NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VI BỌT VỎ PHOSPHOLIPID

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

BÙI THỊ VÂN

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VI BỌT VỎ
PHOSPHOLIPID

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI, 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

BÙI THỊ VÂN

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VI BỌT VỎ
PHOSPHOLIPID
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ
MÃ SỐ: 60.72.04.02

Người hướng dẫn khoa học: 1.TS. Nguyễn Phúc Nghĩa

2.PGS.TS. Nguyễn Ngọc Chiến

HÀ NỘI, 2016


LỜI CẢM ƠN
Có lẽ bất cứ ai cũng đều cảm thấy tự hào và vinh dự khi được là sinh
viên, học viên trường Đại học Dược Hà Nội – ngôi trường đầu ngành với một
bề dày truyền thống giảng dạy, nghiên cứu khoa học. Còn riêng tôi luôn cảm
thấy mình thật may mắn khi đã được học tập và rèn luyện dưới sự dạy bảo tận
tình, tràn đầy tâm huyết của các thầy cô trong trường. Và càng may mắn hơn
nữa khi tôi được là học trò của thầy giáo PGS.TS. Nguyễn Ngọc Chiến và
thầy giáo TS. Nguyễn Phúc Nghĩa. Hai người thầy đã truyền dạy rất nhiều
kiến thức đồng thời luôn nhiệt tình hướng dẫn và hết lòng chỉ bảo tôi trong
quá trình học tập và thực hiện luận văn này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân
thành và lời cảm ơn sâu sắc tới hai thầy.
Đồng thời, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới cô giáo PGS.TS. Phạm Thị
Minh Huệ đã hỗ trợ nguyên liệu, hóa chất cho luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, anh chị cán bộ Viện Công nghệ
Dược phẩm Quốc gia, bộ môn Công nghiệp Dược, bộ môn Bào chế và bộ
môn Hóa lý đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên và tạo điều kiện thuận lợi để tôi
hoàn thành luận văn này.
Xin được cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường cùng các thầy cô, anh chị
phòng sau đại học đã quan tâm và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và
nghiên cứu của mình.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè và
các em sinh viên đã luôn ở bên giúp đỡ, động viên và ủng hộ tôi hoàn thành
luận văn này.
Hà Nội, ngày 30 tháng 03 năm 2016

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Đ T VẤN ĐỀ ............................................................................................................... 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN ............................................................................................ 2
1.1. Cấu tạo vi ọt ......................................................................................................... 2
1.1.1. Lõi khí ............................................................................................................. 2
1.1.2. Vỏ ngoài.......................................................................................................... 2
1.2. Phƣơng pháp ào chế .......................................................................................... 5
1.2.1. Phương pháp siêu âm .................................................................................... 5
1.2.2. Bay hơi dung môi ........................................................................................... 7
1.2.3. Khuấy tốc độ cao ............................................................................................ 7
1.2.4. Đẩy qua màng ................................................................................................ 8
1.2.5. Phun sấy kiểm soát bằng điện trường .......................................................... 8
1.2.6. Phun điện đồng trục (CEHDA) ..................................................................... 8
1.2.7. Hệ vi dẫn (Microfluidic) ................................................................................ 9
1.3. Ứng dụng của vi bọt .......................................................................................... 10
1.3.1. Tác nhân tương phản trong siêu âm .......................................................... 10
1.3.2. Tác nhân phân phối thuốc và gen............................................................... 12
1.4. Sự tồn tại của vi bọt trong cơ thể ..................................................................... 13
1.4.1. Sự hòa tan vi bọt trong máu ........................................................................ 13
1.4.2. Dược động học của vi bọt ............................................................................ 16
1.5. Một số chế phẩm trên thị trƣờng và liều dùng của vi bọt ............................. 17


1.6. Một số phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng vi bọt............................................ 19
1.7. Một số nghiên cứu về vi bọt vỏ lipid trên thế giới .......................................... 20
Chƣơng 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................................ 24
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị .................................................................................. 24
2.1.1. Nguyên vật liệu ............................................................................................. 24
2.1.2. Thiết bị ........................................................................................................... 25
2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 25
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................. 25
2.3.1. Phương pháp bào chế vi bọt ......................................................................... 25
2.3.2. Phương pháp thu vi bọt

hoảng

ch thư c th ch hợp ........................... 27

2.3.3. Phương pháp đánh giá một số đ c t nh của các dịch tạo bọt và vi bọt ..... 27
2.3.4. Phương pháp xử lý hình ảnh bằng phần mềm Image J ............................ 29
3.1.

hảo sát phƣơng pháp ào chế vi bọt phospholipid........................................ 30

3.1.1. Khảo sát phương pháp chuẩn bị dịch tạo bọt.............................................. 30
3.1.2. Khảo sát các thông số thiết bị ảnh hư ng t i quá trình tạo bọt và chất
lượng bọt tạo thành ..................................................................................................... 39
3.2. Khảo sát khả năng tạo bọt của một số các chất và phospholipid ................... 43
3.2.1. Khảo sát khả năng tạo bọt các chất diện hoạt và các polyme thân nư c .. 43
3.2.2. Khảo sát hả năng tạo bọt của các phospholipid ........................................ 44
3.2.3. Khảo sát nồng độ phospholipid ................................................................... 46
3.2.5. Khảo sát sự ết hợp hai phospholipid ......................................................... 48
3.3. Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng tới độ bền bọt sau khi tạo thành ........... 49
3.3.1. Khảo sát ảnh hư ng của các dung dịch pha loãng dịch bọt và ảnh
hư ng của pH hệ đệm ................................................................................................. 49

3.3.2. Khảo sát độ ổn định của các vi bọt

khoảng

ch thư c 1-4 µm ............. 51

3.4. Xác định sức căng ề mặt một số dịch tạo bọt................................................ 52
Chƣơng 4. BÀN LUẬN .............................................................................................. 53
4.1. Về quá trình chuẩn bị dịch tạo bọt .................................................................. 53
4.2. Về các thông số trong quá trình tạo bọt .......................................................... 54
4.3. Về thành phần cấu tạo vỏ vi bọt ....................................................................... 55
4.4. Các yếu tố ảnh hƣởng tới độ bền bọt sau khi tạo thành ................................ 59
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ....................................................................................... 61
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ADN

Axit Deoxyribo Nucleic

CEHDA

Phun điện đồng trục

DCP

Dicetyl phosphat

DMPC

Dimyristoylphosphatidylcholin

DPPA

1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphat

DPPC

1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin

DPPE

1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol-amin

DSPC

Distearoylphosphatidylcholin

DSPE-PEG 2000
DSPG
FDA
HEPES
HSPC

1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N[(polyethylene glycol)-2000]
1,2-Distrearoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-glycerol

Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and
Drug Administration)
Acid 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethansulfonic
Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (Hydrogenated
soy bean phosphatidylcholin)

PA

Acid palmatic

PC

Phosphocholin

PE

Phosphoethanolamin

PEG

Poly (ethylene glycol)

PEG 400

Poly (ethylene glycol) 400

PEG 40S

Poly (ethylene glycol) 40 stearat

PEG 6000

Poly (ethylene glycol) 6000

PET

Hình ảnh chụp positron cắt lớp

PFB

Pefluorocarbon

RES

Hệ thống lưới nội mô


SEM
TEM
Tm

Kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron microscopy)
Hiển vi điện từ truyền qua (Transmission electron
microscopy)
Nhiệt độ chuyển pha (Phase transition temperature)


DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
STT

Tên bảng

Trang

1

Bảng 1.1. Một số chế phẩm trên thị trường

18

2

Bảng 1.2. iều dùng của một số chế phẩm trên thị trường

19

3

Bảng 1.3. Một số chỉ tiêu và phương pháp, thiết bị đánh giá vi
bọt

19

4

Bảng 2.1. Hóa chất và nguyên liệu sử dụng

24

5

Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng

25

6

7

8
9
10

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của phương pháp phân
tán phospholipid trong nước
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời điểm thêm
chất diện hoạt
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm
phân tán
Bảng 3.4. Kết quả so sánh với phương pháp tạo màng phim
Bảng 3.5. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ dịch tạo bọt tới một
số chỉ tiêu chất lượng bọt tạo thành

31

32

34
35
37

11

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các phương pháp
làm nguội dịch sau tạo bọt

38

12

Bảng 3.7. Kết quả khảo sát công suất siêu âm tạo bọt

39

13

14

Bảng 3.8. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhịp phát xung siêu
âm
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm
tạo bọt

41

42


15

Bảng 3.10. Kết quả khảo sát khả năng tạo bọt của một số chất
diện hoạt và polyme thân nước

44

16

Bảng 3.11. Kết quả tạo bọt từ HSPC và DSPG

45

17

Bảng 3.12. Kết quả khảo sát nồng độ phospholipid HSPC

46

Bảng 3.13. Kết quả khảo sát khả năng tạo bọt của HSPC với
18

Tween 80, PEG 400, PEG 6000 và Triton X100 ( ở các nồng

47

độ 0,1; 0,5 và 2 mg/ml)
19

20

21

22

23
24

Bảng 3.14. Kết quả khảo sát khả năng tạo bọt của HSPC với
Poloxamer 188
Bảng 3.15. Kết quả khảo sát khả năng tạo bọt của HSPC với
Poloxamer 407
Bảng 3.16. Kết quả khảo sát khả năng tạo bọt khi kết hợp của
hai phospholipid HSPC và DSPG
Bảng 3.17. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các dung dịch pha
loãng dịch sau tạo bọt
Bảng 3.18. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của đệm citrat với các
pH khác nhau tới dịch sau tạo bọt
Bảng 3.19. Sức căng bề mặt của một số dịch tạo bọt

47

48

48

50

51
52

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

STT

Tên hình

Trang

1

Hình 1.1. Cấu trúc một vi bọt điển hình với các loại vỏ
khác nhau

2

2
3

4

Hình 1.2. Sự hình thành của vi bọt vỏ lipid bằng phương pháp
siêu âm
Hình 1.3. Bộ chế phẩm Lenovist vi bọt lõi không khí, vỏ
galactose và acid palmitic
Hình 3.1. Hình ảnh vi bọt trên tiêu bản sử dụng phương pháp
1 (bên trái) và phương pháp 2 (bên phải) để phân tán

5
18

31

phospholipid
5

6

Hình 3.2. Đồ thị phân bố kích thước vi bọt khi cho chất diện
hoạt trước (Trước SAPT) và sau siêu âm phân tán (Sau SAPT)
Hình 3.3. Đồ thị phân bố kích thước vi bọt với thời gian siêu
âm phân tán 1; 2 và 3 phút

33

34

Hình 3.4. Đồ thị phân bố kích thước vi bọt tạo thành khi phân
7

tán phospholipid bằng phương pháp 2 (pp2) và phương pháp 3

36

(pp3)
8

9

10

11
12

Hình 3.5. Đồ thị phân bố kích thước vi bọt khi thay đổi công
suất siêu âm tạo bọt
Hình 3.6. Đồ thị phân bố kích thước vi bọt khi thay đổi nhịp
phát xung siêu âm
Hình 3.7. Đồ thị phân bố kích thước vi bọt khi thay đổi thời
gian siêu âm
Hình 3.8. Đồ thị phân bố kích thước vi bọt tạo từ HSPC và
DSPG
Hình 3.9. Đồ thị phân bố kích thước vi bọt tạo thành khi kết

40

41

43

45
49


hợp hai phospholipid HSPC và DSPG
13

Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi kích thước và số lượng
vi bọt có kích thước ban đầu 1-4 µm

51

Đ T VẤN ĐỀ
Vi bọt là những bọt khí nhỏ có kích thước cỡ micromet. Chúng có khả
năng phản xạ âm cao do chịu nén ở các cường độ siêu âm khác nhau tốt hơn
nhiều so với chất lỏng và chất rắn [25]. Chúng cải thiện đáng kể chất lượng
hình ảnh trong siêu âm nên được ứng dụng làm chất tương phản phổ biến
trong siêu âm chẩn đoán. Ngoài ra, chúng còn bị phá hủy bởi chính sóng siêu
âm nên được ứng dụng trong điều trị hướng đích [49].
Về cấu tạo cơ bản, vi bọt gồm 2 phần là l i khí và vỏ bao ngoài. Vỏ bao
ngoài có thể là protein, lipid, polyme hoặc chất diện hoạt. Trong đó, vi bọt vỏ
lipid có khả năng phản xạ âm tốt, ổn định với sóng siêu âm đồng thời lipid có
nhiều trong tự nhiên và rất tương thích sinh học [17].
nước ta hiện nay, bào chế và ứng dụng vi bọt còn là vấn đề rất mới
m . Với tính mới m này, sự hữu ích của vi bọt và phospholipid s n có, tiến
hành đề tài: Nghiên c u bào chế vi bọt vỏ phospholipid” với các mục tiêu
sau:
1.

Xây dựng được công thức và phương pháp bào chế vi bọt vỏ

phospholipid.
2.

Đánh giá một số đặc tính và độ ổn định của vi bọt bào chế được.

1


Chƣơng 1. TỔNG QUAN

1.1. Cấu tạo vi ọt
Vi bọt là những bọt nhỏ cỡ micromet, có cấu tạo gồm hai phần cơ bản
là l i khí và lớp vỏ bảo vệ bên ngoài.
Vi bọt đã phát triển qua ba thế hệ. Thế hệ đầu tiên là l i không khí với
vỏ albumin, lipid hoặc acrylat. Thế hệ thứ hai sử dụng l i khí là các hợp chất
của fluor ít tan trong nước, áp suất hơi cao giúp làm tăng độ ổn định cho vi
bọt. Thế hệ thứ ba vượt trội hơn hai thế hệ trước, sử dụng các thành phần kết
hợp để ổn định vi bọt hoặc gắn thêm tác nhân hướng đích [15].

Hình 1.1. Cấu trúc một vi bọt điển hình với các loại vỏ
khác nhau
1.1.1. Lõi khí
i khí là phần khí bên trong của vi bọt, có thể gồm một khí hoặc hỗn
hợp của nhiều khí. Khí có thể là không khí, perfluorocarbon, hoặc nitrogen
[45]. Những khí kém tan trong nước và áp suất hơi cao sẽ khó thoát khỏi vi
bọt hơn và tồn tại lâu hơn trong tuần hoàn máu [47].
1.1.2. Vỏ ngoài
Vỏ ngoài có vai trò như một hàng rào ngăn cản giữa lõi khí và môi
trường nước xung quanh do đó giúp ổn định vi bọt, đồng thời cũng có thể là
―giá đỡ mang thuốc‖. Nguyên liệu tạo vỏ có thể là protein, lipid, polyme hoặc
2


chất diện hoạt… Các nguyên liệu này tạo vỏ ngoài theo cơ chế khác nhau và
có những đặc điểm riêng.
 Vỏ lipid
ipid được dùng phổ biến để tạo vỏ cho vi bọt do có nhiều trong tự
nhiên và khá tương thích sinh học. Các phân tử lipid liên kết rất chặt chẽ với
nhau nhờ tính kỵ nước và lực liên kết Van der Waals giữa các chuỗi acyl,
giúp vi bọt có sự đàn hồi tốt và giảm sự thoát khí ra bên ngoài [33]. Lipid

thường dùng là các phospholipid với cấu trúc một đầu thân nước và một đầu
thân dầu, và thường sử dụng loại phospholipid có đầu thân nước lưỡng cực
như phosphatidylcholine (PC) hoặc phosphatidylethanolamine (PE) [11],
[16], [22], [40]. Đầu thân nước cũng có thể được biến đổi hóa học để gắn với
ADN hoặc liên kết với các poly ion tích điện trái dấu tạo thành cấu trúc đa lớp
[7]. Cũng như liposome, các đầu thân nước của lipid với những biến đổi hóa
học là cơ sở cho các ứng dụng chẩn đoán và điều trị. Đầu thân dầu
hydrocarbon tạo nên bề mặt phân cách giữa pha khí và pha lỏng. Các chuỗi
di-acyl bão hòa thường được chọn do độ hòa tan thấp và khả năng sắp xếp tốt,
có sức căng bề mặt thấp dưới áp lực nén cao, các phospholipid phân nhánh
hoặc chuỗi ngắn thường chỉ hình thành đơn lớp do vậy vi bọt sẽ không ổn
định. Sự có mặt của nhóm methylen trên chuỗi di-acyl bão hòa làm tăng độ
cứng cho vỏ do tăng tính thân dầu và lực hấp dẫn Van der Waal giữa các tiểu
phân lipid [26]. Độ cứng cao thì sự thấm khí kém, lực cắt lớn và giãn nở tốt
hơn so với lipid mạch ngắn [8], [9], [33]. Do vậy vi bọt với lipid mạch acyl
dài có thời gian bán thải dài hơn.
Ngoài phospholipid, thành phần góp phần quan trọng trong sự hình
thành và ổn định vi bọt là các chất nhũ hóa. Các chất nhũ hóa thường dùng
chính là các phospholipid có gắn PEG (như DSPE-PEG2000) [61]. Tuy
nhiên, việc sử dụng chất nhũ hóa khác có khả năng tan tốt trong nước hơn như
PEG40S không phải là hiếm [34]. Chất nhũ hóa PEG góp phần hình thành vi
3


bọt bằng cách làm giảm hàng rào năng lượng cho quá trình hợp nhất vi bọt –
liposome thông qua lực liên kết hấp dẫn. Ngoài ra, các chất nhũ hóa PEG có
thể làm rối loạn cấu trúc sắp xếp lipid của liposome, cho phép lipid dễ dàng
thoát ra và lan tỏa trên bề mặt vi bọt. Khi ở dạng đơn lớp, PEG tạo cấu trúc
bàn chải, ngăn cản sự hợp nhất của vi bọt nhờ lực đẩy không gian. Bàn chải
PEG cũng là vị trí để biến đổi hóa học cho các ứng dụng y sinh học của vi

bọt.
 Vỏ protein
Vi bọt làm tác nhân tương phản đầu tiên được FDA phê chuẩn là các vi
bọt vỏ albumin Albunex® và Optison ™ (GE Healthcare). Gần đây, các vi
bọt vỏ protein được biến đổi chức năng để mang liên kết hướng đích và chứa
thuốc [36].
Vỏ protein thường cứng và thiếu ổn định trong quá trình siêu âm chẩn
đoán và có những vấn đề miễn dịch điển hình do bản chất có nguồn gốc từ
động vật. Trong báo cáo của mình, Cavalieri và đồng nghiệp đã khẳng định
vai trò của cầu nối disulfide trong việc hình thành lớp vỏ protein ổn định [13].
 Vỏ chất diện hoạt
Chất diện hoạt có cấu tạo gồm hai phần: phần thân nước và phần thân
dầu nên chúng có khả năng hấp phụ trên bề mặt phân cách pha và tạo thành
một lớp đơn, đa phân tử hoặc các ion được định hướng làm thay đổi bản chất
phân cực của lớp bề mặt và giảm năng lượng bề mặt giữa hai pha. Nhờ vậy,
vỏ chất diện hoạt dễ dàng hình thành bao quanh lõi khí và giúp vi bọt ổn định.
Wheatley và đồng nghiệp đã xây dựng công thức vi bọt với vỏ là hỗn hợp các
chất diện hoạt Span- 40 và Tween- 40 [55], [63]. Dung dịch Span/ Tween với
tỉ lệ 1:1 được siêu âm trong không khí để tạo thành các vi bọt ổn định. Tỷ lệ
này được xác định nhờ phương pháp màng phim Langmuir Blodgett [63].
 Vỏ polyme
4


Các phân tử polyme liên kết với nhau bằng liên kết ngang hoặc liên kết
chéo. Vì thế vỏ polyme tương đối dày, có khả năng đàn hồi, khả năng tăng độ
hồi âm và phân phối thuốc tốt hơn hơn vỏ lipid và albumin [42], [57].
1.2.

Phƣơng pháp ào chế

1.2.1. Phương pháp siêu âm
Siêu âm là phương pháp đơn giản và phổ biến nhất để tạo vi bọt. Vi bọt
được tạo thành bằng cách phân tán pha khí vào dung dịch chứa nguyên liệu
tạo vỏ thích hợp với lực siêu âm ở cường độ cao. Người ta cho rằng có hai
nguyên tắc cơ bản trong phương pháp này [58]. Thứ nhất, các chất khí được
phân tán để tạo thành các lỗ trống nhỏ qua đó các vật liệu bao phủ như protein
hoặc chất diện hoạt tự động hấp phụ lên bề mặt. Thứ hai, nhiệt độ và áp suất
cao làm thay đổi cấu trúc hóa học của lớp vỏ bề mặt nên cải thiện độ ổn định
của vi bọt hoặc vi giọt. Kích thước bọt và phân bố kích thước bọt tạo thành
phụ thuộc vào tần số, năng lượng và xung của chế độ siêu âm [25]. Nhìn
chung phân bố kích thước bọt được tạo thành bằng phương pháp này thường
tương đối rộng, vì thế trước khi đem sử dụng cần phải được phân loại để loại
bỏ những bọt lớn có thể gây tắc mạch [48].
ĐfĐường khí vào

LilLipid bám trên về mặt bọt

co nhỏ lại

V

Lực chia cắt

Vi cấu trúc

Hình1.2. Sự hình thành của vi bọt vỏ lipid bằng phƣơng pháp siêu âm

5

Nguồn khí đưa vào dịch tạo bọt được lấy từ bề mặt phân cách khí –
lỏng, nhờ lực chia cắt của siêu âm. Do vậy, tốc độ tạo vi bọt bị ảnh hưởng lớn
bởi vị trí của đầu siêu âm. Vi bọt nhanh chóng được tạo ra nếu đầu siêu âm
được đặt ở bề mặt phân cách khí-lỏng. Ngược lại, nếu đặt sâu bên trong dịch
lỏng, tốc độ tạo bọt giảm một cách đáng kể.
Trường hợp có mặt liposome trong môi trường dịch tạo bọt, sự va chạm
giữa liposome và vi bọt trong quá trình siêu âm khiến một số phân tử lipid
chuyển dịch từ vỏ liposome sang vỏ bọt [43]. Khi giải phóng từ lớp kép của
liposome, lipid ngay lập tức tự định hướng đuôi acyl kỵ nước của chúng về
phía l i khí và tự lắp ráp để hình thành màng bao đơn lớp quanh vi bọt [23].
Quá trình hấp phụ tiếp tục cho tới khi mật độ lipid tăng tới giá trị tới hạn,
tương ứng với sức căng bề mặt tại điểm cân bằng, khoảng 25mN m [41]. Tuy
nhiên, sự hòa tan khí do áp lực aplace, như mô tả của Epstein và Plesset
[18], khiến vi bọt co nhỏ, tiếp tục làm giảm khoảng cách giữa các phân tử.
khoảng cách gần, lực hấp dẫn Van der Waals chiếm ưu thế, các phân tử lipid
sắp xếp rất khít nhau tạo nên các vùng tỉ trọng lớn. Sức căng bề mặt lúc này
đạt đến một giá trị rất thấp và sự hòa tan khí của vi bọt dừng lại [9], [10],
[33]. Kết quả là, sự bao màng vi bọt tạo nên một vi cấu trúc độc nhất.
Một số thông số sau có thể ảnh hưởng đến tỷ lệ hấp phụ lipid và khả
năng ổn định của vi bọt. Lực cắt của siêu âm làm tăng tần số va chạm giữa
liposome và vi bọt, qua đó làm tăng khả năng chuyển dịch lipid [51]. Đặc tính
bề mặt của lipid có thể ảnh hưởng đến khả năng liên kết giữa các phân tử và
khả năng vỡ màng phim. Ví dụ, các lipid tích điện khó kết hợp với nhau do
lực đẩy tĩnh điện, trong khi đó, nồng độ muối cao trong môi trường có thể làm
giảm lực đẩy và tạo điều kiện liên kết các phân tử. Ảnh hưởng dạng cấu trúc
của polyme phức tạp hơn do ảnh hưởng của lực liên kết hấp dẫn và lực đẩy
không gian chồng chéo lên nhau. Ví dụ, poly (ethylene glycol) (PEG) có cả
đặc tính thân dầu và thân nước, do đó dễ dàng cố định tại bề mặt khí-lỏng
6

[65] trong khi vẫn hòa tan trong nước [26]. PEG trên bề mặt của một lipid có
thể tạo thuận lợi cho sự hấp phụ lipid tới bề mặt vi bọt do lực liên kết hấp dẫn.
Sau khi hình thành, vi bọt được bao sẽ đẩy các vi bọt khác nhờ lực đẩy không
gian. Sự hấp phụ lipid cũng bị ảnh hưởng bởi tính chất của lõi khí. Szíjjártó
và cộng sự [60] đã chứng minh rằng việc sử dụng l i khí fluorocarbon có thể
tăng mức độ hấp phụ lipid hơn so với khi sử dụng không khí.
1.2.2. Bay hơi dung môi
Đây cũng là phương pháp tương đối phổ biến, đặc biệt hay áp dụng với
các loại vi bọt sử dụng polyme làm lớp vỏ ngoài. Tiến hành bằng cách nhũ
hóa dung dịch polyme (được hòa tan trong một loại dung môi thích hợp)
thành nhũ tương bởi các lực cơ học như: khuấy đảo, chia cắt mạnh [6], [28].
Nhũ tương được hình thành gồm pha ngoại là nước, chứa các chất hoạt động
bề mặt thích hợp. Pha nội là hỗn hợp của hai dung môi không đồng tan với
nước, một dung môi dễ bay hơi và có khả năng hòa tan vỏ polyme, một dung
môi khó bay hơi và không hòa tan polyme. Trong quá trình tiến hành, dung
môi dễ bay hơi sẽ dần mất đi, khiến nồng độ polyme trong pha nội tăng lên và
chuyển dần sang pha dung môi không bay hơi, tạo thành một màng polyme ở
bề mặt giọt nhũ tương. Vi bọt sau đó được hình thành nhờ quá trình đông khô,
loại bỏ lõi dung môi hữu cơ và thay bằng lõi khí.
Đối với phương pháp này, phân bố kích thước vi bọt chủ yếu phụ thuộc
vào kích thước của các hạt nhũ tương và bất kỳ sự chia cắt hay hợp nhất nào
của vi cầu ở các giai đoạn tiếp theo.
1.2.3. Khuấy tốc độ cao
Vi bọt được tạo ra nhờ lực khuấy đảo chia cắt của cánh khuấy, phân tán
pha khí hoặc pha lỏng vào dung dịch của nguyên liệu tạo vỏ. Các phân tử chất
tạo vỏ sẽ tự động tìm đến và sắp xếp trên bề mặt mới trong dung dịch và hình
thành nên vi bọt. Kích thước vi bọt có thể kiểm soát được nhờ tốc độ cánh
khuấy hay tỉ lệ pha lỏng, pha khí. Tương tự phương pháp siêu âm, phân bố

7


kích thước vi bọt bào chế bằng phương pháp này khá lớn, cần phải được phân
loại trước khi đem đi sử dụng.
1.2.4. Đẩy qua màng
Phương pháp tiến hành bằng cách đẩy hỗn hợp chứa nhiều thành phần
đi qua một màng xốp một hoặc nhiều lần, tạo thành các giọt lỏng [29]. Sau đó
cũng tiến hành các bước tiếp theo như phương pháp bay hơi dung môi để tạo
vi bọt, hoặc có thể tạo ngay vi bọt bằng cách sử dụng khí tạo lõi cho vi bọt
như một pha phân tán [38].
Ưu điểm của phương pháp này là kiểm soát kích thước vi bọt tốt hơn,
phân bố kích thước hẹp hơn so với phương pháp siêu âm hay bay hơi dung
môi [36]. Và số lượng vi bọt tạo thành không bị giảm theo thời gian hay khối
lượng của hỗn hợp các thành phần tạo vi bọt. Kích thước cũng như phân bố
kích thước của hệ vi bọt phụ thuộc nhiều vào đặc điểm của các lớp màng
(phân bố kích thước lỗ màng, độ xốp của màng) [30].
1.2.5. Phun sấy kiểm soát bằng điện trường
Đây là kỹ thuật được sử dụng nhằm cải thiện tính đồng nhất của vi bọt.
Các vi bọt được tạo thành từ một vòi phun bằng thép không gỉ (đường kính
đầu phun 20-50μm) được cung cấp dịch phun trong buồng phun có nhúng một
điện cực. Bằng cách thay đổi điện thế của điện cực, xung áp suất sẽ được tạo
ra trong lòng dịch phun, với mỗi xung áp suất một giọt chất lỏng sẽ được đẩy
ra khỏi vòi phun và dịch phun lại được tiếp tục hút vào buồng phun. Để thu
được các vi giọt, có thể phun trực tiếp vào không khí hoặc phun chìm vào
trong một môi trường lỏng. Ưu điểm của phương pháp này là có thể kiểm soát
được kích thước giọt bằng cách thay đổi chế độ phun và không đòi hỏi áp suất
cao để tạo giọt như là với phương pháp màng nhũ hóa [38].
1.2.6. Phun điện đồng trục (CEHDA)
Đây là kỹ thuật gần đây mới áp dụng để tạo vi bọt, trong đó một dòng

dịch lỏng được đưa vào trong buồng phun dưới sự kiểm soát của một điện
8


trường tương tự như kỹ thuật phun sấy. Sau đó phun tạo thành các giọt nhỏ
được giữ trong một hệ treo nhờ các kim phun đồng trục khác. Để bào chế vi
bọt, kim bên trong cung cấp khí còn kim bên ngoài cung cấp dịch có vật liệu
bao ngoài mong muốn. Nhờ thay đổi tỉ lệ pha khí, pha lỏng hay điện áp cung
cấp cho đầu kim phun mà kích thước và độ đồng nhất của vi bọt tạo thành có
thể được kiểm soát [19]. Giảm đường kính vi bọt bằng cách giảm tỉ lệ khí,
tăng điện áp hay giảm đường kính của đầu kim phun [27].
Ưu thế của phương pháp này so với kỹ thuật phun sấy đó là có thể cung
cấp ngay khí cho lõi vi bọt chỉ trong một bước mà không cần các bước xử lý
tiếp theo và cho phép tạo ra các vi bọt có vỏ đa lớp bằng cách tăng số lượng
dòng chất lỏng.
1.2.7. Hệ vi dẫn (Microfluidic)
Kỹ thuật hệ vi dẫn được sử dụng để tạo ra vi bọt có kích thước được
kiểm soát một cách chính xác và thường áp dụng với các vi bọt vỏ polyme.
Thành phần khí tạo l i được cung cấp nhờ một kênh mao dẫn, sau khi đi vào
dung dịch polyme chứa bên trong một kênh mao dẫn đồng trục khác sẽ được
bao bọc lại, tạo thành vi bọt. Thông thường pha khí thường được tiêm vào pha
dầu nhờ một kim đồng trục khác, khí trong pha dầu sau khi thoát ra khỏi đầu
mao dẫn sẽ đi vào dung dịch polyme để tạo một hệ phân tán có chứa có vi bọt
có cấu trúc lõi khí và vỏ trong pha nước. Vi bọt vỏ polyme thu được sau đó sẽ
được làm sạch bằng cách bay hơi dung môi. Có thể tạo các vi bọt đa thành
phần bằng cách kết hợp các thành phần này vào pha dầu để tạo lớp vỏ trong
cùng. Phương pháp bào chế này rất thuận lợi để nghiên cứu số lượng vi bọt ổn
định dựa vào bán kính và độ dày vỏ. Tuy nhiên so với các phương pháp khác
thì phương pháp hệ vi dẫn có năng suất tương đối thấp [4], [68].

9


1.3. Ứng dụng của vi bọt
1.3.1. Tác nhân tương phản trong siêu âm
Vi bọt có khả năng phản xạ âm cao do chịu nén ở các cường độ siêu âm
khác nhau tốt hơn nhiều so với chất lỏng và chất rắn [25]. Đồng thời khi vi
bọt chịu tác động của sóng âm tại một tần số phù hợp, sẽ xảy ra hiện tượng
cộng hưởng âm. Và rất may mắn là vi bọt ở kích thước micromet cộng hưởng
dải tần số thường dùng trong siêu âm chẩn đoán thông thường (1-3MHz).
Sử dụng vi bọt làm tác nhân tương phản trong siêu âm chẩn đoán có hai
đặc tính độc đáo mà không có ở các tác nhân sử dụng trong kỹ thuật chụp Xquang hay chụp cộng hưởng từ. Thứ nhất là vi bọt có kích thước lớn hơn 1μm
nên chúng bị giới hạn phân bố bên trong không gian mạch máu và chỉ phân
bố đúng trong không gian mạch máu. Do đó, khi có bất kỳ một tín hiệu nào
nhận được thì chắc chắn đó là tín hiệu đến từ không gian mạch máu. Thứ hai,
vi bọt có thể bị phá hủy bởi chính sóng siêu âm, ứng dụng trong điều trị
hướng đích [49].
Vi bọt đã giúp cải thiện đáng kể chất lượng hình ảnh trong các trường
hợp siêu âm chẩn đoán sau:
 Hình ảnh buồng tim
Sử dụng tác nhân tương phản vi bọt để lấp đầy buồng tim đã cho những
tín hiệu nổi bật ở khoang thất trái giúp đánh giá chuyển động của nó trong quá
trình tâm thu. Phân định rõ được biên giới của tâm thất còn giúp đánh giá toàn
bộ chức năng tim bằng cách đo phân suất tống máu (tỉ lệ máu trong tâm thất
trái được đẩy ra trong một nhịp tim) và theo dõi chuyển động của thành tim
hay sự tưới máu của động mạch vành để phát hiện bệnh thiểu năng mạch
vành.
 Hình ảnh mạch máu
Khi tiến hành chụp ảnh mạch máu, tác nhân tương phản siêu âm vi bọt
10

giúp: xác định được rằng các mạch máu có bị tắc hay không; đánh giá được
những bất thường của thành mạch máu như phát hiện các mảng xơ vữa và
đánh giá ảnh hưởng của chúng đến lưu lượng dòng máu; xác định hướng dòng
chảy và vận tốc dòng máu thông qua chu kỳ tim ở trạng thái bình thường; thu
được những hình ảnh chụp X-quang mạch máu giống như cây mạch máu
trong các cơ quan [35], [56].
 Hình ảnh tƣới máu mô
Khả năng nhận biết ra các mô được tưới máu và tình trạng tưới máu mô
là vô cùng quan trọng để phát hiện ra các mô bệnh. Siêu âm tuy có thể cho
phép quan sát cấu trúc của cơ tim và nội tạng nhưng nó lại không nhạy cảm
với những mô thiếu máu cục bộ, chẳng hạn như trong trường hợp suy mạch
vành hay thậm chí là những mô đang thay đổi trong giai đoạn đầu của tắc
mạch cục bộ và nhồi máu mô [31]. Sử dụng tác nhân tương phản để lấp đầy
mạch máu trong các mô không chỉ giúp phát hiện tắc mạch ngay sau khi nó
vừa xảy ra mà còn đánh giá được khả năng tưới máu ở mô. Khối u sẽ được
phát hiện dễ dàng hơn, đặc biệt là các khối u nhỏ khi có sự hỗ trợ của tác nhân
tương phản, do chúng ta có thể quan sát được các mạch máu nuôi mô ác tính,
khác hẳn với mạch máu nuôi mô bình thường, chúng thường quanh co và
phân nhánh lộn xộn, tập trung nhiều ở ngoại vi khối u và lưu lượng máu ngoại
vi tăng hoặc giảm hay không có máu nuôi khu vực trung tâm. Phản xạ siêu
âm giúp xác định số lượng vi tuần hoàn của khối u qua đó đánh giá việc hình
thành mạch máu để nuôi khối u [64].
 Hình ảnh phân tử
Việc phát hiện các dấu hiệu đặc trưng cụ thể ở mức phân tử của một
bệnh lý được gọi là hình ảnh phân tử. Khi gắn lên vỏ vi bọt, một số tác nhân
có khả năng hướng tới đích cần có hình ảnh phân tử thì hình ảnh siêu âm tại
vị trí đó sẽ trở nên r nét hơn. Ví dụ như, khi kết hợp phosphotidylserin vào
vỏ lipid, vi bọt sẽ hấp dẫn bạch cầu bắt giữ chúng ngay tại các ổ viêm [46].

11


Các loại mô mục tiêu hay được hướng tới gồm huyết khối, mảng xơ vữa, ổ
viêm, khối u. Ví dụ, để có được hình ảnh rõ ràng về huyết khối, người ta sử
dụng các vi bọt có gắn trên bề mặt các thụ thể GPIIb IIIa được tìm thấy trên
tiểu cầu đã được kích hoạt [53], [66].
 Những vi bọt lý tư ng làm chất tương phản trong chẩn đoán hình
ảnh bằng siêu âm
Vi bọt khi sử dụng làm tác nhân tương phản siêu âm thì kích thước cần
phải được kiểm soát trong giới hạn quy định (1- 10μm) và phân bố kích thước
càng hẹp càng tốt. Vi bọt quá nhỏ sẽ phản xạ âm kém và không bền, vi bọt
quá lớn sẽ không đi qua được lòng mao mạch và có thể gây tắc mạch. Kích
thước vi bọt cần phải được kiểm soát tại cả hai thời điểm trước khi tiêm và
trong suốt thời gian lưu thông trong cơ thể, cần phải hạn chế việc tăng kích
thước do hợp nhất các vi bọt. Đặc biệt, vi bọt cần phải ổn định trong thời gian
siêu âm chẩn đoán hình ảnh. Vì vậy, thời gian bán thải của vi bọt trong cơ thể
là một yếu tố quan trọng [57]. Ngoài ra, vi bọt sẽ tốt hơn nếu:
-

Không chứa các thành phần có nguồn gốc từ protein máu.

-

Có một lớp vỏ đàn hồi giúp tăng khả năng cộng hưởng.

-

Đạt hiệu quả tăng cường tương phản ở liều thấp.

-

Dễ dàng chuyển hóa hoặc bài tiết và có rất ít tác dụng phụ.

-

Dễ dàng để sản xuất hàng loạt.

-

Có thể tiệt trùng bằng nhiệt.

1.3.2. Tác nhân phân phối thuốc và gen
Trong liệu pháp gen, rào cản lớn nhất là không có hệ thống đưa acid
nucleic tới tế bào đích. Sử dụng vi bọt với kỹ thuật siêu âm đã khắc phục tốt
được rào cản này. Gen hướng đích được phân phối bằng cách tiêm đồng thời
ADN plasmid và vi bọt có thể mang lại hiệu quả thông qua mức độ biểu hiện
của gen, nhưng phương pháp này yêu cầu một lượng lớn ADN kết hợp để có
thể định lượng được. Do acid nucleic dễ bị nuclease phân giải và nhanh chóng
12


đào thải qua hệ thống lưới nội mô khi được đưa vào trong máu, vì vậy vi bọt
đã được sử dụng làm chất mang để bảo vệ chúng khỏi bị thoái hóa, tăng thời
gian lưu thông trong mạch máu, cải thiện tính đặc hiệu của việc phân phối tới
đích [5].
Phân phối thuốc tới đích được thực hiện bằng cách kết hợp các phân tử
thuốc và vỏ của vi bọt. Khác với các acid nucleic, các phân tử thuốc hiếm khi
liên kết tĩnh điện với bề mặt vi bọt, thay vào đó chúng kết hợp cùng lớp vỏ
hoặc ngay dưới bề mặt của lớp vỏ hoặc chúng được kết hợp với một chất

mang khác có thể liên kết với bề mặt vi bọt. Sau khi vi bọt tới đích chúng sẽ
bị phá vỡ bởi lực siêu âm và giải phóng thuốc [44]. Như vậy, sử dụng vi bọt
làm tác nhân phân phối thuốc sẽ mang lại nhiều lợi ích như:
- Bảo vệ dược chất khỏi sự tác động của các enzym phân hủy thuốc trong
máu.
- Tăng thời gian lưu thông của thuốc trong máu.
- Hạn chế khả năng gây độc cho các mô lành.
- Vi bọt bị phá vỡ bởi sóng siêu âm do đó có thể kiểm soát được quá trình
giải phóng thuốc.
1.4. Sự tồn tại của vi bọt trong cơ thể
1.4.1. Sự hòa tan vi bọt trong máu
1.4.1.1. Vi bọt hòa tan trong dung dịch
Trong dung dịch, một vi bọt với lõi không khí chịu tác động của áp suất
Laplace và áp suất khí quyển. Áp suất không khí bên trong vi bọt (Pint) cân
bằng với tổng áp suất Laplace (Plap) và áp suất khí quyển (Patm) theo phương
trình:
Pint= Plap + Patm =

+ Patm

(1)

σ: sức căng bề mặt giữa vi bọt và môi trường
r: bán kính vi bọt
13