Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy và dinh dưỡng đến khả năng sinh acid lactic của lactobacillus acidophilus

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
----------

LÊ THỊ MINH PHƯƠNG
Mã sinh viên: 1101398

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA
THỜI GIAN NUÔI CẤY VÀ
DINH DƯỠNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH
ACID LACTIC CỦA
Lactobacillus acidophilus
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ MINH PHƯƠNG
Mã sinh viên: 1101398

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA
THỜI GIAN NUÔI CẤY VÀ
DINH DƯỠNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH
ACID LACTIC CỦA
Lactobacillus acidophilus
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
TS. Đàm Thanh Xuân
Nơi thực hiện:

Bộ môn Công nghiệp dược

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới
cô giáo TS.Đàm Thanh Xuân đã hết lòng hướng dẫn, truyền đạt những kiến
thức quý báu, dành nhiều thời gian, tận tâm chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành
đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo DS.Lê Ngọc Khánh, thầy giáo
ThS.Nguyễn Khắc Tiệp và cô giáo ThS.Kiều Thị Hồng đã cho tôi những bài
học giá trị, nhiệt tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi từ những ngày đầu thực hiện khóa
luận đến nay.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật
viên Bộ môn Công nghiệp Dược và Bộ môn Vật lý & Hóa lý - Trường Đại
học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá
trình nghiên cứu và làm thực nghiệm tại bộ môn.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến toàn thể Ban giám hiệu và các
thầy cô giáo trong trường đã dạy dỗ và dìu dắt tôi trong suốt 5 năm học ở
trường.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những
người đã luôn luôn động viên, ủng hộ và hết lòng giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Lê Thị Minh Phương

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC BẢNG, CÁC ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................. 1
Chương 1. TỔNG QUAN ................................................................................ 2
1.1. Acid lactic .............................................................................................. 2
1.1.1. Đặc điểm .......................................................................................... 2
1.1.2. Công dụng ........................................................................................ 4
1.2. Các phương pháp sản xuất acid lactic ..................................................... 5
1.2.1. Phương pháp tổng hợp hóa học ........................................................ 5
1.2.2.Phương pháp sinh học ....................................................................... 5
1.3. Vi khuẩn sinh acid lactic ........................................................................ 9
1.3.1. Đặc điểm của nhóm vi khuẩn sinh acid lactic ................................... 9
1.3.2. Chi Lactobacillus ............................................................................. 9
1.3.3. Loài Lactobacillus acidophilus ....................................................... 10
1.4. Phương pháp xác định đồng phân quang học ........................................ 12
1.4.1. Phương pháp xác định độ quay cực riêng ....................................... 13
1.5. Một số nghiên cứu về điều chế acid lactic bằng phương pháp sinh tổng
hợp từ vi sinh vật......................................................................................... 13
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................... 15
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ....................................................................... 15
2.1.1. Nguyên vật liệu .............................................................................. 15


2.1.2. Thiết bị sử dụng.............................................................................. 17
2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 17
2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose trong môi trường nuôi cấy
Lactobacillus acidophilus đến khả năng sinh calci lactat định hướng tạo
dạng acid L (+) - lactic ............................................................................. 17

2.2.2. Khảo sát phương pháp tách chiết acid lactic từ sản phẩm calci lactat
thu được và xác định góc quay cực riêng của acid lactic .......................... 18
2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 18
2.3.1. Phương pháp nhân giống và nuôi cấy ............................................. 18
2.3.2. Phương pháp tách chiết Calci lactat từ dịch lên men ....................... 19
2.3.3. Phương pháp Schoorl – Regenbogen định lượng đường [8]............ 19
2.3.4. Phương pháp tính hiệu suất quá trình sinh tổng hợp calci lactat [8] 20
2.3.5. Phương pháp xác định độ quay cực riêng của dung dịch chứa acid
lactic [3] ................................................................................................... 20
2.3.6. Phương pháp định tính glucose....................................................... 21
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN ................................. 22
3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose trong môi trường nuôi cấy
Lactobacillus acidophilus đến khả năng sinh calci lactat định hướng tạo
dạng acid L (+) - lactic ................................................................................ 22
3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose tới hiệu suất sản phẩm
sinh tổng hợp calci lactat .......................................................................... 22
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của lượng glucose được L.acidophilus tiêu thụ
theo thời gian trong môi trường lên men chứa 10 % glucose .................... 25
3.1.3. Lựa chọn thời điểm kết thúc quá trình lên men ............................... 26


3.2. Khảo sát phương pháp tách chiết acid lactic từ sản phẩm calci lactat thu
được và xác định góc quay cực riêng........................................................... 28
3.2.1. Xác định sản phẩm calci lactat thu được sau khi lên men với nồng
độ glucose lần lượt là 1 % và 2 % ............................................................ 28
3.2.2. Quy trình tách chiết acid lactic từ sản phẩm calci lactat thu được ... 29
3.2.3. Sơ bộ xác định góc quay cực của acid lactic sau khi được tinh chế
từ calci lactat ở các nồng độ glucose khác nhau ....................................... 31
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................ 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁCCHỮ VIẾT TẮT
ATCC

American Type Culture Collection
(Trung tâm giữ giống Quốc gia Mỹ)

DĐVN

Dược điển Việt Nam

HPLC

High Performance Liquid Chromatography

kl

Khối lượng

MRS

De Man, Rogosa, Sharpe

L.acidophilus Lactobacillus acidophilus
PLA

Poly acid lactic

tt

Thể tích

vd

Vừa đủ

VSV

Vi sinh vật


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Nội dung

Hình 1.1

Cấu trúc không gian của acid D (-) - lactic và acid L (+) - lactic

Hình 1.2

Quá trình lên men lactic đồng hình (homolactic) và dị hình
(heterolactic)

Hình 1.3

L. acidophilus dưới kính hiển vi quang học (a), kính hiển vi
điện tử (b)

Hình 3.1

Biểu đồ biến thiên hiệu suất tạo calci lactat trong dịch nuôi cấy
theo lượng glucose khởi điểm trong môi trường nuôi cấy

Hình 3.2

Sơ đồ quy trình tách chiết acid lactic từ sản phẩm calci lactat


DANH MỤC CÁC BẢNG, CÁC ĐỒ THỊ
Tên bảng

Nội dung

Bảng 2.1

Các nguyên liệu và hóa chất

Bảng 2.2

Môi trường nhân giống MRS và lên men

Bảng 2.3

Các thiết bị sử dụng

Bảng 3.1

Kết quả lượng sản phẩm calci lactat thu được sau khi thay đổi
nồng độ glucose trong môi trường lên men

Bảng 3.2

Kết quả hàm lượng glucose mà L. acidophilus đã tiêu thụ theo
thời gian

Bảng 3.3

Kết quả định tính lượng đường dư trong dịch lên men theo thời
điểm thu sản phẩm

Bảng 3.4

Kết quả sản phẩm calci lactat thu được ở các nồng độ glucose
khác nhau

Bảng 3.5

Kết quả đo góc quay cực của acid lactic tinh chế sau khi lên men
ở các nồng độ glucose


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Các sản phẩm lên men hiện nay ngày càng được ứng dụng phổ biến
trong mọi lĩnh vực của đời sống như dược phẩm, thực phẩm, mỹ phẩm dệt
may… Trong số các sản phẩm của công nghệ lên men, acid lactic và các dẫn

xuất của nó là những sản phẩm có lịch sử lâu đời và ứng dụng rất rộng rãi [1],
[6], [28].
Phương pháp tổng hợp hóa học acid lactic thường tạo ra dạng racemic.
Trong khi đó phương pháp vi sinh có thể tạo ra sản phẩm dạng acid L (+)
lactic với hiệu suất cao và thân thiện với môi trường [17]. Với các ưu điểm
của phương pháp vi sinh vật cùng với nhu cầu thị trường ngày càng cao,
những năm gần đây, nghiên cứu để tăng năng suất quá trình sinh tổng hợp
acid lactic đã thu hút được nhiều sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế
giới nói chung và Việt Nam nói riêng. Mục tiêu của các nghiên cứu này là
thay đổi các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men sinh tổng hợp, nhằm thu
được sản phẩm với hiệu suất cao [22].
Các yếu tố quyết định tới sự thành công của một quá trình sản xuất theo
phương pháp sinh tổng hợp chính là dinh dưỡng, điều kiện quá trình và thiết
bị lên men. Với mong muốn được góp phần vào các nghiên cứu cải thiện hiệu
suất sinh tổng hợp acid lactic, chúng tôi lựa chọn đề tài “ Khảo sát ảnh hưởng
của thời gian nuôi cấy và dinh dưỡng đến khả năng sinh acid lactic của
Lactobacillus acidophilus”, với các mục tiêu sau:
- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose trong môi trường nuôi cấy
Lactobacillus acidophilus đến khả năng sinh calci lactat định hướng
tạo dạng acid L (+) –lactic.
- Khảo sát phương pháp tách chiết acid lactic từ sản phẩm calci lactat
thu được và xác định góc quay cực riêng


2

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Acid lactic
1.1.1. Đặc điểm
Acid lactic là hợp chất hữu cơ thu được nhờ các phương pháp khác

nhau: phương pháp tổng hợp hóa học và phương pháp lên men vi sinh vật.
Công thức tổng quát: C3H6O3[36]
Tên khoa học: acid 2- hydroxypropanoic
Thành phần: C 40,00%, H 6,71%, O 53,28%
Khối lượng phân tử: 90,08g/mol
 Công thức cấu tạo:

 Các dạng của acid lactic
Trong phân tử của acid lactic có 1 carbon bất đối nên acid lactic có 1
cặp đối quang: acid D (-) - lactic, acid L (+) - lactic.

Acid D (-) - lactic

Acid L (+) - lactic


3

Hai đồng phân quang học này có tính chất hóa lý giống nhau, nhưng
chỉ khác nhau về khả năng làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, một sang
phải và một sang trái. Do đó tính chất sinh học của chúng khác nhau.
 Cấu trúc không gian
Acid lactic là hỗn hợp của 2 dạng đồng phân acid D (-) -lactic và acid L
(+) -lactic.

Acid D (-) - lactic

Acid L (+) - lactic

Hình 1.1. Cấu trúc không gian của acid D (-) - lactic và acid L (+) - lactic

Các acid lactic có tính quang hoạt khi bị ánh sáng phân cực đi qua, các
dạng phân cực có thể chuyển thành dạng acid racemic dưới tác dụng của
enzym racemase từ một vài loài vi khuẩn lactic. Nếu acid D (-) - lactic và acid
L (+) - lactic có trong một hỗn hợp theo tỉ lệ 50:50 người ta gọi là hỗn hợp
racemic. Hỗn hợp này được kí hiệu là DL- lactic acid[1], [26].
 Tính chất của acid lactic
Ở dạng dung dịch: acid lactic là chất lỏng trong suốt, không màu,
không mùi, vị chua đặc trưng, tan tốt trong nước, không bay hơi.
Ở dạng tinh thể: dễ tan ở áp suất khí quyển tạo chất lỏng.
Khi ở pha lỏng, acid lactic dễ chuyển sang dạng dime mạch thẳng
lactoyl lactat và polyme mạch thẳng cao hơn, khi đó nhóm hydroxyl của phân
tử này liên kết ester với nhóm carbonyl của phân tử khác. Dạng dimer mạch
vòng lactic cũng có thể được hình thành nếu được thực hiện đun nóng kéo dài
[1], [26].


4

Acid lactic là một chất có độ hút ẩm cao, là chất lỏng sánh đặc có sẵn
trên thị trường ở những dạng khác nhau về chất lượng và phụ thuộc vào độ
tinh sạch có nhiều tiêu chuẩn khác nhau như: acid lactic kỹ thuật, thực phẩm,
dược phẩm và acid lactic plastic. Ở dạng đồng phân acid D (-) - lactic hoặc
acid L (+) - lactic lần lượt có nhiệt độ nóng chảy và nhiệt độ sôi là 530C và
1220C[33], [36]. Một trong những tiêu chuẩn chất lượng quan trọng của acid
lactic tinh sạch cao là sự bền nhiệt, ví dụ: khi đun nóng dung dịch chứa 80%
acid lactic lên đến 1800C, ta thu được dung dịch không màu [1], [26].
1.1.2. Công dụng
Acid lactic được sử dụng nhiều trong nhiều lĩnh vực:
a. Trong y học
Acid lactic thường được sử dụng dưới dạng muối lactat (calci hoặc

natri lactat) một thành phần chủ yếu trong dịch truyền Ringerlactat để bù
nước và điện giải cho bệnh nhân. Ngoài ra, calci lactat còn là nguồn nguyên
liệu chủ yếu cho các thuốc giàu calci để bổ sung cho bệnh nhân bị thiếu calci
dẫn đến co giật, rối loạn tâm thần… hoặc bồi bổ cho phụ nữ có thai và trẻ nhỏ
còi xương chậm lớn [6].
Bên cạnh đó một dẫn xuất khác của acid lactic là magnesi lactat cũng
có vai trò rất quan trọng trong lĩnh vực y học. Magnesi lactat tác động lên quá
trình tăng trưởng, giống như vitamin D, nó giúp Calci và Phospho cố định
trên xương [11], [30]. Magnesi lactat còn được dùng trong điều trị đau cổ tử
cung trong thai kì [15] hay cần thiết cho quá trình phát triển và hoạt động bình
thường của tổ chức, đặc biệt liên quan đến chuyển hóa [31] và các hoạt động
bình thường của não [34], [35].
b. Trong công nghệ thực phẩm
Acid lactic thường được ứng dụng để sản xuất các sản phẩm lên men từ
sữa như sữa chua, phomat… làm cho sản phẩm thêm giàu dinh dưỡng. Đặc


5

biệt lên men sữa chua không chỉ giúp tăng giá trị dinh dưỡng mà còn có tác
dụng điều trị bệnh đường ruột giúp ăn ngon dễ tiêu hóa.
Ngoài ra, acid lactic dùng để sản xuất dưa chua, sản xuất tương hay
được ứng dụng trong sản xuất các loại sữa bột và bột giàu calci dưới dạng
calci lactat [1].
c. Trong công nghiệp khác
Acid lactic và các dẫn xuất của nó (polylactid – nhựa sinh học PLA)
được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp dược phẩm, thực phẩm, công
nghiệp dệt, tổng hợp vecni, nhựa gia công bằng nhiệt [28].
1.2.Các phương pháp sản xuất acid lactic
1.2.1.Phương pháp tổng hợp hóa học

Từ những năm 1960, các nhà khoa học đã nghiên cứu sản xuất acid
lactic bằng phương pháp tổng hợp hóa học. Phương pháp này được ứng dụng
rộng rãi sản xuất acid lactic cho các ngành công nghiệp khác nhau [28].
 Cộng hợp ái nhân với tác nhân HCN từ nguồn acetaldehyd
CH3CHO
Acetaldehyd

+

HCN

CH3CHOHCN

hydrogen cyanid

lactonitril

 Thủy phân lactonitril bằng acid sulfuric
2CH3CHOHCN + 4H2O + H2SO4
2CH3CHOHCOOH + (NH4)2SO4
Lactonitril

acid lactic

Tuy nhiên, phương pháp này cũng có một số nhược điểm như thường
tạo ra dạng acid racemic DL - lactic và acid D (-) - lactic. Đây là các dạng gây
hại với sức khỏe con người nên ít dùng [19], [21].
1.2.2.Phương pháp sinh học
Cơ sở của phương pháp sinh học là tiến hành lên men trong điều kiện
kị khí hoặc vi hiếu khí với các chủng vi sinh vật sinh acid lactic. Acid lactic

6

được tạo thành từ sự chuyển hóa mono hoặc disaccharid bước đầu đi theo con
đường Embden - Mayerhoff – Parnas (hình 1.1). Sau đó, dưới điều kiện kỵ
khí, acid piruvic sinh ra sẽ được khử hóa thành acid lactic dưới tác dụng của
enzym lactat dehydrogenase. Lactat dehydrogenase (LDH) của các vi khuẩn
lactic đóng vai trò quan trọng trong việc tạo thành acid L (+) - hay D (-) lactic do khả năng lập thể hóa của sản phẩm (do gen ldhD hay ldhL quy định),
tùy theo chủng vi khuẩn lactic có loại gen nào thì sẽ cho sản phẩm tương ứng.
Gen mã hóa enzym L (+) - lactat dehydrogenase được nghiên cứu trên
Lactobacillus plantarum. Gen mã hóa enzym D (-) - lactat dehydrogenase
được nghiên cứu trên Lactobacillus johnsonii[10].


7

Hình 1.2. Quá trình lên men lactic đồng hình (homolactic) và
dị hình (heterolactic) [10]
Cả hai dạng lên men tạo acid lactic từ hydratcarbon là đồng hình
(homolactic) hay dị hình (heterolactic). Lên men lactic đồng hình khi lượng


8

acid lactic chiếm đại đa số do vi khuẩn lactic loại này có enzym aldolase
nhưng không có enzym phosphoketolase. Lên men dị hình khi lượng acid
lactic chiếm tỷ lệ thấp, đi kèm với hỗn hợp các chất khác như acid lactic, acid
formic hoặc CO2, do vi khuẩn lactic không có enzym aldolase nhưng có
enzym phosphoketolase [10].

Phương pháp sinh tổng hợp acid lactic dựa trên quá trình lên men của
vi sinh vật đòi hỏi sự kiểm soát chặt chẽ nhiệt độ và pH. Trung hòa các acid
do các vi sinh vật tiết ra trong quá trình lên men là điều cần thiết do việc tạo
ra các acid sẽ làm giảm pH của môi trường lên men, gây bất lợi cho sự trao
đổi chất của vi sinh vật và có thể làm quá trình lên men dừng lại. Do vậy, việc
bổ sung các hợp chất của Calci hay Magnesi vào môi trường lên men sẽ giúp
giữ pH ở giá trị thích hợp với sự phát triển của vi sinh vật. Sau khoảng thời
gian thích hợp tiến hành thu dịch lên men, xử lý dịch lên men, kết tinh và tinh
chế sẽ thu được sản phẩm Calci lactat hoặc Magnesi lactat. Sau đó tiếp tục
tiến hành quy trình chuyển thành acid lactic thông qua H2SO4. Thực chất quá
trình lên men tạo acid lactic chính là phương pháp lên men vi sinh tạo Calci
lactat hay Magnesi lactat [12], [14], [16], [25].
Phương pháp sinh tổng hợp acid lactic từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm
hơn so với phương pháp tổng hợp hóa học [17], [20], [22], [29].
- Có khả năng tạo ra được dạng acid L (+) - lactic nhiều hơn.
- Nhiệt độ sản xuất thấp, thiết bị và quy trình sản xuất đơn giản, dễ áp
dụng trong điều kiện kinh tế Việt Nam.
- An toàn với môi trường do các dư phẩm của quá trình được tận dụng để
làm nguyên liệu cho thức ăn gia súc hoặc phân bón.


9

1.3. Vi khuẩn sinh acid lactic
1.3.1. Đặc điểm của nhóm vi khuẩn sinh acid lactic
Vi khuẩn sinh Lactic gồm các trực khuẩn hay cầu khuẩn Gram (+), tỉ lệ
GC (guanin và cystein) thấp, chịu được acid, thường không sinh nha bào, kị
khí hoặc vi hiếu khí, được phân nhóm dựa vào đặc điểm chung trong quá trình
trao đổi chất và các đặc tính sinh lý. Ban đầu, các vi khuẩn này được tìm thấy
trong thực vật đã phân hủy và các sản phẩm chứa acid lactic. Điểm chung lớn

nhất của vi khuẩn nhóm này là sự lên men hydratcarbon sinh ra acid lactic là
sản phẩm trao đổi chất cuối cùng[4], [24].
Vi khuẩn sinh Lactic chủ yếu thuộc 4 chi: Lactobacillus, Pediococcus,
Streptococcus, Leuconostoc; ngoài ra có một số loài nấm thuộc chi
Rhizopus[2], [10]. Hình dạng và kích thước của vi khuẩn sinh Lactic rất đa
dạng và phức tạp: hình cầu, hình oval, hình que, mọc đơn, mọc đôi hoặc mọc
thành chuỗi. Sinh lý của vi khuẩn Lactic khá giống nhau, chúng là các vi
khuẩn Gram (+), không tạo bào tử, hầu như không di động, ưa nhiệt, là vi
khuẩn yếm khí hoặc vi hiếu khí, sử dụng năng lượng từ phân giải glucid và
tiết ra acid lactic. Chúng phát triển và tồn tại tốt ở pH thấp (4,5 – 6,8), nhiệt
độ khoảng 10 – 500C [2], [10].
Vi khuẩn Lactic là vi khuẩn dị dưỡng nên môi trường dinh dưỡng
tương đối phức tạp, giàu chất dinh dưỡng gồm: các vitamin, các acid amin,
các peptid ngắn… Chúng có khả năng đồng hóa nhiều loại đường: glucose,
saccarose, lactose, mantose… một vài loài cũng có khả năng sử dụng đường
cao phân tử [2].
1.3.2. Chi Lactobacillus
Là chi lớn nhất trong các vi khuẩn sinh lactic với nhiều chủng đã được
nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất. Chi Lactobacillus được phát hiện với


10

hơn 125 loài, dựa vào sự chuyển hóa glucid trong tế bào và sản phẩm tạo ra
trong quá trình lên men, chia thành 3 nhóm chính[4].
 Nhóm 1: Nhóm vi khuẩn lên men đồng hình, sản phẩm cuối cùng của
quá trình lên men chủ yếu là acid lactic (90 – 98%), các sản phẩm khác
chỉ tồn tại dạng vết nhỏ. Đại diện: L. acidophilus, L. bulgaricus, L.
delbrueckii…
 Nhóm 2: Nhóm vi khuẩn lên men dị hình không bắt buộc, sản phẩm

của quá trình lên men có thể là acid lactic, acid acetic, acid formic,
ethanol. Đại diện: L. plantarum, L. casei, L. leichmannii…
 Nhóm 3: Nhóm vi khuẩn lên men dị hình bắt buộc, sản phẩm cuối cùng
là acid lactic, acid acetic, carbonic, ethanol. Đại diện: L. brevis, L.
fermentum, L. buchneri…
1.3.3. Loài Lactobacillus acidophilus
Loài L. acidophilus thuộc giới vi khuẩn, ngành Fermicutes, lớp bacilli,
bộ lactobacilliales, họ lactobacillaceae, giống Lactobacillus [4].


11

Hình 1.3. L. acidophilus dưới kính hiển vi quang học (a),
kính hiển vi điện tử (b) [4]
Lactobacillus acidophilus là trực khuẩn Gram (+), dạng hình que, mọc
đơn, mọc đôi hoặc tạo chuỗi ngắn, không có lông roi, không sinh bào tử,
không di động, phản ứng catalase âm tính, không ưa muối, ưa acid, phát triển
tốt trong điều kiện sức căng bề mặt thấp và có khả năng kháng lysozym, hô
hấp hiếu khí và kị khí nhưng chủ yếu là kị khí. Do đó môi trường nuôi cấy
thường là kị khí hoặc là giảm áp oxy với 5 – 10 % CO2, là vi khuẩn có thể
sinh trưởng ở nhiệt độ cao (ở 45oC), tuy nhiên nhiệt độ tối ưu để phát triển là
370C, không phát triển trong khoảng 20 – 22oC. Là đại diện chính của nhóm
vi khuẩn sinh acid lactic, nó có khả năng chịu được điều kiện môi trường acid
trong khoảng pH thấp (5 – 6) trong thời gian 24 – 36 giờ [2], [10]. L.
acidophilus thuộc nhóm vi khuẩn lên men đồng hình có khả năng chuyển hóa
hydratcarbon: fructose,glucose,lactose… [10].
Lactobacillus acidophilus là vi sinh vật probiotic, chúng là các vi
khuẩn có lợi trong hệ thống tiêu hóa giúp chống lại vi khuẩn có hại gây bệnh,
góp phần duy trì hệ vi khuẩn có lợi. Lactobacillus acidophilus được phân lập
từ dịch ruột trẻ em và dịch ruột bê.

12

Hiện nay, Lactobacillus acidophilus được sử dụng nhiều trong các chế
phẩm men tiêu hóa như: Antibio, Lactomin… để điều trị các trường hợp rối
loạn tiêu hóa ở trẻ mới ăn dặm hoặc do dùng kháng sinh dài ngày [7].
1.4. Phương pháp xác định đồng phân quang học
Mỗi cặp đối quang sẽ quay mặt phẳng ánh sáng phân cực những góc
bằng nhau, nhưng ngược chiều nhau. Một chất có tính hoạt quang khi số
lượng đối quang này nhiều hơn đối quang kia. Xác định thành phần đối quang
của một chất là rất quan trọng trong tổng hợp bất đối [27].
Thành phần đối quang của một mẫu có thể được thể hiện thông qua giá
trị ee (enantimer exess) là phần nhiều hơn của một đối quang này so với đối
quang còn lại.

Trong đó [S], [R] lần lượt là đồng phân S, R
Tương tự như vậy, thành phần các đồng phân lập thể không đối quang
được thể hiện qua giá trị de (diastereomer excess) là phần nhiều hơn của một
đồng phân lập thể không đối quang này so với đồng phân kia.

Trong đó [S*S] và [S*R] lần lượt là lượng của các đồng phân lập thể
không đối quang.
Có nhiều phương pháp để xác định thành phần của các đối quang của
một đôi đồng phân quang học.Một số phương pháp định lượng được áp dụng
cho phân tử gốc và một số phương pháp khác được áp dụng cho các dẫn xuất
của các hợp chất cần xác định. Các phương pháp hiện nay bao gồm: phương
pháp cộng hưởng từ hạt nhân, sắc ký lỏng hiệu năng cao, điện di mao quản
và phương pháp xác định độ quay cực riêng.

13

1.4.1. Phương pháp xác định độ quay cực riêng
Để đặc trưng cho tính quang hoạt của một chất, người ta dùng độ quay
cực riêng tính theo công thức (a) đối với chất lỏng nguyên chất, công thức (b)
đối với chất trong dung dịch [9].

Trong đó:
α là góc quay cực đo được (0)
L là độ dài của ống đựng chất (dm)
c là nồng độ (g/100ml)
λ là độ dài sóng (thường là 589 nm, vạch D của Na)
to nhiệt độ khi đo (oC)
d là tỷ trọng của chất lỏng (g/ml).
Đối với hợp chất bất kỳ mà góc quay cực của một đối quang tinh khiết
của nó đã biết thì giá trị ee có thể xác định trực tiếp từ góc quay cực xác định
theo công thức (c) [27].
Độ tinh khiết quang học =

[ ]
[ ]



% (c)

Trong đó:
αobs là độ quay cực xác định được
αmax là độ quay cực của mẫu tinh khiết đối quang.

1.5. Một số nghiên cứu về điều chế acid lactic bằng phương pháp sinh
tổng hợp từvi sinh vật
a. Nghiên cứu ở nước ngoài
Garvie Ellen và các cộng sự (1967) đã tiến hành đánh giá ảnh hưởng
của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh acid L (+) - lactic và D (-) - lactic


14

bằng cách lên men một số vi khuẩn sinh acid lactic, với nghiên cứu đặc biệt
trên Lactobacillus acidophilus [17].
Kamila Goderska và các cộng sự (2008) đã tiến hành đánh giá khả năng
sinh acid L (+) - lactic và D (-) - lactic của Lactobacillus acidophilus DSM
20079 trong các môi trường ở các nồng độ khác nhau của một số loại đường.
Kết quả cho thấy môi trường MRS không chứa carbohydrat sinh nhiều acid L
(+) - lactic nhất rồi đến inulin, saccarose, lactose, glucose ( 68% dạng L, thời
gian nuôi cấy 48h, pH 6,6) và cuối cùng là fructose [22].
Hoshino và cộng sự đã nghiên cứu lên men với chủng
Lactobacilluscasei từ nguyên liệu là tinh bột. Sử dụng enzyme amylase để
thủy phân tinh bột. Duy trì tốc độ pha loãng thích hợp, nồng độ acid lactic cao
nhất là 31g/l sau 144h lên men [23].
Roukas và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất acid lactic từ nước sữa đã
tách bơ và protein, sử dụng chủng Lactobacillus casei và chủng Lactococcus
lactis. Nồng độ acid lactic cao nhất là 41g/l có thể đạt được sau 48h lên men
[32].
b. Nghiên cứu trong nước
Lê Thị Thu Hiền đã tiến hành cố định tế bào L.acidophilus trên chất
mang alginat làm cơ sở cho quá trình lên men liên tục sinh tổng hợp acid
lactic và calci lactat [5].

15

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
Chủng giống: Lactobacillus acidophilus ATCC 4653 dạng đông khô.
Nguyên liệu và hóa chất
Bảng 2.1. Các nguyên liệu và hóa chất
Nguyên liệu,
hóa chất

Nguồn gốc

Nguyên liệu,
hóa chất

Nguồn gốc

Glucose

Trung Quốc

NaOH

Trung Quốc

Sữa bột

Việt Nam

NaK(C4H4O6) Trung Quốc

Cao nấm men

Merck – Đức

H2SO4 98%

Trung Quốc

(NH4)2SO4

Trung Quốc

Na2S2O3

Trung Quốc

KH2PO4

Trung Quốc

Cao thịt

Merck – Đức

MnSO4.H2O

Trung Quốc

Pepton

Merck – Đức

FeSO4.7H2O

Trung Quốc

HCl

Trung Quốc

MgSO4.7H2O

Trung Quốc

CuSO4

Trung Quốc

CaCO3

Trung Quốc

KI

Trung Quốc

Nước cất

Việt Nam

Ca(OH)2

Trung Quốc


16

Môi trường nuôi cấy sử dụng:
Bảng 2.2. Môi trường nhân giống MRS và lên men
Môi trường nhân giống MRS

Môi trường lên men

Thành phần

Khối lượng

Thành phần

Khối lượng

Glucose

2,0g

Glucose

2,0g

Pepton

1,0g

Sữa bột

2,6g

Cao thịt

0,5g

Cao nấm men

1,3g

Cao nấm men

0,4g

(NH4)2SO4

0,2g

(NH4)2SO4

0,2g

KH2PO4

0,25g

KH2PO4

0,25g

MnSO4.H2O

0,001g

MnSO4.H2O

0,001g

FeSO4.7H2O

0,001g

FeSO4.7H2O

0,001g

MgSO4.7H2O

0,03g

MgSO4.7H2O

0,03g

Nước máy vđ

100ml

Nước máy vđ

100ml

CaCO3

5,0g

Điều chỉnh pH = 6,3 – 6,5

Điều chỉnh pH = 6,3 – 6,5

.
Các dung dịch sử dụng: được pha theo hướng dẫn của DĐVN IV [3]
 Dung dịch Fehling A: Cân chính xác 34,66g CuSO4.5H2O, hòa tan
trong nước đã acid hóa bằng 2-3 giọt H2SO4 loãng. Thêm nước vừa đủ
500ml.
 Dung dịch Fehling B: Cân 173g muối kép Natri kali tactrat
NaK(C4H4O6) và 50g NaOH, hòa tan trong 300ml H2O, để nguội, thêm
H2O vừa đủ 500ml.
 Dung dịch H2SO4 25%: Đong chính xác 71ml H2SO4 98% pha với
chính xác 500ml H2O, làm nguội.
 Dung dịch Na2S2O3 0,1N: Cân chính xác 25,0g Na2S2O3 và 0,2g
Na2CO3 hòa tan trong nước không chứa CO2 vừa đủ 1000ml.