Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và điều kiện hô hấp đến lượng sinh khối của Lactobacillus sporogenes

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-----  ------

DƯƠNG THỊ HUYỀN TRANG
MÃ SINH VIÊN: 1101526

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA
NHIỆT ĐỘ VÀ ĐIỀU KIỆN HÔ HẤP
ĐẾN LƯỢNG SINH KHỐI CỦA
Lactobacillus sporogenes

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-----  -----DƯƠNG THỊ HUYỀN TRANG
Mã sinh viên: 1101526

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA
NHIỆT ĐỘ VÀ ĐIỀU KIỆN HÔ HẤP
ĐẾN LƯỢNG SINH KHỐI CỦA
Lactobacillus sporogenes
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Đàm Thanh Xuân

2. DS. Tô Ngọc Sắc
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công Nghiệp Dược
Trường đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2016

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN

Với tất cả sự kính trọng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất
tới cô giáo TS. Đàm Thanh Xuân - Giảng viên bộ môn Công nghiệp dược - Trường
đại học Dược Hà Nội và DS. Tô Ngọc Sắc, người đã hết lòng hướng dẫn, truyền đạt
những kiến thức quý báu, dành nhiều thời gian, tận tâm chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Khắc Tiệp, DS. Lê Ngọc Khánh
cùng các thầy cô giáo và các kỹ thuật viên Bộ môn Công nghiệp dược đã nhiệt tình
chỉ bảo và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng đào tạo cùng các thầy cô,
cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội đã dìu dắt tôi trong suốt quá trình
học tập và nghiên cứu tại trường.
Cuối cùng, cho tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn
ở bên, động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi trong mọi mặt để có kết quả như ngày hôm
nay.

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Dương Thị Huyền Trang


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .....................................................................................2
1.1. GIỚI THIỆU VỀ PROBIOTICS ...................................................................... 2
1.1.1. Probiotics tế bào ................................................................................................2
1.1.2. Probiotics bào tử ...............................................................................................3
1.2. Lactobacillus sporogenes .................................................................................... 3
1.2.1. Lịch sử phát hiện ...............................................................................................4
1.2.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa ................................................................4
1.2.3. Những đặc điểm, chức năng sinh học tương đồng giữa Lactobacillus
sporogenes và các vi khuẩn Lactobacillus khác .........................................................7
1.3. ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA
VI SINH VẬT .......................................................................................................... 11
1.3.1. Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy đến sự sinh
trưởng của vi sinh vật. ..............................................................................................11
1.3.2. Ảnh hưởng của các yếu tố bên ngoài đến sinh trưởng của vi sinh vật. ..........11
1.4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ Lactobacillus sporogenes HIỆN NAY .......... 12
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................14
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ......................................................................... 14
2.1.1. Nguyên vật liệu ...............................................................................................14

2.1.2. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu ............................................................14
2.1.3. Thiết bị ............................................................................................................15
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................................ 16
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................... 16
2.3.1. Phương pháp phân lập Lactobacillus sporogenes ..........................................16
2.3.2. Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng ...................................................16
2.3.3. Phương pháp nhân giống và lên men. ............................................................17
2.3.4. Phương pháp thu sinh khối ướt. .....................................................................17
2.3.5. Phương pháp nhuộm màu quan sát bào tử (phương pháp Ogietska) ............17
2.3.6. Phương pháp định tính vi sinh vật đến mức loài bằng kit API 50CH ...........18
2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu ..............................................................................19
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. .........................20
3.1. PHÂN LẬP VÀ SƠ BỘ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH BÀO TỬ
Lactobacillus sporogenes ......................................................................................... 20
3.1.1. Phân lập vi khuẩn Lactobacillus sporogenes và định tính khuẩn lạc thu được
bằng kit API 50CH ....................................................................................................20
3.1.2. Sơ bộ đánh giá khả năng tạo bào tử của Lactobacillus sporogenes................20
3.2. KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ VÀ ĐIỀU KIỆN HÔ HẤP
ĐẾN LƯỢNG SINH KHỐI CỦA Lactobacillus sporogenes ............................... 25
3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của thông số nhiệt độ đến lượng sinh khối Lactobacillus
sporogenes. ...............................................................................................................25
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện hô hấp đến lượng sinh khối Lactobacillus
sporogenes. ...............................................................................................................29
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...............................................................................36
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

API 50CH

Kit định danh các loài Bacillus, Enterobacteriacaea, Vibrioacaea
và các loài Lactobacillus

ATCC

(American Type Culture Collection) Trung tâm giữ giống quốc gia
Mỹ

B. clausii

Bacillus clausii

B. coagulans

Bacillus coagulans

B. subtilis

Bacillus subtilis

C. butyricum

Clostridium butyricum

CFU

(Colony – Forming Unit) Số đơn vị khuẩn lạc

FAO

(Food and Agriculture Organization) Tổ chức Nông lương thế giới.

FDA

Food and Drug Administration

HMG-CoA

3-hydroxy-3-methylglutaryl–coenzym A

H

Giờ

ID

Identification

L. acidophilus

Lactobacillus acidophilus

L. kefir

Lactobacillus kefir

L. sporogenes

Lactobacillus sporogenes

MRS

(de Man, Rogosa and Sharpe) Môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic.

MT

Môi trường

WHO

(World Health Organization) Tổ chức Y tế thế giới


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. So sánh các đặc tính cơ bản của Lactobacillus sporogenes với các chi
Bacillus và Lactobacillus ............................................................................................5
Bảng 1.2. Một số chế phẩm probiotics chứa Lactobacillus sporogenes ..................10
Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng trong đề tài. ...........................................................14
Bảng 2.2. Các thiết bị và dụng cụ sử dụng trong đề tài. ...........................................15
Bảng 3.1. So sánh đặc điểm bào tử L. sporogenes và B. subtilis ............................24
Bảng 3.2. Lượng sinh khối ướt thu được khi nuôi cấy Lactobacillus sporogenes ở
30oC và 37oC .............................................................................................................26
Bảng 3.3. Lượng sinh khối ướt thu được khi nuôi cấy Lactobacillus sporogenes ở
37oC và 45oC .............................................................................................................27
Bảng 3.4. Sự phát triển của L. sporogenes ở hai thể tích môi trường nuôi cấy khác
nhau ...........................................................................................................................31
Bảng 3.5. Sự phát triển L. sporogenes ở hai tốc độ lắc khác nhau .........................33

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Hình ảnh nhuộm Gram tế bào vi khuẩn Lactobacillus sporogenes. ..........4
Hình 1.2. Hình ảnh tế bào sinh dưỡng Bacillus coagulans 36D1 mang bào tử .........5
Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo bào tử Lactobacillus sporogenes .........................................6
Hình 1.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ sinh trưởng vi sinh vật ....................12
Hình 3.1. Hình ảnh L. sporogenes tại thời điểm 48 giờ .........................................21
Hình 3.2. Hình ảnh L. sporogenes tại thời điểm 96h ..............................................22
Hình 3.3. Bào tử B. subtilis ATCC 6633..................................................................24
Hình 3.4. Bào tử L. sporogenes thời điểm 96h .......................................................24
Hình 3.5. Đồ thị so sánh lượng sinh khối ướt thu được khi nuôi cấy Lactobacillus
sporogenes ở 30oC và 37oC ......................................................................................27
Hình 3.6. Đồ thị so sánh lượng sinh khối ướt thu được khi nuôi cấy Lactobacillus
sporogenes ở 37oC và 45oC ......................................................................................28
Hình 3.7. Đồ thị so sánh lượng sinh khối ướt thu được khi nuôi cấy L. sporogenes ở
hai thể tích môi trường khác nhau. ............................................................................31
Hình 3.8. Đồ thị so sánh lượng sinh khối ướt thu được khi nuôi cấy Lactobacillus
sporogenes ở hai tốc độ lắc khác nhau......................................................................34


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Cuộc sống của con người ngày càng được hoàn thiện nhờ sự phát triển của khoa
học công nghệ. Cùng với sự phát triển chung, công nghệ sinh học cũng đang phát
triển mạnh mẽ và được xem là một ngành khoa học của thế kỷ 21. Công nghệ sinh
học đã mang lại những hiệu quả to lớn, đặc biệt trong lĩnh vực y tế và sức khỏe.
Probiotics được biết đến là các lợi khuẩn có nhiều giá trị thiết thực đối với sức
khỏe con người như: chống nhiễm trùng đường tiêu hóa, tăng cường miễn dịch, giảm
cholesterol…. Probiotics đã được sử dụng từ rất lâu trước đây và trong vài thập kỷ

trở lại đây, số lượng nghiên cứu về probiotics cũng như số chế phẩm probiotics có
mặt trên thị trường xuất hiện ngày càng nhiều.
Lactobacillus sporogenes là một chủng vi khuẩn có nhiều đặc tính nổi trội để
có thể sử dụng làm nguyên liệu cho các chế phẩm probiotics: có khả năng sinh bào
tử làm tăng tỉ lệ sống sót và tăng hiệu quả điều trị, có khả năng lên men đồng hình
tạo acid L (+) lactic mà cơ thể có thể chuyển hóa hoàn toàn được,…
Tại Việt Nam, vi khuẩn Lactobacillus sporogenes đã bắt đầu được nghiên
cứu trong những năm gần đây. Tuy nhiên, số lượng nghiên cứu chưa nhiều. Xuất
phát từ những lý do trên, đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và điều kiện
hô hấp đến lượng sinh khối của Lactobacillus sporogenes” được thực hiện với
các mục tiêu:
1. Phân lập và sơ bộ đánh giá khả năng sinh bào tử Lactobacillus sporogenes.
2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và điều kiện hô hấp đến lượng sinh khối của
Lactobacillus sporogenes.


2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. GIỚI THIỆU VỀ PROBIOTICS
Thuật ngữ probiotics có nguồn gốc từ Hy Lạp. Theo nghĩa gốc, “biotic” hay
“biosis” từ chữ “life” là đời sống và “pro” là thân thiện, nên probiotics có thể hiểu
theo nghĩa thân thiện với đời sống con người [31], [42]. Năm 2002, Tổ chức Y tế thế
giới (WHO) và tổ chức Nông lương thế giới (FAO) đã đưa ra định nghĩa ngắn gọn và
hoàn chỉnh nhất về probiotics ở thời điểm hiện tại như sau: “Probiotics là những vi
sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể với một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi
cho sức khỏe vật chủ” [42], [43].
Tuy nhiên, không phải tất cả những vi sinh vật có lợi nào cũng là probiotics.
Theo FAO, WHO, các probiotics sử dụng trên lâm sàng phải đạt được đủ các tiêu
chuẩn sau [43]:

-

Có khả năng sống sót qua hệ tiêu hóa.

-

Có khả năng phát triển trong ruột.

-

Có hiệu quả có lợi đáng tin cậy và được chứng minh một cách khoa học về
tính hiệu quả trong quá trình sử dụng.
Mặc dù chưa có nghiên cứu nào xác định rõ liều sử dụng, liều probiotics trong

các thử nghiệm lâm sàng khá dao động. Khả năng sống được của vi khuẩn trong các
thử nghiệm lâm sàng cũng chưa được ghi nhận một cách cẩn thận nhưng kết quả từ
các nghiên cứu cho thấy liều lượng dưới 107 CFU/ngày ít hoặc không mang lại được
các cải thiện trên lâm sàng. Sử dụng các probiotics có nguồn gốc từ các vi khuẩn với
liều 107 – 1010 CFU/ngày được cho rằng có thể đảm bảo được khả năng sống cao
nhất của các vi khuẩn trong ruột được ghi nhận trong các thử nghiệm lâm sàng [6],
[17].
Vi sinh vật sử dụng trong các chế phẩm probiotics có thể ở dạng tế bào hoặc
bào tử.
1.1.1. Probiotics tế bào
Các probiotics từ các chủng không sinh bào tử, ví dụ Lactobacillus acidophilus,
Bifidobacterium longum… đã được nghiên cứu, phát triển trong khoảng thời gian dài.


3

Do chứa tế bào nên khả năng sống sót của các probiotics sẽ bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu
tố như điều kiện môi trường bảo quản (nhiệt độ, lượng oxy hòa tan…) và hàng rào sinh
học của hệ tiêu hóa (pH dạ dày…). Vì vậy, để tăng khả năng sống sót của probiotics
trong các chế phẩm trong điều kiện bảo quản và sử dụng cần nghiên cứu và xác định
thời điểm thu lượng sinh khối nhiều và khỏe mạnh nhất; đồng thời cũng cần tìm các
dạng bào chế phù hợp, có thể bảo vệ vi sinh vật, giúp gia tăng khả năng sống sót và
khả năng chống chịu trước các điều kiện bất lợi trong bảo quản và sử dụng.
Để ứng dụng trong sản xuất probiotics, người ta thường thu sinh khối ở giai
đoạn đầu của pha log, là lúc vi sinh vật khỏe mạnh nhất, thường từ 24 - 48h sau khi
nuôi cấy [2].
1.1.2. Probiotics bào tử
Bào tử là một hình thức tiềm sinh của vi khuẩn, nó giúp cho vi khuẩn vượt qua
những điều kiện bất lợi như môi trường nghèo dinh dưỡng, nhiệt độ, pH không thích
hợp… Mỗi vi khuẩn chỉ tạo được một bào tử. Khi gặp điều kiện thuận lợi, nó sẽ phát
triển thành tế bào sinh dưỡng [1].
Chế phẩm probiotics bào tử ít hơn các chế phẩm probiotics tế bào, tuy nhiên lại
có tác dụng tốt và phổ biến như Enterogermina, Biovital… Bào tử vi khuẩn có sức đề
kháng lớn với các điều kiện khắc nghiệt của môi trường, do đó chế phẩm probiotics
bào tử sẽ có nhiều ưu điểm hơn so với dạng tế bào, cụ thể :
-

Trong quá trình sản xuất, các điều kiện sấy, đông khô… hay trong quá trình

lưu hành trên thị trường, các chế phẩm từ bào tử ít chịu tác động hơn. Do đó dễ đạt
các tiêu chuẩn về số lượng và chất lượng của bào tử trong sản phẩm.
-

Các bào tử có khả năng chịu tác động của pH dạ dày và tác động của muối mật

để tới ruột non và nảy mầm tại đó.

-

Một số bào tử còn có có khả năng kháng kháng sinh (B. clausii…).
Nhờ các ưu điểm trên, với các loài có khả năng sinh bào tử như Bacillus

clausii..., việc xác định thời điểm tạo nhiều bào tử có vai trò và ý nghĩa thực tiễn vô
cùng quan trọng trong quá trình tạo nguyên liệu probiotics để sản xuất dược phẩm.
1.2. Lactobacillus sporogenes


4

1.2.1. Lịch sử phát hiện
Lactobacillus sporogenes được biết đến lần đầu tiên dưới tên gọi Bacillus
coagulans do một đợt bùng phát của một sản phẩm đặc biệt từ sữa bị đông vón hàng
loạt [23]. Đến năm 1915, vi khuẩn Lactobacillus sporogenes được B.W. Hammer
phân lập tại phòng thí nghiệm nông nghiệp Iowa (Mỹ) [23]. Năm 1932, vi khuẩn này
lại được Horowitz và Wlasowa phân lập và đặt tên là Lactobacillus sporogenes [32].
Đến năm 1957, vi sinh vật này được phân loại lại theo Bergey’s Manual of
Determinative Bacteriology dựa trên các đặc tính sinh hóa và danh pháp chính xác
hiện tại là Bacillus coagulans [12]. Do vi khuẩn này có các đặc điểm của cả hai chi
Lactobacillus và Bacillus, nên vị trí phân loại của nó giữa hai họ Lactobacillaceae và
Bacillaceae vẫn còn gây nhiều tranh cãi [16]. Ngày nay, vi khuẩn này được biết đến
với cả hai tên gọi, nhưng tên gọi Lactobacillus sporogenes vẫn được sử dụng nhiều
hơn trong các chế phẩm thương mại xuất hiện trên thị trường. Do nguồn gốc của
giống vi sinh vật trong khóa luận, tên gọi Lactobacillus sporogenes sẽ được sử dụng.
1.2.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa
L. sporogenes tồn tại trong tự nhiên ở hai dạng: tế bào sinh dưỡng và bào tử.
1.2.2.1. Tế bào sinh dưỡng
 Đặc điểm hình thái:

Lactobacillus sporogenes là trực khuẩn Gram dương, hình que, có khả năng di
động, có khả năng sinh bào tử [15], [26].
Tế bào Lactobacillus sporogenes có xu hướng mọc đơn hoặc hiếm khi ở dạng
chuỗi ngắn [15], [23].

Hình 1.1. Hình ảnh nhuộm Gram tế bào vi khuẩn Lactobacillus sporogenes


5

Hình 1.2. Hình ảnh tế bào sinh dưỡng Bacillus coagulans 36D1 mang bào tử [37]
 Điều kiện nuôi cấy:
L. sporogenes là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ từ 30 50oC, pH khoảng 5,5 - 6,5 [9], [33].
Về dinh dưỡng, vi khuẩn này có khả năng sử dụng nhiều nguồn carbon khác
nhau: glucose, lactose, maltose, dextrose, fructose, galactose…[23], [37].
 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa:

L. sporogenes cho phản ứng catalase dương tính [15], [23]
L. sporogenes có khả năng tổng hợp acid L (+) lactic, không tổng hợp đồng
phân D (-) [30], [37].
L. sporogenes có các đặc tính chung của cả hai chi Lactobacillus và Bacillus,
bảng dưới đây so sánh các đặc tính cơ bản của L. sporogenes với hai chi này.
Bảng 1.1. So sánh các đặc tính cơ bản của Lactobacillus sporogenes với các chi
Bacillus và Lactobacillus [15]
Đặc tính

L. sporogenes

Lactobacillus

Bacillus

Catalase

+

-

+

Oxidase

-

-

+

Nitrate

-

-

+

Sinh bào tử

+

-

+

Khả năng di động

+

+/-

+

Sinh acid lactic

+

+

-

Acid meso-diaminopimelic

+

+/-

+


6

1.2.2.2. Bào tử
 Khi gặp phải những điều kiện bất lợi trong quá trình sinh trưởng và phát triển
như: thành phần môi trường dinh dưỡng không thích hợp, tác động của nhiệt độ, hóa
chất… L. sporogenes chuyển từ dạng tế bào sinh dưỡng sang dạng bào tử, là thể nghỉ
của vi khuẩn ở cuối giai đoạn sinh trưởng. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử nảy
mầm trở lại và phát triển thành tế bào sinh dưỡng. Bào tử của Lactobacillus
sporogenes có hình elip, tách ra hoặc nằm ở một đầu tế bào sinh dưỡng, có kích thước
0,9 – 1,2 µm × 1,0 – 1,7 µm [8], [32]. Cấu tạo chi tiết của bào tử Lactobacillus
sporogenes được mô tả theo hình sau:

Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo bào tử Lactobacillus sporogenes [41]
 Một số đặc tính của bào tử Lactobacillus sporogenes
Bào tử Lactobacillus sporogenes bền với nhiệt và chịu được các tác động bất
lợi từ môi trường: bào tử vẫn sống sau khi xử lý nhiệt độ ở 100°C trong 20 phút trong
dung dịch đệm photphat pH 7 và có khả năng nảy mầm trở lại kể cả trong dịch pha
loãng của acid HCl (pH 4,6 – 5,6) hay của NaOH (pH 7,6 – 9,6), trong dịch muối
(nồng độ 5%, 10%, 20%), dịch acid boric 2,5% và nước cất [15]. Bào tử có khả năng
chịu được kháng sinh gấp 2 - 8 lần so với tế bào sinh dưỡng [8], [20].
Các nghiên cứu về dược lý cho thấy sau khi được đưa vào cơ thể Lactobacillus
sporogenes ở dạng bào tử, đến dạ dày, dưới tác động của pH thấp và sự co bóp của
dạ dày, các lớp màng của bào tử hút nước và trương phồng lên; sự gia tăng hàm lượng
nước làm tăng tỉ lệ trao đổi chất trong bào tử, chồi hình thành và ló ra ngoài lớp màng


7

của bào tử. Khoảng thời gian trung bình từ lúc uống đến lúc bào tử nảy chồi trong tá
tràng là khoảng 4 – 6 giờ, khoảng 85% bào tử ban đầu xuống được đến ruột, tại tá
tràng, bào tử nảy mầm và phát triển nhanh chóng. Bào tử L. sporogenes tồn tại trong

ống tiêu hóa khoảng 7 ngày, sau đó được thải trừ ra ngoài qua phân [9], [26].
1.2.3. Những đặc điểm, chức năng sinh học tương đồng giữa Lactobacillus
sporogenes và các vi khuẩn Lactobacillus khác
Lactobacillus sporogenes mang nhiều đặc tính và chức năng sinh học của chi
Lactobacillus, có ý nghĩa quan trọng trong sản xuất probiotics.
1.2.3.1. Những đặc điểm trao đổi chất
Các nghiên cứu nuôi cấy Lactobacillus trong môi trường dinh dưỡng đã thể hiện
rõ ràng những hoạt tính đáng chú ý, đem tại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ sau:
 Phân giải protein
Lactobacillus có khả năng sinh enzym proteinase phân giải protein thành các
polypeptid mạch ngắn, giúp cho protein được cơ thể vật chủ tiêu hóa dễ dàng. Vì vậy,
các chế phẩm từ hoạt động lên men của Lactobacillus được đánh giá là nguồn dinh
duỡng có giá trị cao cho các đối tượng: trẻ sơ sinh, người đang dưỡng bệnh, người
già.
 Phân giải lipid
Nhờ có enzym lipase, Lactobacillus có khả năng phân cắt chất béo dạng
triglycerid thành các acid béo và glycerol [41]. Một số nghiên cứu lâm sàng và tiền
lâm sàng cho rằng Lactobacillus phân giải được cholesterol trong lipid huyết thanh
[34] và muối mật [21]. Điều này có ý nghĩa về mặt dinh dưỡng, đặc biệt đối với những
bệnh nhân cholesterol máu cao.
 Phân giải đường lactose
Lactobacillus có enzym 𝛽- galactosidase, glycolase và lactic dehydrogenase
(LDH) có tác dụng chuyển hóa đường lactose thành acid lactic. Do đó, Lactobacillus
giúp cải thiện tình trạng không sử dụng được lactose ở những người thiếu enzym
lactase [27], [41]. Sản phẩm chuyển hóa là acid lactic - một acid hữu cơ có những đặc
tính sinh học đặc biệt.


8

Về mặt sinh lý học, acid lactic có những ưu điểm sau [11]:


Tăng cường khả năng tiêu hóa protein sữa thông qua sự đông vón.



Tăng cường hoạt tính Ca, P, Fe



Tăng cử động đẩy nhanh thức ăn đi xuống dạ dày.



Là nguồn năng lượng cho quá trình hô hấp.

Hai đồng phân quang học của acid lactic là acid D (-) lactic và acid L (+) lactic
có thể được tổng hợp bởi các vi khuẩn sinh acid lactic. Ở người, cả hai dạng đồng
phân này đều được hấp thu qua đường ruột. Đồng phân L (+) được hấp thu hoàn toàn
và nhanh chóng chuyển hóa thành glycogen. Đồng phân D (-) không được hấp thu
hoàn toàn, phần acid không được chuyển hóa sẽ được thải trừ qua nước tiểu. Sự xuất
hiện của acid lactic không được chuyển hóa có thể gây nên tình trạng nhiễm toan
chuyển hóa cho cơ thể [14], [41]. Vì vậy, xu hướng mới trong sản xuất probiotics là
tìm những nguồn vi sinh vật chỉ tạo ra acid L (+) lactic sẽ an toàn hơn cho sức khỏe.
Đại diện tiêu biểu là L. sporogenes. Ngoài ra, acid lactic còn hạ pH đường ruột còn
khoảng ~ 5. Do đó, sự phát triển của vi sinh vật gây thối và E. coli (thích nghi ở pH
6 – 7) bị ức chế, làm giảm sự hình thành carcinogen ở ruột già, phục hồi sự cân bằng
và củng cố hệ vi sinh vật đường ruột đã có [24]. Ở âm đạo, acid lactic góp phần duy
trì pH âm đạo ở khoảng 4 – 4,5, tạo môi trường không thích hợp cho mầm bệnh phát

triển như Trichomonas vaginalis (protozoa kí sinh) và Candida albicans (nấm men)
[40].
Tùy thuộc vào loài và điều kiện nuôi cấy, Lactobacillus sản xuất hai loại đồng
phân quang học: D (-) và L (+) acid lactic.
1.2.3.2. Lợi ích trong dinh dưỡng và trị liệu
Một số nghiên cứu lâm sàng và tiền lâm sàng đã cho thấy ích lợi của
Lactobacillus.
 Các lợi ích về mặt dinh dưỡng
Nghiên cứu trên chuột cho thấy lượng ăn và tốc độ ăn tăng lên khi cho chuột ăn
sữa chua chứa Lactobacillus [19]. Vài loài Lactobacillus có khả năng tự tổng hợp


9

vitamin nhóm B. Hàm lượng vitamin nhóm B và K trong sữa chua thường cao hơn
trong sữa tươi [22].
 Lợi ích về mặt trị liệu
Các chế phẩm chứa Lactobacillus đều cho thấy hiệu quả trong chữa trị vô số
các rối loạn và viêm nhiễm bao gồm: viêm ruột kết, táo bón, tiêu chảy đặc biệt là ở
trẻ em [6], cholesterol trong máu cao và viêm âm đạo không điển hình, cải thiện được
tình trạng không sử dụng được lactose.
Khẩu phần chứa Lactobacillus có khả năng hạ cholesterol trong máu, theo cơ
chế kết hợp với muối mật để ngăn cản muối mật đi vào vòng tuần hoàn máu và ức
chế enzym khử HMG-CoA, hạn chế tốc độ tổng hợp cholesterol [26].
Những nghiên cứu gần đây còn cho thấy các loại Lactobacillus có thể thúc đẩy
khả năng sản xuất α - interferon, tính tự vệ của tế bào và hoạt tính của enzym 2-5 Asynthase. Viện Pasteur ở Tokyo đã ghi nhận được lượng interferon tăng 65% ở những
người tham gia thí nghiệm sau 2 tuần tiêu thụ chế phẩm chứa Lactobacillus [28].
Chính những ưu điểm trên phần nào chứng minh hiệu quả của việc ứng dụng
Lactobacillus làm probiotics.
1.2.3.3. Các đặc tính giúp L. sporogenes vượt trội hơn các vi khuẩn Lactobacillus

khác trong ứng dụng làm probiotics.
Ngoài những chức năng sinh học kể trên, L. sporogenes còn vượt trội hơn các
vi khuẩn khác làm probiotics nhờ đáp ứng những yêu cầu của một loài probiotics lý
tưởng như:
 Có nguồn gốc tự nhiên và thích hợp với cơ thể người [32].
 Không mang độc tính hay bất kỳ một tác dụng phụ nào cho người [30].
 Có khả năng gắn vào tế bào biểu mô ruột và cố định trên đường tiêu hóa để

ngăn ngừa và chống mầm bệnh xâm nhập [30].
 Kháng được acid và mật, vẫn sống sau khi di chuyển từ dạ dày xuống ruột non

[41].
 Lên men và tạo ra L (+) acid lactic, được chuyển hóa hoàn toàn trong quá trình

trao đổi chất nên không gây tình trạng nhiễm toan chuyển hóa như D (-) acid lactic


10

[26].
 Tỉ lệ sống cao sau khi trải qua quy trình sản xuất (thu hoạch, sấy khô,...).

Ngoài ra, L. sporogenes còn có tên gọi khác là Bacillus coagulans, và là loài
Bacillus duy nhất dùng làm probiotics có chứng nhận an toàn cho sức khỏe GRAS
(Generally Recognise As Safe) do FDA cấp [15], [37]. Nhờ những ưu điểm kể trên
L. sporogenes ngày càng được ưa chuộng hơn Lactobacillus quen thuộc khác.
2.3. Một số chế phẩm chứa vi khuẩn Lactobacillus sporogenes trên thị trường.
Hiện nay trên thị trường trong và ngoài nước có nhiều chế phẩm chứa
Lactobacillus sporogenes ở dạng tế bào sinh dưỡng hoặc dạng bào tử, dùng đơn lẻ
hoặc phối hợp với các vi khuẩn probiotics khác trong cùng một chế phẩm. Một số sản

phẩm chứa Lactobacillus sporogenes được liệt kê trong bảng sau:
Bảng 1.2. Một số chế phẩm probiotics chứa Lactobacillus sporogenes
Dạng bào
chế

TT

Tên
thương mại

Thành phần

1

Estromineral

L. sporogenes

Viên nén

Rottapharm | Madaus
(Italia)

2

Sporlac®

L. sporogenes

Thuốc bột

UNI-SANKYO Ltd
(Nhật Bản)

3

Insotac

L. sporogenes,

Thuốc bột

CT TNHH Dược Phẩm
Mê Linh

Cốm pha hỗn
dịch uống

Ildong Pharmaceutical
Co., Ltd. (Hàn Quốc)

Viên nang

CT TNHH MTV Vacxin
và sinh phẩm Nha
Trang

B. clausii
L. sporogenes,
4

Biobaby

B. subtilis,

Nhà sản xuất

C. butyricum

L. sporogenes,
5

Biolac

L. acidophilus,
L. kefir


11

1.3. ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA
VI SINH VẬT
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, vi sinh vật sử dụng dinh dưỡng từ môi
trường để tổng hợp nên các cơ chất cần thiết và chịu tác động từ các yếu tố bên ngoài.
Muốn nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật vào sản xuất cần hiểu được ảnh hưởng của
thành phần dinh dưỡng cũng như các yếu tố khác lên sự sinh trưởng và phát triển của
chúng.
1.3.1. Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy đến sự
sinh trưởng của vi sinh vật.
Vi sinh vật chủ yếu thu nhận được chất dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài để

sử dụng làm nguyên liệu cung cấp cho quá trình sinh tổng hợp tạo ra các thành phần
của tế bào hoặc cung cấp cho quá trình trao đổi năng lượng. Căn cứ vào chức năng
sinh lý khác nhau trong tế bào mà người ta thường chia các chất dinh dưỡng thành 5
nhóm lớn: nguồn cacbon, nguồn nitơ, nguồn muối vô cơ, các nhân tố sinh trưởng và
nước. Nhu cầu dinh dưỡng khác nhau ở từng vi sinh vật, ở từng giai đoạn phát triển
của vi sinh vật [2].
1.3.2. Ảnh hưởng của các yếu tố bên ngoài đến sinh trưởng của vi sinh vật.
Các yếu tố bên ngoài tác động lên tế bào rất đa dạng, được chia làm ba nhóm:
yếu tố lý học (nhiệt độ, áp suất…), yếu tố hóa học (pH môi trường, nồng độ oxy
môi trường…) và yếu tố sinh học (chất kháng sinh) [2].
Trong phạm vi đề tài, hai yếu tố bên ngoài ảnh hưởng đến sự phát triển của vi
sinh vật được đề cập đến là nhiệt độ nuôi cấy và nồng độ oxy môi trường.
1.3.2.1. Nhiệt độ môi trường.
Vi sinh vật thường là các sinh vật đơn bào cho nên chúng rất mẫn cảm với sự
biến hóa của nhiệt độ và thường bị biến hóa cùng với sự biến hóa về nhiệt độ của môi
trường nuôi cấy. Trong phạm vi nhiệt độ thấp, khi nhiệt độ tăng lên sẽ làm tăng tốc
độ sinh trưởng của vi sinh vật. Lúc nhiệt độ tăng lên đến một mức độ nhất định thì
nhiệt độ càng tăng tốc độ sinh trưởng càng giảm. Khi nhiệt độ tăng quá cao vi sinh
vật sẽ chết do gây ra sự biến tính của enzym, của các thể vận chuyển và các protein


12

khác… Tại điều kiện nhiệt độ rất thấp, màng sinh chất bị kết đông lại, enzym cũng
ngừng hoạt động, vi sinh vật chậm phát triển hoặc chết.

Hình 1.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ sinh trưởng vi sinh vật
1.3.2.2. Nồng độ oxy
Oxy có vai trò vô cùng quan trọng đối với hoạt động sống của vi sinh vật. Tùy
thuộc nhu cầu sử dụng oxy mà người ta chia vi sinh vật ra thành các nhóm sau:

 Vi khuẩn hiếu khí bắt buộc.
 Vi khuẩn hiếu khí không bắt buộc (hay kỵ khí tùy nghi).
 Vi khuẩn vi hiếu khí.
 Vi khuẩn kỵ khí chịu dưỡng.
 Vi khuẩn kỵ khí bắt buộc.

Theo các khảo sát trước đây, Lactobacillus sporogenes thuộc nhóm vi khuẩn
hiếu khí không bắt buộc (hay kỵ khí tùy nghi) [32].
1.4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ Lactobacillus sporogenes HIỆN NAY
Lactobacillus sporogenes hoặc có thể gọi bằng một tên khác Bacillus
coagulans, thường là vấn đề của các cuộc tranh luận về vị trí phân loại, nhất là từ khi
nó thể hiện đặc tính của cả hai chi Lactobacillus và Bacillus [15], [16]. Trong nhiều
nghiên cứu, tên gọi Bacillus coagulans vẫn hay được một số tác giả sử dụng.
Từ khi được phân lập đầu tiên vào năm 1933 đến nay, L. sporogenes đã trải qua
nhiều nghiên cứu. Những khảo sát về độc tính, khả năng làm giảm cholesterol, trị


13

viêm âm đạo không điển hình… đã chứng minh dần những đặc tính có lợi và vượt
trội của vi khuẩn này. Đã có nhiều nghiên cứu được thực hiện để tối ưu hóa điều kiện
nuôi cấy Bacillus coagulans như nghiên cứu của Rosemarie Marshall and R. J. Beers
năm 1967 [33], tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy Bacillus coagulans để thu được bào tử
như nghiên cứu của Amaha Mikio, Ordal Z. John, Touba Ali năm 1956 [10] hay sinh
acid lactic như nghiên cứu của Payot T, Chemaly Z, Fick M năm 1999 [36]
Nghiên cứu của Rosemarie Marshall and R. J. Beers [33] tiến hành trên 5 chủng
Bacillus coagulans nguồn gốc khác nhau, đều phát triển tốt trong môi trường nuôi
cấy chứa 2% cao nấm men. Nghiên cứu cũng chỉ ra nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển
của B. coagulans trong khoảng từ 30 - 45oC. Năm 2013, Folasade M. Olajuyigbe và
cộng sự đã thực hiện nghiên cứu về ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến lượng

protease do Bacillus coagulans PSB-07 sinh ra. Sản phẩm thu được là protease, bền
với nhiệt và dung môi hữu cơ, đem lại tiềm năng mạnh mẽ ứng dụng vào tổng hợp
peptid, tổng hợp este và các chất tẩy rửa trong công nghiệp [35]. Nghiên cứu của
Hyronimus B, Le Marrec C, Urdaci MC (năm 1998) [25] cho thấy Bacillus coagulans
còn sinh ra coagulin, một loại bacteriocin, có khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh
và gây hư hỏng thực phẩm như Enterococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Listeria và
Pediococcus [25]. Tác giả đã tiến hành khảo sát thời gian nuôi cấy tối ưu B. coagulans
I4 để sản xuất coagulin. Trong môi trường dinh dưỡng MRS ở nhiệt độ 37oC, có cấp
khí, sau khoảng 12h nuôi cấy, coagulin cho hiệu giá lớn nhất (đạt 1200 UI/ml).
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về L. sporogenes (hay Bacillus coagulans) còn khá
ít hoặc chưa được công bố nhiều. Một số đề tài đã tiến hành khảo đặc điểm sinh
trưởng và phát triển của vi khuẩn Lactobacillus sporogenes [9]. Tại trường đại học
Dược Hà Nội cũng đã có một số khảo sát về điều kiện nuôi cấy L. sporogenes được
phân lập từ chế phẩm Estromineral. Tác giả đã khảo sát một số đặc tính sinh học của
L. sporogenes, tìm ra thời điểm bắt đầu sinh bào tử và khảo sát sơ bộ ảnh hưởng của
điều kiện nuôi cấy đến lượng sinh khối L. sporogenes như thời gian nuôi cấy, môi
trường dinh dưỡng…[8]. Những khảo sát về mặt sinh trưởng, phát triển tạo cơ sở cho
nghiên cứu ứng dụng sản xuất chế phẩm từ bào tử vi khuẩn L. sporogenes sau này.


14

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên vật liệu
 Chế phẩm chứa Lactobacillus sporogenes: Estromineral của hãng Rotta |
Madaus (Italia)
 Chủng Bacillus subtilis ATCC 6633: ống chuẩn của Viện kiểm nghiệm thuốc
Trung ương

 Nguyên liệu pha môi trường:
Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng trong đề tài.
Tên hóa chất

Nguồn gốc

Acetat natri

Trung Quốc

Cao nấm men

Merk- Đức

Cao thịt

Merk- Đức

Đỏ Fuchsin Ziehl

Trung Quốc

Glucose

Trung Quốc

HCl

Trung Quốc

H2SO4

Trung Quốc

K2HPO4

Trung Quốc

MgSO4.7H2O

Trung Quốc

MnSO4.4H2O

Trung Quốc

Pepton

Merk-Đức

Triamoni citrat

Trung Quốc

Thạch agar

Việt Nam

Xanh Methyen

Trung Quốc

2.1.2. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu


15

 Môi trường MRS lỏng (MT 1)
Glucose
Pepton

2,0 g

Triamoni citrat

0,2 g

1,0 g

K2HPO4

0,2 g

Cao thịt

1,0 g

MgSO4.7H2O

0,02 g

Cao nấm men

0,5 g

MnSO4.4H2O

0,005 g

Natri acetat

0,5 g

Nước máy vừa đủ

100 ml

 Môi trường MRS thạch (MT 2)
MT 2 = MT 1 + Thạch agar (2g/100ml môi trường)
2.1.3. Thiết bị
Bảng 2.2. Các thiết bị và dụng cụ sử dụng trong đề tài.
Tên thiết bị

Nguồn gốc

Cân phân tích

Đức (Satorious)

Cân kỹ thuật

Đức (Satorious)

Kính hiển vi

Nhật

Lò vi sóng

Hàn Quốc

Máy lắc

Đức

Máy ly tâm

Đức

Nồi hấp tiệt khuẩn

ALP–Nhật

Tủ cấy vô trùng

Trung Quốc

Tủ lạnh

Nhật

Ống nghiệm, bình nón, giấy chỉ thị
vạn năng, đĩa petri


16

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phân lập và sơ bộ đánh giá khả năng sinh bào tử L. sporogenes.
2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và điều kiện hô hấp đến lượng sinh khối
của L. sporogenes.
 Nuôi cấy L. sporogenes ở ba nhiệt độ nuôi cấy 30oC, 37oC và 45oC và so
sánh lượng sinh khối tương ứng ở ba điều kiện.
 Nuôi cấy L. sporogenes trong hai thể tích môi trường nuôi cấy 100 ml và
150 ml, so sánh lượng sinh khối tương ứng ở hai thể tích.
 Nuôi cấy L. sporogenes ở hai tốc độ lắc 110 & 200 vòng/phút và so sánh
lượng sinh khối tương ứng ở hai điều kiện.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp phân lập Lactobacillus sporogenes
Pha 100 ml môi trường MRS (MT 1) theo công thức ở mục 2.1.2 vào bình nón
dung tích 250 ml, nút kín, hấp tiệt trùng ở 121oC trong 20 phút, để nguội. Tiến hành
cấy giống L. sporogenes từ chế phẩm vào bình nón (cho viên Estromineral vào bình
hoạt hóa giống) trong tủ cấy vô trùng. Đặt trong máy lắc ở 37oC, tốc độ 110
vòng/phút trong 24 giờ [8], [25].
Sau 24 giờ, vi khuẩn phát triển làm đục môi trường. Cấy 0,5 ml môi trường
này trên đĩa petri có chứa môi trường MRS thạch (MT 2). Đặt các đĩa petri trong tủ
ấm 37oC trong 48 giờ. Sau 48 giờ, xuất hiện khuẩn lạc màu trắng trên bề mặt thạch.
2.3.2. Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng
Pha môi trường MRS thạch (MT 2), đun nóng làm đồng nhất các thành phần
trong môi trường, phân phối vào các ống nghiệm, mỗi ống 7 ml, nút kín, hấp tiệt

trùng ở 115oC trong 20 phút. Đặt các ống nghiệm nằm nghiêng, môi trường không
lên quá 2/3 chiều cao của ống, để yên cho đến khi mặt thạch đông lại. Dùng que
cấy, cấy giống từ ống giống gốc sang ống thạch nghiêng, đặt nuôi trong tủ ấm ở
37oC trong 48 giờ [3], [7]


17

Định kỳ cấy truyền giống sang môi trường thạch nghiêng mới sau mỗi 1 – 2
tháng nhằm giữ được hoạt tính vi khuẩn.
2.3.3. Phương pháp nhân giống và lên men.
 Nhân giống
Pha 100 ml môi trường MRS (MT 1) theo công thức ở mục 2.1.2 vào bình
nón dung tích 250 ml, hấp tiệt trùng ở 115oC trong 20 phút, để nguội. Dùng que
cấy, cấy một vòng khuẩn lạc từ ống giữ giống vào bình môi trường, đặt trong máy
lắc ở nhiệt độ và điều kiện cấp khí thích hợp trong 48 giờ [3].
 Lên men
Chuẩn bị môi trường lỏng nuôi cấy vi sinh vật trong bình nón dung tích 250
ml, hấp tiệt trùng ở 115oC trong 20 phút, để nguội. Cấy hỗn dịch giống đã được
hoạt hóa ở trên vào bình theo tỉ lệ 10%. Đặt trong máy lắc ở nhiệt độ và điều kiện
cấp khí thích hợp [3].
2.3.4. Phương pháp thu sinh khối ướt.
Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng sẽ phát triển, làm tăng
sinh khối. Hỗn dịch tế bào vi khuẩn trong từng bình nón được ly tâm ở tốc độ
4.000 vòng/phút trong thời gian 15 phút. Tách riêng phần dịch nổi, thu được sinh
khối tế bào ở đáy ống ly tâm. Sử dụng cân kĩ thuật để xác định lượng sinh khối
ướt thu được [3].
2.3.5. Phương pháp nhuộm màu quan sát bào tử (phương pháp Ogietska)
 Nguyên tắc:
Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử: dày, chắc, khó bắt màu, chứa

nhiều lipid. Đầu tiên, xử lý để tế bào chất của bào tử dễ bắt màu với nhiệt và acid.
Tiếp theo, nhuộm màu cả tế bào chất của tế bào và bào tử bằng thuốc nhuộm có
hoạt tính mạnh. Sau đó, tẩy màu tế bào chất của tế bào đi và nhuộm bằng thuốc
nhuộm màu bổ sung. Kết quả là phân biệt được tế bào sinh dưỡng và bào tử của
vi sinh vật do màu sắc khác nhau.