NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG MỘT SỐ KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN NHANH VIBRIO CHOLERAE GÂY DỊCH TIÊU CHẢY CẤP TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN NĂM 2008

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
-------------------------------

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
-------------------------------

PHẠM THẾ VŨ
PHẠM THẾ VŨ

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG MỘT SỐ KỸ THUẬT
CHẨN ĐOÁN NHANH VIBRIO CHOLERAE GÂY DỊCH
TIÊU CHẢY CẤP TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN NĂM 2008

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG MỘT SỐ KỸ THUẬT
CHẨN ĐOÁN NHANH VIBRIO CHOLERAE GÂY DỊCH
TIÊU CHẢY CẤP TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN NĂM 2008

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Mã số:

60.42.30

GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LƢU THỊ KIM THANH

THÁI NGUYÊN - 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

THÁI NGUYÊN - 2009



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Để hoàn thành luận văn này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô:
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số

Khoa Sau đại học, Khoa sinh - KTNN Trường Đại học Sư phạm Thái
Nguyên, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương, Viện Khoa học – Công nghệ Việt

liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa có ai công bố

Nam.

trong một công trình nào khác.

- TS. Lưu Thị Kim Thanh đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ giao đề tài, trực tiếp
hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này.

Tác giả

- Bs. Nguyễn Lê Minh giám đốc Trung tâm Y tế Dự phòng Thái Nguyên đã
giúp đỡ động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi về tinh thần cũng như vật chất
trong quá trình học tập.
- NCVC.Ts. Nghiêm Ngọc Minh Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam đã tận

Phạm Thế Vũ

tình giúp đỡ trong quá trình thực hiện luận văn
Tôi xin cảm ơn tới :
- Cán bộ khoa xét nghiệm Trung tâm Y tế Dự phòng Thái Nguyên, đặc biệt
nhóm cán bộ xét nghiệm vi sinh đã không quản ngày, đêm cũng như các ngày
nghỉ giúp đỡ tôi thu thập mẫu bệnh phẩm, phân lập vi khuẩn tả, pha chế các
loại môi trường, xử lý sấy hấp dụng cụ ...
- Các Bác sỹ, kỹ thuật viên khoa lây, khoa xét nghiệm của các bệnh viện trực
thuộc tỉnh Thái Nguyên (Bệnh viện Đa khoa Trung Ương, Bệnh viện A, Bệnh
viện C, Bệnh viện Gang thép, Trung tâm y tế các huyện thành) đã cùng tham
gia thu phập mẫu khi có bệnh nhân nhập viện.
Thái nguyên, ngày 30 tháng 9 năm 2009
Tác giả
Phạm thế Vũ


MỤC LỤC

Chƣơng 2. ĐÓI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Địa điểm, thời gian nghiên cứu

19

2.2. Nguyên liệu nghiên cứu

19

2.3. Hóa chất thiết bị

20

2.4. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu

21

Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Lý do chọn đề tài

1

2. Mục tiêu nghiên cứu

3

3. Những đóng góp mới của đề tài

3

4. Giới hạn nghiên cứu

3

5. Cấu trúc của luận văn

3

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình dịch tả trên thế giới và Việt Nam

4

1.1.2. Tình hình bệnh tả ở Việt Nam

8
11

1.2.1. Ổ chứa và nguồn bệnh

11

1.2.2. Tác nhân gây bệnh

11

1.2.3. Phương thức lây truyền

12

1.2.4. Tính cảm nhiễm

13

1.2.5. Diễn biến bệnh

13

1.2.6. Kháng nguyên và cấu trucas lớp vi khuẩn

14

1.2.7. Độc tố của vi khuẩn tả

16

1.2.8. Một số phương pháp phát hiện Vibrio cholerrae trong

18

phòng thí nghiệm

21

2.4.2. Cỡ mẫu và cách chọn mẫu

21

2.4.3. Phương pháp nghiên cứu

22

2.4.3.1. Các kỹ thuật lấy mẫu và vận chuyển bệnh phẩm

22

2.4.3.2. Các phương pháp chẩn đoán Vibrio cholerrae

24

2.4.3.3. Tiêu chuẩn đánh giá Vibrio cholerrae dương tính trong

27

4

1.1.1. Tình hình dịch tả trên Thế giới

1.2. Căn nguyên gây bệnh

2.4.1. Đối tượng nghiên cứu

nghiên cứu
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Đặc điểm chung của các đối tƣợng nghiên cứu

29

3.1.1. Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới, tuổi

29

3.1.2. Phân bố lấy mẫu bệnh phẩm theo địa điểm lấy mẫu

33

3.2. Đánh giá phƣơng pháp nghiên cứu phát hiện Vibrio

35

cholerae O1
3.2.1. Nhận biết vi khuẩn di động bằng kỹ thuật soi tươi

34

3.2.2. Nhận biết hình thể và tính chất bắt maufcuar vi khuẩn bằng

37

kỹ thuật nhuộm Gram
3.2.3. Phát hiện Vibrio cholerrae bằng kỹ thuật nuôi cấy

38

3.2.4. Nhận biết Vibio cholerrae bằng phương pháp test nhanh

52


3.2.5. Chẩn đoán Vibio cholerrae bằng kỹ thuật PCR

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

54

3.3. Đánh giá các kỹ thuật chẩn đoán Vibrio cholerae O1
CT

Cholerae Toxi ( Độc tố tả )

57

RNA

Acid deroxy ribonucleic

3.3.3. Kỹ thuật soi tươi với kỹ thuật nuôi cấy

58

DNA

Acid deoxy nucleic

3.3.4. Kỹ thuật nhuộm Gram với kỹ thuật nuôi cấy

58

E.coli

Escherichia coli (Vi khuẩn Ecoli )

3.3.5. Phương pháp test nhanh với kỹ thuật nuôi cấy

59
KIA

Kligler Iron Agar ( Môi trường song đường )

3.3.6. Kỹ thuật nuôi cấy với phương pháp PCR

60
N.A.G

Non Aglutinable Vibrios

3.3.1. Kỹ thuật soi tươi với kháng huyết thanh đặc hiệu

56

3.3.2. Kỹ thuật soi tươi và kỹ thuật nhuộm Gram

3.4. Tổng hợp kết quả các phƣơng pháp và thời gian

61

KẾT LUẬN

66

PCR

Polymerase Chain Reaction ( Phát hiện độc tố V.cholerae)

ĐỀ NGHỊ

68

RAPD

Random Amplified Polymorphic DNA

TÀI LIỆU THAM KHẢO

69
TCBS

Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose ( Môi trường chọn
lọc nuôi cấy vi khuẩn tả )

V.cholerae

Vibriocholerae (Vi khuẩn tả )


DANH MỤC CÁC BẢNG

18

Bảng 3.15

Phân biệt vi khuẩn tả với các phẩy khuẩn khác
thuộc nhóm N.A.G trên 3 loại đường

51

19

Bảng 3.16

Kết quả ngưng kết kháng huyết thanh đa giá và
đơn giá

52

20

Bảng 3.17

Phát hiện Vibrio cholerrae O1 bằng kỹ thuật test
nhanh

54

1

Bảng 1.1

Tình hình dịch tả ở Việt Nam từ tháng 10/2007
đến tháng 5/2008

9

2

Bảng 1.2

Phân lập V.cholerae typ cổ điển và typ Eltor

15

3

Bảng 2.1

Danh mục một số dụng cụ, hóa chất

20

4

Bảng 3.1

Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới, tuổi

29

21

Bảng 3.18

Tỷ lệ Vibrio cholerrae O1 bằng kỹ thuật PCR

55

5

Bảng 3.2

Tỷ lệ bệnh nhân theo tuổi

31

22

Bảng 3.19

57

6

Bảng 3.3

Phân bố bệnh nhân dương tính Vibrio cholerrae
theo giới tính

33

Đánh giá kỹ thuật soi tươi với kháng huyết thanh
đặc hiệu

23

Bảng 3.20

So sánh kỹ thuật soi tươi và kỹ thuật nhuộm
Gram

57

24

Bảng 3.21

Bảng so sánh kỹ thuật soi tươi với kỹ thuật nuôi
cấy

58

7

Bảng 3.4

Tỷ lên thu thập mẫu các địa điểm nghiên cứu

34

8

Bảng 3.5

Tỷ lệ vi khuẩn di động quan sát trên lam kính

36

9

Bảng 3.6

Tỷ lệ vi khuẩn Gram âm quan sát dưới kính hiển
vi

37

25

Bảng 3.22

Bảng so sánh kỹ thuật nhuộm Gram với kỹ thuật
nuôi cấy

59

10

Bảng 3.7

Phần đánh giá chung trong việc xác định các vi
khuẩn

38

26

Bảng 3.23

Bảng so sánh phương pháp test nhanh với kỹ
thuật nuôi cấy

59

11

Bảng 3.8

Tỷ lệ Vbrio cholerrae dương tính bàng kỹ thuật
nuôi cấy

39

27

Bảng 3.24

Đánh giá kết quả của phương pháp thử Oxidase
với kỹ thuật soi tươi

60

12

Bảng 3.9

Nhận xét tính chất khuẩn lạc trên môi trường
TCBS

41

28

Bảng 3.25

Bảng so sánh phương pháp nuôi cấy và PCR

61

13

Bảng 3.10

Nhận xét tính chất khuẩn lạc trên môi trường
thạch kiềm

43

29

Bảng 3.26

Tổng hợp kết quả các phương pháp và thời gian
được áp dụng

61

14

Bảng 3.11

Thời gian mọc khuẩn lạc trên 2 loại môi trường
nuôi cấy

44

30

Bảng 3.27

Một số phương pháp có thể áp dụng chẩn đoán
nhanh Vibrio cholerrae

62

15

Bảng 3.12

Bảng đọc kết quả trên môi trường sinh vật hóa
học

45

31

Bảng 3.28

Bảng so sánh kỹ thuật nuôi cấy với (bảng 3.27)

64

16

Bảng 3.13

Phản ứng Oxidase

47

17

Bảng 3.14

Đặc điểm nuôi cấy trên môi trường peptone kiềm

49


DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU

1

Hình 1.1

Biểu đồ khu trú vi khuẩn tả ở ruột non

17

2

Hình 2.1

Sơ đồ phân lập chẩn đoán Vibrio cholerrae O1

24

Dịch tiêu chảy cấp đang có chiều hướng gia tăng ở các địa phương, tính

3

Biểu đồ 3.1

Đánh giá độ tuổi trong thu thập mẫu

30

từ 23/10/2007 miền Bắc đã xảy ra ba đợt dịch tiêu chảy cấp nguy hiểm, số

4

Biểu đồ 3.2

Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới tính

32

bệnh nhân tiêu chảy cấp đã lên đến 1.335 người, có 136 trường hợp dương

5

Biểu đồ 3.3

Số mẫu thu thập tại 6 bệnh viện trong quá trình thu 35
thập mẫu

tính với phẩy khuẩn tả tại 18 tỉnh / thành phố trong cả nước trong đó có tỉnh

7

Hình 3.4

Hình thể Vibrio cholerrae soi tươi

Khống chế dịch tả là mục tiêu lớn trong chương trình quốc gia phòng
chống bệnh tiêu chảy của Việt Nam. Với những thành tựu và kinh nghiệm

Hình 3.5

Hình thể vi khuẩn nhuộm Gram

37

9

Biểu đồ 3.6

Tỷ lệ dương tính Vibrio cholerrae bằng kỹ thuật
nuôi cấy

40

10

Hình 3.7

Hình ảnh khuẩn lạc Vparaheamoliticus và Vibrio
cholerrae

42

Hình ảnh khuẩn lạc Vibrio cholerrae trên môi
trường thạch kiềm

42

Các môi trường sinh vật hóa học trong chẩn đoán
Vibrio cholerrae

45

12

Hình 3.8

Hình 3.9

Thái Nguyên [13].

36

8

11

1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

phòng chống dịch tả trong nhiều năm qua, ngày nay bệnh tả không còn là nỗi
khiếp đảm của mỗi người dân, của các tổ chức chính quyền và xã hội. Các
điều kiện chuẩn mực về kiểm soát môi trường ở nước ta còn lạc hậu. Các vấn
đề cung cấp nước, vệ sinh thực phẩm, dinh dưỡng an toàn và vấn đề xử lý vệ
sinh chất thải chưa làm được bao nhiêu, nhiều nơi còn bị buông lỏng hoặc
quên lãng. Trong thời kỳ giao lưu phát triển kinh tế và ngoại giao trong quan
hệ hợp tác giữa các nước trong khu vực và toàn cầu ngày càng được mở rộng
thì bên cạnh đó là những điều kiện rất dễ bùng phát các vụ dịch nói chung,

13

Hình 3.10

Hình ảnh phản ứng oxidase

47

14

Hình 3.11

Hình ảnh test nhanh Crystan VC

53

Thái Nguyên là tỉnh miền núi phía Bắc tiếp giáp với các tỉnh: Lạng

15

Hình 3.12

Phản ứng PCR

56

Sơn, Bắc Giang, Bắc Kạn, Tuyên Quang, Vĩnh Phúc, Hà Nội, là cửa ngõ giao

16

Biểu đồ 3.13

Tổng hợp các phương pháp chẩn đoán Vibrio
cholerrae

63

trong đó có dịch tả nói riêng [30].

lưu Kinh tế - Văn hoá – Xã hội thuận lợi giữa các tỉnh miền núi phía Bắc với
đồng bằng Bắc Bộ, là trung tâm đào tạo quan trọng đứng thứ 3 trong cả nước.
Trường Đại học Thái Nguyên với 6 trường đại học thành viên và trên 20
trường cao đẳng trung học dạy nghề. Toàn tỉnh hiện có gần 4000 cơ sở sản
xuất kinh doanh và chế biến dịch vụ phục vụ, trong số 1.150 cơ sở sản xuất
kinh doanh công nghiệp có hàng ngàn bếp ăn tập thể của công nhân, học sinh,
sinh viên… Hội tụ nhiều điều kiện thuận lợi như vậy tuy nhiên vẫn còn rất

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




nhiều khó khăn nếu không được quản lý chặt chẽ đó sẽ là nguồn lây nhiễm

2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

gây ngộ độc thực phẩm hoặc nguồn chứa mầm gây nên bệnh dịch.
Thực hiện công điện khẩn của Cục Y tế dự phòng và Môi trường, Bộ y
tế gửi các Trung tâm y tế Dự phòng các tỉnh thành trong cả nước “Tăng
cường giám sát vệ sinh an toàn thực phẩm trên địa bàn, giám sát chặt chẽ và
phát hiện sớm nhất căn nguyên gây tiêu chảy, xử lý khoanh vùng ổ dịch và
triển khai điều trị kịp thời, không để bệnh nhân tử vong” [30].
Cần phải báo cáo khẩn cấp khi có ít nhất một ca bệnh (kể cả ca đã xác

- Xác định tỷ lệ bệnh nhân dương tính với Vibrio cholerae (V. cholerae )
trong giai đoạn từ tháng 3 năm 2008 đến tháng 7 năm 2008.
- Đánh giá hiệu quả các kỹ thuật phát hiện Vibrio cholerae (soi tươi, nhuộm
soi, test nhanh, nuôi cấy, PCR)
- Lựa chọn những kỹ thuật phù hợp để áp dụng sàng lọc chẩn đoán nhanh

Vibrio cholerae tại labo tuyến huyện khi có dịch tiêu chảy cấp.

định hoặc nghi ngờ), dù ở khu vực dịch xâm nhập hay bệnh lưu hành, y tế cơ
sở nơi phát hiện phải báo cáo ngay theo chế độ báo cáo khẩn cấp của Bộ Y tế.

3. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

Bệnh nhân mắc bệnh tả nếu không được phát hiện sớm và điều trị kịp thời sẽ

- Đề tài nghiên cứu đã đánh giá các kỹ thuật phát hiện Vibrio cholerae trên

bị mất nước và chất điện giải dẫn đến tử vong. Bệnh tả lây truyền rất nhanh
qua đường tiêu hoá và môi trường (nước, chất nôn, phân, rác...) do vậy việc

mẫu phân của bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy cấp tại tỉnh Thái Nguyên.
- Đáp ứng tính ứng dụng và hiệu quả tại labo tuyến huyện.

phát hiện sàng lọc mẫu âm tính ngay tại cơ sở có ý nghĩa hết sức quan trọng,
không những giúp đỡ bệnh nhân có ngay phác đồ điều trị mà còn giúp các nhà

4. GIỚI HẠN NGHIÊN CỨU

dịch tễ có hướng xử lý khoanh vùng, chủ động trong phòng chống dịch,

- Thời gian nghiên cứu ngắn nên ứng dụng đánh giá hiệu quả sau phân tích

không để dịch lây lan rộng trong cộng đồng [4], [6].

chưa có số liệu đánh giá cụ thể.

Đáp ứng với tình hình thực tiễn kể trên, chúng tôi tiến hành đề tài:
" Nghiên cứu ứng dụng một số kỹ thuật chẩn đoán nhanh Vibrio cholerae

5. CẤU TRÚC CỦA LUẬN VĂN

gây dịch tiêu chảy cấp tại tỉnh Thái Nguyên năm 2008"

Ngoài phần mở đầu và kết luận, luận văn có 3 chương:
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương 3: Kết quả và bàn luận

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




- Vụ đại dịch thứ nhất: Lần đầu tiên ghi nhận bệnh tả xảy ra dưới dạng một

CHƢƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

đại dịch, vụ đại dịch này bắt đầu vào năm 1817 tại khu vực châu thổ sông
Hằng, sau đó lan tới nhiều nước thuộc châu Á vá châu Phi [5].
- Vụ đại dịch thứ hai: Lần đầu tiên bệnh tả gây dịch ở Bắc Mỹ năm 1832 tại

1.1.Tình hình dịch tả trên thế giới và Việt Nam

khu vực Quebec ( Canada), New York, Philadelphia, Washington. Trong vụ

1.1.1. Tình hình dịch tả trên thế giới
Bệnh tả được cho là xuất hiện cách đây hàng thế kỷ tại đồng bằng sông
Hằng của các tiểu lục địa Ấn Độ. Thế kỷ thứ XI những đợt dịch tả đã lan tràn
tới nhiều vùng trên thế giới từ Nam Á theo con đường buôn bán, hành hương
và di tản. Trong thời gian có đại dịch, nhiều vụ dịch lớn có tỷ lệ tử vong cao
đã xảy ra ở khắp thành thị châu Âu, châu Mỹ. Năm 1849, có một cuộc điều
tra nổi tiếng của John Snow (Bác sỹ người Anh) đã chứng minh nước là môi
trường truyền bệnh tả [48], [51].
Năm 1817 bệnh xuất hiện tại Châu Âu và Mỹ. Đến đầu thế kỷ 20 đã có
6 "làn sóng bệnh tả" lan khắp thế giới, tiếp đó đến những năm 60 phạm vi
"tung hoành" của vi khuẩn tả đã được "khoanh vùng" và cho đến những năm
gần đây chủ yếu bệnh xuất hiện ở Đông nam Á. Năm 1961 týp "El Tor" gây
dịch tại Philippin và tạo "làn sóng thứ bảy". Từ đó trở đi týp vi khuẩn này tiếp
tục gây những vụ dịch tại châu Á, vùng Trung Đông, châu Phi và một phần
châu Âu [2], [5], [10], [57].
Năm 1883, Robert Koch (nhà vi sinh vật người Đức) phân lập thành
công vi khuẩn từ phân của bệnh nhân biểu hiện các triệu chứng của bệnh này.
Có tài liệu cho rằng trước đó 30 năm nhà giải phẫu học người Ý đã phát hiện
ra phẩy khuẩn là nguyên nhân gây bệnh [43]. Các vụ đại dịch đều bắt nguồn
từ châu Á, sau đó lan tới các châu lục khác ở nhiều nước, trong nhiều năm.
Qua các vụ dịch, có một số ghi nhận đáng chú ý về dịch tễ học, sinh bệnh học,
điều trị và phòng chống bệnh tả được tóm tắt như sau:

đại dịch này, đầu những năm 1930, O’Shaughnessy là người đầu tiên chứng
minh phân của bệnh nhân bị bệnh tả có tính kiềm và có nồng độ điện giải rất
cao. sau phát hiện có ý nghĩa này, Latta đã điều trị thành công một số bệnh

nhân tả mất nước nặng bằng phương pháp tiêm tĩnh mạch dung dịch chứa
muối và điện giải [5], [47].
- Vụ đại dịch thứ 3: Dịch tả lan tới nước Anh, tại Luân Đôn, John Snow đã
phát hiện rất quan trọng về dịch tễ học là bệnh tả lan truyền theo đường nước
sinh hoạt bị ô nhiễm và từ đó đã đề ra biện pháp chống dịch hiệu quả là loại
bỏ nguồn nước sinh hoạt không hợp vệ sinh [17], [27], [61].
- Vụ đại dịch thứ 4: Dịch tả hoành hành dữ dội ở New Orleans và các thành
phố, thị trấn dọc theo triền sông Missippi, Missouri và Ohio của nước Mỹ [1],
[5], [62].
- Vụ đại dịch thứ 5: Dịch tả lan tới vùng trung cận đông, sau đó lan tới Nam
Mỹ, gây ra các vụ dịch lớn với tỷ lệ tử vong cao ở các nước Argentina, Chilê
và Peru. Tại Ai Cập và Calcutta (Ấn Độ), Robert Koch đã phân lập được vi
khuẩn tả từ phân của bệnh nhân bị bệnh tả , chỉ một năm sau khi Koch phân
lập được vi khuẩn tả, Ferran là người đầu tiên đã gây miễn dịch dự phòng
tả bằng vaccin [12], [45].
- Vụ đại dịch 6: Gây ra các vụ dịch lớn ở vùng Trung Cận Đông và bán đảo
Ban Căng, từ năm 1921 đến năm 1961, ngoài một vụ dịch tả lớn xảy ra ở Ai
Cập năm 1961 với 32.978 trường hợp tả, gây tử vong 20.472 người, dịch tả
chủ yếu lưu hành ở các nước thuộc khu vực Đông Nam Á và châu Á, trong 6
vụ đại dịch đầu tiên tác nhân gây bệnh là V. cholerae O1, typ sinh học cổ điển

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

do Pacini mô tả đầu tiên phân lập được năm 1854 và được nhà vi trùng học

trị bệnh tả nhưng tỷ lệ tử vong do bệnh tả vẫn ở mức độ cao, đặc biệt là khu

người Đức Robert Koch khảng định lại năm 1883[5], [46], [59].

vực châu Phi [3], [8], [53].

- Vụ đại dịch thứ 7: Tác nhân gây bệnh là V. cholerae O1, týp sinh học El

Những đặc điểm của týp El Tor giúp nó khẳng định khả năng "tiếp tục

Tor, do Goschlich lần đầu tiên phân lập được năm 1905 được chia làm 4 giai

gây nguy hiểm" bao gồm: Tỷ lệ nhiễm El Tor thấp hơn nhiều so với tỷ lệ

đoạn sau: Từ năm 1961-1962 dịch tả khu trú ở các đảo thuộc Indonesia và các

nhiễm týp cổ điển, thời gian mang trùng sau khi bị bệnh do El Tor dài hơn so

nước Đông Nam Á, với tổng số 13.393 người mắc, tử vong 1.977 người [49],

với trường hợp nhiễm týp cổ điển, El Tor có khả năng tồn tại ngoài môi

[55]. Năm 1963-1969 chỉ trong thời gian ngắn dịch xuất hiện nhiều nước châu

trường tốt hơn, dài hơn týp cổ điển. Chính vì vậy El Tor có khả năng gây dịch

Á: Ấn Độ, Pakistan, Liên Xô cũ, I-Rắc, Việt Nam bắt đầu có dịch tả El Tor

tại cả những nơi Týp cổ điển từng "tung hoành" [7], [36], [50].

vào tháng 1 năm 1964. Giai đoạn tiếp theo từ năm 1970-1990 theo số liệu của

Tháng 4 năm 1997, dịch bùng phát trong cộng đồng 90 ngàn người tị

Tổ chức Y tế Thế giới có 36 nước có dịch tả, điều đáng chú ý là tại Li Băng,

nạn Ruanđa ở Cộng Hoà Công gô. Chỉ trong 22 ngày đầu đã có 1.521 người

Syri chủng gây dịch là El Tor Ogawa, trong khi đó ở các nước liền kề như Ả

chết. Đa số các trường hợp chết đều do không được can thiệp kịp thời. Tại

rập-Xê út, Israel chủng gây dịch lại là El Tor Inaba.Tiếp theo những năm

Mỹ, dịch tả xuất hiện vào những năm 1800 sau đó được khống chế do đảm

1991 đến nay điều đáng chú ý ở nước Trung Mỹ và Nam Mỹ 21/23 nước có

bảo vệ sinh nguồn nước sinh hoạt. Tuy vậy, giao thông và du lịch tạo điều

bệnh tả, năm 1994 châu Mỹ La Tinh chiếm 50% số bệnh nhân tả trên toàn thế

kiện để bệnh xuất hiện lẻ tẻ. Đa số trường hợp do đi du lịch tại các nước Mỹ

giới.Tháng 7/1994 xảy ra một vụ dịch tả thảm khốc tại trại tỵ nạn ở Uganda

La tinh, châu Phi, châu Á. Một số trường hợp nhiễm bệnh do ăn thức ăn mang

với 58.057 trường hợp bị bệnh tả, tử vong 23.800 người, năm 1996 số người

về từ các quốc gia còn lưu hành bệnh [44], [52].

mắc tả ở châu Phi chiếm 60% tổng số các trường hợp mắc tả trên thế giới

Theo Nguyễn Anh Dũng, tính đến năm 1991, đại dịch tả lần thứ 7 đã có

[58], [60]. Tháng 12 năm 1992 một vụ dịch lớn lại sảy ra ở nước này. Vi

91 nước có dịch [6], đến năm 1992 theo Tổ chức Y tế thế giới đã có ít nhất 98

khuẩn gây bệnh được xác định là V. cholerae O139 "Bengal". Về mặt di

nước có dịch tả. Nhờ những hiểu biết đáng kể về căn nguyên gây bệnh, về

truyền, O139 "Bengal" hình thành từ El Tor nhưng cấu trúc kháng nguyên của

điều trị và cơ chế miễn dịch bệnh tả mà tỷ lệ tử vong do tả đã giảm xuống một

chúng cũng biến đổi. Tất cả mọi lứa tuổi (kể cả trong vùng đã có dịch ) đều có

cách đáng kể chỉ còn 1% - 3% [6].

thể bị nhiễm. Chủng O139 đã gây bệnh tại ít nhất 11 nước ở Đông nam Á

Phẩy khuẩn V. cholerae O1 bao gồm hơn 60 nhóm huyết thanh, nhưng

(tính đến năm 2005). Không có số liệu chính xác số người bị bệnh do O139 vì

chỉ có một nhóm huyết thanh O1 là gây được bệnh tả, V. cholerae O1 lại gồm

các nước không thông báo cụ thể các trường hợp bệnh do O1 hay O139 riêng

2 sinh týp là sinh týp cổ điển và sinh týp El-Tor, mỗi sinh týp lại gồm 2 týp

rẽ. Trong những năm cuối thế kỷ 20 dịch tả ngày càng trở nên nghiêm trọng,

huyết thanh (Ogawa và Inaba) [8], [22].

bệnh tả xảy ra ở tất cả các châu lục, tập trung chủ yếu ở những nước đang

Sinh týp El-Tor gây nên hầu hết các vụ dịch tả gần đây, tuy vẫn còn

phát triển, mặc dù y học có những hiểu biết đáng kể về sinh bệnh học và điều

nhiều vụ dịch xảy ra ở tiểu lục địa Ấn Độ là do sinh týp cổ điển. Sinh týp El-

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên






Tor có thể sống kết hợp với một sinh vật dưới nước, làm cho nước trở thành

hiện lại ở khu vực Tây Nguyên ( các tỉnh Đắc Lắc, Lâm Đồng, Gia Lai ) với

một kho tàng lưu trữ gây nhiễm [31], [54].

1.459 bệnh nhân mắc bệnh tả được thông báo [5], [11], [16].

Từ cuối năm 1992, dịch tả do V. cholerae O139 đã xuất hiện ở một số

Dịch tả hiện nay vẫn là gánh nặng đối với ngành y tế và toàn xã hội.

nơi thuộc Đông nam Ấn Độ, sau đó nhanh chóng lan tới Đông Bắc nước này

năm 1993 dịch xảy ra ở 21 tỉnh với 3.460 người mắc bệnh. Năm 1994 dịch

thuộc vịnh Belgan.Tháng 3/1993 dịch lớn sảy ra ở Bangladesh, tiếp đó xuất

xuất hiện ở cả miền Bắc, Trung, Nam và Tây Nguyên với 4.123 trường hợp bị

hiện ở Miama, Trung Quốc (Tân Cương,7/1993), Thailand (8/1993) đến tháng

bệnh. Năm 1995 có 29 tỉnh, thành phố báo cáo có bệnh nhân mắc tả với 6.088

9 cùng năm đã có nhiều trường hợp mắc tả V. cholerae O139 ở Malaysia [34].

trường hợp mắc bệnh tả. Năm 1996, cả nước có 630 trường hợp mắc bệnh tả

Người ta đã phân lập được V. cholerae non O1 ở các bệnh nhân tiêu chảy

ElTor ở 19 tỉnh, thành phố. Vài năm gần đây từ 2001-2002 nước ta vẫn có các

nặng thuộc 2 cộng đồng ở Florida.Tính gây bệnh đường tiêu hoá ở người và

trường hợp tả xảy ra, tuy nhiên bệnh không bùng phát thành các dịch lớn mà

sự đồng nhất hoá của những chủng này làm nảy sinh những câu hỏi về sự

chủ yếu là những ca lẻ tẻ ở khắp cả nước [5].

tương quan của những chủng V. cholerae O1 độc và không độc dọc bờ biển
Gulf của hoa Kỳ [39], [56].

Bảng 1.1. Tình hình dịch tả ở Việt Nam từ 10/2007 - 5/2008

Một đánh giá khảo sát trên tất cả các bệnh viện tư nhân ở Recife cho
kết quả trong 1.435 mẫu chỉ có 1 mẫu dương tính với V. chlerae El-Tor Inaba

Đợt 1

Đợt 2

Đợt 3

23/10/2007

24/12/2007

5/3/2008

1.907

58

3.480

5.445
908

(0.07%), 17 mẫu dương tính (1.2%) gồm V. cholerae non O1, V. fluvialis, V.

Ngày xuất hiện

fumissii, V. parahaemolyticus, V. spp. và rất ít gặp ở những người có điều

Tổng số mắc

kiện xã hội khá, ngay cả khi dịch đang xảy ra [49].

Số dương tính (+) với tả

295

32

581

1.1.2.Tình hình bệnh tả ở Việt Nam

Số tỉnh/thành có tả (+)

14

1

18

Hà Nội

Hà Nội

Hà Nội

0

0

0

06/12/2007

5/2/2008

22/5/2008

Bệnh tả là nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy cấp ở Việt Nam từ

Tập trung nhiều nhất tại

hơn một thế kỷ qua với 2 triệu trường hợp mắc bệnh tả được thông báo. Năm

Số tử vong

1937-1938 dịch tả từ Hồng Kông theo đường biển xâm nhập vào các tỉnh

Ngày kết thúc

Tổng

0

miền Bắc là Hải Phòng, Móng Cái, từ đó dịch lan sang theo đường sắt và
đường bộ tới nhiều tỉnh đồng bằng Bắc Bộ và Trung Bộ. Số người mắc lên tới

(Nguồn số liệu: Cục Y tế Dự phòng và Môi trường Việt Nam)

20.678 người, trong đó số chết là 14.992 người, tỷ lệ tử vong tới 70%. Bệnh
tả Eltor lần đầu tiên xuất hiện ở miền Nam năm 1964 với 20.009 người mắc

Nguyễn Phú Quý (1993) đã thông báo về những đặc điểm sinh học của

bệnh, trong đó 821 người tử vong. Từ đó đến nay, ở miền Trung và miền Nam

V. cholerae O139 và quy trình kỹ thuật phân lập xác định mầm bệnh với

bệnh tả xảy ra dưới dạng lưu hành, hàng năm có hàng trăm bệnh nhân bị bệnh

kháng huyết thanh đặc hiệu của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương [36].

tả được thông báo. Năm 1994 sau hàng chục năm vắng bóng, bệnh tả xuất

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Kết quả xét nghiệm phân lập được V. cholerae El-Tor có sự dao động
lớn giữa các tác giả, thấp nhất là 1,52 % và cao nhất là 45,70 %. Phan Đạo và

1.2. Căn nguyên gây bệnh
1.2.1. Ổ chứa và nguồn bệnh

cộng sự cho rằng thời gian đỉnh của vụ dịch tỷ lệ phân lập cao trên 50% [9].

Người là ổ chứa vi khuẩn tả quan trọng và cũng là nguồn bệnh, bao

Một số tác giả còn đưa ra tỷ lệ phân lập theo nhóm tuổi, tỷ lệ phân lập vi

gồm người mắc bệnh thể điển hình hoặc các thể nhẹ, không điển hình và

khuẩn tả dương tính ở nhóm tuổi 6-16 tuổi là 15,08 %, 17-50 tuổi là 44,56 %,

người mang mầm bệnh không triệu chứng (còn gọi là người lành mang trùng).

điều này càng chứng tỏ dưới 50 tuổi có tỷ lệ mắc tả cao [6], [7]. Tỷ lệ người

Sau vụ dịch tả có một tỷ lệ nhỏ (khoảng 3-5%) bệnh nhân các thể có khả năng

lành mang trùng, khi phân lập vi khuẩn tả ở những người lành trong các vụ

mang vi khuẩn tả kéo dài một vài tháng, đôi khi kéo dài hàng năm nếu không

dịch, các tác giả trong nước cho thấy rất thấp là 1% và cao nhất là 15% [9],

được điều trị đặc hiệu đúng quy định. Vi khuẩn tả có thể tồn tại lâu dài ở một

[14].

số loài nhuyễn thể (trai, sò, ngao...) vùng cửa sông hay ven biển. Đây là ổ
So với nhiều dịch bệnh mới xuất hiện và đang diễn biến phức tạp hiện

nay, bệnh tiêu chảy cấp nguy hiểm không phải là bệnh khó kiểm soát, dịch

chứa thiên nhiên của vi khuẩn tả ngoài ổ chứa quan trọng là người [15], [24].
1.2.2. Tác nhân gây bệnh

bệnh có thể bùng phát khi có đủ ba mắt xích liên kết với nhau (nguồn bệnh,

Tác nhân gây bệnh tả là V. cholerae lần đầu tiên được Pacini người Ý

đường lây, sức cảm thụ), cả 3 mắt xích này đã được xác định rất rõ bởi các

mô tả năm 1854 khi ông tìm thấy rất nhiều vi khuẩn hình cong trong ruột của

nhà dịch tễ học. Mặc dù chưa khẳng định được nguyên nhân gây bệnh, nhưng

bệnh nhân bị tả. Năm 1883 Robert Koch cũng tìm thấy tác nhân có hình thể

qua số liệu nghiên cứu của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, có thể khẳng

tương tự khi ông nghiên cứu bệnh tả ở Ai Cập, ông mô tả vi khuẩn có hình

định vi khuẩn tả xuất phát từ thực phẩm. Chưa bao giờ có một vụ dịch nào

dấu phẩy và Koch đặt tên là Vibrio comma, tên này được dùng mấy chục năm

phức tạp như bây giờ, gần như đồng loạt tất cả các Quận huyện của Hà Nội

trước khi người ta đổi tên là V. cholerae, để tưởng nhớ ông Pacini, V.

đều có dịch. Trong khi đó các ổ dịch lại không liên quan đến nhau, các bệnh

cholerae được xác định rất rõ thông qua các tính chất sinh vật, hoá học và sự

nhân không sống cùng nhau, không ăn cùng nhau [13].

đồng nhất của DNA, tuy nhiên chúng không đồng nhất về khả năng gây bệnh,

Tại tỉnh Thái Nguyên, sau nhiều năm không xuất hiện bệnh tả, đến

điều này đặc biệt quan trọng vì các chủng gây bệnh mới có khả năng sinh độc

ngày 13/11/2007 có 23 bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy cấp trong đó có 01

tố ruột và gây dịch. Một sự phân biệt đơn giản trong y tế cộng đồng là V.

bệnh nhân dương tính với V. cholerae O1. Dịch bệnh xuất hiện sau khi đã

cholerae thuộc nhóm huyết thanh O1 có khả năng sinh được độc tố, còn lại tất

được phát hiện tại nhiều tỉnh lân cận, hầu hết các trường hợp mắc bệnh là do

cả các nhóm khác thì không có khả năng gây bệnh hoặc rất hiếm khi gây

đến các vùng có dịch ăn uống phải thức ăn nhiễm khuẩn sau đó về địa phương

bệnh. V. cholerae O1 thuộc nhóm huyết thanh O1 có khả năng sinh độc tố và

và phát bệnh, tuy vậy dịch đã được khống chế thành công không lan rộng

gây thành đại dịch tả, tuy nhiên có một số ít chủng không sinh ra độc tố và

thêm và không truờng hợp nào tử vong.

không có gen mã hoá độc tố. Các chủng ở môi sinh không có khả năng sinh
độc tố và không gây bệnh, ngoại lệ có một só chủng V. cholerae O1 phân lập
được ở một số bệnh nhân tiêu chảy hoặc nhiễm trùng ngoài đường tiêu hóa,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




V. cholerae O1 gồm 3 týp huyết thanh là Inaba, Ogawa và Hikojima và bao

uống ô nhiễm phân có vi khuẩn tả và thức ăn có nguồn gốc thủy hải sản cửa

gồm hai sinh týp khác nhau là sinh typ cổ điển và sinh týp El tor [23], [35].

sông, ven biển có chứa các thể tiềm sinh lâu dài của vi khuẩn tả.

Những năm gần đây, khi các vụ dịch tả do V.cholerae O139 gây ra,

Bệnh tả lây mạnh nhất ở giai đoạn toàn phát của bệnh. Thời gian thải vi

việc định danh tất cả các chủng V. cholerae đều dựa trên tính chất sinh vật

khuẩn thường kéo dài khoảng 1 tuần sau khi hết tiêu chảy cấp. Một số ít bệnh

hoá học, sau đó nếu chủng nào không ngưng kết với O1 thì được gọi là

nhân có thể gây nhiễm sau mắc bệnh nhiều tuần, thậm chí nhiều tháng do khả

“Vibrio cholerae - không O1”, sau này được đổi thành Vibrio không gây tả

năng đào thải vi khuẩn tả từng đợt theo phân. Các yếu tố lây truyền vi khuẩn

hoặc “nhóm Vibrio không ngưng kết”. Hiện nay các nhóm này thuộc các

tả là nước, thực phẩm tươi sống, thực phẩm đã qua chế biến, bàn tay, dụng cụ

nhóm huyết thanh từ O2 - O138, không có khả năng gây dịch tả. Nhóm Vibrio

ăn uống, đồ dùng cá nhân và ruồi nhặng bị nhiễm phẩy khuẩn tả. Những yếu

này đôi khi gây tiêu chảy do liên quan đến ăn hải sản, hoặc các nhiễm trùng

tố nguy cơ làm tăng khả năng lan truyền bệnh tả là mật độ dân cư đông đúc,

ngoài đường tiêu hoá như vết thương...

đời sống kinh tế, xã hội và dân trí thấp, điều kiện vệ sinh an toàn thực phẩm

Vụ dịch tả xảy ra vào đầu năm 1993 tại Ấn Độ và Bangladaesh do một

không đảm bảo, nguồn nước sinh hoạt khan hiếm, thiếu nhà vệ sinh hợp tiêu

loại Vibrio non O1 gây ra, đó là V. cholerae O139 còn gọi là Vibrio Bengal.

chuẩn, vệ sinh môi trường không tốt, thực hành vệ sinh cá nhân kém, khu vực

Nhìn chung đây là một chủng lai giữa V. cholerae O1 và Vibrio cholerae -

bị lũ lụt và sau lũ lụt [32], [41].

non O1 và điều quan trọng là độc lực của nó là độc tố ruột và kháng nguyên

1.2.4. Tính cảm nhiễm

nhung mao đồng điều hoà độc tố, tuy nhiên chủng O139 giống với sinh týp
ElTor hơn [38], [41].

Mọi người đều có thể nhiễm vi khuẩn tả. Cơ thể sau khi mắc bệnh tả
hoặc nhiễm khuẩn không triệu chứng có miễn dịch đặc hiệu với chủng tả gây

Dựa vào độc tính vi khuẩn V. cholerae O1 có thể chia thành 2 nhóm

nhiễm nhưng thời gian miễn dịch thường ngắn, trung bình 6 tháng, không có

chính theo huyết thanh (serogroups) đó là O1 và O139. Nhóm O1 có hai týp

miễn dịch chéo giữa nhóm V. cholerae O1 với nhóm O139. Những nhóm

sinh học (biotype) ElTor và cổ điển, El Tor là tên của một trạm y tế ở Ai cập

người có nguy cơ cao với tả là những người tiếp xúc gần gũi (cùng ăn, uống,

nơi mà týp vi khuẩn này được phát hiện trong đại dịch năm 1907, hiện nay

sinh hoạt) với bệnh nhân tả, dân cư tại vùng có tập quán ăn uống không hợp

Eltor là thủ phạm chính của các trận dịch tả trên thế giới. Mỗi týp sinh học

vệ sinh, sử dụng thức ăn đường phố, hải sản chưa chín, nước chưa qua khử

Eltor hay cổ điển có thể chia thành 3 nhóm nhỏ theo huyết thanh là Ogawa,

trùng, dùng phân tươi trong trồng trọt, khu vực đồng bằng cửa sông, ven biển,

Inaba, Hikojima, mỗi nhóm còn có thể chia thành nhóm nhỏ hơn dựa vào

vùng bị ngập lụt [31].

kháng nguyên (antigen) A, B hay C [21], [33], [40].

1.2.5. Diễn biến bệnh
Thời kỳ ủ bệnh từ vài giờ tới 5 ngày, thường từ 2-3 ngày, thời kỳ khởi

1.2.3. Phƣơng thức lây truyền
Bệnh tả lây theo đường tiêu hóa, chủ yếu qua ăn uống. Vi khuẩn tả xâm

phát rất ngắn, bệnh nhân bắt đầu cảm thấy đầy bụng và sôi bụng; tiếp theo đó

nhập vào đường tiêu hóa của người lành từ 2 nguồn chính: Thức ăn, nước

tiêu chảy, lúc đầu có phân, sau chỉ toàn nước và kiệt sức nhanh chóng. Bệnh
nhân thường chỉ nôn sau khi đã tiêu chảy nhiều lần, thời kỳ toàn phát thường

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




có các triệu chứng tiêu chảy liên tục, nhiều lần, phân toàn nước, nước phân lờ

Týp Hikojima có kháng nguyên A, B, C.

lờ đục như nước vo gạo, trong đó có những vẩy màng màu trắng (là mảnh tế

Týp sinh vật: Chủng V. cholerae O1 được chia thành 2 týp sinh vật là týp cổ

bào thượng bì niêm mạc ruột lẫn phẩy khuẩn tả). Bệnh nhân không đau bụng,

điển và týp ElTor.

mót rặn và không có nhày máu mũi. Số lần tiêu chảy và số lượng nước mất

Bảng 1.2. Phân lập V. cholerrae týp cổ điển và týp Eltor

thay đổi tùy từng trường hợp nặng nhẹ khác nhau như nôn dễ dàng, lúc đầu
nôn ra thức ăn, sau chỉ toàn nước trong hoặc vàng nhạt, tiếp theo các triệu

Tính chất

chứng khác bệnh nhân không sốt, người mệt lả, có thể bị chuột rút, biểu hiện

V. cholerae

V. cholerae

týp cổ điển

týp Eltor

tình trạng mất nước từ độ I đến độ III như khát nước, da khô, nhăn nheo, hốc

Làm tan hồng cầu cừu

Nhậy

Kháng

hác, mắt trũng, mạch nhanh, huyết áp hạ, có khi không đo được, tiểu tiện ít

Ngưng kết hồng cầu gà

-

+

hoặc vô niệu, chân tay lạnh... Ngoài ra bệnh nhân có thể bị rối loạn thăng

Polymixin B 50đv

-

+

bằng điện giải như hạ kali máu [5], [19].

Phage IV

Nhậy

Kháng

1.2.6. Kháng nguyên và cấu trúc lớp vỏ vi khuẩn
Sự thay đổi tính chất kháng nguyên là yếu tố quan trọng trong nghiên

Nội độc tố có mặt trong phẩy khuẩn cũng như trong các vi khuẩn Gram

cứu dịch tễ và độc lực của vi khuẩn. Đối với vi khuẩn tả, khả năng gây thành

âm khác. Chúng ta còn biết ít về cấu trúc lớp vỏ liposaccharide của phẩy

dịch của chủng Bengal nói trên là môt ví dụ minh hoạ. Nhiều loại vi khuẩn

khuẩn. Tuy nhiên, một số đặc điểm đặc thù của lớp vỏ phẩy khuẩn cũng đã

khác trong môi trường nước cũng có kháng nguyên roi như vi khuẩn tả vì vậy

được nghiên cứu. Điều quan trọng nhất là sự thay đổi cấu trúc lớp vỏ có thể

không thể căn cứ vào loại kháng nguyên này để phân biệt. Týp huyết thanh

xảy ra trong cả điều kiện in vitro lẫn in vivo. Đây có thể là một nguyên nhân

phẩy khuẩn đã được phân biệt dựa trên đặc điểm vào kháng nguyên O ( kháng

dẫn đến sự biến đổi của các chủng không có độc lực trong tự nhiên thành

nguyên vỏ). Hầu hết các chủng vi khuẩn tả đều không có độc tính. Chủng

chủng cổ điển có khả năng gây thành dịch và ngược lại.

Bengal gây thành dịch được định danh là O1. Tuy vậy có tới 3 týp sinh học

Phân nhóm V. cholerae O1 là các vi khuẩn gây dịch tả và V. cholerae

của O1 được gọi tên Ogawa, Inaba và Hikojima. Mỗi chủng trong 3 loại này

không phải nhóm O1 / không phải O139 ( gọi tắt V. cholerae non – O1 / non -

có khả năng thể hiện đặc tính của chủng cổ điển hay của El Tor. Chủng

O139) hay nhóm N.A.G ( Non Aglutinable Vibrios ) các phẩy khuẩn không

Bengal O139 là chủng huyết thanh mới có kháng nguyên O đặc thù. Đặc tính

ngưng kết, gồm các vi khuẩn có tính chất sinh vật hoá học giống V. cholerae

kháng nguyên đặc thù của Bengal O139 có thể giúp chúng ta giải thích vì sao

nhóm O1, nhưng không ngưng kết với kháng huyết thanh O1, nhóm này có

cơ thể không có miễn dịch sau khi bị bệnh [5].

thể gây bệnh nhẹ không thành dịch. Đặc điểm chủ yếu của những chủng này

Các kháng nguyên vỏ của phẩy khuẩn gồm:

là không sản xuất độc tố tả và không liên quan tới dịch tiêu chảy. Những

Týp Ogawa có kháng nguyên A và B;

chủng này được phân lập tình cờ từ những trường hợp tiêu chảy do ăn tôm

Týp Inaba có kháng nguyên A và C;

cua hoặc từ những nhiễm trùng ngoài ruột khác như: Vết thương, tai, đờm,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




nước tiểu, dịch não tuỷ. Phẩy khuẩn thuộc nhóm này được tìm thấy ở cửa

gồm 5 tiểu phần B và một tiểu phần A, tiểu phần B trưởng thành có 103 acid

sông, các nhiễm trùng do các chủng này thường bắt nguồn từ ngoại cảnh,

amin và có trọng lượng phân tử 11.5 KDa, tiểu phần A có trọng lượng phân tử

V. cholerae O139 ( chủng Bengal ) lúc đầu, vi khuẩn gây vụ dịch này liên

29 KDa gồm 2 chuỗi polypeptide (A1 có trọng lượng phân tử 23.5.KDa và A2

quan tới vi khuẩn tả non-O1 vì nó không ngưng kết với kháng huyết thanh O1

có trọng lượng phân tử 5.5 Kda), hai tiểu phần nối với nhau bằng cầu disulfit.

nhưng triệu chứng lâm sàng rất dữ dội và giống tả. Chủng V. cholerae O139

Bản chất miễn dịch học của độc tố tả CT giống hệt độc tố ruột không chịu

được cho là chủng lai của chủng V. cholerae O1 và chủng non ( có tính chất

nhiệt của E.coli sinh độc tố [5].

sinh vật hoá học giống V.cholerae nhóm O1, nhưng không ngưng kết với
kháng

huyết

thanh

O1).

CácVibrio

khác:

V.

parahaemolyticus,

V. alginolyticus, các Vibrio nhóm F.V. parahaemolyticus được coi là một
trong những nguyên nhân quan trọng gây ngộ độc thực phẩm do ăn hải sản
sống hoặc chưa được nấu kỹ với các triệu chứng viêm ruột và tiêu chảy cấp
tính [5], [44].
1.2.7. Độc tố của vi khuẩn tả
V. cholerae sinh ra rất nhiều sản phẩm ngoại tế bào. Đặc điểm tiêu chảy
mất nhiều nước là do độc tố ruột gây ra được gọi là độc tố tả cholerae toxin
(CT). Những nghiên cứu trên người tình nguyện cho thấy CT là nguyên nhân
chủ yếu gây bệnh tả, tuy nhiên các chủng tả nếu loại bỏ gen mã hoá CT vẫn
có thể xảy ra tiêu chảy nhẹ hoặc vừa ở nhiều cá thể. Điều này có thể suy ra

còn có những yếu tố nào đó hay loại độc tố nào khác ngoài CT. Độc tố tả
được Robert Koch mô tả từ năm 1884 khi ông cho đó là một chất độc đặc
biệt tác động lên tế bào biểu mô ruột. Năm 1959 có hai nhà khoa học nghiên
cứu độc lập tại Ấn Độ là De và Dutta đã đưa canh khuẩn tả vào ruột thỏ và

Hình 1.1. Biểu đồ khu trú của vi khuẩn trong ruột

10 năm sau Finkelstein và LoSpalluto đã tinh chế được độc tố này cho phép

non />
nhiều nhà khoa học nghiên cứu về lĩnh vực cấu trúc, thụ thể bám và cơ chế tác

(Phẩy khuẩn tả tiếp xúc và gắn với các tế bào niêm mạc ruột thỏ qua thí

dụng của CT [43].

nghiệm quan sát dưới kính hiển vi điện tử).

Cấu trúc độc tố tả bao gồm hai tiểu phần A và B, tiểu phần B có tác

Khi theo nước uống hay thức ăn vào trong dạ dày, vi khuẩn chịu tác

dụng bám dính vào thụ thể đặc hiệu của tế bào biểu mô ruột, tiểu phần A có

động của dịch dạ dày có độ pH thấp ( môi trường axit ). Những vi khuẩn sống

chức năng enzym đặc hiệu có khả năng chui vào tế bào chủ. Độc tố CT bao

xót sẽ tiếp tục xuống ruột non. Ở ruột non, vi khuẩn có khả năng tồn tại rất

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên






tốt. Phẩy khuẩn có khả năng kháng tác động của muối mật, xâm nhập qua lớp

Phương pháp Real-time PCR.

màng nhầy trên niêm mạc ruột. Quá trình xâm nhập được hỗ trợ bởi men tan
nhầy và các men phân cắt protein thành các peptide. Do khả năng "tự bơi", vi

CHƢƠNG II

khuẩn có thể chuyển động ngược chiều với nhu động ruột để tiếp cận với
niêm mạc ruột nhờ đặc điểm hoá hướng động của chúng.

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Khả năng gắn kết và cố định vào tế bào niêm mạc có thể được hỗ trợ
bởi các "sợi lông" của chúng kết lại thành bó ở một đầu vi khuẩn. Các sợi này

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

được gọi là toxin coregulated pili là các sợi phối hợp điều hoà độc tố. Biểu
hiện các gene của các lông này liên quan đến gene quyết định độc tố của vi

khuẩn. Chúng ta chưa có hiểu biết đầy đủ về tác động qua lại giữa các toxin
coregulated pili với tế bào vật chủ. Các thụ quan trên về mặt tế bào tiếp nhận
các sợi này cũng chưa được xác định. Chuỗi amino acid của coregulated pili
tương tư như N-methylphenylalamine pili của Pseudomonas và Neisseria.
Men tan nhầy của phẩy khuẩn giúp chúng phân giải các protein như
fibronectin, lactoferrin và phân giải chính độc tố của nó. Vai trò của men
trong cơ chế gây độc vẫn còn là câu hỏi vì đột biến gene của men này vẫn

Đề tài được tiến hành từ tháng 3 năm 2008 đến tháng 9 năm 2009.
Thu thập mẫu nghiên cứu từ những bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy cấp
nghi ngờ mắc tả tại các khoa lây của 6 bệnh viện trên địa bàn tỉnh Thái
Nguyên.
Chẩn đoán xác định V. cholerae tại phòng thí nghiệm vi sinh Trung tâm
Y tế Dự phòng Thái Nguyên.
Thực hiện kỹ thuật PCR tại phòng vi khuẩn đường ruột Viện Vệ sinh
Dịch tễ Trung ương.

không làm giảm độc lực của vi khuẩn. Có giả thuyết cho rằng men tan nhầy
có tác dụng giúp vi khuẩn tách khỏi tế bào chứ không hỗ trợ quá trình gắn kết
vì vi khuẩn có xu hướng tách khỏi các tế bào trần để tìm đến những tế bào
khác mới [26].

Gồm các chủng V. Cholerae phân lập được từ bệnh nhân trong quá
trình nghiên cứu.

1.2.8. Một số phƣơng pháp phát hiện V. cholerae trong phòng thí nghiệm
Phương pháp soi kính hiển nền đen;

Bao gồm các dụng cụ thông thường được sử dụng trong phòng thí
nghiệm vi sinh và sinh học phân tử (Đèn cồn, tăm bông, que cấy, hộp petri,

Phương pháp nuôi cấy;

pipette pasteur, ống nghiệm, pipette man, đầu col các loại, ống eppendorf các

Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang dùng kháng huyết thanh O1;
Phản ứng đồng ngưng kết dùng kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên O1;
Phản ứng ELISA dùng hạt nhiễm từ để tìm CT;

cỡ, dung dịch glycerin, nước muối sinh lý, lọ đựng mẫu 100ml vô trùng, găng
tay cao su, khẩu trang, túi ninol các loại, hộp bảo quản mẫu, phích lạnh…)
2.3. Hóa chất thiết bị

Kít chẩn đoán nhanh Cholera Screen;

Các loại hóa chất sử dụng trong thí nghiệm khi thực hiện luận văn là các sản

Chẩn đoán bằng phương pháp sinh học phân tử ( PCR);

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2.2. Nguyên liệu nghiên cứu



phẩm của các công ty hóa chất có uy tín trên thế giới và có độ tinh khiết cao.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Bảng 2. 1. Danh mục một số dụng cụ, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

TT

Tên hóa chất, môi trƣờng

Hãng sản xuất

(1)

(2)

(3)

21

Tủ lạnh sâu

Sanyo

22

Cân phân tích

Mettler – Thụy Sỹ

23

Tủ cấy vô trùng

Việt Nam

24

Nồi khử trùng

Mỹ

1

Môi trường Carry-blair

Mecrk – Đức

2

Môi trường TCBS

Mecrk – Đức

3

Môi trường Thạch kiềm pH 8,5-9,5

Mecrk – Đức

2.4. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu.

4

Kligler Iron Agar ( KIA)

Mecrk – Đức

2.4.1. Đối tƣợng nghiên cứu:

5

Môi trường mannit - di động

Mecrk – Đức

6

Môi trường Ure - Indol

Mecrk – Đức

7

Môi trường basikow

Mecrk – Đức

8

Thuốc thử Kovacs

Mecrk – Đức

9

Kháng huyết thanh đa giá O1, O139

Anh

10

Kháng huyết thanh đơn giá (Ogawa, Inaba)

Anh

11

Thuốc nhuộm Gram

Mecrk – Đức

12

Kính hiển vi

Đức

13

Máy PCR

Mỹ

14

Máy đo pH

Mettler – Thụy Sỹ

p = 0,5 : Tỷ lệ bệnh nhân bị tiêu chảy cấp phải nằm viện (giả định).

15

Bộ chạy điện di

Đức

d : sai số tuyệt đối chấp nhận = 6 % = 0,06

16

Máy chụp ảnh gel

Mỹ

17

Máy trộn vortex

Anh

Chọn mẫu có chủ đích là những bệnh nhân bị bệnh tiêu chảy cấp có triệu

18

Máy ly tâm

Anh

chứng lâm sàng nghi mắc bệnh tả.

19

Lò vi sóng

Sanyo

20

Máy lắc ổn nhiệt

Anh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



25

o

Tủ ấm 37 C

Memmect – Đức

Bệnh nhân tiêu chảy cấp nghi ngờ mắc bệnh tả được hệ thống giám sát bệnh
truyền nhiễm ghi nhận trước khi tiến hành lấy mẫu.
2.4.2. Cỡ mẫu và cách chọn mẫu
Tính cỡ mẫu : Áp dụng công thức tính cỡ mẫu cho nghiên cứu mô tả
p x (1-p)
n = Z(1-/2) -------------d2
n: cỡ mẫu
α = 0,05 ; độ tin cậy 95%
z1-α/2 : hệ số tin cậy. Với độ tin cậy là 95% thì hệ số tin cậy
z(1-α/2) = 1,96

Thay vào công thức (1) có n = 266
Cỡ mẫu thu thập được là: 270

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS 12.0 với các test thống kê thường dùng

chứa môi trường vận chuyển Carry - Blair và đưa về phòng xét nghiệm sớm

trong y tế, gồm: tần xuất, tỷ lệ %, tỷ suất chênh OR, so sánh sự khác nhau

trong điều kiện không cần giữ lạnh [4], [20].

giữa các phương pháp bằng test 2.

Mẫu thực phẩm cần đảm bảo tính đại diện, thu thập mẫu tại nhiều vị trí

2.4.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

trên thực phẩm, khối lượng mỗi mẫu khoảng 25 gam, mẫu được chuyển về

- Phương pháp dịch tễ học mô tả cắt ngang: Nhằm đánh giá tình hình dịch tễ

phòng xét nghiệm sớm. Mẫu nước thu thập có tính đại diện cho khối nước cần

liên quan đến yếu tố mắc bệnh của bệnh nhân, mô tả hiện tượng sức khỏe và

kiểm nghiệm, chọn nhiều vị trí mẫu khác nhau, tránh gây tạp nhiễm mẫu

các yếu tố nguy cơ có liên quan đến sức khỏe đó một cách chính xác để tiến

trong lúc thu thập, lấy nước vào bình thuỷ tinh vô trùng 500-1000ml, nếu lấy

hành thu thập mẫu bệnh phẩm, điều tra cắt ngang sự phân bố tình trạng mắc

ở sông cần chọn nơi nước chảy giữa dòng độ sâu 20-30 cm.
Giám sát người lành mang trùng trong một vụ dịch tả, tất cả những

bệnh tại thời điểm đang xảy ra dịch [37].
- Nghiên cứu thực nghiệm labo để đánh giá tỷ lệ phát hiện V.cholerae O1

người tiếp xúc gần gũi với bệnh nhân tả đều được coi là có thể mang mầm

đồng thời phân tích đánh giá hiệu quả của các phương pháp nghiên cứu để

bệnh và vì vậy cần được theo dõi sức khỏe liên tục trong vòng 5 ngày kể từ

đưa ra tính ưu việt, phù hợp nhằm áp dụng thực tiễn tại cơ sở [37].

lần tiếp xúc cuối cùng, để kịp thời phát hiện ca bệnh mới. Với những người

2.4 3.1. Các kỹ thuật lấy mẫu và vận chuyển bệnh phẩm

tiếp xúc ở đầu vụ dịch cần được lấy phân xét nghiệm tìm vi khuẩn tả. Những

* Kỹ thuật lấy mẫu

người tiếp xúc gần và người lành mang vi khuẩn tả (phát hiện qua xét nghiệm

Thu thập và vận chuyển bệnh phẩm là một bước quan trọng trong quá

phân) phải được điều trị dự phòng bằng kháng sinh. Mẫu bệnh phẩm là huyết

trình phân lập và phát hiện các vi khuẩn gây bệnh đường ruột. Thu thập và

thanh được lấy 2 lần trong giai đoạn cấp tính và giai đoạn hồi phục.

vận chuyển bệnh phẩm không đúng cách sẽ ảnh hưởng đến kết quả chẩn đoán

* Bảo quản bệnh phẩm

tác nhân gây bệnh và điều trị, mẫu bệnh phẩm là phân hoặc chất nôn, thức ăn,

Cần được giữ vào môi trường bảo quản và vận chuyển khi ở xa phòng

chất chứa trong ruột non, ruột già sau khi mổ tử thi, và người tiếp xúc với

xét nghiệm và bệnh phẩm không được làm xét nghiệm sau 2 giờ (tính từ khi

bệnh nhân, mẫu được thu thấp càng sớm càng tốt trước khi điều trị kháng

thu thập mẫu). Môi trường vận chuyển Carry-Blair là môi trường tốt nhất để

sinh.

bảo quản và vận chuyển, có thể dùng dung dịch đệm glyxerin, môi trường vận
Mẫu bệnh phẩm là phân phải được lấy càng sớm vì vi khuẩn ở trong

chuyển đã thu thập mẫu được chuyển sớm tới phòng xét nghiệm hoặc giữ ở tủ

phân rất nhiều trong những ngày đầu của bệnh và trước khi bắt đầu điều trị

lạnh 4oC ( nếu chưa được xét nghiệm ngay ). Trong vụ dịch tả nguy hiểm mẫu

kháng sinh, sau khi lấy cho vào lọ không có chất khử khuẩn hoặc chất tẩy rửa,

bệnh phẩm cần được lưu giữ trong hộp sắt kín để tránh lây lan trong quá trình

nút lọ được đậy chặt chống rò rỉ, có thể lấy phân bằng ống thông trực tràng

vận chuyển [34].

hoặc tăm bông vô trùng, bệnh phẩm cần được giữ nhiệt độ 4 oC - 8oC và đưa
ngay đến phòng xét nghiệm trong vòng 2 giờ, nếu ở ổ dịch xa phòng xét
nghiệm, bệnh phẩm cần lấy bằng tăm bông vô trùng sau đó cho vào lọ có

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




2.4.3.2. Các phƣơng pháp chẩn đoán V. cholerae

* Kỹ thuật soi tƣơi trực tiếp
Hòa mẫu phân vào nước muối sinh lý, nhỏ một giọt lên lam kính, đậy

Sơ đồ các phƣơng pháp chẩn đoán V. cholerae trong phòng thí nghiệm

la men, soi tiêu bản trực tiếp bằng kính hiển vi ( Hình 3.4 ) kết quả cho thấy

[13].

vi khuẩn di động rất nhanh theo những đường thẳng từ đầu đến cuối vi
trường, soi tiêu bản trên kính hiển vi nền đen, phẩy khuẩn di động như sao đổi
ngôi.
BÖnh phÈm

Tiến hành soi tươi trực tiếp mẫu phân và chất nôn của bệnh nhân nhằm

phát hiện vi khuẩn di động. Soi tiêu bản trên kính hiển vi nền đen vi khuẩn tả

370C/3-6 giê

có một lông ở đầu nên khả năng di động rất mạnh như sao đổi ngôi. Trong

Pepton kiÒm

Soi T-¬i

quá trình nghiên cứu chúng tôi thực hiện các bước như sau:
TCBS, Th¹ch
KiÒm

370C/3-6 giê

TCBS, Th¹ch
KiÒm

Pepton kiÒm

đậy phiến kính mỏng (lamen) lên trên. Soi tiêu bản trực tiếp trên kinh hiển vi
370C/3-6 giê

nếu nghi ngờ V. cholerae vi khuẩn di động rất nhanh theo những đường thẳng
từ đầu đến cuối vi trường (tuy nhiên có một số vi khuẩn đường ruột khác cũng

370C/ 24 giê

di động khi soi tươi trên kính hiển vi).

Oxidaza (+)

TÝnh chÊt
sinh ho¸

- Lam kính 2: Nhỏ một giọt huyền dịch phân lên lam kính, nhỏ một giọt

KIA: Glucoza(+); Lactoza (-);
H¬i(-); H2S (-)
Mannit (+); di ®éng (+)

kháng huyết thanh tả đa giá. Phương pháp soi tiêu bản trực tiếp trên kính hiển

Urea (-); Indol (+)

vi nền đen đã được sử dụng từ lâu, nhưng không được phù hợp với điều kiện

LDC: (+)

của các phòng xét nghiệm tuyến huyện, trên kính hiển vi nền đen phẩy khuẩn

Saccaroza: (+)

tả di động như sao đổi ngôi.

Arabinoza:(-)
Mannoza: (+)

Ng-ng kÕt kh¸ng

huyÕt thanh

- Lam kính 1: Hoà mẫu phân vào nước muối sinh lý, nhỏ 1 giọt lên lam kính,

§a gi¸ O1
§a gi¸ O139

§¬n gi¸
Ogawa
§¬n gi¸
Inaba

Lam kính

Lamen

Hình 2.1. Sơ đồ phân lập chẩn đoán V. cholerae
Hình 2.2. Hình vẽ lam kính và la men soi tƣơi bằng kính hiển vi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Phương pháp soi tươi trên kính hiển vi nền đen hoặc phản pha dùng để
phát hiện tính di động của V. cholerae, đặc biệt khi phân của bệnh nhân chứa

5

* Kỹ thuật nuôi cấy
Chọn lọc những khuẩn lạc thuần khiết qua các bước cấy chuyển khác

>10 vi khuẩn/gam phân. Hơn nữa kỹ thuật này còn dùng kết hợp kháng huyết

nhau do vậy tính chất môi trường nuôi cấy phải có tính chọn lọc ức chế loại vi

thanh V. cholerrae để ức chế sự di động trên nền khi soi và chỉ trong vòng từ

khuẩn này nhưng lại phù hợp với loại vi khuẩn kia, phương pháp nuôi cấy

3 - 5 phút khoảng 50% vi khuẩn V. cholerae bị tụ lại, vì vậy kỹ thuật này có

được coi là “tiêu chuẩn vàng” tuy nhiên vẫn có mặt hạn chế là thời gian trả

giá trị để chẩn đoán nhanh trong vùng có dịch, độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ

lời kết quả khảng định lâu phải mất thời gian từ 24 giờ - 48 giờ và không phát

thuật này tùy thuộc vào kinh nghiệm của kỹ thuật viên.

hiện được V. cholerae nếu bệnh nhân đã dùng thuốc kháng sinh.

* Kỹ thuật nhuộm Gram

* Kỹ thuật PCR ( Polymerase Chain Reaction )

Kỹ thuật nhuộm Gram phát hiện hình thể và tính chất bắt màu của vi

Dùng để phát hiện gen ctx, kỹ thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao

khuẩn, với thành phần thuốc nhuộm gồm có tím gentian, dung dịch lugol,

hơn các kỹ thuật khác, ngoài ra áp dụng kỹ thuật PCR để tìm độc tố CT trong

Fucsin kiềm bằng cách cố định tiêu bản sau đó nhỏ thuốc nhuộm tím gentian

thực phẩm, PCR là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh

lên trong 2 phút, rửa nước, sau đó nhỏ dung dịch lugol lên trong 2 phút, hất

học hiện đại và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử,

o

đi, tẩy mầu bằng cồn 90 tới khi bạc màu, rửa nước, nhỏ dung dịch Fucsin

đánh dấu một bước tiến vô cùng quan trọng tương đương với việc khám phá

kiềm ( pha loãng tỷ lệ 1/10 ) lên trong 1/2 phút, rửa nước, để tiêu bản khô

ra các enzyme hạn chế và kỹ thuật Southern blot. Kỹ thuật PCR dựa trên cơ

trong không khí hoặc dùng giấy thấm, soi tiêu bản bằng vật kính dầu.

sở phản ứng mở rộng primer nhờ Taq polymerase để khếch đại in vitro các

Nhận biết vi khuẩn Gram âm bắt màu đỏ, có hình thể mảnh, cong, hình

nucleic acid đặc trưng. PCR cho phép khếch đại theo hàm mũ lên đến hàng

dấu phẩy, không có vỏ, không sinh nha bào, khi nuôi cấy lâu ngày sẽ có sự

triệu lần các đoạn DNA có chiều dài từ 200 – 3000 bp. Đoạn DNA được

thay đổi về hình thể so với ban đầu.

khếch đại ( DNA đích ) được nhận diện nhờ cặp primer đặc trưng thường có

* Phƣơng pháp dùng kít nhanh

chiều dài khoảng 20 nucleotide. Taq polymerase là một loại enzyme chịu

Dựa trên nguyên lý sắc ký miễn dịch, màng nitrocellulose được gắn

nhiệt được dùng để tổng hợp các đoạn DNA mới trong môi trường có 4 loại

với kháng thể đơn dòng đặc hiệu với V. cholerae O1 và O139 thành hai băng

deoxy nucleotide (dATP, dCTP, dGTP và dTTP) và hai primer, trên cơ sở

riêng biệt, khi mẫu thử đi qua màng nitrocellulose, Colloidal Gold (chất keo

khuôn mẫu của một đoạn DNA nhất định đã biết hoặc chưa biết trình tự. Các

vàng) cặp đôi với kháng thể đơn dòng, cặp đôi này gắn với kháng nguyên của

đoạn DNA mới hình thành lại được sử dụng làm khuôn mẫu. Sau nhiều chu

mẫu thử. Hỗn hợp kháng nguyên - kháng thể sẽ thấm qua màng nitrocellulose

kỳ, số lượng đoạn DNA nói trên được nhân lên gấp nhiều lần, nhờ vậy có thể

và gắn với kháng thể kháng V. cholerae O1 và O139 và hình thành các băng

đủ số lượng để tách ra, phân tích trình tự hoặc tạo dòng [21], [25].

màu đỏ.

2.4.3.3. Tiêu chuẩn đánh giá V. cholerae dƣơng tính trong nghiên cứu
* Soi tươi : Hình thể nhỏ, di động nhanh trên lam kính;
* Nhuộm Gram: Gram âm, hình cong dấu phẩy;

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




* Nuôi cấy:

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

+ Trên môi trường pepton kiềm mặn, mọc đục 3-6 h, có váng nổi mặt môi
trường;

3.1. Đặc điểm chung của đối tƣợng nghiên cứu

+ Trên môi trường thạch kiềm khuẩn lạc nhỏ, trong, tròn, bờ đều, vi khuẩn

3.1.1. Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo giới, tuổi

mọc sau 6-24 giờ;
+ Trên môi trường thạchTCBS nếu nghi ngờ V. cholerae khuẩn lạc màu vàng,
nhỏ, trong, thời gian mọc khuẩn lạc 12 – 24 giờ;

Giới tính và lứa tuổi là một trong những đặc điểm được chúng tôi quan
tâm kết hợp với yếu tố dịch tễ khi tiến hành lấy mẫu xem khả năng bị mắc

+ Phản ứng Oxidaza : Dương tính khi chuyển màu xanh tím;
+ Sinh vật hoá học: Lên men đường Mannoza, Sacaroza, Arabinoza;
+ Ngưng kết KHT đa giá và đơn giá;

bệnh tả ở giới nào hoặc độ tuổi bao nhiêu. Nên trong quá trình tiến hành thu
thập mẫu bệnh phẩm trên bệnh nhân, chúng tôi thu thập được một số thông tin
về sự phân bố theo giới tính và nhóm tuổi như sau:

* Test nhanh : Xuất hiện 2 vạch là vạch chứng và vạch mẫu thử;
* Phương pháp PCR dương tính.

Bảng 3.1. Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo giới, tuổi

Giới

n

X ± SD

Trung vị

min - max

Nữ

164

34,2±14,5

34(24-45)

8 - 67

Nam

106

31,8±15,5

34(17-44)

5 - 68

270

33,3±14,9

34(21-45)

5 - 68

P> 0,05
Tổng

Bảng phân bố đối tượng nghiên cứu ( Bảng 3.1; bảng 3.2; biểu đồ
3.1) cho thấy nhóm tuổi thấp nhất đối với nữ là 8 và đối với nam là 5; độ tuổi
cao nhất đối với nữ là 67 đối với nam là 68. Kết quả cho thấy sự khác biệt về
tuổi giữa các bệnh nhân nam và nữ không có ý nghĩa thống kê ( P > 0,05 )

CHƢƠNG III
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Bảng 3.2. Tỷ lệ bệnh nhân theo tuổi

Số mẫu thu thập tính theo độ tuổi
95
100
90

Số mẫu

Tỷ lệ (%)

5 -10

Tuổi

10

3,60

11-20

22

8,15

21 -30

95

35,17

31-40

79

29,15

41-50

46

17,36

>50

18

6,57

Tổng cộng

270

100

79

80
70
60
46

50
40
30
20

22

18
10

10
0
5-10 Tuổi

> 50 Tuổi

11-20 Tuổi 41 - 50 Tuổi 31-40 Tuổi 21-30 Tuổi

Biểu đồ 3.1. Đánh giá độ tuổi trong thu thập mẫu
Nghiên cứu của Nguyễn Đăng Hiền và cộng sự (2008 ) cho kết quả
trong tổng số 1.808 trẻ em nhập viện do tiêu chảy có tới 1.018 trẻ tiêu chảy
cấp do virut Rota và hầu hết các trường hợp này thường xuất hiện chủ yếu
trong 3 năm đầu khi trẻ mới sinh [12].
Trong nghiên cứu chúng tôi không đánh giá tác nhân do virut Rota, chỉ
tham khảo qua điều trị của thầy thuốc, chủ yếu dựa vào các biểu hiện lâm
sàng để loại bỏ nguyên nhân gây tiêu chảy do vi rút nên lứa tuổi 5-10 thu thập
được 10 bệnh nhân chiếm tỷ lệ 3,6 % , Lứa tuổi này có tỷ lệ nghi mắc tả thấp
cũng phù hợp với các nghiên cứu khác vì sự biến động của lứa tuổi này không
lớn mọi sinh hoạt phụ thuộc gia đình, nếu có thời gian chúng tôi đánh giá
thêm tác nhân do virut Rota ở lứa tuổi mới sinh đến 10 tuổi thì ý nghĩa nghiên
cứu sẽ mở rộng hơn. Nghiên cứu của M.Ehara và cộng sự (2004) cho rằng
nguy cơ mắc bệnh tả của trẻ em dưới 15 tuổi thường tăng vào đầu vụ dịch
[55]. Nghiên cứu của Thẩm Chí Mục (1994) cho kết quả ngược lại cho rằng
nhóm tuổi này lại tăng vào cuối vụ dịch [28]. Tuy nhiên các kết quả trên cũng
chỉ dừng lại đánh giá một vụ dịch nhưng cũng có thể là những gợi mở cho các

nghiên cứu tiếp theo trong chương trình phòng chống các bệnh tiêu chảy ở
nhóm tuổi này.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Lứa tuổi từ 21- 30 thu thập được 95 mẫu chiếm tỷ lệ 35,17 % lứa tuổi
31- 40 thu thập được 79 bệnh nhân chiếm tỷ lệ 29,15 % sau đến lứa tuổi 41 –
50 chiếm tỷ lệ 17,36 % ( Bảng 3.2 ). Đây là những lứa tuổi lao động quan
trọng trong xã hội và có tỷ lệ mắc tả cao nhất so với các lứa tuổi khác, ở lứa
tuổi này có nhiều mối liên quan về yếu tố dịch tễ như đi học, đi công tác, đi
làm…và điều đặc biệt sinh hoạt ăn uống ở quán cơm bình dân nên yếu tố vệ
sinh không đảm bảo. Nghiên cứu Thẩm Chí Mục (1996) đã đánh giá vai trò
của thực phẩm và vệ sinh của người phục vụ kết quả là 28,7 % số mẫu thực
phẩm không đạt tiêu chuẩn vệ sinh và 20 % mẫu bàn tay nhân viên không đạt
tiêu chuẩn [27].
Phan Đạo và cộng sự cho rằng trong thời gian đỉnh của vụ dịch tỷ lệ
phân lập được vi khuẩn tả cao trên 50% [9]. Với nghiên cứu của chúng tôi tỷ
lệ phân lập dương tính vi khuẩn tả là 5,93 %. Qua điều tra yếu tố dịch tễ của
các bệnh nhân trước khi vào viện có 11 bệnh nhân mắc bệnh tả có nguồn lây
nhiễm mầm bệnh từ Hà Nội chiếm tỷ lệ 68,75 %. Phải chăng tại tỉnh Thái
Nguyên chưa đến điểm đỉnh của vụ dịch mà tỷ lệ mắc bệnh do yếu tố bên
ngoài đưa đến sau đó được phát hiện.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Bảng 3.3. Phân bố bệnh nhân dƣơng tính V. cholerae theo giới tính

Phân bố nhóm đối tượng theo giới tính

Nữ

Nam

Giới tính

Mắc tả

Tỷ lệ %

Nam

9

56,25

Nữ

7

43,75

16

100

39.30%

60.70%

Tổng

Phân bố bệnh nhân dương tính V. cholerae theo giới tính cho kết quả 9
Biểu đồ 3.2. Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo giới tính

bệnh nhân nam mắc chiếm tỷ lệ 56,25 % trong khi đó nữ có 7 bệnh nhân
chiếm tỷ lệ 43,75 % ( Bảng 3.3 )

Nhìn chung bệnh tả không phân biệt theo giới tính, mọi người đều có

Tất cả các lứa tuổi đều có thể mắc tả, nhưng có tác giả cho rằng ở lứa

thể mắc bệnh. Nghiên cứu của Vũ Minh Hương và cộng sự (1994 ) cho biết tỷ

tuổi trẻ và tuổi cao trên 50 tuổi có tỷ lệ mắc cao [18], [45], nghiên cứu của

lệ dương tính ở nữ là 57,88 % và ở nam giới là 42,12 % [16]. Theo nghiên

CDC (2004) nhận xét khi không kiểm soát yếu tố dịch tễ dịch sẽ lan rộng

cứu của Dalsgaard A và cộng sự (1997) ở Peru đã xảy ra vụ dịch tả tác nhân

trong cộng đồng lúc đó lứa tuổi từ 26-50 tỷ lệ mắc sẽ thấp hơn so với lứa tuổi

do V. cholerae O1 đã có 230 người mắc tiêu chảy cấp trong đó tỷ lệ nữ mắc

từ 1-18 tuổi hoặc tuổi trên 50 [49], phải chăng sức đề kháng của trẻ em và

bệnh là 59,24 % và nam giới mắc bệnh là 40,76 % [54]. Kết quả ( Biểu đồ

người cao tuổi yếu nên tỷ lệ mắc bệnh cao.

3.2) cho thấy tỷ lệ nữ mắc tiêu chảy cấp là 60,7 % và nam 39,3 % cũng phù

Hiện nay chưa có nghiên cứu nào đưa ra một thang tuổi nhất định có
tính chất mẫu về các trường hợp mắc tả. Nhận xét của chúng tôi cũng phù hợp

hợp với nhận xét của các tác giả trên ( Biểu đồ 3.2 ).

với nhận xét nghiên cứu của Thẩm Chí Mục về đánh giá đặc điểm dịch tễ học
bệnh tả qua các vụ dịch ở Nam Hà tỷ lệ nam giới chiếm tỷ lệ 54,38 % [27].
3.1.2. Phân bố lấy mẫu bệnh nhân theo địa điểm lấy mẫu
Các mẫu trong nghiên cứu được thu thập là lấy mẫu phân của những
bệnh nhân đến điều trị tại 6 khoa lây của bệnh viện trên địa bàn tỉnh với tiêu
chuẩn lựa chọn là những bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy cấp, với các triệu
chứng lâm sàng điển hình nghi mắc tả, không sốt. Kết quả được trình bày tại
( Bảng 3.4 )

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

tỉnh Thái Nguyên 50 km, có diện tích rộng 520,75 km2 với dân số 90.000
người, số giường bệnh trên 200, phải chăng với diện tích rộng mật độ dân cư

Bảng 3.4. Tỷ lệ thu thập mẫu các địa điểm nghiên cứu

thưa yếu tố dịch tễ không nhiều nên khả năng lây nhiễm cũng giảm.
Địa điểm lấy mẫu

Mã

Tỷ lệ

hóa
BV1

(%)
Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái

Phân bố đối tượng nghiên cứu theo địa điểm lấy
mẫu
140

45,19

122

120

Nguyên

100
80

BV2

Bệnh viện Đa khoa huyện Đồng Hỷ

14,07

Số luợng

60

38

34
29

40

BV3

Bệnh viện C

12,59

BV4

Bệnh viện A

10,74

BV5

Bệnh viện Đa khoa huyện Đại Từ

8,89

BV6

Bệnh viện Đa khoa huyện Định Hóa

8,52

Tổng:

100

24

23

20
0
BV1

BV2

BV3

BV4

BV5

BV6

Khu vực nghiên cứu

Biểu đồ 3.3. Số mẫu thu thập tại 6 bệnh viện trong quá trình nghiên cứu
Kết quả (Biểu đồ 3.3 ) cho thấy tại BV1 thu thập được mẫu của 122
bệnh nhân, các bệnh viện còn lại thu thập được từ 23 – 38 bệnh nhân.
3.2. Đánh giá phƣơng pháp nghiên cứu phát hiện V. cholerae

Trên 6 bệnh viện lấy mẫu cho thấy: BV1 là bệnh viện trực thuộc Trung
ương nằm trung tâm tỉnh Thái Nguyên, Thành phố Thái Nguyên có diện tích

3.2.1. Nhận biết vi khuẩn di động bằng kỹ thuật soi tƣơi
Đây là tiêu chí để đánh giá các phương pháp trong quá trình nghiên cứu, việc

177 km , dân số 294.759 người với một trường Đại học Thái Nguyên gồm 6

phát hiện vi khuẩn tả di động trên kính hiển vi nền đen đã được áp dụng từ

trường Đại học thành viên và hơn 20 trường trung cấp, cao đẳng, số giường

lâu, tuy nhiên nhiều phòng thí nghiệm không có kính hiển vi nền đen để thực

bệnh trên 500 giường do vậy số bệnh nhân nhân nghi mắc tả cũng chiếm tỷ lệ

hiện phương pháp này. Với lý do đó chúng tôi đã trực tiếp soi tươi tìm vi

cao. Trong nghiên cứu của chúng tôi cho thấy số bệnh nhân mắc bệnh tiêu

khuẩn trên kính hiển vi thường để xem tính chất di động.

2

chảy cấp nghi tả ở BV1 chiếm tỷ lệ cao nhất 45,19 %. Ngược lại ở BV6 là
huyện Định Hóa số mắc tiêu chảy cấp nghi tả chiếm tỷ lệ thấp 8,52 % điều

Bảng 3.5. Tỷ lệ vi khuẩn di động quan sát trên lam kính

này cũng phù hợp với tình hình mắc chung vì huyện Định Hóa cách trung tâm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Soi tƣơi

n

%

Di động

28

10,37

Không di động

242

89,63

270

100

Tổng

Vi khuẩn di động quan sát được trên lam kính khi soi trên kính hiển vi,
đây là kỹ thuật thực hiện đầu tiên trong quá trình phân tích, có ý nghĩa đánh
giá định hướng ban đầu. Kỹ thuật này tuy đơn giản nhưng đòi hỏi kỹ thuật
Hình 3.5. Hình thể vi khuẩn V. cholerae nhuộm Gram

viên có kinh nghiệm cũng như kỹ năng thực hành.
Nghiên cứu của chúng tôi khi quan sát soi kính cho thấy vi khuẩn di
động ( Hình 3.4 ) là 28 mẫu trên 270 mẫu thu thập chiếm tỷ lệ 10,37%

Bảng 3.6. Tỷ lệ vi khuẩn Gram âm quan sát dƣới kính hiển vi

( Bảng 3.5 ). Như vậy nếu thực hiện tốt kỹ thuật soi tươi mẫu ngay tại cơ sở
sẽ giúp cho thầy thuốc có hướng điều trị. Thực hiện một kỹ thuật đơn giản kết

Nhuộm Gram

hợp với tập huấn kỹ thuật hàng năm chúng tôi nghĩ rằng các kỹ thuật viên sẽ
thực hiện tốt kỹ thuật soi tươi.

n

Tỷ lệ %

Gram âm

45

16,66

Gram dƣơng

225

94,44

270

100

Tổng

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy 45 mẫu bắt màu Gram âm
chiếm tỷ lệ 16,66% ( Bảng 3.6 ), kỹ thuật nhuộm cho kết quả nhanh, đơn giản,

thực tế đã góp phần đáng kể trong việc phát hiện nhanh vi khuẩn tả ngay tại
cơ sở.
Kỹ thuật nhuộm soi là nhận biết Gram âm nhưng kết hợp nhận biết
hình thể là mảnh cong, không có vỏ, điều đặc biệt dễ nhận biết là có hình dấu

Hình 3.4. Hình thể V. cholerae soi tƣơi
3.2.2. Nhận biết hình thể và tính chất bắt màu của vi khuẩn bằng kỹ

phẩy thì khả năng phát hiện sẽ cao hơn, kỹ thuật nhuộm soi được dùng để

thuật nhuộm Gram

sàng lọc có hướng điều trị kịp thời sau đó vẫn phải chẩn đoán khảng định
bằng phương pháp nuôi cấy.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Đánh giá nghiên cứu của chúng tôi về phân lập các loại vi khuẩn trong
quá trình nuôi cấy mẫu phân ở bệnh nhân tiêu chảy cấp nghi mắc tả trên 270

3.2.3. Phát hiện V. cholerae bằng kỹ thuật nuôi cấy
Quá trình nhận biết khuẩn lạc và xác định rõ vi khuẩn trong quá trình

mẫu bệnh phẩm cho thấy đối với chủng V. cholerae O1 có 16 mẫu dương

nuôi cấy là rất cần thiết, kết quả nghiên cứu thể hiện ( Bảng 3.7 )

tính, với vi khuẩn E. coli có 47 mẫu dương tính, các phẩy khuẩn không phải

Bảng 3.7. Phần đánh giá chung trong việc xác định các vi khuẩn

vi khuẩn tả (N.A.G) có 4 mẫu, trong nghiên cứu chúng tôi các vi khuẩn gây
tiêu chảy có tỷ lệ phát hiện dương tính tương đương với các công bố của các

Các loại vi sinh vật

tác giả khác. Ngoài ra có một số loaị vi khuẩn khác nhưng vì điều kiện và thời

Nuôi cấy
Số mẫu (+) / 270 mẫu

Tỷ lệ (%)

V. cholerae O1

16

5,92

E. coli

47

17,40

N.A.G

4

1,49

Nghiên cứu của tác giả Đinh Sỹ Hiển và cộng sự tại 25 xã của huyện
Từ Liêm, Hà Nội với 2.601 mẫu trong 5 năm cho thấy tỷ lệ dương tính của
các loại vi khuẩn gây tiêu chảy là 11,54% [11]. Phải chăng V. cholerae xuất

gian ngắn nên chúng tôi chưa đánh giá hết được.
Bảng 3.8. Tỷ lệ V. cholerae O1 dƣơng tính bằng kỹ thuật nuôi cấy

Kết quả

Nuôi cấy

Tỷ lệ %

Âm tính

254

94,07

Dương tính

16

5,93

270

100

Tổng

hiện khi các căn nguyên khác phát triển hay V. cholerae là yếu tố mồi từ đó
xuất hiện các căn nguyên khác.

Tỷ lệ V. cholerae O1 phát hiện bằng kỹ thuật nuôi cấy cho kết quả 16

Nghiên cứu của Lê Lan Hương và cộng sự (1995) đã nghiên cứu trên

mẫu dương tính trên 270 mẫu chiếm tỷ lệ 5,93% ( Bảng 3.8; biểu đồ 3.6 ), kỹ

121 mẫu phân bệnh nhân có 32 mẫu dương tính với một số vi khuẩn gây tiêu

thuật này cho kết quả rất chính xác nhưng phải qua nhiều bước khác nhau, đặc

chảy (V.cholerae O1 , Shigella, Salmonella, E. coli ) chiếm tỷ lệ 26,45 %

biệt phải có phòng xét nghiệm vi sinh hợp lý đúng tiêu chuẩn, đủ môi trường

[15], kết quả khảo sát của Nguyễn Thị Thế Trâm và cộng sự (1985) tại

nuôi cấy, cán bộ xét nghiệm phải có kinh nghiệm phán đoán để có các hướng

phường Vĩnh Phước, Nha Trang cho thấy tỷ lệ dương tính đối với các vi

cấy chuyển cần thiết tiếp theo, khâu cuối cùng của kỹ thuật là khẳng định

khuẩn gây bệnh tiêu chảy là 11,34% [42].

bằng ngưng kết kháng huyết thanh đa giá, đơn giá trước khi kết luận.

Còn tại các bệnh viện có ổ dịch ở khu vực 5 tỉnh Duyên Hải miền
Trung qua kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Thế Trâm, Nguyễn Thị Kê với
5.171 mẫu thu thập cho thấy tỷ lệ dương tính với 4 tác nhân gây bệnh là
24,34% (V. cholerae O1, Shigella, Salmonella, Echerichia coli ) [42].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên