Nghiên cứu nâng cao tỉ lệ sống sót của lactobacillus acidophilus trong vi nang alginat phối hợp tinh bột

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ KIỀU TRANG
MÃ SINH VIÊN: 1101537

NGHIÊN CỨU NÂNG CAO TỈ LỆ
SỐNG SÓT CỦA Lactobacillus
acidophilus TRONG VI NANG
ALGINAT PHỐI HỢP TINH BỘT
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ KIỀU TRANG
MÃ SINH VIÊN: 1101537

NGHIÊN CỨU NÂNG CAO TỈ LỆ
SỐNG SÓT CỦA Lactobacillus acidophilus
TRONG VI NANG ALGINAT PHỐI HỢP
TINH BỘT
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
Ths. Kiều Thị Hồng
Nơi thực hiện:
BM Công nghiệp dược

HÀ NỘI – 2016



LỜI CẢM ƠN
Khóa luận này được thực hiện và hoàn thành tại tổ Vi sinh – bộ môn Công
nghiệp Dược. Trong thời gian thực hiện khóa luận, em đã nhận được rất nhiều sự
quan tâm, giúp đỡ của thầy cô, bạn bè và gia đình.
Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô giáo thạc sĩ Kiều Thị Hồng
đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện từ những ngày đầu đến khi em
hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô giáo TS. Đàm Thanh Xuân đã nhiệt
tình giúp đỡ, chỉ dẫn và đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp em thực hiện đề tài.
Đồng thời, em cũng xin cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô giáo, các
anh chị kĩ thuật viên trong bộ môn Công Nghiệp Dược trong suốt quá trình làm đề tài
nghiên cứu và thực hiện tại bộ môn.
Nhân dịp này, em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy
cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã quan tâm, dạy dỗ trong thời
gian em học tập tại trường.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã động viên giúp
đỡ em rất nhiều trong quá trình học tập và trong cuộc sống.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Nguyễn Thị Kiều Trang


MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .....................................................................................2
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ PROBIOTIC ....................................................................2
1.1.1. Khái niệm về probiotic ...............................................................................2
1.1.2. Vai trò của probiotic ..................................................................................2
1.1.3. Cơ chế tác dụng của probiotic ...................................................................3
1.1.4. Các chủng probiotic phổ biến ....................................................................3
1.1.5. Các thế hệ probiotic ...................................................................................3
1.2. ĐẠI CƯƠNG VỀ Lactobacillus acidophilus .................................................4
1.2.1. Đặc điểm hình thái .....................................................................................4
1.2.2. Tác dụng .....................................................................................................5
1.3. PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ .....................................................................6
1.3.1. Khái niệm đông khô ....................................................................................6
1.3.2. Ưu nhược điểm của đông khô ....................................................................6
1.3.3. Một số tá được dùng bảo vệ trong đông khô ..............................................7
1.4. PHƯƠNG PHÁP VI NANG HÓA ................................................................8
1.4.1. Khái niệm ...................................................................................................8
1.4.2. Đặc điểm.....................................................................................................8
1.4.3. Phương pháp vi nang hóa bằng tách pha đông tụ .....................................9
1.4.4. Tình hình nghiên cứu về vi nang alginat – tinh bột .................................12
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU .........................................................................................................13
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ .........................................................13
2.1.1. Chủng vi sinh vật ......................................................................................13
2.1.2. Hóa chất ...................................................................................................13
2.1.3. Môi trường................................................................................................13
2.1.4. Máy móc, dụng cụ ....................................................................................14
2.1.5. Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu ................................................14
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .........................................................................15

2.2.1. Nghiên cứu gia tăng số lượng sống sót của vi sinh vật trong vi nang
alginat phối hợp tinh bột chứa L. acidophilus ...................................................15
2.2.2. Đánh giá độ ổn định của vi nang alginat – tinh bột sau thời gian bảo
quản 2 tháng. ......................................................................................................15
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............................................................15
2.3.1. Phương pháp tiệt khuẩn ...........................................................................15
2.3.2. Phương pháp nhân giống .........................................................................15
2.3.3. Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào..............................................16
2.3.4. Phương pháp tạo hạt vi nang chứa Lactobacillus acidophilus ...............16
2.3.5. Phương pháp đông khô ............................................................................17
2.3.6. Phương pháp xác định hàm ẩm ................................................................17
2.3.7. Phương pháp pha loãng liên tục để xác định số lượng VSV [1]..............17
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................19
3.1. Nghiên cứu gia tăng số lượng sống sót của vi sinh vật trong vi nang
alginat phối hợp tinh bột chứa L. acidophilus ...................................................19
3.1.1. Khảo sát số lượng VSV trong nang alginat và alginat – tinh bột sau khi ủ
trong dung dịch MRS và cao nấm men 2%. .......................................................19
3.1.2. Khảo sát số lượng VSV trong vi nang alginat và alginat – tinh bột sau khi
đông khô .............................................................................................................24
3.2. Đánh giá độ ổn định của vi nang alginat phối hợp tinh bột sau thời gian
bảo quản 2 tháng………………………………………………………………..28
3.2.1. So sánh số lượng vi sinh vật sống sót trong vi nang alginat – tinh bột
trong các mẫu. ....................................................................................................28
3.2.2. Theo dõi hàm ẩm của mẫu vi nang alginat – tinh bột sau thời gian bảo
quản 2 tháng .......................................................................................................30
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................32
I. KẾT LUẬN .......................................................................................................32
II. KIẾN NGHỊ ....................................................................................................32

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỨ VIẾT TẮT

ATCC (American Type Culture Collection) : Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ
Alg

: Alginat

B. longum

: Bifidobacterium longum

B. bifidum

: Bifidobacterium bifidum

Cps ( Cycles per second)

: Vòng/giây

H

: Giờ

LAB (Lactic acid bacterium)

: Vi khuẩn lactic

L. acidophilus

: Lactobacillus acidophilus

L. gasseri

: Lactobacilus gaseri

L. rhamnosus

: Lactobacillus rhamnosus

MRS

: Môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic

MT

: Môi trường

TB

: Tinh bột

VSV

: Vi sinh vật

WHO (World health organization)

: Tổ chức y tế thế giới

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT

Tên bảng

Trang

1

Bảng 2.1. Các hóa chất dùng trong nghiên cứu

13

2

Bảng 2.2. Các máy móc dùng trong nghiên cứu

14

Bảng 3.1. Số lượng vi sinh vật trong vi nang alginat và vi
3

nang alginat – tinh bột trước và sau khi ủ trong MRS (cfu/g)

21

Bảng 3.2. Số lượng vi sinh vật trong vi nang alginat và vi
4

nang alginat – tinh bột trước và sau khi ủ trong cao nấm men

22

2% (cfu/g)
Bảng 3.3. Số lượng vi sinh vật sống sót trong hạt Alg và hạt
5

Alg-TB ở các điều kiện khác nhau sau đông khô (cfu/g)

25

Bảng 3.4. Số lượng vi sinh vật sống sót trong vi nang alginat
6

– tinh bột sau thời gian bảo quản (2 tháng) ở 4oC (cfu/g)

29

Bảng 3.5. Hàm ẩm của vi nang alginat – tinh bột sau thời
7

gian bảo quản 2 tháng

30


DANH MỤC CÁCH HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Tên hình vẽ, đồ thị

STT

1

Hình 1.1. Hình ảnh vi khuẩn Lactobacillus acidophilus

Trang

5

Hình 1.2. (a1-3) hình ảnh chụp CT cắt lớp tia X và (b1-3)
2

hình ảnh kính hiển vi điện tử quét của hạt alginat đông khô ở

10

các nồng độ tá dược độn khác nhau
Hình 3.1. (1)-(2) Hình ảnh khuẩn lạc trên đĩa petri của
Lactobacillus acidophilus trong vi nang alginat – tinh bột
3

(3)-(4) Hình ảnh khuẩn lạc trên đĩa petri của Lactobacillus

20

acidophilus trong vi nang alginat
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn số lượng vi sinh vật trong hạt Alg

4

và hạt Alg – TB sau khi ủ trong MRS và cao nấm men 2%

22

(cfu/g . 109)
Hình 3.3. (1) hình ảnh hạt alginat – tinh bột và (2) hình ảnh
5

hạt alginat sau khi ủ trong môi trường MRS và đem đông

25

khô
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn hàm ẩm của các mẫu trước và sau
6

thời gian bảo quản.

30



1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Vi khuẩn probiotic được biết đến là một nhóm vi sinh vật mang lại nhiều lợi ích
cho con người như: ngăn ngừa nhiễm khuẩn đường ruột, cải thiện khả năng dung nạp
lactose, tăng cường miễn dịch [20]…. Tuy nhiên, các vi sinh vật này dễ bị ảnh hưởng

bởi các điều kiện môi trường như: pH, nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm… Khi sử dụng theo
đường uống, pH acid, enzyme tiêu hóa, acid mật… là các yếu tố làm giảm số lượng
sống sót, ngăn cản việc thiết lập cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột. Ngoài ra, các
thông số liên quan trong quá trình sản xuất cũng ảnh hưởng đến khả năng sống sót
của vi khuẩn probiotic [34]. Do đó, để đảm bảo số lượng vi sinh vật trong chế phẩm
và đem lại tác dụng mong muốn, cần tạo ra những nguyên liệu có khả năng cung cấp
lượng vi sinh vật phù hợp và có thể chất thích hợp. Nhiều nghiên cứu được tiến hành
nhằm tìm ra những biện pháp làm tăng khả năng chống chịu của vi khuẩn trước điều
kiện bất lợi trong sản xuất, bảo quản và sử dụng. Một trong những phương pháp phổ
biến để bảo quản chế phẩm sinh học là đông khô. Phương pháp đông khô và phương
pháp vi nang hóa được ứng dụng rộng rãi. Đã có nhiều nghiên cứu về việc sử dụng
tinh bột làm tá dược bảo vệ để tăng khả năng chống chịu của vi sinh vật và cải thiện
thể chất của nguyên liệu probiotic sau đông khô ở dạng vi nang. Tinh bột phối hợp
Alginat giúp bảo vệ vi sinh vật sau đông khô và tăng tỉ lệ sống sót của vi sinh vật
cũng là một hướng nghiên cứu đáng chú ý.
Chính vì vậy, đề tài “Nghiên cứu nâng cao tỉ lệ sống sót của Lactobacillus
acidophilus trong vi nang alginat phối hợp tinh bột” được thực hiện với các mục tiêu
cụ thể sau:
1. Nghiên cứu gia tăng số lượng sống sót của vi sinh vật trong vi nang alginat
phối hợp tinh bột so với vi nang alginat chứa L. acidophilus.
2. Đánh giá độ ổn định của vi nang alginat – tinh bột sau thời gian bảo quản 2
tháng.


2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ PROBIOTIC
1.1.1. Khái niệm về probiotic
Probiotic là thuật ngữ bắt đầu từ tiếng Hy Lạp, từ pro và biota, có nghĩa là

“dành cho sự sống”, dùng để chỉ những vi khuẩn sống có thể cạnh tranh với các tác
nhân gây bệnh và giúp cải thiện hệ cân bằng hệ vi sinh vật đường tiêu hóa [27].
Theo tổ chức y tế thế giới WHO: “Probiotic là các vi sinh vật sống khi đưa 1 lượng
cần thiết vào cơ thể đem lại hiệu quả có lợi cho cơ thể” [41].
1.1.2. Vai trò của probiotic
Kể từ những năm 1990, các nghiên cứu lâm sàng đã chứng minh rằng liệu
pháp probiotic có thể giúp điều trị một số căn bệnh tiêu hóa, làm chậm sự phát triển
của bệnh dị ứng ở trẻ em, điều trị và ngăn ngừa nhiễm trùng âm đạo và tiết niệu ở
phụ nữ…
Một số tác dụng của probiotic:
- Cải thiện chức năng miễn dịch [30] [32].
- Ngăn ngừa các vi khuẩn gây bệnh, lập lại thế cân bằng vi khuẩn đường ruột
[30].
- Cải thiện tình trạng không dung nạp lactose [45].
- Giảm cholesterol huyết thanh: Những nghiên cứu trên động vật đã chứng minh
tính hiệu quả của một số probiotic trong việc giảm lượng cholesterol huyết thanh.
Một số thử nghiệm trên người cũng đã cho thấy sữa lên men với LAB làm giảm mức
cholesterol [39].
- Huyết áp: Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc tiêu thụ sữa chua lên men với
các chủng LAB khác nhau có thể dẫn đến giảm nhẹ huyết áp, điều này có thể giải
thích do peptid tương tự yếu tố ức chế ACE sinh ra trong quá trình lên men [39].
- Tổng hợp vitamin nhóm B: Một số tác giả cho rằng thành phần vitamin B trong
các chế phẩm sữa lên men được sinh ra bởi vi sinh vật sinh acid lactic [37].


3

1.1.3. Cơ chế tác dụng của probiotic
- Probiotic kích thích sản xuất acid lactic làm giảm độ pH trong ruột, giúp sản
xuất các lợi khuẩn cho đường tiêu hóa [37].

- Probiotic có thể cải thiện chức năng miễn dịch bằng cách kích thích tăng số
lượng tế bào sản xuất IgA, tăng tỷ lệ tế bào lympho T [30] [32].
- Probiotic bảo vệ cơ thể, chống lại vi khuẩn gây bệnh bằng cách cạnh tranh chất
dinh dưỡng và năng lượng. Ngoài ra, trong quá trình trao đổi chất probiotic tạo ra các
sản phẩm có tính kháng khuẩn như acid hữu cơ (acid lactic và acid acetic),
hydroperoxid, ethanol, diacetyl, acetaldehyde, CO2, reuterin, reutericyclin và
bacteriocin…[30].
- Vi khuẩn lactic tích cực chuyển đổi lactose thành acid lactic. Vì vậy, khi sử
dụng các chế phẩm probiotic sẽ cải thiện được tình trạng không dung nạp lactose
[45].
1.1.4. Các chủng probiotic phổ biến
Hiện nay, các chủng vi khuẩn được sử dụng với vai trò là các probiotic chủ
yếu thuộc chi Lactobacillus và Bifidobacterium, ngoài ra Enterococcus và
Streptococus cũng được sử dụng nhưng ít hơn. Những vi khuẩn này thường cư trú
trong ruột.
Một số chủng tiêu biểu bao gồm: L. acidophilus, L. gasseri, L. rhamnosus, B.
longum, B. bifidum. Bên cạnh những vi khuẩn còn có nấm men Saccharomyces
boulardii cũng được xem là probiotic.
1.1.5. Các thế hệ probiotic
Probiotic có trong các sản phẩm lên men tự nhiên: sữa chua, dưa chua, phô
mai, kim chi… được dùng có lợi về mặt dinh dưỡng, nhưng chưa có tính hỗ trợ trị
liệu một cách rõ ràng.
Thế hệ 1, probiotic không bao (non-coated): vi khuẩn được phân lập và tăng
số lượng để sử dụng, nhưng vẫn là vi khuẩn không bao nên probiotic không thể sống


4

sót khi qua dạ dày và hiệu quả không được như mong muốn. Các dòng sản phẩm như
Antibio, Biolac, Bio-Acimin, Bio-Baby…

Thế hệ 2, dạng bao tan trong ruột (enteric-coated): vi khuẩn chứa trong nang
có lớp bảo vệ chỉ tan trong ruột, hầu hết probiotic được xử lí với một polymer acrylic
acid. Tác nhân bảo vệ này chỉ được cho phép sử dụng trong dược phẩm, không thích
hợp cho thực phẩm bổ sung probiotic vì có thể gây tác dụng phụ [31].
Ví dụ: Primadophilus, Gr-8 Dophilus,…
Thế hệ 3, dạng bao vi nang (micro-encapsulated): giúp vi khuẩn ổn định trong
quá trình bảo quản và chống chọi với môi trường dạ dày tốt hơn, nhưng lớp bao không
hòa tan hoàn toàn trong đường ruột, đặc biệt với những người có hệ ruột ngắn (trẻ
em) hoặc những người ăn nhiều chất béo dẫn đến vi nang có xu hướng đi qua ruột và
thải ra ngoài theo phân mà không hoặc tạo rất ít tác dụng có lợi. Ví dụ: Lactomin.
Thế hệ 4, bao kép: probiotic được bao 2 lớp, hiệu quả cao và khắc phục được
nhược điểm phóng thích chậm ở ruột như cách bao của các thế hệ cũ. Lớp bao
polysaccharid giúp bảo đảm cho vi sinh vật sống tốt trong quá trình sản xuất và bảo
quản, lớp bao protein có đặc tính đông vón trong môi trường acid giúp chống được
tác động khi qua dịch dạ dày và muối mật để đến ruột. Tại ruột, nhờ lớp protein có
khả năng phân tán tốt trong pH trung tính hoặc hơi kiềm ở ruột, probiotic sẽ phóng
thích tốt nhờ đó sản sinh nhanh chóng để phát huy tối đa tác dụng [31].
Ví dụ: Kidlac, Lacclean Gold, Chewable 7.1, Yamyam.
 Sản phẩm nghiên cứu thuộc thế hệ thứ 3 – dạng bao vi nang.
1.2. ĐẠI CƯƠNG VỀ Lactobacillus acidophilus
1.2.1. Đặc điểm hình thái
Lactobacillus acidophilus thuộc họ Lactobacillaceae, chi Lactobacillus, nhóm
vi khuẩn lactic (LAB) và tồn tại trong đường tiêu hóa, âm đạo của người và động vật,
nơi mà môi trường sống khá có tính axit, pH khoảng 5-6, thời gian 24-36 giờ [3].
Cấu trúc hình thái của Lactobacillus acidophilus là trực khuẩn hình que, Gram dương,
kích thước thường là 0,6-0,9 × 1,5-6 𝜇𝑚, mọc đơn hoặc mọc đôi tạo thành chuỗi


5

ngắn, không sinh bào tử, không di động, kị khí không bắt buộc, phản ứng catalase âm
tính. Nhiệt độ phát triển tối ưu 37oC [16].
Điểm hạn chế của Lactobacillus acidophilus: Khả năng sống sót của L.
acidophilus phụ thuộc vào nhiều yếu tố như pH, sự acid hóa trong sản phẩm lên men,
sản phẩm hydroperoxid, nồng độ oxy hòa tan (khuếch tán từ bao bì, trong môi trường
nuôi cấy, bảo quản), nhiệt độ bảo quản, độ ổn định của dạng khô hoặc đông khô [38]
[36], trong đó, nồng độ oxy hòa tan có vai trò đáng kể trong việc hạn chế khả năng
sống sót của L. acidophilus. Do đó, sau một thời gian bảo quản, số lượng L.
acidophilus sống sót sẽ bị giảm đáng kể [15].

Hình 1.1. Hình ảnh vi khuẩn Lactobacillus acidophilus
1.2.2. Tác dụng
Cũng là một loại probiotic, L. acidophilus có những tác dụng tương tự của
probiotic như:
- Cạnh tranh vị trí, làm giảm số lượng vi sinh vật hoặc nấm gây hại ở ruột non,
có khả năng sinh lactase - một enzyme quan trọng trong quá trình chuyển hóa sữa.
Tạo môi trường acid là môi trường thuận lợi cho hệ lên men đường ruột và đồng thời
ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh Gram âm [16].
- Tổng hợp các vitamin, ngoài ra còn có khả năng sản xuất acid lactic và các
chất diệt khuẩn như Lactocidin, Bacteriocin.
- Điều trị các bệnh đường tiêu hóa (táo bón, tiêu chảy) [16].
- Chủng L. acidophilus LA-5 có tác dụng lên hệ miễn dịch, làm lượng cytokine
tăng lên, tăng hoạt động thực bào và sản xuất kháng thể [20].


6

- Giảm sinh tổng hợp cholesterol [16].
- Ức chế các vi khuẩn đường ruột chuyển đổi tiền chất gây ung thư thành chất
gây ung thư [16].

1.3. PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ
1.3.1. Khái niệm đông khô
Đông khô là quá trình làm khô vật liệu ở nhiệt độ thấp, dưới các điều kiện cho
phép, để loại trừ nước bằng cách thăng hoa, thay đổi trạng thái nước từ thể rắn sang
thể hơi mà không qua thể lỏng [2] [19].
Quá trình đông khô thường chia thành ba giai đoạn: giai đoạn lạnh đông, giai
đoạn thăng hoa, giai đoạn bay hơi ẩm liên kết còn lại.
- Giai đoạn lạnh đông: Vật tự lạnh đông ngay trong buồng sấy hoặc được làm
lạnh đông riêng bên ngoài buồng sấy nhằm chuyển toàn bộ ẩm từ trạng thái lỏng sang
trạng thái rắn, đồng thời làm giảm nhiệt độ xuống dưới nhiệt độ điểm ba của ẩm.
- Giai đoạn thăng hoa: Vật đã lạnh đông được đặt trong buồng sấy, đồng thời
tiến hành hút chân không. Chế độ làm việc trong buồng sấy phải ở chế độ thăng hoa,
áp suất và nhiệt độ phải thấp hơn điểm ba. Ẩm trong vật chuyển từ trạng thái rắn sang
trạng thái hơi mà không qua trạng thái lỏng.
- Giai đoạn bay hơi ẩm liên kết còn lại: Ở giai đoạn này, nhiệt độ của vật tăng
nhanh, ẩm trong vật là ẩm liên kết ở trạng thái lỏng. Nhiệt độ môi chất trong buồng
sấy lúc này cũng cao hơn nhiệt độ ở giai đoạn thăng hoa.
1.3.2. Ưu nhược điểm của đông khô
 Ưu điểm
Do quá trình sấy được thực hiện ở nhiệt độ thấp, nước chuyển trực tiếp từ dạng
rắn sang dạng hơi nên đông khô có rất nhiều ưu điểm so với các phương pháp sấy
khác [2] [19] như:
- Giữ nguyên màu sắc, cấu trúc, hương vị.
- Giữ được hoạt tính sinh học.
- Bảo vệ nguyên vẹn các vitamin như lúc còn tươi.


7

- Không làm biến chất albumin.

- Giữ nguyên được thể tích ban đầu của vật.
 Nhược điểm
- Giá thành thiết bị cao.
- Vận hành phức tạp, đòi hỏi người thao tác phải có trình độ kĩ thuật cao.
- Tiêu hao điện năng lớn làm giá thành sản phẩm tăng cao.
 Do những ưu nhược điểm trên nên đông khô chỉ được áp dụng khi yêu cầu sản
phẩm phải có chất lượng cao [24].
1.3.3. Một số tá được dùng bảo vệ trong đông khô
Đông khô là một trong những phương pháp phổ biến nhất để sản xuất lượng
lớn vi sinh vật với nồng độ cao [12]. Tuy nhiên, trong quá trình này, vi khuẩn vẫn
gặp phải nhiều điều kiện bất lợi, đặc biệt là trong giai đoạn tiền đông. Một số nghiên
cứu cho rằng các biến đổi sinh học xảy ra trong quá trình chuyển nước thành băng là
nguyên nhân chính gây tổn thương cho tế bào. Các tinh thể nước đá lớn hình thành
bên ngoài tế bào gây ra một áp lực thẩm thấu lớn do làm tăng nồng độ chất tan bên
ngoài tế bào làm tế bào bị mất nước, giảm khối lượng dẫn đến một số tình trạng như
thay đổi cấu trúc màng tế bào, mất hoặc hợp nhất lớp màng kép hay phá hủy các cơ
quan trong tế bào. Tiếp theo là sự hình thành các tinh thể nước đá bên trong tế bào.
Cơ chế chính xác gây tác hại từ băng trong tế bào vẫn chưa rõ ràng, nhưng có
thể do sự phá hủy vật lý của màng tế bào, sự hình thành bong bóng khí trong tế bào
và phá vỡ bào quan [11]. Một số nghiên cứu khác lại cho rằng nước kết tinh và nhiệt
độ thấp làm biến tính protein và tổn thương màng tế bào vi khuẩn, làm cho vi khuẩn
giảm khả năng tồn tại, mất khả năng sinh sản [23]. Để ngăn chặn hoặc giảm thiểu các
tác dụng bất lợi này, nhiều chất đã được sử dụng như tá dược bảo vệ trong quá trình
đông khô [12].
Các chất bảo vệ hay tá dược đông khô là các chất được thêm vào trong thành
phần nguyên liệu đem đông khô nhằm bảo vệ tế bào trong quá trình đông khô và đảm
bảo sức chịu đựng của VSV trong quá trình làm khô [23].


8

Tá dược thường được sử dụng là sữa gầy, trehalose, glycerol, betain, adonotol,
glucose, lactose, amino acid (arginine, acid glutamic), peptid, protein, dịch chiết sinh
học tự nhiên và polymer như dextran, polyethylene glycol, alginate [10] [21] [28].
1.4. PHƯƠNG PHÁP VI NANG HÓA
Có rất nhiều phương pháp tạo chế phẩm probiotic như tạo dạng bột đông khô,
tạo cốm… Các phương pháp này đã và đang được sử dụng phổ biến do đã được
nghiên cứu lâu đời nên giá thành rẻ và dễ triển khai trên quy mô công nghiệp, tuy
nhiên khả năng sống sót của vi khuẩn lại không cao. Vấn đề cải thiện số lượng vi
khuẩn sống sót trong quá trình bảo quản và trong những điều kiện bất lợi về môi
trường như pH thấp ở dạ dày, các enzyme tiêu hóa là một vấn đề đáng quan tâm. Một
trong những hướng giải quyết được quan tâm hiện nay là cung cấp cho các VSV một
rào cản vật lý để chống lại các điều kiện bất lợi từ môi trường, trong đó phải kể đến
công nghệ vi nang hóa [44].
1.4.1. Khái niệm
Vi nang hóa là một trong những phương pháp cố định tế bào được sử dụng
rộng rãi hiện nay. Phương pháp sử dụng các chất tạo màng (gel) là các polymer có
nguồn gốc tự nhiên như gelatin, alginat, chitosan, cellulose… hoặc có nguồn gốc
nhân tạo như polyamid, polystyren, polyacrylat, polyacrylamid, polyester, polyvinyl
pyrrolidon (PVP), polyethylene glycol (PEG)…để bẫy, nhốt và bao gói các tế bào,
cơ thể vi sinh vật trong các nang nhỏ [9] [5].
1.4.2. Đặc điểm
Vi nang hóa giúp ngăn cách nguyên liệu trong lõi với môi trường cho tới khi
chúng được giải phóng, vì thế cải thiện khả năng ổn định, kéo dài tuổi thọ của nguyên
liệu trong lõi và giải phóng ổn định có kiểm soát. Vi nang có thể có kích thước từ
dưới µm đến vài mm và có thể có các hình dạng khác nhau. Vi nang là bức tường
chắn bán thấm, hình cầu và mỏng, giúp tế bào vi khuẩn được giữ lại trong vi nang,
chất dinh dưỡng và chất chuyển hóa có thể phân tán qua màng bán thấm dễ dàng.

9

Màng vi nang cung cấp một rào chắn để bảo vệ tế bào và làm giảm thiểu sự
nhiễm khuẩn. Lõi nguyên liệu bao gói được giải phóng theo nhiều cơ chế như: đứt
gãy màng chắn, hòa tan màng chắn, tan chảy màng chắn và khuếch tán qua màng
[44].
1.4.3. Phương pháp vi nang hóa bằng tách pha đông tụ
1.4.3.1. Nguyên tắc
Tách pha nhờ sự thay đổi nhiệt độ, thay đổi pH, sự hóa muối hoặc khi thêm
một dung môi thứ hai vào hệ vi nang. Tác động vào dung dịch keo trong một dung
môi thích hợp nhằm thay đổi độ tan của nó, kết quả là một lượng đáng kể keo được
tách ra thành pha mới. Như vậy hệ trở thành hai pha, một pha có nồng độ cao chất
keo được tách ra dưới dạng giọt nhỏ được gọi là giọt đông tụ. Sau đó, các giọt đông
tụ dần kết dính lại với nhau hoặc hấp phụ trên bề mặt chất cần bao gói tạo thành lớp
màng bao.
1.4.3.2. Nguyên liệu Alginat
a.. Cấu tạo, nguồn gốc
Alginat là tên gọi chung cho các muối của acid alginic, tồn tại dưới dạng anion.
Acid aginic là một heteropolymer saccharid mạch thẳng, cấu tạo từ hai gốc uronic là
acid 𝛼 − 𝐿 − 𝑔𝑙𝑢𝑟𝑜𝑛𝑖𝑐 và acid 𝛽 − 𝐷 − 𝑚𝑎𝑛𝑛𝑢𝑟𝑜𝑛𝑖𝑐 nối với nhau bằng liên kết 14-glucosid.
Alginat được chiết xuất từ rong biển nâu, Alginat được khai thác rộng rãi trong
các ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm nhờ khả năng bao gói các chất đại
phân tử, tế bào [30].
b. Tính chất
Hai tính chất quan trọng của alginat là độ nhớt dung dịch và khả năng tạo gel
[29].
Độ nhớt: Natri alginat tan trong nước tạo dung dịch có độ nhớt dao động trong
khoảng từ 10-3500 cps. Độ nhớt của dung dịch alginat phụ thuộc vào số lượng nhánh
của phân tử alginat. Ngoài ra, độ nhớt của dung dịch còn thay đổi tùy theo nồng độ,
nhiệt độ, pH và sự có mặt của ion kim loại.

10

Khả năng tạo gel: Dung dịch alginat có khả năng tạo gel với các cation kim
loại hóa trị II, III như Ca2+, Ba2+, Sr2+, sự tạo gel được giải thích theo mô hình vỉ
trứng. Bình thường trong dung dịch alginat tồn tại block M và block G tương ứng là
các dải hẹp và dải gấp khúc. Khi có mặt ion kim loại đa hóa trị ở nồng độ thích hợp
thì sự tạo gel xảy ra. Các phân tử alginat sắp xếp lại song song nhau, các phần gấp
khúc tạo thành khoảng không gian giống như chỗ đặt trứng. Các ion Ca2+ khớp vào
các khoảng trống này tạo nên mạng lưới không gian ba chiều. Với cấu trúc gel này,
khi sử dụng làm màng bao, chúng có vai trò như một tấm chắn chống lại những yếu
tố bất lợi của môi trường và cho phép giải phóng vi sinh vật được bao theo hướng có
kiểm soát [29].
c. Ưu điểm
Alginat không độc, tạo gel dễ dàng với Calci clorid, gel có độ ổn định cao. Vi
khuẩn sống không bị ảnh hưởng trong suốt quá trình vi nang hóa. Alginat có độ ổn
định cao, độ xốp cao và có khả năng chống chịu các muối và chất tạo phức.

Hình 1.2. (a1-3) hình ảnh chụp CT cắt lớp tia X và (b1-3) hình ảnh kính hiển vi
điện tử quét của hạt alginat đông khô ở các nồng độ tá dược độn khác nhau


11

1.4.3.3 Tinh Bột
a. Khái niệm, cấu tạo
Tinh bột là hợp chất hữu cơ rất phổ biến, được phát triển khi người Ai Cập sử
dụng nó như chất kết dính làm từ lúa mì. Các loại thực phẩm giàu tinh bột có nguồn
gốc từ hạt, rễ, củ. Từ những năm 1900 tinh bột đã được sử dụng rộng rãi, nguyên liệu

để sản xuất chất ngọt, ethanol, tinh bột sáp-ngô, tinh bột biến tính, acid hữu cơ, acid
amin, polyol với nhiều tiện ích.
Tinh bột là một polysaccharide được cấu tạo từ 2 polysaccharid là Amylose
và Amylopectin. Cả hai cấu tử này đều được cấu tạo từ 𝛼-D glucose bằng liên kết 𝛼1,4-glucosid và liên kết 𝛼-1,6-glucosid. Tỉ lệ amylose/amylopectin trong đa số tinh
bột là 1/4 [7].
Amilose có khối lượng phân tử 20000-30000 đvC. Mạch thẳng, không phân
nhánh, tạo bởi 2 𝛼-D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết 𝛼-1,4-glucosid, màu
xanh đặc trưng.
Amilopectin có khối lượng phân tử 200000-1000000 ĐvC. Mạch thẳng, phân
nhánh. Liên kết trên mạch thẳng là liên kết 𝛼-1,4-glucosid, còn liên kết trên mạch
nhánh là liên kết 𝛼-1,6-glucoside.
b. Tính chất
Trong môi trường acid, tinh bột bị thủy phân thành sản phẩm hòa tan. Ở môi
trường acid mạnh, sản phẩm thủy phân cuối cùng là glucose. Trong môi trường kiềm,
tinh bột bị ion hóa từng phần do sự hydrat hóa tốt hơn. Tinh bột ở dạng hạt hoặc tinh
bột chưa xử lý thì khó bị tấn công bởi những enzyme thủy phân.
Khi hòa tan tinh bột vào nước, do sự hấp thụ nước làm hạt tinh bột trương
phồng lên, tăng thể tích. Hiện tượng này gọi là hiện tượng trương nở của tinh bột.
Trên 55-70oC, các loại tinh bột trương lên do hấp thụ nước vào các nhóm hydroxyl
phân cực, độ nhớt của dung dịch tăng mạnh. Kéo dài thời gian xử lí nhiệt có thể gây
nổ vỡ hạt tinh bột, thủy phân từng phần và hòa tan phần nào vào các phần tử cấu
thành của tinh bột, kèm theo sự giảm độ nhớt của dung dịch [6].


12

c. Ưu điểm
Tinh bột là một polysaccharid tự nhiên, có mặt trong hầu hết các loại cây xanh
và trong tất cả các loại mô: lá, quả, hạt phấn hoa, rễ, cành và thân cây. Tinh bột được
tổng hợp trong thời gian phát triển và trưởng thành của các cơ quan lưu trữ, như củ,

trái cây và các loại hạt. Sau đó, tinh bột tổng hợp được suy thoái trong thời gian này
mầm của hạt giống hoặc củ, hoặc trong quá trình chín của quả. Trong quá trình
chuyển hóa, tinh bột phân hủy tạo ra nguồn Cacbon và năng lượng cho cơ thể sống.
Tinh bột không độc, không sinh đáp ứng miễn dịch [18].
Tinh bột là tá dược độn phổ biến, giá rẻ và có thể tiêu hóa được.
Tinh bột được ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm, sản xuất ethanol,
polyol…chất ổn định thực phẩm trong sản xuất sữa chua vì vậy tính tương hợp sinh
học và độc tính của nó với vi khuẩn đã được thử nghiệm rộng rãi.
1.4.4. Tình hình nghiên cứu về vi nang alginat – tinh bột
Vi nang alginat đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu để bảo vệ tế bào,
protein, vi khuẩn, các loại thuốc kém bền với dịch vị….[29].
Trong đó, nghiên cứu về hạt vi nang của nisin (một peptid kháng khuẩn) trong
alginat, Diamante Maresca và cộng sự (2015) đã cho thấy vi nang tạo bởi hạt alginat
có tính đồng nhất về hình dáng và bề mặt hình thái học [14].
Năm 2013, Martin và cộng sự báo cáo tinh bột giúp nâng cao khả năng sống
sót của Lactobacillus acidophilus trong quá trình đông khô và bảo quản ở 4oC [26].
Năm 2015, nghiên cứu của Mariana de Araujo Etchepare và cộng sự đã chỉ ra
vi nang alginat – tinh bột bảo vệ Lactobacillus acidophilus khi tiếp xúc với dịch tiêu
hóa mô phỏng tốt hơn kể cả ở dạng ẩm hay dạng đông khô [25].
Ở Việt Nam, tác giả Mai Hương (2014) đã báo cáo tinh bột có hiệu quả bảo
vệ L. acidophilus trong quá trình vi nang hóa, đông khô và bảo quản [4].
Tác giả của Bùi Thị Lệ Quyên (2015) đã kết luận ở môi trường có pH thấp,
các hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy có khả năng bao gói VSV,
giúp tránh tiếp xúc với môi trường khắc nghiệt [6].


13

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ
2.1.1. Chủng vi sinh vật: Lactobacillus acidophilus ATCC 4356.
2.1.2. Hóa chất
Bảng 2.1.Các hóa chất dùng trong nghiên cứu
Tên hóa chất

Nguồn gốc

Tên hóa chất

Nguồn gốc

Glucose

Trung Quốc

Triamoni citrate Trung Quốc

Pepton

Ấn Độ

Natri acetat

Trung Quốc

Cao thịt

Merck-Đức

Natri citrate

Trung Quốc

Cao nấm men

Merck-Đức

Alginat

Ấn Độ

K2HPO4

Trung Quốc

Calci clorid

Trung Quốc

MgSO4.7H2O

Trung Quốc

Tinh bột sắn

Việt Nam

MnSO4.4H2O

Trung Quốc

Thạch (Agar)

Việt Nam

Natri clorid

Trung Quốc

2.1.3. Môi trường
 MRS lỏng (MT1)
Glucose

20,0g

Natri acetat

5,0 g

Pepton

10,0g

K2HPO4

2,0g

Cao thịt

10,0g

MgSO4.7H2O

0,2g

Cao nấm men

5,0g

MnSO4.4H2O

0,05g

Triamoni citrat

2,0g

Nước máy vừa đủ

1000 ml

 Môi trường MRS thạch (MT2)
MT2 = MT1 + thạch (25 g thạch/1000 ml môi trường)


14

2.1.4. Máy móc, dụng cụ
 Máy móc

Bảng 2.2.Các máy móc dùng trong nghiên cứu
Tên thiết bị

Nguồn gốc

Tên thiết bị

Nguồn gốc

Tủ cấy vô trùng

Nhật (Sanyo)

Nồi hấp tiệt khuẩn

ALP-Nhật

Tủ ấm CO2

Nhật (Sanyo)

Cân phân tích

Đức (Satorious)

Tủ lạnh sâu

Đức

Cân kỹ thuật

Đức (Satorious)

Tủ lạnh LG

Hàn Quốc

Máy khuấy từ

Hàn Quốc (Wisd)

Thiết bị đông khô

Đức

Máy đo hàm ẩm

Mỹ (Ohaus)

 Dụng cụ
Bình nón 100, 250, 1.000ml

Ống nghiệm

Cốc có mỏ

Pipet chia vạch

Ống đong

Pipete tips (Đầu côn)

Bơm tiêm

Micropipet

Vợt rửa hạt

Đĩa petri đường kính 9 cm

2.1.5. Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu
- Dung dịch alginat 4%: cân chính xác 4,00 g alginat, phân tán đều trong 100ml
nước cất có khuẩy trộn và gia nhiệt 40oC.
- Dung dịch natri citrat 2%: cân chính xác 2,00 g natri citrat, hòa tan hoàn toàn
trong 100ml nước cất.
- Dung dịch CaCl2 2%: cân chính xác 2,00 g CaCl2, hòa tan hoàn toàn trong
100ml nước cất.
- Dung dịch NaCl 0,9%: cân chính xác 0,90 g NaCl, hòa tan hoàn toàn trong
100ml nước cất.


15

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nghiên cứu gia tăng số lượng sống sót của vi sinh vật trong vi nang alginat
phối hợp tinh bột chứa L. acidophilus
- Khảo sát số lượng VSV trong vi nang alginat và alginat – tinh bột sau khi ủ
trong dung dịch MRS và cao nấm men trước khi đông khô.
- Khảo sát số lượng VSV trong vi nang alginat và alginat – tinh bột sau khi đông
khô.

2.2.2. Đánh giá độ ổn định của vi nang alginat – tinh bột sau thời gian bảo quản 2
tháng.
- So sánh số lượng vi sinh vật sống sót trong vi nang alginat – tinh bột trong các
mẫu.
- Xác định hàm ẩm của mẫu trước và sau thời gian bảo quản.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp tiệt khuẩn
a. Phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm
Nguyên liệu cần tiệt khuẩn được đựng trong bình nón, đậy kín bằng nút bông,
sau đó tiệt trùng trong nồi hấp ở 115oC, 1,6-1,8 atm trong 30 phút.
b. Tiệt khuẩn tinh bột bằng Tyndall
Cân một lượng tinh bột nhất định cho vào bình nón, đậy kín bằng nút bông, để
ở 70oC- 80oC trong 1 giờ, ủ bình trong tủ ấm 5% CO2, 37oC trong 24 giờ. Lặp lại thao
tác trong 3 ngày liên tục.
2.3.2. Phương pháp nhân giống
Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng (công thức
nêu trong mục 2.1.3). Hòa tan hết các thành phần. Hút 10 ml môi trường MRS lỏng
vào mỗi ống nghiệm sạch, nút kín bằng nút nhựa đỏ, không chảy ở nhiệt độ hấp tiệt
khuẩn. Tiến hành tiệt khuẩn môi trường bằng nhiệt ẩm 115oC trong 30 phút, sau đó
để nguội xuống khoảng 37- 40oC. Cấy giống vào ống nghiệm trên. Ủ các ống nghiệm
đã được cấy giống VSV trong tủ ấm 5% CO2 trong 24 h ở 37±1oC.