Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây rận trâu (Dioscorea SP.), họ củ nâu (Dioscoreaceae) ở Đà Nẵng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ TƢƠI

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ
THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY RẬN
TRÂU (DIOSCOREA SP.), HỌ CỦ NÂU
(DIOSCOREACEA) Ở ĐÀ NẴNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI – 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ TƢƠI

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ
THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY RẬN
TRÂU (DIOSCOREA SP.), HỌ CỦ NÂU
(DIOSCOREACEA) Ở ĐÀ NẴNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN
MÃ SỐ: 60720406

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Hoàng Tuấn

HÀ NỘI – 2016


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này tôi đã nhận
được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các chuyên gia trong
lĩnh vực cùng đồng nghiệp và gia đình.
Trước hết tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Sau Đại
học, các thầy cô giáo, các kỹ thuật viên bộ môn Dược liệu, Dược học cổ
truyền và Thực vật- Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi
cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Tiếp theo, tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học
Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm và các cán bộ đồng nghiệp Khoa
Nông học Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho tôi yên tâm
học tập và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Hoàng Tuấn người
thầy đã tận tình hướng dẫn, luôn quan tâm chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận
lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin cám ơn TS. Đỗ Thị Hà, Trưởng khoa Hóa Thực vật- Viện
Dược liệu cùng các anh chị kỹ thuật viên Khoa Hóa thực vật- Viện Dược liệu
đã tận tình giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi nghiên cứu và hoàn thành luận văn
này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS. Nguyễn Thị Duyên, em
Lê Thị Mai Anh, anh Nguyễn Văn Phương đã giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn

này.
Cuối cùng là lời cảm ơn sâu sắc nhất, tôi muốn gửi tới gia đình, người
thân và bạn bè những luôn luôn bên cạnh ủng hộ tôi trong quá trình học tập và
nghiên cứu.
Thái Nguyên, ngày 30 tháng 3 năm 2016
Nguyễn Thị Tƣơi


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 3
1.1. Chi Dioscorea L. ........................................................................................... 3
1.1.1. Vị trí phân loại của chi Diocorea L. .......................................................... 3
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Dioscorea L. .................................. 3
1.1.3. Các nghiên cứu về phân loại thực vật của chi Dioscorea L. ở Việt Nam .. 4
1.1.4. Các nghiên cứu về hóa học của chi Dioscorea L. ...................................... 5
1.1.5. Ứng dụng của chi Dioscorea L ................................................................... 7
1.1.5.1. Ứng dụng trong đời sống ......................................................................... 7
1.1.5.2. Ứng dụng trong y học .............................................................................. 8
1.2. Diosgenin ....................................................................................................... 9
1.2.1. Công thức cấu tạo, tính chất lý, hóa học ..................................................... 9
1.2.2. Ứng dụng của diosgenin ............................................................................. 10
1.2.3. Các loài Dioscorea dùng làm nguồn nguyên liệu chiết xuất
diosgenin ............................................................................................................... 11
1.2.4.Các phương pháp định lượng diosgenin .................................................... ..13
1.3. Cây Rận Trâu ............................................................................................... ..14
1.3.1. Đặc điểm thực vật. .................................................................................... ..14

1.3.2. Thành phần hóa học .................................................................................. ..14
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. ..15


2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ............................................................................... 15
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu ............................................................................ 15
2.1.2. Các hóa chất, máy móc, thiết bị dùng trong nghiên cứu .......................... 15
2.2. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................. 16
2.2.1. Nghiên cứu về thực vật ............................................................................. 16
2.2.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học ........................................................... 17
2.2.2.1.Định tính một số hợp chất hữu cơ trong dược liệu bằng phản ứng hóa
học ....................................................................................................................... 17
2.2.2.2. Chiết xuất, phân lập các hợp chất trong thân rễ Rận Trâu ..................... 21
2.2.2.3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được .................. 24
2.2.3. Định lượng diosgenin trong thân rễ Rận trâu ........................................... 25
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................ 27
3.1. Đặc điểm thực vật và dược liệu ................................................................... 27
3.1.1. Mô tả đặc điểm thực vật, đặc điểm dược liệu và giám định tên khoa học
của cây Rận trâu .................................................................................................. 27
3.1.2. Hình ảnh đặc điểm vi phẫu của lá, thân và thân rễ cây Rận trâu .............. 29
3.1.2.1. Đặc điểm vi phẫu lá............................................................................... 29
3.1.2.2. Đặc điểm vi phẫu thân ........................................................................... 30
3.1.2.3. Đặc điểm vi phẫu thân rễ ....................................................................... 31
3.1.3. Đặc điểm bột lá, thân, thân rễ Rận trâu..................................................... 32
3.1.3.1. Đặc điểm bột lá ...................................................................................... 32
3.1.3.2. Đặc điểm bột thân ................................................................................. 33
3.1.3.3. Đặc điểm bột thân rễ .............................................................................. 34


3.2. Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học ................................................. 35

3.2.1. Xác định sơ bộ thành phần các nhóm chất có trong dược liêu nghiên
cứu ....................................................................................................................... 35
3.2.2. Chiết xuất, phân lập các hợp chất saponin có trong thân rễ Rận trâu ....... 37
3.2.2.1. Chiết xuất ............................................................................................... 37
3.2.2.2. Phân lập các hợp chất saponin ............................................................... 38
3.2.3. Kết quả dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được ............................... 40
3.2.3.1. Hợp chất RT01 ....................................................................................... 40
3.2.3.2. Hợp chất RT02 ....................................................................................... 45
3.3. Định lượng diosgenin trong thân rễ Rận trâu .............................................. 50
3.3.1. Chuẩn bị mẫu ............................................................................................ 50
3.3.2. Phân tích mẫu ............................................................................................ 51
3.3.3. Kết quả định lượng diosgenin trong thân rễ Rận trâu ................................ 55
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN ................................................................................. 56
4.1. Về thực vật ................................................................................................... 56
4.2. Về hóa học .................................................................................................... 57
4.3. Về định lượng diosgenin trong thân rễ Rận trâu .......................................... 59
KẾT LUẬN ........................................................................................................ 61
KIẾN NGHỊ ....................................................................................................... 62
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
13

C-NMR: Carbon Nuclear Magnetic Resonance

CDCl3: Deuterated chloroform
COSY: Correlation spectroscopy
16-DPA: 10-dehydro pregnennolon acetat
d: doublet

DEPT: Detortionless enhancement by polarisationtrasfer
1

H-NMR: Proton Nuclear Magnetic Resonance

HPLC: High-performance liquid chromatography
HPTLC: High performance thin layer chromatography
HMBC: Heteronuclear multilpe bond cerelation
HSQC: Heteronuclear single quantum corelation
MS: Mass spectrum
m/z: Khối lượng/điện tích ion
NMR: Nuclear Magnetic Resonance
NOESY: Nuclear Magnetic Resonance
p/đ: Phân đoạn
SD: Standard deviation (Độ lệch chuẩn)
s: singlet
STT: Số thự tự
SKLM: Sắc ký lớp mỏng
Rf: Hệ số di chuyển
TT: Thuốc thử
v/v: Thể tích/ thể tích


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Số lượng các loài trong chi Dioscorea ở Việt Nam

4

Bảng 1.2. Một số loài Dioscocrea ở Việt Nam

5

Bảng 1.3. Các loài Dioscorea quan trọng được sử dụng để sản xuất

11

diosgenin trong công nghiệp
Bảng 3.1. Kết quả định tính sơ bộ các chất trong thân rễ Rận trâu

36

Bảng 3.2. Hàm lượng cắn các phân đoạn chiết xuất từ thân rễ Rận

38

trâu
Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất RT01 và hợp chất tham

42

khảo
Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất RT02 và hợp chất tham

47

khảo
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của diosgenin

54

Bảng 3.6. Hàm lượng diosgenin trong thân rễ Rận trâu

55


DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ
Trang
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của diosgenin

9

Hình 3.1.1. Một số đặc điểm hình thái của cây Rận trâu

28

Hình 3.1.2. Vi phẫu lá Rận trâu

30

Hình 3.1.3. Vi phẫu thân Rận trâu

31

Hình 3.1.4. Vi phẫu thân rễ Rận trâu

32

Hình 3.1.5. Một số đặc điểm bột lá Rận Trâu

33

Hình 3.1.6. Một số đặc điểm bột thân Rận Trâu

34

Hình 3.1.7. Một số đặc điểm bột thân rễ Rận Trâu

35

Hình 3.2.1. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ thân rễ Rận trâu

38

Hình 3.2.2. Sơ đồ phân lập hợp chất saponin từ thân rễ Rận trâu

40

Hình 3.2.3. Cấu trúc của hợp chất RT01

45

Hình 3.2.4. Cấu trúc của hợp chất RT02

50

Hình 3.3.1. Sắc ký đồ của các mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu trắng

53

Hình 3.3.2. Phổ hấp thụ UV của diosgenin chuẩn và trong mẫu thử

53

Hình 3.3.3. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của diosgenin

55


ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là quốc gia nằm ở vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có nhiều
điều kiện thuận lợi cho các sinh vật phát triển tạo ra hệ thực vật phong phú và
đa dạng. Trong số đó có rất nhiều các loài thuốc quý và đang được sử dụng.
Nguồn cây thuốc dân gian cũng như vốn sử dụng dược liệu phong phú của
đồng bào các dân tộc vẫn là kho tàng quý giá để khám phá. Tuy nhiên việc sử
dụng chúng chủ yếu là theo kinh nghiệm dân gian hay trong y học cổ truyền
được lưu truyền từ đời này qua đời khác, còn rất nhiều cây thuốc chưa được
nghiên cứu hoặc nghiên cứu chưa có hệ thống. Vì vậy việc nghiên cứu cây cỏ
làm thuốc một cách đầy đủ và toàn diện là điều cần thiết góp phần nâng cao
tính an toàn và hiệu quả điều trị.
Hiện nay ngành y các nước dùng khoảng hơn 100 loại chế phẩm hormon
để chữa bệnh, khoảng 50 chứng bệnh thường không chữa được bằng các
thuốc khác. Các chế phẩm này được sản xuất hoặc từ các hormon động vật
hoặc từ các sapogenin và alcaloid steroid thực vật (diosgenin, hecogenin,
solasodin,…) [25]. Khoảng 50- 60% dẫn chất steroid dùng làm thuốc trên
toàn cầu được sản xuất từ diosgenin. Nhiều nước trên thế giới cũng như Việt
Nam đã và đang chú ý nghiên các cây cỏ thuộc chi Dioscorea họ Củ nâu
(Dioscoreaceae) với mục đích chiết xuất diosgenin sản xuất các chế phẩm
hormon steroid. Nhu cầu về lượng thân rễ Dioscorea để sản xuất diosgenin
ngày càng lớn, trong khi đó nguồn nguyên liệu cung cấp diosgenin ngày càng

giảm do sự khai thác quá mức [27], [34], [36]. Điều này đòi hỏi cần tìm thêm
những nguồn nguyên liệu khác cung cấp diosgenin. Trong khi đó chi
Dioscorea trên thế giới có khoảng 600 loài, ở Việt Nam có hơn 40 loài [8],
[13], [40]. Và còn nhiều loài trong số đó chưa được nghiên cứu để xác minh
hàm lượng diosgenin.

1


Gần đây chúng tôi mới phát hiện một loài Dioscorea sp. tại Đà Nẵng mà
người dân địa phương gọi là cây Rận trâu (từ đây chúng tôi gọi loài này là
Rận trâu). Cho đến nay, theo tổng quan tài liệu chưa thấy có nghiên cứu nào
sâu về cây này ở Việt Nam.
Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và
thành phần hóa học của cây Rận Trâu (Dioscorea sp.), họ Củ nâu
(Dioscoreaceae) ở Đà Nẵng” với mục tiêu :
- Nghiên cứu đặc điểm thực vật, đặc điểm vi học và giám định tên khoa
học của cây Rận trâu ở Đà Nẵng.
- Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số saponin từ
thân rễ cây Rận trâu.
- Định lượng diosgenin trong thân rễ Rận trâu.

2


Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1. Chi Dioscorea L.
1.1.1. Vị trí phân loại của chi Diocorea.
Vị trí phân loại của chi Dioscorea trong hệ thống phân loại thực vật của
Takhatajan 1987 [4] như sau:

Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)
Lớp Hành (Liliopsida)
Phân lớp hành (Liliidae)
Bộ củ nâu (Dioscoreales)
Họ củ nâu (Dioscoreaceae)
Chi Dioscorea
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố và của chi Dioscorea L.


Đặc điểm thực vật:
Thực vật chí Đông Dương [42] mô tả:
Cây cỏ lâu năm hoặc hàng năm. Bộ phận dưới mặt đất giàu chất dự trữ

(tinh bột). Thân leo, có những loài thì thân quấn sang phải, số khác thì quấn
sang trái. Lá nguyên, một số ít trường hợp là lá kép; lá mọc xen kẽ hoặc mọc
đối. Kiểu hoa: đa phần hoa đơn tính, hiếm khi gặp kiểu hoa khác. Hoa thường
không có cuống hoặc có cuống rất ngắn mọc thành chùm hay bông rủ xuống.
Lá đài và cánh hoa giống nhau, lá đài 3, cánh hoa 3. Hoa đực: nhị 6 hoặc 3 có
khi lép hay không có và rất ngắn. Hoa cái giữa các loài trong chi không khác
nhau lắm, các đặc điểm không phong phú như hoa đực. Bầu 3 ô, mỗi ô chứa 2
noãn, noãn ngược, đầu nhụy 6 tạo thành 3 cặp. Quả nang chẻ ô có 3 cánh.
Quả mở bằng cách nứt dọc theo mép của cánh với trục quả. Hạt có cánh ở tất
cả các loài.


Phân bố:

3

Chi có khoảng 600 loài, phân bố rộng ở vùng nhiệt đới và ôn đới châu
Á, Australia, châu Mỹ. Ở Việt Nam có hơn 40 loài [8], [13], [40]. Ở châu Á
có khoảng 140 loài [38].
1.1.3. Các nghiên cứu về phân loại thực vật của chi Dioscorea L. ở Việt
Nam
Nhiều tác giả Việt Nam và nước ngoài đã nghiên cứu chi Dioscorea L. ở
Việt Nam về mặt phân loại thực vật.
Loureiro trong bộ “Thực vật chi Nam bộ” đã mô tả 6 loài thuộc chi
Dioscorea L. ở Nam bộ nước ta [37].
Prain và Burkill đã mô tả 51 loài thuộc chi Dioscorea L. ở Đông dương,
trong đó Việt Nam có 27 loài [28] (Bảng 1.1). Đây là công trình lớn nhất và
có giá trị nhất về nghiên cứu phân loại chi Dioscorea L. ở Đông dương cũng
như Việt Nam.
Bảng 1.1. Số lượng các loài trong chi Dioscorea L. ở Việt Nam
STT

Sections

Số loài có ở Việt Nam

1

Stenophora Uline

4

2

Stenocorea Prain et Burkill

1

3

Combilium Prain et Burkill

1

4

Illigastrum Prain et Burkill

1

5

Shannicorea Prain et Burkill

1

6

Paramecocarpa Prain et Burkill

1

7

Lasiophyton Uline

7

8

Opsophyton Uline

1

9

Enantiophyllum Uline

10

Năm 1972, Phạm Hoàng Hộ trong cuốn “Hải nam thực vật chí” đã giới
thiệu 26 loài ở Việt nam [17], tác giả đã tóm tắt nêu sự phân bố và bổ sung
thêm hình vẽ các loài Prain et Burkill đã công bố trong “Thực vật chí tổng
4


quát Đông dương” [28]. Đây là một tài liệu mang tính chất phổ biến khoa
học, có giá trị trong việc nhận biết các loài. Năm 2000 các tác giả đã đưa tổng
số loài lên 43 loài.
Năm 1977, Lê Đình Bích đã thống kê và lập danh mục gồm 36 loài
thuộc chi Dioscorea, tác giả đã mô tả 8 loài trong đó có 2 loài mới đối với hệ
thực vật Việt nam (Dioscorea subcalva Prain et Burkill và D. collettii Hook.
f.) [5]. Năm 1996, kết hợp điều tra nghiên cứu thực địa với việc tra cứu các tài
liệu tác giả và cộng sự đã đưa ra bảng gồm 41 loài thuộc chi Củ nâu ở Việt
Nam, nêu sự phân bố của các loài này ở Việt Nam và các nước lân cận [6].
Tổng hợp các tài liệu trên cùng sự điều tra trong chương trình địa lý y tế

quân sự Miền trung và Địa lý y tế quân sự Tây nguyên chúng tôi lập được
danh sách các loài thuộc chi Dioscorea L. thường được sử dụng ở các địa
phương của nước ta (Bảng 1.2).
Bảng 1.2. Một số loài Dioscocrea L. ở Việt Nam
STT

Tên Việt Nam

Tên Việt Nam

1

Dioscorea collettii Hook. f.

Nần nghệ

2

D. membranacea Piere

Nần đen

3

D. dissimulan et Burkill

Từ dấu

4

D. hemsleyi Prain et Burkill

Từ hemsley

5

D. paradoxa Prain et Burkill

Từ ngược

6

D.subcalva Prain et Burkill

Cư chinh

7

D. aff. Tokoro Mark.

Nần dứa

8

D. zingiberensis

Nần gong

1.1.4. Các nghiên cứu về hóa học của chi Dioscorea L.
Có nhiều công trình nghiên cứu về mặt hóa học của các cây thuộc chi

Dioscorea. Kết quả nghiên cứu cho thấy thành phần chủ yếu trong thân rễ của
5


các loài này là tinh bột. Nhiều loài được xếp vào danh sách nguyên liệu để thu
tinh bột (D. alata). Tinh bột trong thân rễ của một số loài Dioscorea không
chỉ sử dụng làm lương thực, thực phẩm mà còn làm tá dược trong sản xuất
thuốc, một số loài có hàm lượng tanin cao.
Takeda đã nghiên cứu sapogenin steroid của họ Dioscoreaceae, ông nhận
thấy rằng có sự liên quan về mặt hóa học và hình thái giải phẫu giữa các loài
khác nhau trong chi Củ nâu (Dioscorea L.). Theo tác giả các loài thuộc
section Stenophora Uline thường chứa saponin steroid trong thân rễ, còn ở
các section khác không tìm thấy các chất này [40]. Phần lớn các công trình
nghiên cứu về mặt hóa học của chi Dioscorea L. thường quan tâm đến thành
phần saponin trong thân rễ và thành phần này thường được coi là hoạt chất
chính. Các nghiên cứu về mặt hóa học của họ Củ nâu trước đây cho thấy có
saponin steroid và sự có mặt của alcaloid trong một số loài trong chi Củ nâu
(Dioscorea L.). Tuy nhiên việc nghiên cứu về các alcaloid chưa được chú ý
đến nhiều.
Có rất nhiều công trình nghiên cứu saponin steroid trong chi Dioscorea
L. Các công trình nghiên cứu của các nhà khoa học Mỹ đã chứng minh các
saponin steroid có nhiều trong họ Hành (Liliaceae), họ Thủy tiên
(Amaryllidaceae) và họ Củ Nâu (Dioscoreaceae). Đáng chú ý nhất là các loài
trong chi Dioscorea L. trước đây trong công nghiệp để tổng hợp các thuốc
hocmon steroid chủ yếu dùng diosgenin được chiết xuất từ các loài thuộc chi
Dioscorea L. Khoảng 90% các hormon được sản xuất từ diosgenin và các các
sapogenin có cấu trúc tương tự. 117 loài (chiếm 18% tổng số loài) của chi
Dioscorea L. đã được nghiên cứu về saponin steroid, có nhiều loài có hàm
lượng rất cao (Dioscorea spiculiflora Heml.). Với sự hỗ trợ của các phương
tiện phân tích các nhà khoa học đã phân lập ra nhiều chất trong thân rễ của chi

này [6].
6


Năm 1986, Nguyễn Hoàng, Lê Đình Bích đã nghiên cứu saponin steroid
của 8 loài thuộc chi này, hàm lượng diosgenin trong thân rễ và rễ củ (tính theo
trọng lượng khô) của chúng rất khác nhau [5].
Nguyễn Hoàng và cộng sự đã nghiên cứu diosgenin trong Nần gừng thu
mẫu tại Quảng Nam- Đà Nẵng, đã xác định hàm lượng 1% diosgenin trong
thân rễ [14].
Năm 1985, Đống Việt Thắng và cộng sự đã phân lập được từ loài D.
deltoidea nhập nội vào Việt Nam 2 saponin A và B, saponin A trùng với
deltonin. Khi thủy phân saponin A thì được diosgenin và phần đường gồm Dglucose và L-rhamnose. Saponin B trùng với diocin. Thủy phân saponin B thu
được diosgenin và phần đường gồm D-glucose và L-rhamnose [16].
Nguyễn Xuân Cường và cộng sự đã nghiên cứu thành phần hóa học
trong D. hispida Dennst. Đã xác định hàm lượng saponin 10% trọng lượng
khô. Saponin này có tác dụng trị nấm ngoài da. Tác giả đã xác định và phân
lập cấu trúc của genin A [10].
Các công trình nêu trên cho thấy saponin steroid có trong nhiều loài
thuộc chi Dioscorea ở nước ta. Một số loài có hàm lượng diosgenin lớn có thể
nghiên cứu trồng để chiết xuất diosgenin.
1.1.5. Ứng dụng của chi Dioscorea
1.1.5.1.


Ứng dụng trong đời sống
Do thân rễ chứa nhiều chất dinh dưỡng nên một số loài Dioscorea

được sử dụng làm lương thực, chế biến thức ăn, đặc biệt khi thiếu đói, giáp
hạt như: khoai mỡ (D. alata), củ từ (D. esculenta), khoai rạng (D. glabra), củ

mài (D. persimilis)…[4], [8], [13].


Thân rễ chứa tanin, dùng để nhuộm lưới và quần áo như: Củ nâu

(D. cirhosa), từ ngược mùa (D. intempestiva)…[8], [13].

7




Thân rễ một số loài có độc, dùng để diệt chấy rận, duốc cá, tẩm

mũi tên như: củ mài gừng (D. zingiberensis), từ poilane (D. deltoidea), củ nần
(D. hispida), …[8], [13].
1.1.5.2.

Ứng dụng trong y học

Một số loài dùng để chiết xuất diosgenin từ thân rễ. Ngoài ra, nhiều loài
trong chi Dioscorea được sử dụng làm thuốc. Dưới đây là một số tác dụng
của các loài Dioscorea:
- Bổ dưỡng nhất là khi cơ thể suy nhược, thận suy: D. alata, D.
asculenta, D. glabra, D. persimilis…[8], [9], [13].
- Chỉ huyết, tiêu ứ huyết: D. bulbifera, D. cirrhosa, D. esculenta...[8],
[9], [13].
- Mạnh gân xương, trị phong thấp, đau lưng, mỏi gối: D. hispida, D.
pentaphylla, D. collettii…[8], [9], [13].
- Trị sưng tấy, vết thương, phần mềm: D. esculenta, D. chingii, D.

subcalva, D. pentaphylla, D. hispida…[8], [9], [13].
- Giải độc: D. esculenta …[8], [9], [13].
Các loài Dioscorea có chứa phytoestrogens, các chất này có nhiều tác
dụng kháng độc tố như làm chậm quá trình lão hóa của cơ thể và tăng cường
sức khỏe toàn diện nhất là ở phụ nữ. Gần đây, thân rễ Dioscorea được xác
định có tác dụng điều chỉnh đáp ứng miễn dịch, kháng viêm, chống loãng
xương. Thêm nữa, tác dụng chống oxy hóa của dioscorin, một protein dự trữ
trong thân rễ Dioscorea cũng được nghiên cứu rộng rãi. Đã chứng minh được
rằng sử dụng thân rễ Dioscorea có thể cải thiện một số bất thường về chuyển
hóa bao gồm tăng đường huyết, bất thường chức năng ruột và chuyển hóa
lipid (Jeon và cộng sự, 2006) [40].
8


1.2. Diosgenin
1.2.1. Công thức cấu tạo, tính chất lý, hóa học
Diosgenin là một sapogenin steroid, được sản xuất thông qua thủy phân
saponin bằng acid, base mạnh hoặc các enzyme.
Công thức cấu tạo:
H3C

O

CH3

CH3
CH3

O

HO

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của diosgenin
Tên IUPAC: (3β,25R)-spirost-5-en-3-ol.
Công thức phân tử: C27H42O3.
Tính chất vật lý:
- Khối lượng phân tử: 414.62058 g/mol
- Tỷ trọng: 1,13g/cm3
- Nhiệt độ nóng chảy: 205-208oC
- Độ tan: tan tốt trong chloroform 20mg/ml, cho màu hơi vàng. Tan ít
trong các dung môi hữu cơ khác, không tan trong nước.
Tính chất hóa học: diosgenin là một sapogenin steroid thuộc nhóm
spirostan nên có các đặc tính sau:
- Có tính chất tạo bọt: tạo bọt trong môi trường kiềm.
- Các phản ứng màu:
+ Acid sulfuric đậm đặc hòa tan các saponin và cho thấy màu thay đổi
từ vàng, đỏ, lơ-xanh lá hay lơ-tím (Phản ứng Salkowski).
+ Sapogenin hòa tan vào 1ml anhydrid acetic, cho thêm 1 giọt H2SO4
đậm đặc cho màu xanh lá (Phản ứng Liebermann – Burchardt).
9


1.2.2. Ứng dụng của diosgenin
- Diosgenin được chứng minh là có tác dụng duy trì ổn định mức
cholesterol máu và là nguyên liệu khởi đầu cho việc tổng hợp một số sản
phẩm nội tiết tố như: dehydroepiandrosteron, progesteron. Diosgenin có tác
dụng ngăn ngừa sự mất xương ở mức độ tương tự estrogen. Do vậy diosgenin
được sử dụng để điều trị cho bệnh nhân sau mãn kinh để làm giảm sự tiến
triển loãng xương [36].
- Diosgenin có tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu và huyết khối, kéo dài

thời gian thromboplastin (APTT), thời gian thrombin (TT), thời gian
prothrombin (PT). Do đó, nó có tác dụng trong việc điều trị các bệnh về tim
mạch như bệnh mạch vành và cơn đau thắt ngực [32].
- Trong các tế bào ung thư vú HER2-overexpressing, người ta thấy có sự
tăng lên rõ rệt của Fatty acid synthetase (FAS). Diosgenin có khả năng ngăn
chặn sự xuất hiện của FAS trong các tế bào ung thư vú. Diosgenin ưu tiên ức
chế sự tăng sinh và gây độc tế bào ung thư HER2-overexpressing. Hơn nữa
diosgenin ức chế phản ứng phosphoryl hóa Akt, mTOR và JNK. Diosgenin có
khả năng ức chế sự tồn tại, sự phát triển và gia tăng của các tế bào ung thư vú
[29], [33].
- Ứng dụng quan trọng của diosgenin đó là nguồn nguyên liệu bán tổng
hợp ra 16-dehydro pregnenolon acetat (16-DPA), là chất trung gian để tổng
hợp các dẫn chất steroid. Khoảng 50- 60% dẫn chất steroid dùng làm thuốc
trên toàn cầu được sản xuất từ diosgenin. Hàng năm ước tính ngành dược cần
10.000 tấn thân rễ Dioscorea để sản xuất diosgenin [34], [36].
Trong số hàng trăm saponin steroid được biết cho đến nay thực tế cũng
chỉ 10 chất có giá trị kinh tế lớn vì hai lý do:
- Có nguồn nguyên liệu tự nhiên dồi dào hoặc trồng trọt dễ có năng xuất
cao.
10


- Hệ thống Spiroketal trong cấu trúc của chúng dễ dàng bị phá để cho ra
hợp chất trung gian là dehidropregnenolon acetat (DPA) là khung cơ bản để
tổng hợp các thuốc steroid.
Diosgenin là chất có ưu thế nhất về 2 phương diện trên [11].
1.2.3. Các loài Dioscorea dùng làm nguồn nguyên liệu chiết xuất
diosgenin
Khoảng 90% các dẫn chất steroid dùng làm thuốc được sản xuất đều đi
từ nguyên liệu là diosgenin. Mặc dù diosgenin có gặp trong họ Liliaceae (chi

Trillium), họ Zingiberaceae (chi Costus), họ Taccaceae (chi Tacca) nhưng chỉ
có họ Dioscoreaceae mới có giá trị thực tế [23].
Theo số liệu của Barua và cộng sự năm 1954, 1956 có trên 50 loài
Dioscorea chứa diosgenin [35]. Những loài Dioscorea có hàm lượng
diosgenin đáng kể thường có thân quấn ngược chiều kim đồng hồ [23]. Phần
lớn diosgenin được sản xuất trên thế giới xuất phát từ các loài Trung Mỹ, chủ
yếu là D. floribunda và D. composita, cả hai đều mọc hoang ở bản địa [35].
Trong thân rễ của D. floribunda D. composita thành phần diosgenin và
yamogenin chiếm gần 90 % glycosid toàn phần, cả hai đều là những tiền chất
steroid có giá trị D. deltoidea chứa diosgenin ở trạng thái tinh khiết nhất, nên
có giá trị cao trên thị trường steroid [30].
D. nipponica và D. zingiberensis chứa diosgenin và được trồng nhiều ở
Trung Quốc, nước sản xuất diosgenin nhiều nhất hiện nay [28].
Bảng 1.3. Các loài Dioscorea quan trọng được sử dụng để sản xuất
diosgenin trong công nghiệp [36].
Loài

Xuất xứ

D. composita Hemsl.

Mexico

D. mexacana Dcheidw
11


D. floribunda M. Martens & Galeotti
Ấn Độ

D. deltoidea Wall. Ex Griseb.
D. sylvatica Eckl.

Nam Phi, Zimbabwe

D. collettii Hook. F
D. pathaica Prain & Burkill

Trung Quốc

D. nipponica Makino
D. zingiberensis C. H. Wright
Tại Việt Nam, vào những năm 1980 Nguyễn Hoàng, Lê Đình Bích,
Nguyễn Bá Hoạt và cộng sự đã tiến hành điều tra cơ bản nguồn nguyên liệu
cung cấp diosgenin ở Việt Nam trong 4 họ: Dioscoreaceae (chi Dioscorea),
Costaceae (chi Costus), Zygophyllaceae (chi Tribulus), Taccaceae (chi
Tacca). Qua đó phát hiện 4 loài có triển vọng làm nguyên liệu chiết xuất
diosgenin [14], [16]:
- D. dissimulans (hàm lượng diosgenin 2%).
- D. membranacea (hàm lượng diosgenin 2- 2.3%).
- D. collettii (hàm lượng diosgenin 2.5- 4.4%).
- D. zingiberensis (hàm lượng diosgenin 1.4- 2.4%).
Về mối liên quan giữa hình thái thực vật và thành hóa học, các loài
Dioscorea có hàm lượng saponin steroid đáng kể ở Việt Nam, bên cạnh có
đặc điểm thân rễ và dây leo quấn trái, đều có những cặp gai cong ở cuống lá
[14].
Cũng trong thời gian này Viện Dược liệu [19], di thực 3 loài Dioscorea
vào Việt Nam: D. composita, D. floribunda và D. deltoidea. Đã xác định điều
kiện trồng chăm sóc phù hợp với 3 loài trên. Tuy nhiên sapogenin thu được từ
D. composita và D. floribunda đều có tạp chất pennogenin (hàm lượng

pennogenin trong sản phẩm từ vết đến 35% đối với D. composita, và từ 1-5%
12


đối với D. floribunda). Các nhà khoa học đã nghiên cứu xử lý tạp chất
penogenin song không thành công. Nghiên cứu bán tổng hợp 16-DPA từ hỗn
hợp diosgenin- pentogenin chưa biết tỷ lệ thành phần, chiết xuất từ D.
composita và D. floribunda cho thấy hiệu suất chỉ bằng 1/2 so với điều chế từ
diosgenin có hàm lượng trên 90% [19].
Các nhà khoa học tại Viện Dược liệu đã xây dựng quy trình chiết xuất
diosgenin từ dược liệu, áp dụng để chiết diosgenin từ D. floribunda trên quy
mô phòng thí nghiệm và quy mô bán công nghiệp. Từ diosgenin chiết được đã
tổng hợp 16- DPA và các dẫn chất steroid [26].
1.2.4. Các phƣơng pháp định lƣợng diosgenin


Phƣơng pháp cân
Bột dược liệu được thủy phân bằng acid, chiết bằng dung môi hữu cơ,

sau đó bốc hơi dung môi, sấy, cân [21].


Phƣơng pháp đo quang
Bột dược liệu được thủy phân, chiết bằng dung môi hữu cơ, sau đó ,sau

đó tiến hành sắc ký lớp mỏng để xác minh diosgenin. Diosgenin được chiết
bằng cloroform, lên màu bằng FeCl3 và H3PO4- H2SO4 (10:1, v/v), đo ở bước
sóng 485 nm [21].


Phƣơng pháp sắc ký khí
Bột dược liệu được ủ men, thủy phân, trung tính hóa, sấy khô, hòa tan

trong dung môi với chất nội chuẩn cholesterol rồi phân tích bằng máy sắc ký
khí [20].


Phƣơng pháp HPLC
Bột dược liệu được thủy phân, chiết bằng dung môi hữu cơ, bốc hơi

dung môi, hòa tan trong methanol rồi phân tích bằng máy HPLC [39].


Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)

13


Bột dược liệu được thủy phân, chiết bằng dung môi hữu cơ, bốc hơi
dung môi, hòa tan cắn trong cloroform. Chấm sắc ký của mẫu, cùng với dãy
diosgenin đối chiếu. Sau đó đo mật độ quang vết sắc ký bằng Densitometer
[1], [27].
Trong 4 phương pháp trên, phương pháp cân đòi hỏi lượng mẫu nhiều và
gặp sai số lớn trong quá trình chiết tách mẫu. Phương pháp đo quang phụ
thuộc vào độ bền màu của diosgenin với hỗn hợp thuốc thử. Phương pháp sắc
ký khí có quá trình chuẩn bị mẫu phức tạp. Phương pháp HPTLC kết hợp với
máy Densitometer cho kết quả nhanh, dễ thực hiện và kết quả khá chính xác
thích hợp cho định lượng sơ bộ. Phương pháp HPLC được sử dụng phổ biến
hiện nay.
1.3. Cây Rận Trâu

1.3.1. Đặc điểm thực vật
Thân dây leo (hoặc bò lan trên mặt đất ở những bãi đất trống) quấn sang
trái, dài đến 5m, đường kính thân 2-3mm, thân có từng cặp gai cong , dài 12mm ở hai gốc cuống lá. Lá mọc so le có cuống dài 5-7cm mang 3 lá chét, lá
chét ở giữa to và dài hơn, hình trứng nhọn ở đầu, hai lá bên bé hơn, hình trứng
lệch, phiến lá có 3 gân xuất phát từ gốc. Củ có nhiều nhánh, nhìn hao hao
giống củ gừng, có nhiều gai nhọn và rễ con cứng phân bố đều trên mặt củ.
Cây tập trung ở những khu rừng thưa có ánh sáng hoặc đồi chè, đất pha cát,
ven các bờ mương, bờ suối [24].
1.3.2. Thành phần hóa học
Cho đến nay, theo tổng quan tài liệu, chưa có nghiên cứu nào về thành
phần hóa học của cây Rận Trâu. Vì vậy việc nghiên cứu thành phần hóa học
của cây Rận Trâu là cần thiết, góp phần tăng giá trị ứng dụng của cây vào
thực tế, một nguồn nguyên liệu chiết diosgenin tiềm năng, góp phần làm
phong phú hơn những hiểu biết về hóa thực vật của các cây thuộc chi
Dioscorea, bổ sung thêm thông tin vào cơ sở dữ liệu khoa học của Việt Nam.
14


Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu
Mẫu cây Rận Trâu được thu hái ở Bà Nà- Đà Nẵng vào tháng 02/2015.
Một phần thân, lá, thân rễ được bảo quản trong cồn 600 để nghiên cứu
đặc điểm vi phẫu.
Một phần thân, lá, thân rễ được rửa sạch, thái lát mỏng, sấy khô ở 600C,
nghiền thành bột thô bảo quản nơi khô thoáng.
2.1.2. Các hóa chất, máy móc, thiết bị dùng trong nghiên cứu
Các hóa chất và thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của
dược điển Việt Nam IV.
- Diosgenin đối chiếu của Viện Dược liệu.

- Bản mỏng silicagel GF254 (Merck, Germany).
- Silicagel dùng cho sắc ký cột pha thường (Merck, Kielselgel 60, cỡ hạt
là 0,020-0,040 và 0,040-0,063 mm), pha đảo (30-50 µm, FuJisilisa Chemical
Ltd), Dianiom HP-20.


Hóa chất:
- Acid sulfuric, acid clohydric, natri hydroxyd, natri carbonat…
- Các thuốc thử dùng trong phản ứng định tính: TT Mayer, Dragendorff,

Buchardat, Diazo…
- Cloramin, cloralhydrat, acid acetic, xanh methylen, đỏ son phèn.
- Thuốc thử vanillin trong acid sulfuric đặc.
- Dung dịch đệm phosphat- natri clorid.


Dung môi: Cloroform, methanol công nghiệp, methanol Merck, ethanol,

aceton, nước cất, Acetonitril (Merck), acid phosphoric (Merck), nước cất 2
lần.

15




Dụng cụ: bát sứ, ống nghiệm, pipet chính xác, bình nón, bình đựng

mức, cốc cỏ mỏ, ống đong.


Thiết bị:
- Bếp cách thủy, sinh hàn hồi lưu, bình ngấm kiệt.
- Máy đo quang phổ UV khoa Hóa phân tích- Đại học dược Hà Nội.
- Máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR AM500 FT-NMR spectrometer.
- Máy HPLC Shimadzu LC- 10ATVP tại khoa Hóa phân tích- Tiêu

chuẩn Viện Dược liệu.
- Cân phân tích Precisa, cân kỹ thuật Sartorius.
- Máy đo độ ẩm Satorius.
- Đèn tử ngoại hai bước sóng 254 và 368 nm.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu về thực vật


Đặc điểm hình thái: Quan sát, mô tả đặc điểm hình thái của mẫu

nghiên cứu tại thực địa bằng phương pháp mô tả phân tích, chụp ảnh, thu hái
và làm tiêu bản mẫu khô. Mẫu tiêu bản khô được lưu tại phòng tiêu bản, Bộ
môn thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội.


Nghiên cứu đặc điểm hiển vi [7].
- Đặc điểm vi phẫu: Vi phẫu được cắt, bằng máy cắt cầm tay, tẩy và

nhuộm bằng phương pháp nhuộm kép, quan sát dưới kính hiển vi để xác định
đặc điểm vi phẫu và chụp ảnh dưới kính hiển vi.
- Đặc điểm bột: Lá, thân, thân rễ sấy khô ở 600, nghiền nhỏ thành bột
mịn bằng cối sứ, rây lấy bột mịn, lên tiêu bản, quan sát dưới kính hiển vi để
xác định đặc điểm bột và chụp ảnh dưới kính hiển vi.



Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu:
Giám định tên khoa học của cây trên cơ sở phân tích các đặc điểm hình

thái, đặc điểm của bộ phận sinh sản, so sánh đối chiếu với mẫu tiêu bản lưu
16