Tóm tắt luận văn thạc sỹ: Nghiên cứu chế tạo gelatinase tái tổ hợp và đánh giá đặc tính của enzyme

PHẦN I. MỞ ĐẦU
1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Trong những năm gần đây enzyme đang là hướng đi mới được ứng dụng vào nhiều
ngành khác nhau và đem lại nhiều hiệu quả với ưu điểm chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm
nhanh hơn hàng nghìn lần so với chất xúc tác hóa học khác; phản ứng xảy ra trong điều kiện
êm dịu không cần tác nhân nhiệt độ cao, pH lớn; phản ứng có tính đặc hiệu, đặc biệt an toàn
đối với con người và thiên nhiên.
Mặt khác, hiện nay, ở Việt Nam có một số công trình nghiên cứu sản xuất enzyme tái
tổ hợp với các mục đích sử dụng trong công nghiệp, thực phẩm, nông nghiệp. Cụ thể: Đề tài
nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng cao từ các vi sinh vật
tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi; Đề tài “Nghiên cứu xây dựng
quy trình công nghệ sản xuất enzyme tái tổ hợp Streptokinase và yếu tố hoạt hóa
plasminogen”.
Gelatinase là một trong những enzyme được nghiên cứu hiện nay với tác dụng có thể
thủy phân được gelatin. Gelatin là một polymer tự nhiên có nguồn gốc từ collagen của
da, xương của bò, lợn, cá; là loại protein không mùi, không vị, trong suốt hoặc có màu
hơi hơi vàng, gelatin được sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm, dược phẩm và mỹ
phẩm.
Gelatinase được tách chiết từ nhiều loài vi khuẩn khác nhau Pseudomonas,
Aerromonas, Enterobacter,…Hoạt động chính của enzyme này là thủy phân các liên kết
peptit của gelatin để tạo ra các đoạn peptit ngắn và các axit amin, tuy nhiên nguồn
gelatinase này thường là tác nhân gây nên độc tố của vi khuẩn, đồng thời một số loại vi
khuẩn có thể gây hại đối với con người, động vật cây trồng như Pseudomonasaeruginosa
gây bệnh mủ xanh ở người không an toàn và hiệu quả không cao, vì vậy sản xuất enzyme tái
tổ hợp đang là hướng đi mới với mong muốn tạo được nguồn enzyme tái tổ hợp an toàn.
Mặt khác, để có một lượng gelatinase lớn ứng dụng trong thực tế với ngành công
nghiệp chế biến bằng phương pháp thông thường sẽ khó chủ động, số lượng enzyme cần
thiết sẽ không đáp ứng đủ. Do đó, việc sản xuất vi sinh vật tái tổ hợp, để từ đó sản xuất
enzyme gelatinase tái tổ hợp thành công, đạt chất lượng tốt sẽ góp phần quan trong trong
việc ứng dụng enzyme này với quy mô rộng, lớn.
Với những lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chế tạo gelatinase tái

tổ hợp và đánh giá đặc tính của enzyme ”.
2. MỤC TIÊU
2.1. Mục tiêu chung
Chế tạo được gelatinase tái tổ hợp và đánh giá được đặc tính của gelatinase tái tổ
hợp.

1


2.2. Mục tiêu cụ thể
1. Chế tạo được enzyme tái tổ hợp gelatinase
2. Xác định được điều kiện thích hợp để biểu hiện gen mã hóa gelatinase
3. Xác định được các đặc tính của gelatinase tái tổ hợp, bao gồm: đặc tính vật lý,
hóa học của enzyme.
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
1. Nghiên cứu tạo chủng biểu hiện gen mã hóa gelatinase
2. Nghiên cứu xác định các điều kiện biểu hiện gen mã hóa gelatinase
3. Nghiên cứu các đặc tính của gelatinase tái tổ hợp.
4. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
4.1. Đối tượng nghiên cứu: Gelatinase tái tổ hợp.
4.2. Nguyên liệu nghiên cứu: Gen mã hóa gelatinase nhóm A (kích thước 501bp) được
tách dòng từ 2 chủng vi khuẩn Pseudomonas C4.4.1; và A.hydrophila C4.1.1.
4.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian nghiên cứu: Đề tài được tiến hành từ tháng 10/2013 đến tháng 9/2014.
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm của khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại
Học Mở Hà Nội.

5. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI
- Hệ thống hóa được các kỹ thuật trong công nghệ tạo enzyme tái tổ hợp nói chung và
trong công nghệ tạo gelatinase tái tổ hợp nói riêng.

- Đưa ra các điều kiện để chế tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong xử lý phụ
phẩm chế biến cá da trơn.

PHẦN II. NỘI DUNG
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Tổng quan về gelatin và gelatinase
1.1. Gelatin
Gelatin là một polymer tự nhiên có nguồn gốc từ collagen của da, xương của bò, lợn,
cá. Gelatin hòa tan khi đun nóng (khoảng 40 oC) và cô đặc khi làm lạnh, cùng với nước ở

2


điều kiện bình thường có dạng sệt. Theo Hofmeister: Gelatin là sản phẩm của sự thủy phân
Collagen bởi nhiệt:
C102H149N31O38 (collagen) + H2O 
C102H151N31O39 (gelatin)
Về cấu tạo, gelatin chứa 18 – 20 acid amin, trong đó có 8 trên 9 acid amin thiết yếu
(Hình 1).

Hình 1. Cấu trúc chuỗi acid amin của gelatin
Sản phẩm sau khi thủy phân gelatin bao gồm một số acid amin theo bảng sau:
Bảng 1. Thành phần acid amin của gelatin
STT
Loại acid amin
Tỉ lệ (% )
1
Alanine
8.6 - 10.7
2

Arginine
8.3 - 9.1
3
Aspartic acid
6.2 - 6.
4
Cysteine
0.1
5
Glutamic acid
11.3 - 11.7
6
Glycine
26.4 - 30.5
7
Hydroxylysine
1.04
8
Hydroxyproline
13.5
9
Isoleucine
1.36
10
Leucin
3.1 - 3.34
11
Lysine
4.1 - 5.2 4
12

Methionin
0.8 - 0.92
13
Histidine
0.85 - 1.0
14
Phenylalanine
2.1 - 2.56
15
Proline
16.2 - 18.0
16
Serine
2.9 - 4.13
17
Threonine
2.2
18
Tyrosine
0.44 - 0.91
19
Valine
2.5 - 2.8 2,519
1.2. Gelatinase
Gelatinase là một enzyme thủy phân protein có trong một số loài vi khuẩn và động
vật bậc cao. Gelatinase là enzyme thuộc nhóm protease - nhóm hydrolase, xúc tác cho quá
trình thủy phân liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và peptid thành các acid

3

amin tự do, một ít peptid ngắn, peptone. Enzyme này có khả năng thủy phân các cấu trúc
ngoại bào như elastin, collagen và gelatin.
Ở cơ thể con người, gelatinase được chia thành hai loại, đó là: gelatinase A và
gelatinase B (hình 1a, 1b). Gelatinase A hay gelatinase 72 kDa còn được gọi là collagenase
72 kDa typ IV thuộc nhóm MMP-2, được mã hóa bởi gen GelE có kích thước là 501bp.
Gelatinase B hay gelatinase 92 kDa còn được gọi là collagenase 92 kDa typ IV thuộc nhóm
MMP-9, được mã hóa bởi gen GelE có kích thước là 615bp.

Hình 2a. Cấu trúc gelatinase A
Hình 2b. Cấu trúc gelatinase B
Ở vi khuẩn, gelatinase thuộc loại protease có trọng lượng phân tử là 72 kDa, với trung
tâm hoạt động có chứa ion Zn2+ (bảng 1)
Bảng 2. Một số loài vi khuẩn có khả năng sinh gelatinase
Tên loài
Staphylococcus aureus
Bacillus subtilis
Clostridium perfringens
Corynebacterium sp
Proteus spp
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas fluorescens
Serratia plymuthica
Serratia liquefaciens
Serratia rubidaea
Peudomonas anguilliseptica

Hoạt tính Gelatinase
+
+

+
+
+
+
+
+
+
+
+

2. Một số loài vi khuẩn sử dụng để tách chiết gelatinase
2.1. Vi khuẩn Aeromonas hyrophila
A.hydrophila là một loài vi khuẩn gram âm, có dạng hình que ngắn. Kích thước chiều
rộng thường từ 0,3 đến 1µm, và chiều dài từ 1 đến 3 µm. Chúng không có khả năng hình
thành bào tử và có thể sinh trưởng ở nhiệt độ thấp (4oC).

4


Hình 3. Hình thái A. hydrophila
A. hydrophila thường được biết đến là nguyên nhân gây nên bệnh đốm đỏ trên cá.

Hình 4. Cá nhiễm khuẩn A.hydrophila
2.2. Vi khuẩn Pseudomonas
Loài điển hình : Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas
Stutzeri, Pseudomonas Putida , Pseudomonas oleovorans , Pseudomonas denitrificans
Đặc điểm hình thái học chung cho Pseudomonas (viết tắt là Ps) là trực khuẩn Gram
âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu (tiên mao một hoặc chùm tiên mao) và không có
bào tử.

Hình 5. Đặc điểm hình thái Pseudomonas aeruginosa
Một trong những enzyme quan trọng nhất do Pseudomonas sinh ra là Protease. Bên
cạnh đó chúng còn có khả năng tiết ra enzyme gelatinase phân giải gelatin có ý nghĩa rất lớn
trong công nghiệp, dược phẩm, mỹ phẩm.
Các loài cá hay bị nhiễm khuẩn Pseudomonas là cá tra, cá basa, cá trê, cá bống
tượng, cá tai tượng...gây nên những dấu hiệu bệnh lý như xuất huyết từng đốm nhỏ trên da,

5


xung quanh miệng và nắp mang, phía mặt bụng. Bề mặt cơ thể có thể chảy máu, tuột nhớt
nhưng không xuất huyết vây và hậu môn.

Hình 6. Cá nhiễm khuẩn Pseudomonas
3. Tình hình thực tế
4. Các thành phần thủy phân từ da cá
Bảng 3. Các thành phần acid amin chủ yếu trong da một số loại cá nước lạnh, nước ấm
và bì lợn (thành phần trong 1000g)
Da cá
tuyếta

Loại acid amin
Alanine
Glycine
Hydroxyproline
Proline

96
344
50

106

Da cá
Alaska
pollockb
108
358
55
95

Hakea
119
331
59
114

5. Biến nạp
6. Vector biểu hiện
6.1. Vector biểu hiện
6.2. Vector biểu hiện gen trong vi khuẩn E.coli
7. Sơ đồ tiến trình thí nghiệm

6

Megrima
123
350
60
115

Cá rô
phic
123
347
79
119

Bì lợnd
112
330
91
132


CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị
1.1. Vật liệu
1.1.1. Các chủng vi sinh vật - Vi khuẩn E.coli
1.1.2. Vector sử dụng trong đề tài - Vector biểu hiện pET32a+

Hình 7. Sơ đồ pET32a+ dùng trong biểu hiện gen
1.1.3. Mồi
Tên mồi
Gelatinase-A

Trình tự mồi
5’ AATGGATCCGACTTCCAAGAATT 3’
5’ TTAGAGCTC TTGCTTCAAATGTTT 3’

1.1.4. Môi trường

 Môi trường LB lỏng
 Môi trường LB thạch
 Môi trường LB - Kháng sinh
1.2. Hóa chất
 Hóa chất tách plasmid từ tế bào vi khuẩn
 Hóa chất chạy điện di gel agarose
 Hóa chất tinh sạch ADN từ gel agarose
 Hóa chất chạy điện di SDS-PAGE
1.3. Thiết bị

7

Kích thước gel
501 bp


2. Phương pháp nghiên cứu
2.1. Phương pháp điện di trên gel agarose
2.2. Kiểm tra sự mang gen của vector tái tổ hợp bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain
Reaction)
2.3. Phương pháp tinh sạch ADN từ gel agarose
2.4. Tách chiết thu nhận plasmid pET-32a(+) bằng phương pháp SDS-kiềm
2.5. Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn
2.6. Phương pháp nối gen
2.7. Phương pháp biến nạp vector mang ADN đích vào tế bào vật chủ
2.8. Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ vi khuẩn E.coli
2.9. Phương pháp biểu hiện gen mã hóa genatinase trong vi khuẩn E. coli BL21(DE3)
2.10. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni2+
2.11. Phương pháp điện di gel SDS-PAGE
2.12. Phương pháp thu enzyme gelatinase

2.13. Phương pháp đánh giá khả năng phân giải của gelatinase với gelatin thô
2.14. Phương pháp xác định hoạt tính của gelatinase
2.15. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn
2.16. Phương pháp xác định ảnh hưởng của các ion kim loại đến khả năng phát triển sinh
khối và hoạt tính enzyme gelatinase
2.17. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính của gelatinase
2.18. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của chất tẩy rửa đến hoạt tính của gelatinase
2.19. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của dung môi hữu cơ đến hoạt tính của gelatinase
2.20. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu

8


CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Nghiên cứu biểu hiện gen gelatinase trong vi khuẩn E.coli BL21
1.1. Thiết kế vector tái tổ hợp pET32a+ - GelE/A
Gen mã hóa gelatinase đã được nhóm nghiên cứu của khoa Công nghệ Sinh học, viện
Đại học Mở Hà Nội xác định trình tự. Trình tự thu được có độ tương đồng 99% với trình tự
gen GelE của GeneBank có mã số: DQ845100.1 (hình 1.1).
Hình 1.1 So sánh mức độ tương đồng giữa GelE phân lập và GeneBank
Enterococcus faecalis GelE (gelE) gene, partial cds
Sequence ID: gb|DQ845100.1|Length: 580Number of Matches: 1
Score
Expect Identities
Gaps
Strand Frame
1044 bits(565) 0.0
580/586(99%) 6/586(1%) Plus/Plus
Features:
Query

1

Sbjct

1

Query

61

Sbjct

61

Query

121

Sbjct

121

Query

181

Sbjct

181

Query

241

Sbjct

241

Query

301

Sbjct

301

Query

361

Sbjct

355

Query

421

Sbjct

415

Query

481

Sbjct

475

Query

541

Sbjct

535

GACTTCCAAGAATTCATGATTATGCCTGTAGGTGCGCCTACATTCAAAGAAGCTTTACGT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GACTTCCAAGAATTCATGATTATGCCTGTAGGTGCGCCTACATTCAAAGAAGCTTTACGT

60

ATGGGTGCAGAAGTATACCACGCATTAGCTTCAATCTTAAAAGGTCGCGGTTTAGCTACT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATGGGTGCAGAAGTATACCACGCATTAGCTTCAATCTTAAAAGGTCGCGGTTTAGCTACT

120

TCAGTAGGTGACGAAGGTGGTTTCGCTCCTAACCTAGGTTCAAACGAAGAAGGTTTCGAA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TCAGTAGGTGACGAAGGTGGTTTCGCTCCTAACCTAGGTTCAAACGAAGAAGGTTTCGAA

180

GTAATCATCGAAGCTATCGAAAAAGCTGGCTATGTTCCTGGTAAAGACGTTGTTCTTGCT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTAATCATCGAAGCTATCGAAAAAGCTGGCTATGTTCCTGGTAAAGACGTTGTTCTTGCT

240

ATGGATGCTGCCTCTTCAGAATTCTACGACAAAGAAAAAGGCGGTTACGTTTTAGCTGAC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATGGATGCTGCCTCTTCAGAATTCTACGACAAAGAAAAAGGCGGTTACGTTTTAGCTGAC

300

TCAGGCGAAGGTGGCGAAAATACAACTGTAGATATGATCGCGTTCTACGTAGTAAAATTA
|||||||||
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
||||
TCAGGCGAA---GGCGAAAATACAACTGTAGATATGATCGCGTTCTACGTAGT---ATTA

360

GTTTCTATATACCCAATCATTTCTATCGAAGACGGCTTAGACGAAAACGACTGGGACGGA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTTTCTATATACCCAATCATTTCTATCGAAGACGGCTTAGACGAAAACGACTGGGACGGA

420

TTCAAAATATTAACTGAAGTATTAGGCGACAAAGTTCAATTAGTTGGTGACGATTTATTC
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TTCAAAATATTAACTGAAGTATTAGGCGACAAAGTTCAATTAGTTGGTGACGATTTATTC

480

GTAACAAACACAACTAAATTAGCTGAAGGTATCGAAAAAGGTATCGCTAACTCAATCCTA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTAACAAACACAACTAAATTAGCTGAAGGTATCGAAAAAGGTATCGCTAACTCAATCCTA

540

ATCAAAGTTAACCAAATCGGTACTTTAACTGAAACATTTGAAGCAA
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATCAAAGTTAACCAAATCGGTACTTTAACTGAAACATTTGAAGCAA
+

60

120

180

240

300

354

414

474

534

586
580

Gen GelE/A và vector pET 32a được cắt lần lượt với enzyme BamHI rồi được điện
di và tinh sạch. Sản phẩm tinh sạch tiếp tục được cắt với XhoI. Sản phẩm xử lý enzyme cuối
cùng sẽ được tinh sạch và điện di kiểm tra trên gel agarose 1% (Hình 1.2) trước khi thực
hiện phản ứng ghép nối với nhau (Hình 1.3).

9


Hình 1.2. Hình ảnh điện di gen GelE và vector pET 32a+ cắt bằng các enzyme giới
hạn Bam HI và Xho I
M: thang chuẩn 10kb, 1: sản phẩm cắt gen GelE, 2: sản phẩm cắt vector pET 32a+
Kết quả điện di cho thấy sản phẩm cắt enzyme của gen GelE và vector pET 32a +
xuất hiện 1 băng duy nhất, có kích thước khoảng 0,5 kb và 5,9 kb, tương tự như kích thước
lý thuyết của gen và vector. Kết quả này chứng tỏ, sản phẩm PCR sau khi cắt bằng hai
enzyme cắt giới hạn Bam HI và Xho I có chất lượng tốt, không thay đổi đáng kể so với kích
thước ban đầu của gen.

Hình 1.3. Sơ đồ tóm tắt quá trình thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa gelatinase

Hình 1.4. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng
enzyme BamHI và XhoI
M: thang chuẩn 10kb; 1: Sản phẩm PCR gen GelE; 2: sản phẩm cắt pET 32a+/ GelE
với enzyme BamHI và XhoI

10


Kết quả điện di cho thấy: các enzyme giới hạn đã cắt plasmid thành hai băng có kích
thước tương ứng với kích thước của gen GelE/A và vector pET 32a +. Như vậy có thể kết
luận, chúng tôi đã thiết kết thành công vector tái tổ hợp pET 32a+-GelE/A.
1.2. Biểu hiện gen mã hóa gelatinase trong tế bào vật chủ
Kết quả nuôi cấy vi khuẩn được thể hiện ở hình 1.5.

Hình 1.5. Kết quả biến nạp vector pET 32a+/GelE vào tế bào E.coli BL21(DE3)
và nuôi trên môi trường LBAmp
Sự biểu hiện protein GelE trong E coli BL21(DE3) bước đầu được phân tích bằng
phương pháp SDS-PAGE.

Hình 1.6. Kết quả điện di protein tái tổ hợp gelatinase trên gel SDS-PAGE
(M: thang chuẩn; giếng 1: E.coli BL21- pET32a+/GelE không cảm ứng với IPTG; giếng 23: E.coli BL21- pET32+/GelE cảm ứng với IPTG; giếng 4: E.coli BL21- pET32+).
So sánh giữa hình ảnh điện di đồ của các mẫu có và không có chất cảm ứng IPTG,
đồng thời so sánh kích thước với thang protein chuẩn ta thấy: các mẫu có cảm ứng với IPTG
(đường chạy số 2-3) xuất hiện một băng protein mới có kích thước nằm ở khoảng giữa 72
kDa (tương ứng với kích thước lý thuyết của protein gelatinase có gắn đuôi His-tag) còn ở
mẫu không cảm ứng với IPTG (đường chạy số 1) không thấy xuất hiện băng này. Hơn nữa,
ở mẫu nuôi E.coli BL21- pET 32a+ cũng không bổ sung IPTG (đường chạy số 4) không
thấy xuất hiện băng protein trên. Như vậy, băng protein xuất hiện mới này khả năng lớn
chính là protein tái tổ hợp đích mà chúng tôi cần biểu hiện.

11


1.3. Tinh sạch và đánh giá hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp
Các phân đoạn protein thu được sau khi tách ra khỏi cột được kiểm tra trên SDSPAGE, kết quả thể hiện ở hình 1.7

Hình 1.7. Điện di protein gelatinase tinh sạch trên SDS-PAGE
M: Thang protein chuẩn, 1-4: gelatinase thu ở pha 1, 2, 3, 4
Kết quả điện di trên hình 1.7 cho thấy, tất cả các phân đoạn dịch tinh sạch đều chỉ
xuất hiện duy nhất một băng protein ở kích thước 72 kDa, tương ứng với kích thước lý
thuyết của gelatinase A. Kết quả này chứng tỏ rằng đã tinh sạch thành công protein
gelatinase. Theo báo cáo của Vu và công sự 1998, kích thước của gelatinase A cũng có kích
thước 72 kDa, tương tự với kích thước của protein tái tổ hợp được tạo ra bởi nghiên cứu
này.
Nhằm chứng minh hoạt tính của gelatinase sau tinh sạch, chúng tôi sử dụng 4 phân
đoạn tinh sạch từ dịch nuôi cấy, cảm ứng chủng E.coli BL21/pET 32a+-GelE rồi đánh giá
mức độ phân giải gelatin của enzyme. Kết quả thể hiện trong hình 1.8

Hình 1.8. Hình ảnh phân giải gelatinase của enzyme thu được từ chủng E.coli
BL21/pET 32-GelE
1: phân đoạn 1; 2: phân đoạn 3; 3: phân đoạn 4; 4-6: phân đoạn 2
Kết quả hình 1.8 cho thấy, enzyme sau quá trình tinh sạch trên cột sắc ký
ProbondTM Nickel-Chelating Resin (Invitrogen) đảm bảo hoạt tính.

12


2. Xác định điều kiện thích hợp để biểu hiện gen mã hóa gelatinase
2.1. Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng IPTG đến kết quả biểu hiện gen mã hóa
gelatinase

Kết quả biến nạp được thể hiện ở hình 2.1.

Hình 2.1. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E. coli BL21
Chủng E.coli BL21- pET32a+/GelE được nuôi cấy ở các điều kiện pH = 7, thời gian
tăng sinh 3 giờ, nhiệt độ tăng sinh 370C, nồng độ kháng sinh ampicillin là 100 µg/ml, nồng
độ IPTG cảm ứng là 1mM, 2mM, 3mM, 4mM, 5mM, 6mM. Kết quả thí nghiệm được kiểm
tra bằng điện di SDS – PAGE, thể hiện ở hình 2.2.

Hình 2.2. Mức độ biểu hiện protein GelE ở các nồng độ IPTG cảm ứng
M: thang protein chuẩn, 1-6: protein thu được từ dịch tăng sinh chủng E.coli BL21pET32a+/GelE được cảm ứng với các nồng độ IPTG là 6, 5, 4, 3, 2, 1mM, 7: không cảm
ứng IPTG
Kết quả điện di cho thấy, nồng độ IPTG từ 1-6mM đều cảm ứng sinh gelatinase.
Trên hình ảnh điện di đồ, cả 6 mẫu này đều xuất hiện vạch tương ứng với kích thước
72kDa, tương ứng với trọng lượng lý thuyết của enzyme gelatinase.
Dịch tăng sinh của chủng vi khuẩn biểu hiện được cảm ứng với IPTG và không cảm
ứng với IPTG được tách để định xác định hoạt tính gelatinase. Kết quả thí nghiệm được thể
hiện ở hình 2.3.

13


Hình 2.3. Mức độ biểu hiện gelatinase ở các nồng độ IPTG cảm ứng
Hình 2.3 cho thấy: Các mẫu được cảm ứng với IPTG nồng độ 1 và 2mM có hoạt lực
gelatinase mạnh hơn các mẫu cảm ứng với IPTG nồng độ 3-6mM. Kết quả này chứng tỏ,
hàm lượng IPTG là 1mM là phù hợp để biểu hiện gen mã hóa gelatinase.
2.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp
gelatinase của chủng vi khuẩn tái tổ hợp
Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy (nguồn dinh dưỡng nitơ và các bon) đến sự sinh
trưởng của chủng vi khuẩn biểu hiện gen mã hóa gelatinase E.coli BL21- pET32a+/GelE và
hoạt tính của enzyme gelatinase được trình bày trong bảng 4.

Bảng 4. Ảnh hưởng của nguồn các bon và nitơ đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính
enzyme tái tổ hợp
Các
Các bon
Nitơ
thông
Yeast
số sinh Glucose Sucrose Lactose extract Peptone NH4Cl NH4(SO2)4 Urea
trưởng
Mật độ
0.41
sinh
2.57 ±
2.23 ±
0.79 ±
3.17 ±
3.18 ±
1.23 ±
1.25 ± 0.14
±
khối
0.03
0.09
0.02
0.03
0.01
0.00
0.01
(OD600)
D-d

(mm)

8.12

7.33

1.34

8.22

8.48

3.52

3.92

1.59

Kết quả trong bảng cho thấy, glucose là cơ chất cacbon phù hợp hơn cả cho sự phát
triển của chủng vi khuẩn biểu hiện. Bên cạnh đó, theo dõi động thái học sinh trưởng của
sinh khối chủng biểu hiện trong 16 giờ, với 2 giờ kiểm tra nồng độ sinh khối 1 lần cho kết
quả trong hình 2.4.

14


Hình 2.4. Ảnh hưởng của nguồn các bon đến khả năng sinh trưởng của chủng
E.coli BL21- pET32a+/GelE (◊: glucose, sucrose, ∆: lactose)
Kết quả trong hình 2.4 cho thấy có sự khác biệt lớn về tốc độ tăng trưởng của sinh
khối vi khuẩn được nuôi trong môi trường LB có bổ sung glucose và sucrose so với sinh

khối vi khuẩn được nuôi trong môi trường bổ sung lactose.
Đánh giá về hoạt tính gelatinase của chủng biểu hiện, kết quả thể hiện trong hình 2.5.

Hình 2.5. Ảnh hưởng của nguồn các bon đến hoạt tính gelatinase của chủng
E.coli BL21- pET32a+/GelE (◊: glucose, sucrose, ∆: lactose)
Kết quả hình 2.5 cho thấy: Glucose là nguồn các bon phù hợp nhất cho sự phát triển
cũng như hoạt tính gelatinase của chủng E.coli BL21- pET 32a+/GelE.
Về ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính gelatinase của
chủng E.coli BL21- pET 32a+/GelE được đánh giá với hai nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ. Kết
quả theo dõi ảnh hưởng của các loại cơ chất nitơ được thể hiện trong hình 2.6.

Hình 2.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng của sinh khối chủng
E.coli BL21- pET32a+/GelE (♦: yeast extract, ■: peptone, ∆: NH4Cl,
Ο: (NH4)2SO4, : urea)
Kết quả hình 2.6 cho thấy: Nguồn nitơ hữu cơ là phù hợp hơn cho sự phát triển của
chủng tái tổ hợp E.coli BL21- pET 32a+/GelE. Theo dõi hoạt tính gelatinase của các mẫu
E.coli BL21- pET32a+/GelE được tăng sinh trong môi trường có cơ chất nitơ khác nhau cho
kết quả thể hiện trong hình 2.7.

15


Hình 2.7. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt tính gelatinase của chủng E.coli BL21pET32a+/GelE (♦: yeast extract, ■: peptone,∆: NH4Cl,Ο: (NH4)2SO4, : urea)
Kết quả hình 2.7 thể hiện hoạt tính phân giải gelatin của các mẫu vi khuẩn tăng sinh
trong môi trường có chứa yeast extract hoặc peptone cao hơn 2-5 lần so với hoạt tính của
các mẫu tăng sinh trong môi trường chứa nitơ vô cơ.
2.3. Ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ
Phân tích mức độ biểu hiện bằng phương pháp điện di SDS-PAGE, chúng tôi đánh
giá hoạt tính của enzyme bằng phương pháp đục lỗ thạch. Kết quả được thể hiện trong hình
2.8.

Hình 2.8. Mức độ biểu hiện gelatinase ở các nhiệt độ nuôi cấy
Hình ảnh điện di đồ: 1-3: protein tổng số trong các mẫu tăng sinh ở nhiệt độ 37oC, 30oC và
28oC; hình ảnh đĩa thạch: 1,2,3: vùng phân giải gelatin của enzyme tái tổ hợp thu được từ
mẫu tăng sinh ở nhiệt độ 37oC, 30oC và 28oC
Kết quả hình 2.8 cho thấy: Ở nhiệt độ 28oC và 30oC có xuất hiện băng protein mờ ở
kích thước 72 kDa, chứng tỏ gelatinase tổng hợp ở mức độ yếu so với ở 37 0C. Bên cạnh đó,
kích thước vùng phân giải gelatin của mẫu tăng sinh ở 37 0C cũng lớn hơn và rõ hơn so với
các mẫu còn lại.
Theo dõi ảnh hưởng của nhiệt độ đến nồng độ sinh khối và hoạt tính gelatinase cho
thấy chủng E.coli BL21-pET32a+/GelE phát triển tốt nhất cùng như hoạt tính gelatinase
mạnh nhất ở 370C (hình 2.9, 2.10).

Hình 2.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của sinh khối chủng
E.coli BL21- pET32a+/GelE (♦: 370C, : 300C, ∆: 280C)

16


Hình 2.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính gelatinase của sinh khối chủng E.coli
BL21- pET32a+/GelE (♦: 370C, : 300C, ∆: 280C)
2.4. Ảnh hưởng của yếu tố pH
Kết quả được thể hiện ở hình 2.11, 2.12.

Hình 2.11. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của sinh khối chủng E.coli
BL21- pET32a+/GelE (♦: pH=7, : pH= 6, ∆: pH= 8)
Kết quả hình 2.11 cho thấy: Mật độ quần thể trong mẫu tăng sinh ở môi trường có
pH=7 cao hơn so với các mẫu tăng sinh ở môi trường có pH= 6 và 8.

Hình 2.12. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính gelatinase của sinh khối chủng E.coli

BL21- pET32a+/GelE (♦: pH=7, : pH= 6, ∆: pH= 8)
Hình 2.12 cho thấy khả năng phân giải gelatin của dịch sinh khối vi khuẩn trong mẫu
tăng sinh ở môi trường có pH=7 cao hơn so với các mẫu tăng sinh ở môi trường có pH= 6
và 8.
Kiểm tra hàm lượng và hoạt lực của enzyme bằng phương pháp điện di và đục lỗ
thạch, kết quả thể hiện ở hình 2.13.

17


Hình 2.13. Mức độ biểu hiện gelatinase ở các giá trị pH khác nhau
Hình ảnh điện di đồ: 1: thang protein chuẩn; 2-4: protein tổng số trong các mẫu tăng sinh
có pH môi trường là 7, 8, 6; hình ảnh đĩa thạch: 1,2,3: vùng phân giải gelatin của enzyme
tái tổ hợp thu được từ mẫu có pH môi trường là 7, 8 và 6
Qua hình 2.13 cho thấy: Mẫu nuôi cấy với pH môi trường là 6 (đường chạy số 4) có
băng protein mờ nhất hay lượng protein thu được là thấp nhất. Ngược lại với các mẫu có pH
môi trường là 7 và 8 (đường chạy 2, 3), băng protein đích xuất hiện tương đối giống nhau và
đậm hơn so với băng protein ở môi trường có pH là 6. Kiểm tra hoạt tính phân giải gelatin
cũng cho kết quả tương tự, kích thước vùng phân giải của gelatinase giảm dần theo thứ tự từ
mẫu có pH môi trường là 7, 8 và 6. Chúng tôi cho rằng pH = 7 là pH phù hợp nhất để biểu
hiện gen mã hóa gelatinase.
2.5. Ảnh hưởng của yếu tố thời gian nuôi cấy
Kết quả thu được thể hiện trong hình 2.14 và 2.15.

Hình 2.14. Ảnh hưởng của thời gian tăng sinh đến khả năng sinh trưởng của sinh khối
chủng E.coli BL21- pET32a+/GelE
Kết quả hình 2.14 cho thấy mức độ tăng trưởng quần thể phụ thuộc lớn vào thời gian
nuôi cấy, quần thể vi khuẩn đạt tới pha cân bằng ngay sau 8 giờ theo dõi và giảm nhẹ sau 24
giờ.

18


Hình 2.15. Ảnh hưởng của thời gian tăng sinh đến hoạt tính gelatinase của sinh khối
chủng E.coli BL21- pET32a+/GelE
Kết quả hình 2.15 cho thấy: mức độ phân giải cơ chất mạnh nhất trong khoảng thời
gian từ 14-18 giờ, sau đó giảm dần.
Đánh giá hàm lượng và hoạt lực của enzyme bằng phương pháp điện di SDS-PAGE
và đục lỗ thạch, kết quả thể hiện ở hình 2.16.

Hình 2.16. Mức độ biểu hiện gelatinase ở các giá trị OD khác nhau
Hình ảnh điện di đồ: 1-3: protein tổng số trong các mẫu mẫu tăng sinh sau 12, 16 và 24
giờ; hình ảnh đĩa thạch: 1,2,3: vùng phân giải gelatin của enzyme tái tổ hợp thu được từ
mẫu tăng sinh sau 12, 16 và 24 giờ
Kết quả hình ảnh điện di cho thấy: Cả 3 đường chạy 1, 2 và 3 đều xuất hiện băng
tương ứng với kích thước lý thuyết của gelatinase là 72 kDa, nhưng độ đậm của băng không
có sự khác biệt lớn. Kiểm tra hoạt tính của enzyme trong các mẫu tăng sinh cho thấy, sau
12h, 16h và 24h tăng sinh thì kích thước vùng phân giải của mẫu tăng sinh sau 16 giờ lớn
hơn so với kích thước vùng phân giải của mẫu tăng sinh sau 12 giờ và 24 giờ. Từ các kết
quả này chúng tôi xác định thời gian tăng sinh chủng biểu hiện là 16h.
2.6. Ảnh hưởng các ion kim loại
Kết quả thí nghiệm trình bày trong bảng 5.
Bảng 5. Ảnh hưởng của các ion bổ sung đến khả năng phát triển sinh khối và
hoạt tính gelatinase của chủng E.coli BL21- pET32a+/GelE

19


Kết quả thí nghiệm cho thấy, ion Ca2+ có khả năng tăng cường hoạt tính của
gelatinase tái tổ hợp cũng như mật độ sinh khối chủng biểu hiện E.coli BL21- pET32/GelE.

Các ion Mg và Mn2+ được bổ sung từng ion vào môi trường nuôi cấy thì không có vai trò
đáng kể trong việc tăng hoạt tính nhưng khi kết hợp với ion Ca 2+ thì lại có tác dụng làm tăng
đáng kể hoạt tính của enzyme cũng như mật độ sinh khối. Các ion Ca 2+ + Mg2+ + Mn2+ có
tác dụng kích thích sự tăng trưởng của quần thể chủng biểu hiện dẫn tới lượng enzyme được
tổng hợp ra nhiều hơn để làm nên hoạt tính của enzyme mạnh hơn.
Ngược lại, các ion Fe2+, Co2+, Zn2+ lại ức chế hoàn toàn khả năng sinh trưởng của
chủng E.coli BL21- pET32/GelE đồng nghĩa với việc không tổng hợp được enzyme.
3. Xác định đặc tính của gelatinase tái tổ hợp
3.1. Đánh giá hoạt tính gelatinase trên gelatin bột
Kết quả được thể hiện trên biểu đồ 3.1 và hình 3.1

Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng phân giải gelatin
( 1: enzyme của Sigma, 2: enzyme tái tổ hợp)

Hình 3.1. Kết quả phản ứng biure thủy phân gelatin ở 370C
( 1: enzyme của Sigma, 2: enzyme tái tổ hợp, ĐC: không bổ sung enzyme)
Kết quả cho thấy, gelatinase có khả năng hoạt động mạnh nhất ở mức nhiệt độ 37⁰C

20


Tiếp tục xác định thời gian thủy phân gelatin của enzyme tái tổ hợp. Kết quả trong đồ
thị 3.2 và hình 3.2.

Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của thời gian tới khả năng phân giải gelatin
( 1: enzyme của Sigma, 2: enzyme tái tổ hợp)

Hình 3.2. Kết quả phản ứng biure thủy phân gelatin sau 48h xử lí
( 1: enzyme của Sigma, 2: enzyme tái tổ hợp, ĐC: không bổ sung enzyme)
Như vậy, hiệu xuất thủy phân của gelatinase cao nhất sau 36-48h xử lý.

3.2. Xác định đặc tính vật lý của gelatinase tái tổ hợp
3.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của gelatinase
Theo dõi thí nghiệm trong 12 giờ với các mẫu enzyme được xử lý ở 300C, 370C,
450C, 500C, 600C, 700C, 800C chúng tôi thu được kết quả như hình 3.3.

Hình 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của gelatinase

21


Kết quả hình 3.3 cho thấy: Khi có ion Ca2+ thì hoạt tính enzyme cao nhất ở 45°C.
Khi không có Ca2+ hoạt tính của gelatinase luôn thấp hơn nhưng hoạt tính enzyme vẫn đạt
cao nhất ở 45°C. Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy, nhiệt độ từ 370C đến 50°C không làm
thay đổi vùng liên kết với Ca2+ của enzyme.
Độ bền nhiệt của gelatinase theo dõi trong 60 giờ ở điều kiện xử lý nhiệt là 50°C, cứ
mỗi 6 giờ, enzyme lại được đánh giá hoạt tính một lần, chúng tôi thu được kết quả như hình
3.4.

Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian xử lý nhiệt đến hoạt tính của gelatinase
Kết quả hình 3.4 cho thấy: Hoạt tính enzyme ổn định trong 12 giờ đầu, sau đó, thời
gian ủ càng lâu thì hoạt tính càng giảm, đến 60 giờ thì khả năng thủy phân gelatin cho còn
đạt 8-12% so với hoạt tính ban đầu.
Từ các kết quả trên, chứng tỏ,enzyme gelatinase hoạt động tốt nhất ở 50 0C trong 12
giờ xử lý.
3.2.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của gelatinase
Dưới đây là biểu đồ ảnh hưởng của pH đến hoạt tính tương đối của gelatinase (Hình
3.5).

Hình 3.5. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của gelatinase
Kết quả hình 3.5 cho thấy: Sự bổ sung ion Ca2+ có vai trò trong việc ổn định hoạt

tính của enzyme ở pH từ 7-7,5. So sánh về ảnh hưởng của ion Ca2+ và độ pH đến hoạt tính
enzyme cũng chứng tỏ rằng pH = 7 thích hợp nhất đối với hoạt tính của gelatinase.
3.3. Xác định đặc tính hóa học của gelatinase tái tổ hợp
3.3.1. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính của gelatinase

22


Dưới đây là bảng tổng kết ảnh hưởng của ion kim loại và hóa chất đến hoạt tính của
enzyme gelatinase.
Bảng 6. Ảnh hưởng của các ion kim loại và hóa chất đến hoạt tính của gelatinase
Nồng độ ion (mM)
STT
Ion bổ sung
Không bổ sung
2
5
10
Hoạt tính tương đối (%)
2+
1
Ca
100
111
103
115
2+
2
Cu
100

105
96
95
3
Co2+
100
110
102
92
2+
4
Mn
100
101
99
97
2+
5
Fe
100
105
110
104
2+
6
Mg
100
101
103
100

7
EDTA
100
4
0
0
8
β-mercaptoetanol
100
0
0
0
2+
2+
2+
Kết quả bảng 6 cho thấy các ion Mg , Ca , Fe không làm ảnh hưởng hoặc làm
tăng nhẹ hoạt tính của enzyme gelatinase. Trong khi đó các ion như: Cu 2+, Co2+, Mn2+ gây
ức chế hoạt tính của enzyme ở nồng độ 5 -10 mM, còn ở nồng độ thấp 2 mM thì hoạt tính
của gelatinase không bị ảnh hưởng nhiều. Còn đối với trường hợp của EDTA và βmercaptoetanol thì gây kìm hãm rất mạnh đối với hoạt tính của enzyme gelatinase.
3.3.2. Ảnh hưởng của chất tẩy rửa đến hoạt tính của gelatinase

Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của các chất tẩy rửa đến hoạt tính của enzyme gelatinase
Qua biểu đồ 3.3 ta thấy: Tween 20 nồng độ 0,3 – 1 % hầu như không ảnh hưởng đến
hoạt tính của gelatinase. Triton X-100 ở nồng độ 1% có ảnh hưởng nhẹ đến hoạt tính của
gelatinase. Ở nồng độ thấp hơn thì enzyme gelatinase hầu như không bị ảnh hưởng và hoạt
tính vẫn còn duy trì ở mức 97 – 98%. Tuy nhiên đối với SDS thì hoạt tính của gelatinase bị
ảnh hưởng rõ rệt. Với nồng độ SDS càng cao thì hoạt tính gelatinase càng thấp, và dù ở
nồng độ rất thấp là 0,3 % thì hoạt tính của gelatinase cũng bị giảm mạnh chỉ còn 53%.
3.3.3. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ đến hoạt tính của gelatinase
Dưới đây là biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của các dung môi hữu cơ đến hoạt tính của

enzyme gelatinase khi xử lý ở các nồng độ 10%, 20% và 30% trong thời gian 1 giờ tại nhiệt
độ 50ºC.

23


Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của các dung môi hữu cơ đến hoạt tính của enzyme gelatinase.
Qua biểu đồ 3.4 ta thấy: n-butanol (nBtOH) có ảnh hưởng ức chế rõ rệt hoạt tính của
enzyme gelatinase. Các dung môi hữu cơ khác như methanol, ethanol, isopropanol và
aceton hầu như không ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính của enzyme, hoạt tính của enzyme
tăng nhẹ lên 103% và giảm nhẹ xuống 90% ở nồng độ thí nghiệm là 10 – 30%.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. KẾT LUẬN
1. Đã tạo thành công chủng E.coli BL21- pET32/GelE biểu hiện gen mã hóa enzyme
gelatinase, kích thước protein tái tổ hợp khoảng 72 kDa tương ứng với kích thước
lý thuyết của enzyme gelatinase A.
2. Đã xác định được các điều kiện phù hợp để biểu hiện gen mã hóa gelatinase:
2.1. Nồng độ của chất cảm ứng IPTG phù hợp là 1mM.
2.2. Điều kiện nuôi cấy:
- Môi trường nuôi cấy (nguồn dinh dưỡng nitơ và các bon):
+ Glucose là nguồn các bon phù hợp nhất cho sự phát triển cũng như hoạt tính
gelatinase của chủng E.coli BL21- pET 32a+/GelE.
+ Nguồn nitơ hữu cơ (yeast extract hoặc peptone) là phù hợp nhất cho sự phát triển
của chủng tái tổ hợp E.coli BL21- pET 32a+/GelE.
- Chủng E.coli BL21-pET32a+/GelE phát triển tốt nhất cùng như hoạt tính gelatinase
mạnh nhất ở 370C
- pH = 7 là pH phù hợp nhất để biểu hiện gen mã hóa gelatinase.
- Thời gian tăng sinh chủng biểu hiện là 16h.
- Sự phối hợp các ion phù hợp cho sự tăng sinh chủng vi khuẩn tái tổ hợp

E.coli BL21(DE3) - pET 32a(+)/GelE là 1mM Ca2+ + 1mM Mg2+ + 1mM Mn2+
3. Đã xác định được các đặc tính của gelatinase tái tổ hợp.
3.1. Khả năng phân giải gelatin bột của enzyme tái tổ hợp và enzyme thương mại của
Sigma là tương đương, hiệu suất phân giải đạt trên 90%.
3.2. Enzyme gelatinase tái tổ hợp hoạt động tốt nhất ở 500C trong 12 giờ xử lý và độ pH
phù hợp cho hoạt động của enzyme là 7.
3.3. Ảnh hưởng của các ion kim loại, chất tẩy rửa, dung môi hữu cơ đến hoạt tính của
gelatinase là:

24


-

-

-

Các ion Mg2+, Ca2+, Fe2+ không làm ảnh hưởng hoặc làm tăng nhẹ hoạt tính của
enzyme gelatinase, Các ion như: Cu2+, Co2+, Mn2+ gây ức chế hoạt tính của enzyme ở
nồng độ cao, còn ở nồng độ thấp thì hoạt tính của gelatinase không bị ảnh hưởng
nhiều. Với EDTA và β-mercaptoetanol thì gây kìm hãm rất mạnh đối với hoạt tính
của enzyme gelatinase.
Tween 20 hầu như không ảnh hưởng đến hoạt tính của gelatinase. Triton X-100 có
ảnh hưởng nhẹ đến hoạt tính của gelatinase. SDS nồng độ càng cao thì hoạt tính
gelatinase càng thấp, và dù SDS ở nồng độ rất thấp thì hoạt tính của gelatinase cũng
bị giảm mạnh.
n-butanol (nBtOH) có ảnh hưởng ức chế rõ rệt hoạt tính của enzyme gelatinase làm
hoạt tính enzyme gelatinase giảm mạnh. Các dung môi hữu cơ khác như methanol,
ethanol, isopropanol và aceton hầu như không ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính của

enzyme.

2. KIẾN NGHỊ
-

Tiếp tục nghiên cứu các điều kiện thu hồi enzyme để thu được gelatinase có hoạt tính
cao nhất.
Nghiên cứu ứng dụng gelatinase vào thủy phân các phụ phẩm trong chế biến cá da
trơn để sản xuất các sản phẩm chất lượng cao dùng cho thực phẩm, mỹ phẩm.

25