Bước đầu nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng sinh khối tế bào Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.)

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015

BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN
CHẤT LƢỢNG SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ
(Taxus wallichiana Zucc.)
Vũ Bình Dương*; Nguyễn Văn Long*
TÓM TẮT
Mục tiêu: xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở (TCCS) của sinh khối tế bào (SKTB) Thông đỏ
(Taxus wallichiana). Đối tượng và phương pháp: SKTB Thông đỏ nuôi cấy trong môi trường
lỏng. Tiến hành khảo sát các chỉ tiêu chất lượng chung theo Dược điển Việt Nam (DĐVN) IV,
định tính và định lượng paclitaxel, baccatin III bằng HPLC. Kết quả: đã khảo sát được các chỉ
tiêu chất lượng của SKTB Thông đỏ. Từ đó đưa ra các chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm, bao
gồm: hình thức cảm quan, độ ẩm, tro toàn phần, tro không tan trong axít, định tính, định lượng,
độ nhiễm khuẩn. Trong đó, các chỉ tiêu chất lượng quan trọng là định tính, định lượng paclitaxel
và baccatin III: hàm lượng paclitaxel không được < 0,03% và baccatin III không được ít hơn
0,005%. Kết luận: đã xây dựng và thẩm định được TCCS của SKTB Thông đỏ. Với TCCS xây
dựng được, có thể sử dụng trong kiểm nghiệm đánh giá chất lượng của SKTB Thông đỏ thu
được từ quá trình nuôi cấy sinh khối.
* Từ khóa: Thông đỏ; Sinh khối tế bào; Tiêu chuẩn chất lượng; Nuôi cấy tế bào.

Initial Study of the Standardization of Cellmass of Taxus Wallichiana
Summary
Objective: Establishment of institutional standard of Taxus wallichiana cellmass. Subjects
and methods: Taxus wallichiana cellmass which was cultured in liquid media. Evaluate general
specifications as regulated by Vietnamese Pharmacopoeia IV, qualitative and quantitative
determination of baccatin III by HPLC. Results: All specification of Taxus wallichiana cellmass
has been evaluated for standardization. From which, we established the standard criteria of
Taxus cellmass including: appearance, humidity, total ash, acid-insoluble ash, qualitative,
quantitative, bacteria count. In which, the most important specifications are qualitative and
quantitative criteria of paclitaxel and baccatin III: the content of paclitaxel is recommended to be
not less than 0.03% and baccatin III should be not less than 0.005%. Conclusion: Institutional

standard of taxus wallichiana cellmass has been established. With the selected criteria,
the Taxus cellmass can be evaluated for quality control during plant cell biomass production
process.
* Key words: Taxus wallichiana; Cellmass; Quality control; Plant cell culture.
* Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Vũ Bình Dương ()
Ngày nhận bài: 14/11/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 25/12/2014
Ngày bài báo được đăng: 29/12/2014

5


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015

ĐẶT VẤN ĐỀ
Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.)
phân bố ở Cao nguyên Đà Lạt (Lâm Đồng)
với số lượng cá thể nhỏ. Đây là dược liệu
ghi trong sách đỏ cần lưu ý bảo vệ [2]. Từ
Thông đỏ chiết xuất được paclitaxel (biệt
dược taxol) sử dụng phổ biến và hiệu quả
trong điều trị nhiều loại ung thư như: ung
thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư dạ
dày... Tuy nhiên, việc khai thác Thông đỏ
tự nhiên để chiết xuất paclitaxel khó đáp
ứng được nhu cầu điều trị ung thư (do tốc
độ sinh trưởng chậm, hàm lượng hoạt
chất thấp). Để khắc phục nhược điểm
này, bên cạnh việc nghiên cứu nhân
giống, trồng phát triển nguồn gen cây

Thông đỏ, công nghệ SKTB thực vật là
hướng đi mới có triển vọng trong sản xuất
các hoạt chất từ dược liệu nói chung và
các loài Thông đỏ nói riêng [3]. Học viện
Quân y đã nghiên cứu thành công quy
trình SKTB Thông đỏ ở quy mô phòng thí
nghiệm để chiết xuất paclitaxel cũng như
các dẫn chất sử dụng làm nguyên liệu
bào chế thuốc điều trị ung thư [4]. Để có
căn cứ cho việc thẩm định quy trình sản
xuất sinh khối, cũng như sử dụng sản
phẩm SKTB Thông đỏ cho chiết xuất
paclitaxel và các hoạt chất được ổn định,
cần có nghiên cứu về xây dựng tiêu
chuẩn chất lượng sản phẩm. Chúng tôi
nghiên cứu đề tài này nhằm: Khảo sát
xây dựng TCCS SKTB Thông đỏ.
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Nguyên vật liệu và thiết bị.
Sinh khối tế bào Thông đỏ thu hoạch
từ nuôi cấy trong môi trường lỏng
hildebrandt, được rửa sạch, sấy khô (lô
6

SH 03/2011); các hóa chất, dung môi hữu
cơ đạt tiêu chuẩn tinh khiết và tinh khiết
phân tích; chất chuẩn paclitaxel và baccatin
III (Sigma).
Thiết bị chiết siêu âm gia nhiệt (Memmert

GmbH + Co.KG D-91126 Schwabach FRG,
Đức). Máy cất quay (Rotavapor R-200,
Buchi, Đức); cân phân tích Sartorius (độ
chính xác 0,1 mg); cân kỹ thuật (độ chính
xác 0,01 g); máy ly tâm lạnh Universal 320
(Hettich, Đức); máy lắc siêu âm (Soniclean Úc); sắc ký lỏng hiệu năng cao (Waters 2695D, Mỹ) và một số trang thiết bị khác.
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
Tiến hành khảo sát các chỉ tiêu chất
lượng SKTB Thông đỏ theo phương pháp
chung của DĐVN IV [1] quy định với
dược liệu gồm: hình thức, độ ẩm, tro toàn
phần, tro không tan trong axít, độ nhiễm
khuẩn.
- Định tính paclitaxel và baccatin III:
tiến hành định tính bằng phương pháp
HPLC [5], phân tích sắc ký đồ của mẫu
thử với dung dịch hỗn hợp 2 chất chuẩn
và với mẫu Thông đỏ tự nhiên chuẩn.
- Định lượng paclitaxel và baccatin III:
bằng phương pháp HPLC đã khảo sát
trước đó [5] gồm: điều kiện sắc ký: cột
Luna Phenomenex C18 (5 m, 250 mm x
4,6 mm); pha động:acetonitril:nước cất
(chạy theo chương trình gradient), thể tích
bơm mẫu (20 µl), detector PDA (238 nm),
cột Luna (5 m); tốc độ dòng: 0,7 ml/phút.
Xử lý mẫu theo quy trình đã khảo sát [5].
So sánh diện tích pic của mẫu thử với
paclitaxel và baccatin III chuẩn. Từ đó
tính được hàm lượng paclitaxel và baccatin

III trong mẫu sinh khối.


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Hình thức cảm quan.
Thấy SKTB Thông đỏ là những khối tế bào khô, xốp, màu nâu, không có nấm mốc,
không có mùi lạ.
2. Độ ẩm.
Cân chính xác 1,000 g SKTB Thông đỏ. Tiến hành theo phương pháp mô tả trong
phụ lục 9.6 - DĐVN IV.
Bảng 1: Kết quả xác định độ ẩm trong SKTB Thông đỏ (n = 5).
g

X

g

1

1,1124

1,0568

5,00

2

1,1920

1,1429

4,12

3

1,1154

1,0612

4,86

4

1,0256

0,9784

4,60

5

1,0325

0,9827

4,82
4,68 ± 0,34

± SD

Độ ẩm trong SKTB Thông đỏ là 4,68 ± 0,34%.
3. Tro toàn phần.
Cân chính xác 1,500 g sinh khối, tiến hành xác định tro toàn phần theo phương
pháp mô tả trong phụ lục 9.8 - DĐVN IV.
Bảng 2: Kết quả xác định tro toàn phần của SKTB Thông đỏ (n = 5).
(g)

(g)

X

1

1,5235

0,0943

7,19

2

1,5795

0,0979

6,20

3

1,5987

0,1092

6,83

4

1,5654

0,1001

6,39

5

1,5901

0,0976

6,14

± SD

6,35 ± 0,28

Khối lượng tro toàn phần trong SKTB Thông đỏ là 6,35 ± 0,28%.
4. Tro không tan trong axít.
Cân khoảng 1,500 g dược liệu, nung ở 4500C để thu được tro toàn phần. Tiếp tục

thêm 25 ml dung dịch HCl 2M (TT), tiến hành theo phương pháp mô tả trong phụ lục
9.7 - DĐVN IV.
7


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015

Bảng 3: Kết quả xác định tro không tan trong axít của SKTB Thông đỏ (n = 5).
g

1
2
3
4
5

X

mg

1,5235
1,5795
1,5987
1,5654
1,5901

2,7
2,6
3,3
1,8

2,5

0,13
0,12
0,15
0,09
0,09
0,11 ± 0,02

± SD

Khối lượng tro không tan trong axít trong dược liệu SKTB Thông đỏ là 0,11 ± 0,02%.
5. Định tính paclitaxel và baccatin III.
Cân khoảng 500 mg SKTB Thông đỏ và mẫu Thông đỏ tự nhiên. Tiến hành định
tính paclitaxel và baccatin III theo phương pháp HPLC.
a

31.144

0.020

18.626

0.025

AU

0.015

0.010

0.005

0.000
10.00

12.00

14.00

16.00

18.00

20.00

22.00

24.00
26.00
Minutes

28.00

30.00

32.00

34.00

36.00

38.00

40.00

32.00

34.00

36.00

38.00

40.00

32.00

34.00

36.00

38.00

40.00

0.025
0.020

0.010

b

31.149

18.629

AU

0.015

0.005
0.000
-0.005
10.00

12.00

14.00

16.00

18.00

20.00

22.00

24.00
26.00

Minutes

28.00

30.00

0.025

0.020

AU

31.131

c

0.015

18.650

0.010

0.005

0.000
10.00

12.00

14.00

16.00

18.00

20.00

22.00

24.00
26.00
Minutes

28.00

30.00

Hình 1: Sắc ký đồ của chuẩn (a), mẫu Thông đỏ tự nhiên (b) và mẫu SKTB Thông đỏ (c).
8


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015

Đa số các pic xuất hiện trên mẫu
Thông đỏ tự nhiên đều xuất hiện trên pic
của mẫu SKTB Thông đỏ. Tại thời điểm
18,6 phút và 31,1 phút, ở sắc ký đồ mẫu
SKTB xuất hiện pic giống như các pic của
mẫu chuẩn baccatin III và paclitaxel. Như
vậy, trong SKTB Thông đỏ có baccatin III

và paclitaxel.
6. Định lƣợng paclitaxel và baccatin III.
Cân chính xác 500,0 mg SKTB đã
nghiền mịn cho vào ống ly tâm 50 ml, thêm
10 ml methanol, lắc xoáy với tốc độ 1.000
vòng/phút trong 5 phút. Ly tâm với tốc độ
3.000 vòng/phút trong 10 phút. Gạn lấy
dịch, SKTB trong ống ly tâm được chiết

như trên 3 lần nữa, mỗi lần với 10 ml
methanol. Gộp các dịch ly tâm, chuyển vào
bình gạn đã có sẵn 25 ml dung dịch natri
clorid 5%, lắc đều. Loại tạp bằng n-hexan 2
lần, mỗi lần 10 ml, gạn bỏ dịch chiết nhexan. Lớp nước được lắc kỹ với
dicloromethan 4 lần, mỗi lần 15 ml. Gộp các
dịch chiết dicloromethan, lọc qua natri sulfat
khan. Sau khi lọc xong, rửa lớp natri sulfat
bằng 2 - 3 ml dicloromethan. Gộp các dịch
lọc và dịch rửa dicloromethan, bốc hơi
dung môi ở 350C dưới dòng khí nitơ tới
cắn. Hòa cắn vừa đủ trong 5 ml methanol.
Lọc qua màng lọc 0,45 m, được dung dịch
tiêm sắc ký.

Bảng 4: Kết quả xác định hàm lượng paclitaxel và baccatin III trong SKTB Thông đỏ
(n = 6).
mg
mg

X

KHỐI LƯỢNG
PACLITAXEL
(mg)

KHỐI LƯỢNG
BACCA TIN III
(mg)

1

524,5

4,98

0,1809

0,0363

0,0324

0,0065

2

498,6

5,04

0,1747

0,0369

0,0270

0,0057

3

516,7

4,97

0,1743

0,0355

0,0304

0,0062

4

505,2

4,45

0,1743

0,0361

0,0304

0,0063

5

501,9

4,69

0,1708

0,0357

0,0277

0,0058

6

517,4

4,87

0,1742

0,0354

0,0300

0,0061

0,1749 ± 0,0030

0,0360
± 0,0006

0,0297 ± 0,0018

0,0061 ±
0,0003

± SD

Hàm lượng paclitaxel và baccatin III trong SKTB Thông đỏ lần lượt là 0,0360% và
0,0061%.
7. Độ nhiễm khuẩn.
Bảng 5: Kết quả đánh giá độ nhiễm khuẩn của SKTB Thông đỏ.
Y ª u

9

K Õ t

K Õ t

Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được không quá 104/01 g

142 ± 12

Đạt

Tống số Enterobacteria không quá 500/01 g

94 ± 11

Đạt

Nấm và mốc không quá 100/01 g

22 ± 2

Đạt

Không được có Salmonella/10 g

Không có

Đạt

Mẫu không có Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus
aureus./01 g

Không có

Đạt


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015

Độ nhiễm khuẩn của mẫu SKTB Thông
đỏ đạt mức 4 của DĐVN IV. Đây là mức
công bố phù hợp cho thuốc, bán thành phẩm
từ dược liệu.
Từ các kết quả đánh giá trên, căn cứ vào
quy định chung của DĐVN IV, chúng tôi đưa
ra TCCS của SKTB Thông đỏ gồm các chỉ
tiêu sau:
- Nguồn gốc: là khối tế bào Thông đỏ
được tạo ra bằng công nghệ SKTB thực vật
từ nguồn thân non Thông đỏ tự nhiên (Taxus
wallichiana Zucc.). SKTB Thông đỏ thu
hoạch từ hệ thống bioreactor, lọc, rửa, sấy
khô.
- Hình thức: khối tế bào khô, xốp, màu
nâu, không có nấm mốc, không có mùi lạ.
- Độ ẩm: không quá 12%.
- Tro toàn phần: không quá 8%.
- Tro không tan trong axít: không quá 2%.
- Định tính: phải thể hiện phép thử định
tính của paclitaxel và baccatin III.
- Định lượng:
+ Hàm lượng paclitaxel trong SKTB
Thông đỏ không < 0,03%.
+ Hàm lượng baccatin III trong SKTB
Thông đỏ không < 0,005%.
- Độ nhiễm khuẩn: đạt mức IV của
DĐVN IV.
Bản TCCS đã được Viện Kiểm nghiệm

Thuốc Trung ương thẩm định. Tiến hành
kiểm nghiệm mẫu SKTB Thông đỏ theo
TCCS đã đề xuất. Kết quả mẫu đều đạt các
chỉ tiêu chất lượng theo bản TCCS đã công
bố (phiếu kiểm nghiệm số: 42TCH/01 ngày
11 - 12 - 2011 của Viện Kiểm nghiệm Thuốc
Trung ương).
Như vậy, TCCS đã khảo sát được có thể
sử dụng để kiểm nghiệm, đánh giá
chất lượng của mẫu SKTB Thông đỏ thu
được từ quá trình nuôi cấy SKTB.

10

KẾT LUẬN
Đã khảo sát các chỉ tiêu chất lượng của
SKTB Thông đỏ. Từ đó đưa ra các chỉ tiêu
chất lượng của sản phẩm, bao gồm: hình
thức cảm quan, độ ẩm, tro toàn phần, tro
không tan trong axít, định tính, định lượng,
độ nhiễm khuẩn. Trong đó, các chỉ tiêu chất
lượng quan trọng là định tính, định lượng
paclitaxel và baccatin III: hàm lượng
paclitaxel không được ít hơn 0,03% và
baccatin III không được < 0,005%. Với các chỉ
tiêu chất lượng khảo sát được, có thể sử
dụng trong kiểm nghiệm đánh giá chất lượng
của SKTB Thông đỏ thu được từ quá trình
nuôi cấy sinh khối.
TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bộ Y tế. Dược điển Việt Nam. Nhà xuất
bản Y học. 2009.
2. Đỗ Huy Bích và CS. Cây thuốc và động vật
làm thuốc ở Việt Nam, tập 2. Nhà xuất bản Khoa
học và Kỹ thuật. 2009, tr.897-900.
3. Phan Đình Châu, Vũ Bình Dương. Sản xuất
thuốc điều trị ung thư paclitaxel từ các loài Thông
đỏ bằng công nghệ SKTB thực vật. Tạp chí
Thông tin Y Dược học. 2011, số 8, 9, tr.7-10, 1215.
4. Vũ Bình Dương, Nguyễn Văn Long, Phạm
Văn Hiển, Chử Đức Thành. Nghiên cứu nuôi cấy
SKTB Thông đỏ Việt Nam trong môi trường lỏng.
Tạp chí Y - Dược học Quân sự. 2011, 8, tr.7-14.
5. Vũ Bình Dương, Đào Văn Đôn, Nguyễn
Văn Long, Nguyễn Thị Thiện, Phạm Thị Thanh
Hà. Nghiên cứu định lượng các hoạt chất trong
sinh khối Thông đỏ bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao. Tạp chí Dược học. 2010, 9,
tr.21-24.