khảo sát sự hình thành protease và mk7 của bacillus subtilis natto trong môi trường nuôi cấy chứa đậu tương

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ THÙY DUNG
MÃ SINH VIÊN: 1101085

KHẢO SÁT SỰ HÌNH THÀNH PROTEASE
VÀ MK-7 CỦA Bacillus subtilis natto
TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
CHỨA ĐẬU TƯƠNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ THÙY DUNG
MÃ SINH VIÊN: 1101085

KHẢO SÁT SỰ HÌNH THÀNH PROTEASE
VÀ MK-7 CỦA Bacillus subtilis natto
TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
CHỨA ĐẬU TƯƠNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
Ds. Lê Ngọc Khánh
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp Dược

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến
thầy giáo Ds. Lê Ngọc Khánh - Giảng viên Bộ môn Công nghiệp Dược, người thầy
đã luôn quan tâm, trực tiếp tận tình hướng dẫn tôi thực hiện khóa luận này.
Đồng thời, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới Ts. Đàm Thanh Xuân, Ths.
Nguyễn Khắc Tiệp, đã cho tôi nhiều ý kiến đóng góp quý báu và giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên trong Bộ
môn Công nghiệp Dược đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi thực hiện khóa luận.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo
trường Đại học Dược Hà Nội đã dìu dắt, dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
tôi trong thời gian học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và tất cả những người thân, bạn bè đã động
viên, khích lệ, ủng hộ nhiệt thành và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên
cứu vừa qua.
Hà Nội, ngày 11 tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Lê Thị Thùy Dung


MỤC LỤC
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .....................................................................................3
1.1.

Vi khuẩn Bacillus subtilis natto và chế phẩm Natto .................................3

1.1.1.

Vi khuẩn Bacillus subtilis natto ..............................................................3

1.1.2.

Chế phẩm natto và tác dụng ....................................................................4

1.2.

Protease và Nattokinase ..............................................................................5

1.2.1.

Protease ...................................................................................................5

1.2.2.

Nattokinase .............................................................................................6

1.2.3. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng
sinh enzym protease của B. subtilis natto.............................................................7
1.3.

Vitamin K2 và MK-7 ...................................................................................8

1.3.1.

Nguồn gốc ...............................................................................................8

1.3.2.

Sơ lược về Vitamin K .............................................................................8

1.3.3.

Vitamin K2 và MK-7 ..............................................................................9

1.3.4.

Cấu trúc MK-7 ........................................................................................9

1.3.5.

Tính chất vật lý, hóa học .........................................................................9

1.3.6.

Tác dụng và cơ chế tác dụng ................................................................10

1.3.7.

Các nghiên cứu định tính, định lượng và sản xuất MK-7 .....................12

1.3.8.

Các chế phẩm chứa MK-7 trên thị trường ............................................13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................15
2.1. Nguyên liệu và thiết bị sử dụng ...................................................................15
2.1.1. Vi sinh vật sử dụng ...................................................................................15
2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng .................................................................15
2.1.3. Môi trường ................................................................................................15
2.1.4. Thiết bị và dụng cụ ...................................................................................16
2.2. Nội dung nghiên cứu .....................................................................................17


2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung đậu tương tới khả năng sinh protease
của Bacillus subtilis natto……………………………………………….…… 17
2.2.2. Sơ bộ định tính MK-7 trong dịch lên men Bacillus subtilis natto với môi
trường canh thang chứa đậu tương ………………..………………...… 17
2.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................17
2.3.1. Phương pháp giữ giống và nuôi cấy Bacillus subtilis natto .....................17
2.3.2. Phương pháp thử hoạt tính enzym protease .............................................18
2.3.3. Phương pháp chiết MK-7 từ dịch lên men ...............................................18
2.3.4. Phương pháp chiết MK-7 từ chế phẩm Natto...........................................18
2.3.5. Phương pháp sắc kí lớp mỏng định tính MK-7 ........................................19
2.4. Một số công thức sử dụng trong kết quả thực nghiệm ..............................19
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ .......................................................21
3.1. Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung đậu tương tới khả năng sinh
protease của Bacillus subtilis natto .....................................................................21
3.1.1. Khảo sát nguồn nguyên liệu đậu tương dạng hạt và dạng bột tới hoạt
tính enzym protease ............................................................................................21
3.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ đậu tương tới khả năng sinh enzym Proteae

của Bacillus subtilis natto...................................................................................23
3.1.3.

Ảnh hưởng của thời gian thu sản phẩm tới nồng độ enzym protease...25

3.2. Sơ bộ định tính MK-7 trong dịch lên men Bacillus subtilis natto với môi
trường canh thang chứa đậu tương ...................................................................28
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ....................................................................................32
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AND

Acid deoxyribo nucleic

Atm

Atmosphe

B. subtilis natto

Bacillus subtilis natto

Da, kDa

Dalton, kilo Dalton

FU

Fibrinolytic units (Đơn vị đánh giá khả
năng phân giải fibrin của chất nghiên cứu)

Gla

Axit γ-carboxyglutamic

HPLC

High-performance liquid chromatography

mmHg

Milimet thủy ngân

MK-7

Menaquinone 7

NCBI

National center for Biotechnology
Information (Trung tâm quốc gia về thông
tin công nghệ sinh học)

pI

Điểm đẳng điện

TLC

Thin layer chromatography

TLPT

Trọng lượng phân tử

t – PA

Tissue plasminogen activator (các tác
nhân hoạt hóa plasminogen ở mô)

v/v

Thể tích/Thể tích

VSV

Vi sinh vật

w/v

Khối lượng/Thể tích


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Nguyên liệu và hóa chất sử dụng ..............................................................15
Bảng 2.2. Thiết bị được sử dụng ...............................................................................16
Bảng 3.1: Đường kính vòng phân giải casein của dịch lên men B. subtilis natto với
đậu tương dạng hạt và dạng bột ................................................................................22

Bảng 3.2: Đường kính vòng phân giải casein của dịch lên men khi bổ sung hạt đậu
tương tại các nồng độ ................................................................................................24
Bảng 3.3: Đường kính vòng phân giải casein của dịch lên men tại các thời điểm ...26
Bảng 3.4: Kết quả định tính MK-7 trong dịch lên men và chế phẩm Natto .............29


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ
Hình 1.1. Hình thái vi khuẩn của Bacillus subtilis natto ............................................4
Hình 1.2: Công thức cấu tạo của menaquinone – 7 ....................................................9
Hình 1.3: Cơ chế tác động của MK-7 .......................................................................11
Hình 1.4: Vipteen – Công ty CPDP Vinh Gia...........................................................14
Hình 1.5: Vững cốt Vinh Gia – Công ty CPDP Vinh Gia ........................................14
Hình 2.1: Bản mỏng sắc kí ........................................................................................19
Hình 3.1: Đường kính vòng phân giải casein của dịch lên men B. subtilis natto với
đậu tương dạng hạt và dạng bột ................................................................................22
Hình 3.2: Đường kính vòng phân giải casein của dịch lên men nuôi cấy B subtilis
natto trong môi trường canh thang có hạt đậu tương ................................................24
Hình 3.3: Đường kính vòng phân giải casein sau các khoảng thời gian nuôi cấy B.
subtilis natto trong môi trường có đậu tương ............................................................26
Hình 3.4: Bản mỏng chạy sắc kí chế phẩm Natto (Lần 3) ........................................29
Hình 3.5: Bản mỏng chạy sắc kí dịch lên men (Lần 3) .............................................29
Hình 3.6: Bản mỏng chạy sắc kí chế phẩm Natto (Lần 2) ........................................30
Hình 3.7: Bản mỏng chạy sắc kí dịch lên men (Lần 2) .............................................30


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bacillus subtilis natto là một phân loại dưới loài thuộc loài Bacillus subtilis,
được tìm thấy năm 1905. Kể từ đó, nó đã được ứng dụng trong sản xuất thuốc thú y,

thực phẩm chức năng, các thức ăn tốt cho sức khỏe. B. subtilis natto giúp lên men
các sản phẩm từ đậu tương, như Natto của Nhật, Kinema của Nepal và Thuanao của
Thái Lan.
Natto là món ăn truyền thống của Nhật, mang nhiều lợi ích cho sức khỏe, hiện
đang rất được quan tâm nghiên cứu. Người ta tìm thấy trong Natto có chứa lượng lớn
Nattokinase, là một protease có khả năng tiêu fibrin mạnh, dùng được đường uống để
phòng bệnh huyết khối. Một chất khác rất có giá trị nhưng được phát hiện muộn hơn
là MK-7. MK-7 thuộc nhóm Vitamin K, có tác dụng phòng ngừa loãng xương, giúp
xương chắc khỏe, đồng thời còn phòng ngừa một số bệnh tim mạch.
Nattokinase và MK-7 đã được khẳng định về tác dụng và đang được sử dụng
ngày càng rộng rãi trên thế giới. Hiện nay Nattokinase được sản xuất bằng phương
pháp tái tổ hợp hoặc lên men mẻ, hơn là khai thác từ Natto. MK-7 được sản xuất chủ
yếu của quá trình lên men lỏng sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis. Các sản phẩm
Nattokinase và MK-7 được rất nhiều công ty dược phẩm nghiên cứu và sản xuất.
Tuy nhiên tại Việt Nam, có rất ít công ty sản xuất các sản phẩm Nattokiase, protease
hay MK-7, chúng ta chủ yếu sử dụng các sản phẩm ngoại nhập với giá thành cao.
Dạng thực phẩm truyền thống của Nhật Bản cũng được nhập khẩu nhưng không
được dùng phổ biến vì nặng mùi, nhớt, rất khó ăn, không phù hợp với khẩu vị người
Việt Nam. Bởi vậy, vấn đề cần thiết đặt ra là, cần phải nghiên cứu phương pháp sản
xuất để chủ động trong cung cấp các sản phẩm protease và MK-7.
B. subtilis natto có khả năng phát triển tốt trên đậu tương đã nấu chín, nhiều
công ty đã sử dụng đậu tương làm nguồn dinh dưỡng trong lên men sản xuất protease,
Nattokinase và MK-7. Với lợi thế nguồn đậu tương sẵn có trong nước, việc lựa chọn
nghiên cứu môi trường lên men B. subtilis natto chứa đậu tương là một hướng đi đầy
tiềm năng. Do đó khóa luận “Khảo sát sự hình thành protease và MK-7 của Bacillus


2

subtilis natto trong môi trường nuôi cấy chứa đậu tương” được thực hiện với hai mục

tiêu:
 Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung đậu tương tới khả năng sinh protease
của Bacillus subtilis natto.
 Sơ bộ định tính MK-7 trong dịch lên men Bacillus subtilis natto với môi
trường canh thang chứa đậu tương.


3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.

Vi khuẩn Bacillus subtilis natto và chế phẩm Natto

1.1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis natto
Bacillus subtilis natto là vi sinh vật thuộc chi Bacillus, loài Bacillus subtilis
được phân lập và định danh lần đầu tiên vào năm 1905 [64].
1.1.1.1. Phân loại khoa học
B. subtillis natto là một vi khuẩn thật (Eurobacteria) thuộc: Giới: Bacteria;
Ngành: Firmicutes; Lớp: Bacilli; Bộ: Bacillales; Họ: Bacillaceae; Chi: Bacillus;
Loài: Bacillus subtilis. Phân loại dưới loài: Bacillus subtilis natto [59].
Khi mới được phát hiện, Bacillus subtilis natto được coi như là một loài vi
sinh vật mới. Hiện nay B. subtilis natto được phân loại là một dòng thuộc loài B.
subtilis nhưng phân biệt với các dòng khác ở khả năng lên men tạo sản phẩm natto
[18].
1.1.1.2. Nguồn gốc
B. subtilis natto được phân lập từ Natto – món ăn truyền thống của người Nhật.
Vi khuẩn có nhiều trong rơm rạ, cỏ khô, phát triển rất tốt trên đậu tương đã nấu chín,
chúng cũng phát triển trên các loại ngũ cốc, các nguồn thực phẩm có nguồn gốc động
vật như cá, thịt, tôm, cua,… [18], [53].

1.1.1.3. Đặc điểm hình thái
B. subtilis natto là trực khuẩn Gram (+), hình que. Nội bào tử hình que có kích
thước dưới 1μm. Các tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hay nối với nhau tạo thành chuỗi.
Khuẩn lạc khô, không màu, có kích thước lớn và hình dạng bất định. Bề mặt hơi nhăn
tạo thành lớp mịn, lan rộng trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường
thạch [53].


4

Bào tử

Tế bào vi khuẩn

Hình 1.1. Hình thái vi khuẩn của Bacillus subtilis natto [69]
1.1.1.4. Đặc điểm sinh dưỡng
B. subtilis natto là vi sinh vật dị dưỡng, có khả năng sử dụng nhiều nguồn
hydratcacbon: đường đơn như glucose, fructose,…; đường đôi như maltose, lactose,
saccharose,…; polysaccharid như tinh bột,... Nguồn nitơ cần thiết cho sự phát triển
của vi khuẩn là acid amin và protein. VSV có thể sử dụng dễ dàng acid glutamic,
arginin,… nhưng không sử dụng được threonin, methionin, tryptophan, phenylalanin.
VSV cũng cần có biotin để phát triển, trong môi trường không có biotin các tế bào
dinh dưỡng không thể phát triển, bào tử cũng không nảy mầm được [53].
1.1.1.5. Đặc điểm sinh lý
B. subtilis natto là vi khuẩn hiếu khí, có thể phát triển ở nồng độ oxy lớn hơn
3%. Vi khuẩn phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng (30 – 500C), pH trung tính hoặc
hơi kiềm, khoảng pH tối ưu cho sự sinh trưởng là 7,2 – 7,6. Nhiệt độ tối ưu là 370C,
nhiệt độ tối ưu cho sự nảy mầm của bào tử là 400C. Sự phát triển của vi khuẩn bị ức
chế ở lớn hơn 550C và pH bé hơn 4,5 [53].
1.1.1.6. Sản phẩm trao đổi chất của Bacillus subtilis natto

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, B. subtilis natto có khả năng sinh
nhiều sản phẩm trao đổi chất như MK-7, γ-PG theo Bhat [8], levan (fructan) theo
Santos và cộng sự [12], nhóm enzym ngoại bào như 𝛾-transpeptidase, phytase,
amylase, cellulase và nhóm enzym được nghiên cứu nhiều nhất là protease [14],
[13].
1.1.2. Chế phẩm Natto và tác dụng
Natto là một món ăn truyền thống của Nhật Bản đã có từ cách đây hơn 1000


5

năm, có mùi nồng đặc trưng và độ nhớt cao. Natto truyền thống được làm bằng cách
ủ hạt đậu đã luộc chín trong các bó rơm hoặc phủ rơm lên, do trong rơm rạ có B.
subtilis natto. Việc tìm ra vi khuẩn gây ra quá trình lên men này là nhờ tiến sĩ Shin
Sawamura (đại học Tokyo). Năm 1905, ông phân lập được loại vi khuẩn có khả
năng lên men tạo Natto bằng cách sử dụng duy nhất nó và đặt tên là Bacillus natto
Sawamura [64]. Năm 1913, ông công bố kết quả của mình qua nhiều mẫu nghiên
cứu và kết luận vi khuẩn chủ yếu có trong Natto là Bacillus subtilis natto; đồng thời
mô tả chi tiết đặc điểm vi khuẩn, enzym và nhu cầu dinh dưỡng [64].
Năm 1980, Tiến sĩ Hiroyuki Sumi đã phát hiện ra Natto có khả năng làm tan
huyết khối. Thành phần có tác dụng tuyệt vời này được ông đặt tên là Nattokinase, là
một loại enzym serine protease trong Natto. Tác dụng tiêu huyết khối của Nattokinase
lớn hơn gấp 4 lần plasmin, đồng thời hoạt hóa pro-urokinase, tăng tạo plasmin. Tác
dụng hạ cholesterol và hạ huyết áp của Natto cũng đã được ghi nhận. Năm 2006, tại
hội nghị quốc tế về dinh dưỡng tổ chức tại New Zealand, giáo sư Masafumi
Kitakaze khẳng định tác dụng làm giảm rõ rệt chứng mỡ máu cao và kêu gọi cộng
đồng thế giới cải thiện nếp sống sinh hoạt và tiêu thụ Natto [65].
Một tác dụng quan trọng khác của Natto là ngăn chặn loãng xương, được coi là
kết quả của nhiều yếu tố. Trong đậu tương có chất Isoflavon, có tác dụng tương tự
như hormon sinh dục nữ, giúp ngăn ngừa xốp xương [58]. Đồng thời, Natto chứa hàm

lượng rất cao Vitamin K2, mà chủ yếu là Menaquinon -7 (MK-7), giúp gắn kết canxi
vào xương, giúp xương chắc khỏe.
Ngoài ra, Natto còn được chứng minh có tác dụng trong ngăn ngừa ung thư,
cải thiện hệ tiêu hóa, chống lão hóa, béo phì, kháng khuẩn…
Trong các mục sau của phần tổng quan, chỉ xin làm rõ thêm về hai chất có
trong Natto là enzym protease và MK-7 là hai đối tượng nghiên cứu của đề tài.
1.2.

Protease và Nattokinase

1.2.1. Protease


6

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, B. subtilis natto có khả năng sinh
nhiều nhóm enzym ngoại bào khác nhau như: nhóm enzym 𝛾-transpeptidase,
phytase, amylase, cellulase và nhóm enzym được nghiên cứu nhiều nhất là protease
[13], [14]. Enzym protease là các enzym thuộc nhóm hydrolase xúc tác cho quá
trình thủy phân liên kết peptit (–CO-NH-) của protein tạo thành sản phẩm cuối cùng
là các acid amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết
ester và vận chuyển acid amin [3].
Các enzym protease có thể thu nhận từ động vật và thực vật nhưng vi sinh vật
là nguồn phổ biến hơn trong công nghiệp do các lợi ích về khoa học và kinh tế. Chi
Bacillus là chi vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease và có nhiều ứng dụng
trong công nghiệp, với sản lượng trên 100 tấn/năm.
Có nhiều cách phân loại protease. MEROPS – Cơ sở dữ liệu về peptidase phân
protease thành bảy họ, dựa vào sự tương đồng chuỗi acid amin và trật tự của bộ ba
xúc tác [66]. Enzym protease trong Natto là enzym ngoại bào, thuôc họ SerinPeptidase, gồm một số enzym sau :


Nattokinase: là một enzym thuộc họ subtilisin; tên khác subtilisin NAT hay

subtilisin BSP. Kí hiệu: EC 3.4.21.62. Cấu tạo gồm một chuỗi polypeptid đơn có 275
gốc acid amin và không có cầu nối disulfua trong phân tử. TLPT: 27.728Da [31],
[33], [63].


Elastase: theo nghiên cứu của Sumi, elestase có TLPT: 20kDa, pI = 8,7 [21].

Elastase mới do Muramatsu nghiên cứu có TLPT: 29,8kDa; ổn định hoạt tính trong
khoảng pH từ 8 – 9; nhiệt độ 500C [36].


Bacillopeptidase F: có TLPT khoảng 34kDa. Trung tâm hoạt động là bộ ba

xúc tác: Ser, His, Asp [60].


Protease serin: có TLPT khoảng 90 kDa; trung tâm hoạt động là bộ ba xúc

tác: Asp33, His81, Ser259 [18].
Nattokinase là protease ngoại bào có ý nghĩa nhất và đang được nghiên cứu,
ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y dược học.
1.2.2. Nattokinase


7

Nattokinase (kí hiệu là EC 3.4.21.62) là một enzym có hoạt tính tiêu fibrin rất

mạnh có nguồn gốc từ Natto – món ăn truyền thống của Nhật Bản [33].
Như đã nói đến trong mục 1.1.2. Enzym Nattokinase có tác dụng làm tan huyết
khối mạnh. Nattokinase làm tan huyết khối bằng cách trực tiếp giáng hóa fibrin trong
cục máu đông, giáng hóa fibrin gián tiếp bằng cách hoạt hóa Pro - urokinase thành
urokinase, giáng hóa fibrin gián tiếp bằng cách hoạt hóa quá trình tổng hợp t -PA
trong huyết tương.
Đặc biệt, Nattokinase không ảnh hưởng tới sự hình thành fibrin từ fibrinogen,
do đó không làm suy giảm cơ chế đông máu bình thường của cơ thể. Vì vậy,
Nattokinase không gây ra biến chứng chảy máu như các thuốc chống đông thông
thường khác [35].
Do tác dụng này, Nattokinase có thể:
• Hỗ trợ sự lưu thông bình thường của máu và độ nhớt máu
• Hỗ trợ cơ chế đông máu bình thường của cơ thể
• Hỗ trợ sản xuất plasmin, làm giảm fibrin
• Giúp duy trì mức huyết áp bình thường
Nattokinase cũng đã được xác nhận có thể hấp thu qua đường ruột chuột [15].
Hiện nay, Nattokinase được sử dụng cho các trường hợp như tăng huyết áp,
đột quỵ, huyết khối tĩnh mạch sâu, xơ cứng động mạch, tuần hoàn kém, bệnh lý võng
mạc, tiểu đường, bệnh trĩ, viêm màng dạ con, u xơ tử cung, ung thư và bệnh beriberi…
[4], [54], [55], [56], [57] [67].
Hiện nay, trên thị trường đang lưu hành một số sản phẩm chứa nattokinase
dưới dạng viên nang: Nattospes (300FU/g), S-Nattokinase (5.000FU/g), Nattokinase
plus FUcoidan (2.000FU/g), Nattokinase plus (3.000FU/g)...
1.2.3. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng
sinh enzym protease của B. subtilis natto
Năm 2013, Đinh Thu Hương đã xác định lên men B. subtilis natto trong môi
trường canh thang khi bổ sung 2% maltose, 0,5% casein, CaCl2 0,05% giúp tăng tiết


8

protease hơn 20% so với môi trường canh thang thường, tuy nhiên các enzym tạp
cũng tăng lên [1].
Năm 2005, Junguo Liu và cộng sự đã nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện dinh
dưỡng cho sinh tổng hợp Nattokinase sử dụng chủng Bacillus subtilis natto NLSSE.
Kết quả nguồn carbon tốt nhất là maltose 2%, nguồn nitơ tốt nhất là pepton đậu tương
8,28 %, hoạt tính Nattokinase đạt 1.300U/ml [25].
Năm 2008, Deepak và cộng sự nghiên cứu tối ưu hóa môi trường cho sinh tổng
hợp Nattokinase từ chủng Bacillus subtilis. Hoạt tính Nattokinase đạt 3.194 U/ml với
thành phần môi trường (%): glucose 1%, pepton 5,5%, MgSO4 0,2% và CaCl2 0,5%
[9].
LiHui Rong (2011) xác định môi trường tối ưu cho sản xuất Nattokinase từ vi
khuẩn Bacillus subtilis natto gồm: MgSO4 0,02%, K2HPO4 0,02%, KH2PO4 0,01%,
CaCl2 0,05%, maltose 3%, pepton từ đậu tương 3% [45].
Lê Thị Bích Phượng và cộng sự (2012) đã phân lập được hai chủng Bacillus
sp.7.2 và Bacillus sp. NP3 có khả năng sinh tổng hợp enzym Nattokinase 470FU/g
trên môi trường thạch đậu tương hấp chín ở điều kiện nuôi cấy trên đĩa petri và trên
khay từ một số chủng Bacillus spp. lấy từ bộ sưu tập giống của Viện sinh học nhiêt
đới và phân lập từ thực phẩm Natto [2].
1.3.

Vitamin K2 và MK-7

1.3.1. Nguồn gốc
Vitamin K2 ( gồm MK-7 và các MK-n khác) là một nhóm vitamin thuộc
nhóm vitamin K.
1.3.2. Sơ lược về Vitamin K
Vitamin K lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1929 bởi Henrik Dam [20].
Vitamin K thuộc nhóm vitamin tan trong dầu, giống nhau ở cấu trúc vòng
naphthoquinone, có nhóm thế methyl tại vị trí cacbon số 3, đóng vai trò quan trọng

trong sự điều chỉnh quá trình đông máu, giúp chống lại sự băng huyết. Đồng thời, nó
cũng được biết có tác dụng trong phòng ngừa loãng xương.


9

Có hai loại vitamin K dạng tự nhiên: Vitamin K1 hay còn gọi là phylloquinone được
tìm thấy trong thức ăn tự nhiên. Vitamin K2 hay còn gọi là menaquinone có nguồn
gốc từ vi khuẩn [51]. Các Menaquinone thường được ký hiệu là MK-n, trong đó n là
số lượng nhóm isoprenoid không bão hòa trên mạch nhánh, có thể khác nhau giữa 1
và 15 [53]. Vitamin K tổng hợp gồm 3 loại là vitamin K3, vitamin K4, vitamin K5
[51].
1.3.3. Vitamin K2 và MK-7
Các dạng phổ biến của Menaquinon tìm thấy trong thực phẩm là MK-4, MK7, MK-8, MK-9, trong đó MK-4, MK-7 là được nghiên cứu nhiều nhất. Một số vi
khuẩn sản xuất Vitamin K2 là vi khuẩn lactic (chủ yếu là MK-8 và MK-9), vi khuẩn
propionic (chủ yếu là MK-9) [38]. Cả hai chủng được sử dụng trong sản xuất pho mát
và sữa đông pho mát, tạo thành những nguồn giàu vitamin K2 ở châu Âu và Bắc Mỹ.
MK-7 có nhiều trong những thực phẩm lên men như phomat, miso, và đặc biệt là ở
Natto. Sản phẩm Natto từ Nhật Bản được chế biến từ đậu tương, lên men bởi vi khuẩn
B. subtilis natto. Sản phẩm này cung cấp lượng lớn Vitamin K2 chủ yếu dưới dạng
MK-7 ( 870 µg/100g) [27].
1.3.4. Cấu trúc MK-7
Công thức phân tử C46H64O2 [68].
Trọng lượng phân tử: 648,99916 g/mol [68].
Công thức cấu tạo

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của menaquinone – 7.
Tên IUPAC:
2-[(2E,6E,10E,14E,18E,22E)-3,7,11,15,19,23,27-heptamethyloctacosa2,6,10,14,18,22,26-heptaenyl]-3-methylnaphthalene -1,4-dione [46].
1.3.5. Tính chất vật lý, hóa học

10

Màu sắc: tinh thể màu vàng [32].
Điểm sôi: 2000C tại 0,0002 mmHg [32].
Điểm nóng chảy: 540C [29].
Độ hòa tan: không tan trong nước, tan được trong dầu, mỡ [39].
1.3.6. Tác dụng và cơ chế tác dụng
1.3.6.1.

Tác dụng và cơ chế tác dụng

Vitamin K được xem là “ Vitamin đông máu” từ khi được phát hiện năm 1929,
do tác dụng của nó tới quá trình đông máu trong cơ thể. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu
chỉ ra chức năng khác của Vitamin K ngoài vai trò cổ điển của nó, bao gồm tăng
cường cấu trúc xương, điều biến sự vôi hóa thành mạch, từ đó giúp cải thiện sức khỏe
xương và giảm các rủi do về tim mạch.
Tất cả các Vitamin K được cho rằng có chung một tác dụng quan trọng, do
chung cấu trúc vòng naphthoquinon [44]. Vitamin K là một đồng yếu tố với enzyme
γ-glutamate carboxylase (GGCX), giúp chuyển đối gốc glutamat trong cấu trúc
protein thành γ-carboxyglutamate, có ái lực mạnh mẽ với canxi. Các protein này được
gọi là protein phụ thuộc Vitamin K, hay các Gla protein [44].
Hiện nay có mười chín thành viên viên nhóm Gla được biết đến, trong đó có
Osteocalcin ở xương và Matrix GLA protein (MGP) chủ yếu ở sụn và thành mạch
máu liên quan đến quá trình tạo xương mà không liên quan đến đông máu.
Osteocalcin tạo ra từ tế bào sinh xương nhờ được cảm ứng bởi vitamin D3, cần
vitamin K hoạt hóa để có thể gắn và vận chuyển calci vào [11], [34], [40]. MGP có
thể ngăn chặn lắng đọng canxi quá mức trong [51], [52], [62] và ngăn lắng đọng
canxi thành mạch, giúp giảm vôi hóa thành mạch [24], [30]. Vitamin K2 được cho là

có hoạt tính γ-carboxyl mạnh nhất trong nhóm vitamin K [61].


11

Hình 1.3: Cơ chế tác động của MK-7
Vitamin K2 còn có những tác động độc lập khác cơ chế đồng yếu tố với
GGCX. Nó dường như ức chế sự sinh hủy cốt bào (osteoclastogenesis), làm giảm tái
hấp thu xương bởi hủy cốt bào và tăng tổng hợp xương bằng tế bào tạo xương nhờ
kích hoạt sự sinh tạo cốt bào [19], [26].
1.3.6.2.

Nghiên cứu lâm sàng về tác dụng của Vitamin K2 và MK-7

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra tác dụng quan trọng của Vitamin K2 trong việc
tăng cường sự khỏe mạnh của xương, đặc biệt trong loãng xương [5] và giảm vôi hóa
mạch máu cũng như nguy cơ tim mạch [50], được nêu ra như phương pháp điều trị
điều trị thường xuyên nhất được chỉ định đối với bệnh loãng xương ở Nhật Bản [5].
Năm 1995, bộ y tế Nhật Bản đã công nhận tác dụng của MK-4 và khuyến khích người
dân sử dụng MK-4 để phòng ngừa loãng xương [23].
Những người Nhật Bản khỏe mạnh tiêu thụ lượng lớn Natto có nồng độ MK7 và osteocalcin carboxyl hóa tăng đáng kể. Một số nghiên cứu cho thấy mối liên kết
giữa chỉ số mật độ xương (BMD) cao hơn của người Nhật Bản với mức tiêu thụ cao
Natto [22], [28]. Tuy nhiên, tác dụng của MK-7 khi sử dụng ở nồng độ thấp như chế
độ ăn uống hằng ngày với sức khỏe xương vẫn chưa được chứng minh rõ ràng.


12

Năm 2008, Gast công bố kết quả của mình sau khi nghiên cứu trên 17000
người tham gia, các menaquinon có lợi nhất về tim mạch mà các menaquinon chuỗi

dài, (MK-7 và lớn hơn) với việc giảm nguy cơ tử vong 9% với liều bổ sung
10mg/ngày. Trong khi đó, lượng vitamin K1 không liên quan đáng kể đến bệnh động
mạch [16]. Geleijnse và cộng sự, nghiên cứu đánh giá trên gần 5000 người, thấy rằng
một lượng cao của K2 ( ≥ 32 mcg mỗi ngày), nhưng không phải K1, giảm vôi hóa
động mạch 50%, tử vong do bệnh tim mạch 50% và tất cả các nguyên nhân cái chết
là 25% [17] . Như vậy, có lẽ chỉ Vitamin K2, chứ không gồm Vitamin K1 có tác dụng
trong phòng ngừa các bệnh về tim mạch. Và trong các Vitamin K2, thì menaquinon
chuỗi dài có liên quan mật thiết hơn.
Thời gian bán thải của Vitamin K1 và MK-4 là vài giờ [37], thời gian bán thải
của MK-7 là vài ngày [46], [49]. Với cùng lượng sử dụng hằng ngày, nồng độ của
MK-7 trong huyết tương có thể cao gấp năm lần Vitamin K1. Theo GS.TS. Hoàng
Tích Huyền, đại học Y Hà Nội, MK-4 có thời gian bán thải ngắn, khá khó khăn trong
sử dụng, hiện nay MK-7 được sử dụng phổ biến hơn.
1.3.6.3.

Áp dụng trong điều trị

MK-7 được sử dụng để dự phòng và giúp phòng ngừa loãng xương, còi xương,
gãy xương, giúp xây dựng và bảo vệ xương khỏe mạnh, làm chậm quá trình mất
xương do tuổi, cải thiện chất lượng xương trong nhiều nguyên nhân bệnh lý như mãn
kinh, do dùng thuốc (như corticoid), bệnh Parkinson, xơ gan mật, chán ăn [41][70].
Đối với tim mạch, MK-7 giúp chống xơ vữa động mạch, chống tắc nghẽn mạch,
tránh nhồi máu cơ tim, đau thắt ngực [70].
1.3.7. Các nghiên cứu định tính, định lượng và sản xuất MK-7
1.3.7.1.

Sản xuất MK-7

Hiện nay MK-7 có thể được sản xuất bằng các phương pháp hóa học tổng hợp
hoặc thông qua quá trình lên men, thường sử dụng các chủng vi khuẩn Bacillus

subtilis như Bacillus subtilis natto. Đối với phương pháp sản xuất bằng cách lên men,
MK-7 sau đó được tách chiết hoặc bán dưới dạng hỗn hợp dầu thực vật, như dầu
MenaQ7 Oil M 1500 của Nattopharm [10].


13

Surya Rosa-Putra và cộng sự đã nghiên cứu sinh tổng hợp MK-7 từ
Sphingobacterium multivorum thông qua con đường methylerythritol phosphate và
tiến hành tinh chế MK-7 bằng TLC (CH2Cl2: n-hexan, 1:1, Rf = 0,4) [42].
Nhiều nghiên cứu tiến hành để xác định môi trường nuôi cấy phù hợp để sản sinh
MK-7. Aydin Berenjian và cộng sự (2006) sử dụng phương pháp lên men lỏng đưa
ra môi trường thích hợp gồm 5% (w/v) cao nấm men; 18,9% (w/v) pepton đậu tương;
5% (w/v) glycerol and 0,06% (w/v) K2HPO4, hàm lượng MK-7 thu được là 62,32 ±
0,34 mg/L [6]. Raja Mahanama và cộng sự (2011) sử dụng phương pháp lên men bán
rắn, nồng độ mk7 là tối đa (110 mg/kg) trong môi trường bán rắn có độ dày 2 mm
[43].
1.3.7.2.

Định tính và định lượng MK-7

Hệ dung môi thường được sử dụng chiết MK-7 để định tính, định lượng trong
các nghiên cứu là n-hexan: 2-propanol. Năm 2011, Aydin Berenjian và cộng sự đã
khảo sát thời gian chiết, tỉ lệ dung môi; dịch chiết, với hệ dung môi là n-hexan và 2propanol. Kết quả thu được điều kiện tối ưu để chiết MK-7 là n-hexan:2-propanol
(2:1, v/v), thời gian chiết là 1 phút [7]. Cũng có thể chiết MK-7 bằng các dung môi
thân dầu khác, hoặc bằng chất lỏng siêu tới hạn [10].
Surya Rosa-Putra và cộng sự đã tiến hành tinh chế MK-7 bằng TLC (CH2Cl2: nhexan, 1:1, Rf = 0,4) [42]. Barbara Schoepp-Cothenet và cộng sự (2008) sử dụng
methanol/cloroform để chiết, và định tính bằng TLC [47]. Ngoài ra, để định tính và
định lượng MK-7, người ta cũng hay sử dụng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao.
Leon J. Schurgers và Cees Vermeer đã định tính Vitamin K1 và K2 trong các loại

thực phẩm bằng HPLC sử dụng cột C-18 pha đảo [48].
1.3.8. Các chế phẩm chứa MK-7 trên thị trường
Sản xuất MK-7 bằng phương pháp lên men đã được ứng dụng nhiều trên thế
giới, tạo ra các sản phẩm thương mại tiện dụng, đem lại nhiều lợi ích về kinh tế. Tại
Việt Nam cũng có công ty CP Dược phẩm Vinh gia sản xuất sản phẩm cung cấp MK7 như Vững cốt Vinh Gia, Vipteen Vinh Gia. Việc tiếp tục nghiên cứu sâu để phát
triển sản phẩm là rất cần thiết và tiềm năng.


14

Hình 1.4: Vipteen – Công ty CPDP

Hình 1.5: Vững cốt Vinh Gia – Công

Vinh Gia

ty CPDP Vinh Gia


15

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và thiết bị sử dụng
2.1.1. Vi sinh vật sử dụng
Bacillus subtilis natto – (chủng được phân lập từ chế phẩm Natto Nhật Bản
trên thị trường được lưu giữ tại phòng Vi sinh – Bộ môn Công nghiệp Dược – Trường
Đại học Dược Hà Nội).
2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng
Nguyên liệu và hóa chất sử dụng được đưa ra trong Bảng 2.1
Bảng 2.1. Nguyên liệu và hóa chất sử dụng

Tên

Nguồn gốc

Tên

Nguồn gốc

Pepton

Ấn Độ

Dung dịch Xanh methylen

Việt Nam

Cao thịt

Đức

Đậu tương

Việt Nam

NaCl

Trung Quốc

Casein

Trung Quốc

Thạch bột

Trung Quốc

2.1.3. Môi trường
a) Công thức môi trường thạch thường (MT1)
Thành phần

Lượng

Pepton

1,0g

Cao thịt

0,5g

NaCl

0,5g

Thạch thường

2,3g

Nước máy vđ

100ml

b) Công thức môi trường canh thang (MT2)
Thành phần

Lượng

Pepton

1,0g

Cao thịt

0,5g


16

NaCl

0,5g

Nước máy vđ

100ml

c, Công thức môi trường canh thang bột đậu (MT3)
Thành phần

Lượng

Pepton

1,0g

Cao thịt

0,5g

NaCl

0,5g

Bột đậu tương

Tùy nồng độ

Nước máy vđ

100ml

d, Công thức môi trường canh thang đậu hạt (MT4)
Thành phần

Lượng

Pepton

1,0g

Cao thịt

0,5g

NaCl

0,5g

Đậu tương hạt

Tùy nồng độ

Nước máy vđ

100ml

2.1.4. Thiết bị và dụng cụ
Danh sách thiết bị sử dụng được đưa ra trong Bảng 2.2
Bảng 2.2. Thiết bị được sử dụng
Tên

Nguồn gốc (Hãng)

Tên

Nguồn gốc (Hãng)

Tủ cấy vô trùng

Italia (UV Bioair)

Máy lắc

Đức (Bioshaker)

Tủ ấm, tủ sấy

Đức (Memmert)

Tủ lạnh

Nhật (Toshiba)

Nhật (ALP)

Cân kỹ thuật

Đức (Satorius)

Hàn Quốc (Daewoo)

Máy li tâm

Nồi hấp tiệt
trùng
Lò vi sóng

Đức (Rotofix)
(Universal)

17

Các dụng cụ được sử dụng: Bình nón, bình định mức, cốc đong, cốc có mỏ,
đĩa petri nhựa (đường kính 8,8 cm), ống nghiệm, ống li tâm, pipetman, pipet tip, thước
kẹp Palmer,…
2.2. Nội dung nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu giải quyết 2 mục tiêu sau:
2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung đậu tương tới khả năng sinh
protease của Bacillus subtilis natto
- So sánh ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu đậu tương dạng nguyên hạt và
dạng bột tới khả năng sinh enzym protease.
- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đậu tương tới khả năng sinh enzym Proteae
của Bacillus subtilis natto.
- Khảo sát thời gian thu enzym protease khi nuôi cấy vi khuẩn trong các môi
trường canh thang có bổ sung đậu tương.
2.2.2. Sơ bộ định tính MK-7 trong dịch lên men Bacillus subtilis natto với môi
trường canh thang chứa đậu tương
- Định tính MK-7 bằng phương pháp sắc kí mỏng trong dịch lên men từ các
môi trường có sử dụng nguyên liệu đậu tương dạng hạt.
- Định tính MK-7 trong chế phẩm Natto.
- So sánh kết quả định tính MK-7 trong dịch lên men và chế phẩm Natto.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp giữ giống và nuôi cấy Bacillus subtilis natto
a) Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng
Pha môi trường thạch thường (theo mục 2.1.3), đun cho đồng nhất. Chia đều
môi trường vào trong các ống nghiệm (5-6ml/ống), nút kín. Hấp tiệt khuẩn ở điều
kiện 1atm/20 phút. Sau khi tiệt khuẩn xong, đặt nghiêng các ống nghiệm và để nguội
cho thạch đông lại. Tiến hành cấy truyền từ ống giống gốc sang ống môi trường mới
theo hình ziczac. Đặt các ống đã cấy giống vào tủ ấm, ở 370C/24 giờ. Bảo quản các

ống giống trong tủ lạnh 4-50C. Việc cấy truyền được thực hiện 1-2 tháng/lần [11].
b) Phương pháp nhân giống trong bình nón