

c tách

c nghi n thành d ng b t

l nh -85°C. ADN c a h gen

c bi t v i

ut

c chi t ra kh i t bào

ng t bào c a chúng ch a nhi u protein nên

c b ng chloroform

ph m ADN. T 0,5g m i lo i chúng tôi thu
m u ADN có

u t

ng, Sa Th y – Kon Tum,

m chi t có ch a Tris HCL 1M, pH 8,0; EDTA 0,5M pH 8,0; NaCL

chúng tôi x lý d ch chi t thu

c sóng

ng

ng

ADN t ng s bao g m các gi ng: Duy Linh – Lâm

0,000

ut

N NG CH U H N

NG

m n trong c i chày x
B ng 3.9 cho th y, các gi ng
h t n y m m và cây non

N KH

Chúng tôi s d ng m m 3 ngày tu i c a 5 gi ng

0,000

CNg

ch ng NH9.

mô t m i quan h c a 5 gi ng

3.3. PHÂN L P GEN LIÊN QUAN

3.3.1. Tách chi t ADN t h gen c a 5 gi ng

NH9
AZP

ng

ng prolin, t l thi t h i...

c h s khác nhau v kh n ng ph n ng c a các gi ng

ut

Gi ng

i v i các tác

ng, d a trên s bi u hi n c a các tính tr ng nh : hàm l

tinh s ch

nh n ng

c 200µl d ch chi t ADN. Các

c ki m tra b ng ph

= 260 nm và 280 nm ADN h p th

Sau khi xác

lo i b protein ra kh i ch

ng pháp quang ph h p th
b

c sóng 260 nm.

, chúng tôi ki m tra ch ph m ADN b ng ph

ng

pháp i n di trên gel agarose 0,8%. K t qu cho th y, ch có m t b ng chính t p

43

44


trung các phân t ADN, có phân t l
c tách chi t t các gi ng

ch t và

ut

ng

m b o cho vi c s d ng
M

1

ng l n (hình 3.10).
ut

ng

i u này ch ng t , ADN

i s ch, không b

M

1

2

3

4

5

t gãy, ít t p

nhân b n gen b ng k thu t PCR.
2

3

4

5

1.6kb

Hình 3.11. Hình nh
5 gi ng

ut

n di

n gen chaperonin

c nhân lên b ng k thu t PCR

ng (M: Thang ADN chu n; 1- DL: 2- ST; 3- CNg; 4- NH9; 5- AZP)

3.3.3. Tách dòng s n ph m PCR và ki m tra vect tái t h p mang
Hình 3.10. nh

n di ADN t ng s t 5 gi ng

ut

ng

chaperonin b ng enzym gi i

M- Thang ADN chu n; 1- DL ;2 – ST; 3- CNg; 4 –NH9; 5 – AZP
3.3.2. Nhân gen chaperonin t bào ch t các gi ng
S d ng ADN h gen làm khuôn

ut

nm i

t ng h p d a vào trình t cADN c a chaperonin t bào ch t gi ng
l nh Nh t B n. Trên c s xác

nh

c n ng

ng, Sa Th y - Kon Tum, Ch mnga là xác

ut

g nm i

c

ng ch u

ng (Duy Linh - Lâm

k L k và Az mpa – Gia Lai), m c ích

nh s có m t c a gen chaperonin c a 5 gi ng

nhi t, nhi t

ut

3.3.3.1. Tách dòng

khuôn t i u cho ph n ng PCR,

chúng tôi ã ti n hành nhân gen chaperonin c a 5 gi ng

ut

c h xu ng 550C. ây là nhi t

ADN c a h gen. Sau 32 chu k ph n ng, s n ph m PCR

ng. Trong chu trình
t i u

g n m i vào

c ki m tra b ng

n

di trên gel agaroza 1% (hình 3.11).
K t qu nhân gen cho th y, c 5 gi ng
PCR v i kích th

c phân t là 1,6 kb. Kích th

ut

ng

c phân t c a cADN gen chaperonin gi ng

Nh t B n.

u này ch ng t

u t

chaperonin và không có intro trong c u trúc gen. L
ph n ng PCR

ut

ng ADN

c chính

ng Bonminori -

ng nghiên c u

th c hi n các nghiên c u ti p theo

45

c s n ph m

c s n ph m PCR nh n

b ng kích th

c 5 gi ng

u thu

u t

n gen

ng Duy Linh – Lâm

ng (DL) và NH9

ng b ng k thu t PCR

nhân gen chaperonin v i

n c a hai gi ng

u có gen

c nhân lên qua

n ph m PCR

a hai gi ng

ut

ng DL và NH9

t o c s cho vi c xác nh trình t gen chaperonin
trên sau khi ã nhân

cm ts l

tôi ti n hành tách dòng phân t
1.2. Tách dòng

ng l n

a hai gi ng

n gen này b ng

u t ng

thu t PCR. Chúng

n gen ã nhân v i vi c s d ng vet tách dòng Pjet

c th c hi n b ng cách g n tr c ti p s n ph m PCR vào vect tách

dòng plasmit Pjet 1.2 sau ó bi n n p vào ch ng E. coli và c y trên môi tr
l c có ampixillin. Trên môi tr

ng này, chúng tôi ã thu

ng ch n

c nhi u khu n c tr ng và

m t s khu n c xanh. Theo lý thuy t, các khu n c tr ng

c o ra t các t bào

mang vet có g n ADN ngo i lai. Nh m xác nh chính xác khu n c ó có mang

n

ph m PCR mong mu n hay không, chúng tôi ti n hành tách chi t ADN plasmit

a

m t s

khu n

c tr ng và ch n

pCR15(NH9) có ADN plasmit v i

c 3 khu n l c pCR9(DL), pCR11(DL),
di

3.3.3.2. Ki m tra vet tái t h p mang
ki m tra kích th

ng i n di cao h n

i ch ng.

n gen chaperonin b ng enzym gi i

c th c t c a

c t ki m tra các m u ADN plasmit thu

c b ng enzym EcoRI.

46

n

n ADN xen vào, chúng tôi ti n hành

trí c a enzym


này trong plasmit Pjet 1.2 n m

2 bên

a

10

n g n. N u vect tái t h p g n

20

30

40

50

60

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

n gen mong mu n thì sau khi c t b ng enzym gi i
ra m t

n plasmit tái t h p

v ng

n ADN dài kho ng 1,6kb.
K t qu

n di sau khi c t cho th y,

tái t h p có KTPT 1,6 kb t

n ADN

ng ng v i kích th

tách dòng. Vì v y, có th kh ng

c c t v ng ra kh i vect

c c a o n gen chaperonin c n

nh r ng chúng tôi ã ch n

c 3 dòng plasmit

AB004233

ATGTCGGCAA TCGCGGCTCC CCAACACAGA TCCTCGAAGA CAGAGTCCTA CGTGGACAAT

M103

.......... .......... ...G...... .......... .......... ...T.....C

Cuc vang

.......... .......... ...G...C.. .......... .G........ ...T.....C

DL-CHAP1

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

DL-CHAP2

.......... .......... ...G...C.. .......... .G........ ...T.....C

NH9

.......... .......... .......... .......... .......... ..........
70

tái t h p (2,3) c a m u DL và 1 dòng plasmit tái t h p (4) c a m u NH9 có ch a
o n chaperonin có kích th

c 1,6 kb (hình 3.12).
M

1

2

3

4

80

90

100

110

120

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
AB004233

AAGCGCAAGG AGGATATCCG CCATGCCAAC ATCGTGGCCG CACGCTCAGT CGCCAACGCG

M103

.......... .T..C..... ...C..G... .......... .......C.. ..........

Cuc vang

.......... .T..C..... ...C...... .......... .......C.. ..........

DL-CHAP1

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

DL-CHAP2

.......... .T..C..... ...C...... .......... .......C.. ..........

NH9

.......... .......... .......... .......... .......... ..........
130

140

150

160

170

180

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

1,6kb

Hình 3.12. i n di
M: Marker kích th

n ph m c t các plasmit tái t h p b ng enzym gi i

c phân t ; 1: Plasmit

Trình t gen chaperonin c a hai gi ng

u t

ng DL và NH9

ng pháp Sanger trên máy xác

c Clustal

các trình gen chaperonin c a gi ng

ut

t bi n ch u nóng M103 và gi ng

Vàng (CV) (hình 3.13).

47

nh trình t ADN t

ki m tra k t qu

chaperonin, s d ng ph n m m sinh

gi ng

.......... .......... C......... .......... C......... ..........
.......... .......... .......... .......... .......... ..........

DL-CHAP2

.......... .......... C......... .......... .......... ..........

NH9

.......... .......... .......... .......... .......... ..........
190

u

ng DL và NH9

ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analizer.

Cuc vang
DL-CHAP1

i ch ng âm; 2: plasmit pDL- Chap1;

3.3.4. K t qu gi i trình t nucleotit c a gen chaperonin c a hai gi ng

nh theo ph

GTTCGCACCA GTCTGGGCCC TAAGGGCATG GACAAGATGA TCTCCACCTC CTCCGACGAG
.......... .......... .......... .......... .......... ..........

n

3: Plasmit Pdl - Chap2; 4: Plasmit pNH9

hành xác

AB004233
M103

c ti n

u t

ng

a ph

ng ch u h n Cúc

220

230

240

AB004233

GTCATCATCA CCAACGACGG CGCCACCATC CTCAACAAGA TGCAGGTCCT CCAGCCCGCC
.......... ....T..... .......... .......... .......... ..........

Cuc vang

.......... ....T..... .......... ..T....... ......G... ......G...

DL-CHAP1

.......... .......... .......... .......... .......... ..........

LD-CHAP2

.......... ....T..... .......... .......... .......... ..........

NH9

.......... .......... .......... .......... .......... ..........
250

260

270

280

290

300

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

c trình t gen

ng ch u l nh Bominori – Nh t B n,

210

M103

ng

so sánh trình t gen này v i

200

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB004233

GCCAAGATGC TCGTCGAGCT CTCCAAGTCC CAGGACTCCG CCGCCGGCGA CGGCAGCACC

M103

.......... .......... .......... .......... .......... .....C...T

Cuc vang

.......... .......... .......... .......... .......... .....C..TT

DL-CHAP1

.......... .......... .......... .......... .......... .....C....

DL-CHAP2

.......... .......... .......... .......... .......... .....C...T

NH9

.......... .......... .......... .......... .......... .....C....

48