kỹ thuật DAN tái tổ hợp

MỤC LỤC
MỤC LỤC............................................................................................1
TÓM LẠI...........................................................................................33
LỜI NÓI ĐẦU
Công nghệ sinh học (Biotechnology) là một lĩnh vực công nghệ cao, công
nghệ của thế kỷ XXI. Ít năm trước đây, trước thềm của thế kỷ XXI, đã có nhiều
ý kiến nhận định, phán đoán của các nhà khoa học, các nhà nghiên cứu chiến
lược, các nhà hoạch định chính sách,… về một ngành khoa học mũi nhọn có thế
sẽ được phát triển trong tương lai.
Có ý kiến thì cho rằng ngành khoa học mũi nhọn trong tương lai ở thế kỷ
XXI sẽ là ngành công nghệ thông tin. Một số ý kiến khác lại cho rằng phải là
ngành công nghệ điện tử viễn thông hay của các cuộc hành trình bay vào vũ trụ,
v.v...Mỗi người một ý, chẳng ai chịu ai. Mỗi người, mỗi nhóm đều cố gắng đưa
ra những dẫn chứng có tính thuyết phục cao nhất, nhằm chứng minh cho nhận
định của mình là đúng, là có lý. Thế nhưng, gần đây, tất cả đã cùng đồng ý với
nhau rằng: Thế kỷ XXI này chắc chắn sẽ là thế kỷ của Công nghệ sinh học!
Thực vậy, công nghệ sinh học (CNSH) là một bước tiến mới nhất trong nỗ
lực lâu dài chinh phục tự nhiên để nâng cao điều kiện sống của con người.
Những năm gần đây, trong bản đại hợp tấu khoa học và công nghệ, bộ đàn dây
CNSH đã bắt đầu tấu lên những khúc nhạc mới lạ, với nhiều cung bậc, nhiều tiết
tấu mà thậm chí chúng ta chưa từng nghe. Những khúc nhạc mới lạ này đã thực
sự có những đóng góp tích cực, quan trọng trong việc tạo ra nhiều của cải vật
1
chất, các phương tiện tồn tại và phát triển của xã hội loài người. CNSH đã được
phát triển và ứng dụng trong nhiều ngành, nhiều lĩnh vực của cuộc sống. Chúng
ta đã sử dụng CNSH trong lĩnh vực nông-lâm - ngư nghiệp, lĩnh vực y-dược, bảo
vệ môi trường,…thậm trí là cả trong lĩnh vực thể thao. Trong mỗi lĩnh vực,
CNSH đều đã mở ra được các cách thức, phương thức làm cho cuộc sống an
toàn hơn, mạnh khoẻ hơn và năng suất cao hơn.
Từ xa xưa, công nghệ sinh học (CNSH cổ truyền và CNSH cận đại) đã
được loài người ứng dụng phục vụ nhiều nhu cầu cuộc sống. Từ những thao tác

rất nhỏ trong cuộc sống như muối dưa, muối cà đến việc sản xuất ở qui mô công
nghiệp các sản phẩm của công nghệ lên men, công nghệ vi sinh như các đồ uống
có cồn (rượu, bia ), các dung môi hữu cơ, các vitamin, các loại vaccine, thuốc trừ
sâu sinh học, phân bón sinh học, … Vài thập kỷ gần đây, với sự ra đời của
CNSH hiện đại ( gồm: Công nghệ di truyền - Genetic engineering, công nghệ tế
bào - Cell engineering, công nghệ vi sinh vật/ công nghệ lên men - Microbial
engineering/ Fementation engineering, công nghệ enzym/ protein - Enzym/
Protein engineering và CNSH môi trường - Environmental biotechnology ), loài
người đã và đang có thể sửa chữa, trao đổi, cải tạo, tạo mới vật chất di chuyền ở
cấp độ phân tử. Thực tế phát triển và ứng dụng CNSH hiện đại trên cơ sở kế
thừa và phát huy CNSH cổ truyền và cận đại, những năm gần đây, loài người đã
có thể tuyển chọn và dần tạo thêm được nhiều giống cây trồng, vật nuôi mới có
năng suất, chất lượng cao, sức chống chịu tốt; Đã và đang có thể chuẩn đoán,
phòng ngừa hay cứu chữa các bệnh hiểm nghèo, bệnh di truyền như bệnh tiểu
đường, khối u, ung thư, lùn bẩm sinh, thiếu máu; các bệnh nhiễm sắc thể thường
và nhiễm sắc thể giới tính; viêm gan B, viêm não Nhật Bản, bại liệt, sốt rét, …;
Đã có thể tạo ra ngày một nhiều các chủng, loài vi sinh vật mới hoặc chỉ định
các vi sinh vật này tạo ra các protein, enzim có hoạt tính cao hơn hay các sản
phẩm khác mà vốn dĩ trước đây chúng ta không làm được…
2
ADN tái tổ hợp là kỹ thuật đầu tiên của hàng loại kỹ thuật Công nghệ sinh
học hiện đại khác, tập hợp lại gọi là Công nghệ di truyền (Genetic technology)
…
NỘI DUNG TIỂU LUẬN
1. Lược sử ra đời của kỹ thuật ADN tái tổ hợp
Năm 1972 các phân tử ADN tái tổ hợp đầu tiên được tạo ra tại trường
Đại học Stanford ( Mỹ ) do nhà khoa học Paul Berg và các cộng sự thực hiện
bằng cách sử dụng đặc tính cắt của enzym giới hạn (Restriction enzym) và khả
năng nối các mạch ADN với nhau của enzym nối ligase. Nhờ kỹ thuật này vật
chất di truyền thường là một hay và gen có thể lắp ghép vào phân tử ADN có

nguồn gốc khác ( ví dụ lắp ghép gen của động vật, thực vật vào plasmid của vi
khuẩn hoặc vào phagơ
λ
) để hình thành ADN tái tổ hợp. Khi các cơ thể ADN tái
tổ hợp được tạo thành có thể được chuyển từ cơ thể này ( cơ thể cho ) sang cơ
thể hoặc tế bào khác ( cơ thể nhận hoặc tế bào nhận ). Điều cơ bản và quan trọng
là các gen tái tổ hợp này vẫn di trì chức năng cũ của nó trong cơ thể, hoặc tế bào
nhận.
Năm 1973 các nhà khoa học đã nối nhiều đoạn ADN vào plasmid được
tách ra từ vi khuẩn E.coli. Plasmid này có thể hoạt động, tự sao chép khi đưa vào
tế bào vi khuẩn E.coli, từ đó tạo ra công nghệ quan trọng trong công nghệ di
truyền là tách dòng gen.
3
Thành tựu đầu tiên của kỹ thuật ADN tái tổ hợp là việc sản xuất ra
hoocmon sinh trưởng người (hGH-human growth hoocmon) nhờ vi sinh vật
nhận là Escherichia coli (E.coli). Các nhà khoa học đưa được gen mã hoá hGH
vào E.coli. E.coli có ADN tái tổ hợp đã sản sinh ra một lượng rất lớn hoocmon
sinh trưởng người và được sử dụng vào thực tiễn y học.
Vào những năm đầu của thập kỷ 80 thế kỷ XX, nhờ kỹ thuật ADN tái tổ
hợp, người ta đã sản xuất interferol, sản xuất protein chống đông máu v.v…
2. Kỹ thuật ADN tái tổ hợp và một số ứng dụng.
2.1. Kỹ thuật ADN tái tổ hợp.
ADN tái tổ hợp (recombinant DNA) là ADN được tạo ra từ hai hay nhiều
nguồn vật liệu di truyền khác nhau. Phân tử ADN tái tổ hợp được tạo ra nhờ kỹ
thuật ghép nối các đoạn ADN của các cá thể khác nhau trong cùng một loài,
hoặc của các loài khác nhau.
Kỹ thuật tái tổ hợp ADN được thực hiện qua nhiều công đoạn phức tạp,
tinh vi, thực chất là một công nghệ gồm các bước chủ yếu sau:
Bước 1: Nuôi tế bào cho plasmid để tạo vector chuyển gen và nuôi tế bào cho (ví
dụ tế bào của người) để cung cấp ADN.

Bước 2: Tách chiết ADN plasmid và ADN tế bào cho. Bước này còn được gọi là
phân lập gen.
Bước 3: Cắt cả hai loại ADN (ADN plasmid và ADN tế bào cho) bằng cùng một
loại enzym giới hạn (restriction enzym-RE). Ví dụ, sử dụng enzym giới hạn
endonuclease EcoRI tạo ra các đầu so le.
Bước 4: Trộn chung ADN plasmid đã bị cắt với ADN tế bào cho cũng đã bị cắt
bởi một loại enzym giới hạn như đã nêu trên.
Bước 5: Bổ sung enzym nối ligase để tạo ra ADN tái tổ hợp hoàn chỉnh.
Bước 6: Biến nạp ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ (ví dụ vi khuân E.coli) và nhân
dòng.
4
Bước 7: Chọn lọc và tạo dòng tế bào chủ (vi khuẩn) mang ADN tái tổ hợp và
theo dõi hoạt động, biểu hiện của gen thông qua sản phẩm của gen lấy từ tế bào
cho.

2.1.1. Các enzym chủ yếu dùng trong kỹ thuật ADN tái tổ hợp
2.1.1.1. Các enzym giới hạn
Trong công nghệ di truyền muốn tạo ra ADN tái tổ hợp để đưa vào tế bào
chủ cần phải có công cụ cắt plasmid hình vòng và đoạn ADN của tế bào rồi cho
chúng nối lại với nhau. Công cụ cắt ADN là các enzym giới hạn
a) Khái niệm về enzym giới hạn
5
Thông thường tế bào vi khuẩn bị nhiễm phagơ (thể thực khuẩn) thì vi
khuẩn đó bị phagơ phá huỷ. Một số chủng vi khuẩn sau khi bị nhiễm phagơ lại
không bị phá huỷ, do trong tế bào vi khuẩn này có loại enzym có khả năng cắt
ADN phagơ thành những đoạn nhỏ. Năm 1970, Hamilton Smith là người đầu
tiên tách được loại enzym này từ loại vi khuẩn Haemiphilus influenzae được gọi
tên là HinII. Ngay sau đó, các nhà khoa học đã nhận thấy rằng, phần lớn các loài
vi khuẩn mang loại enzym có chức năng cắt ADN lạ xâm nhập để bảo vệ tế bào
khỏi bị xâm nhập của các ADN lạ. Những enzym đó được gọi là enzym giới

hạn.
Enzym giới hạn là enzym có khả năng nhận biết những đoạn trình tự ADN
nhất định và cắt ADN ở ngay thời điểm này hay ở điểm kế cận. Tuỳ theo
phương thức cắt và nguồi gốc của enzym giới hạn mà người ta phân loại và đặt
tên cho các enzym giới hạn đó
b) Phân loại enzym giới hạn
Các enzym giới hạn được phân thành 3 kiểu I, II và III. Các enzym giới
hạn thường dùng phổ biến trong công nghệ ADN tái tổ hợp, công nghệ di truyền
thuộc kiểu II. Các enzym này cắt bên trong mạch ADN (không phân huỷ từ 2
đầu của ADN) nên còn được gọi là enzym endonuclease. Enzym giới hạn kiểu II
thực chất là endonuclease giơi hạn kiểu II.
Các enzym giới hạn kiểu II: Cách gọi tên các enzym giới hạn kiểu II cũng
như các enzym giới hạn khác dựa trên quy ước chung. Tên enzym giới hạn được
ghép bởi chữ cái đẩu tiên là tên chi và hai chữ tiếp theo là hai chữ cái tên loài
của vi sinh vật mà enzym được tách chiết. Nhưng chữ và số La mã tiếp theo là
tên của chủng và dòng của loài sinh vật cụ thể đã tách chiết enzym:
Ví dụ: E.coRI (thuộc chi Escherichia, loài coli, chủng Ry 13) Một số loại
khác như E.coRV, BamHI, HaeIII, Smal, …
2.1.1.2. Các enzym polymerase
a) Khái niệm
6
Các enzym polymerase xúc tác cho quá trình sao chép các axit nucleic
(ADN, hoặc ARN) được sử dụng nhiều trong Công nghệ di truyền. Khi nói về
một enzym polymerase nào đó, người ta thường dùng thuật ngữ “ phụ thuộc
ADN ” hoặc “ phụ thuộc ARN ” để chỉ axit nucleic mà enzym này xúc tác cho
việc sao chép. ADN polymerase phụ thuộc ADN thì sao chép ADN sang ADN;
ADN polymerase phụ thuộc ARN thì sao chép ARN sang ADN, còn enzym
ARN polymerase phụ thuộc ADN thì phiên mã ADN sang ARN. Các enzym này
tổng hợp axit nucleic bằng cách nối các nucleotit với nhau theo nguyên tắc bổ
sung dựa theo mạch khuôn. Quá trình tổng hợp mạch mới bổ sung diễn ra theo

chiều 5’-3’ và sự khởi đầu cần có đầu 3’-OH tự do.
b) Phân loại
Các ADN polymerase: (Enzym ADN polymerase I, Enzym T
4
ADN
polymerase, Enzym Taq polymerase …) Hiện nay còn có nhiều loại ADN
polymerase khác lưu hành trên thị trường như T
7
ADN polymerase, Vent ADN
polymerase …
Các enzym ARN polymerase: Có ba loại enzym ARN polymerase thường
được dùng trong thực tế, đó là SP
6
ARN polymerase, T
3
ARN polymerase và T
7
ARN polymerase …
Enzym phiên mã ngược (Reverse transcriptase): Có khả năng tổng hợp
ADN một mạch gọi là ADN bổ trợ (cADN) từ khuôn mARN, hoặc từ một đoạn
polynucleotit được tổng hợp bằng con đường hóa học. Nhờ có con đường phiên
mã ngược này mà có thể tổng hợp được hầu hết các gen riêng biệt nào đó nếu
như có mặt mARN của gen đó. Các cADN mạch đơn có thể biến thành mạch
kép nhờ ADN polymerase và được gọi là cADN mạch kép (c-DNA duplex).
Đoạn cADN mạch kép có thể gắn vào plasmid rồi biến nạp vào vi khuẩn, từ đó
tạo dòng c-ADN. Nếu cADN có nguồn gốc từ một gen thì ta tạo được dòng gen.
Trong trường hợp mARN trưởng thành khi đã ở ngoài nhân thì ta sẽ thu được
7
dòng gen chỉ chứa những đoạn mã hóa (exon). Không có đoạn không mã hóa
(intron).

2.1.1.3. Các enzym nối (Ligase)
Enzym ligase là enzym nối quan trọng trong tế bào. Các enzym này xúc
tác hình thành các liên kết phosphodiester để nối các đoạn axit nucleic với nhau.
ADN ligase xúc tác nối hai đoạn ADN với nhau, ARN ligase là enzym chủ yếu
được sử dụng rộng rãi. Có một số loại enzym nối khác nhau, nhưng enzym T
4
ADN ligase là enzym chủ yếu được sử dụng rộng rãi nhất trong các phòng thí
nghiệm về công nghệ di truyền.
Có 3 loại enzym nối thường dùng trong Công nghệ di truyền. Enzym
E.coli ADN ligase được tách chiết từ vi khuẩn E.coli, xúc tác phản ứng nối hai
đoạn trình tự ADN có đầu sole. Enzym T
4
ADN ligase được tách chiết từ phage
T
4
xâm nhiễm vào E.coli, có chức năng giống như E.coli ADN ligase nhưng lại
có khả năng nối hai đoạn trình tự ADN có đầu bằng và là enzym nối được ưa
chuộng nhất hiện nay. Enzym T
4
ARN ligase tách chiết từ phage T
4
xâm nhiễm
E.coli, có khả năng nối hai trình tự ARN bằng các liên kết phosphodiester.
Ngoài các loại enzym nối kể trên, hiện nay người ta còn sử dụng các đoạn
nối (đầu dính–adaptor) cho các enzym cắt đầu bằng. Adaptor xúc tác nối các
đoạn ADN do có các enzym giới hạn cắt đầu bằng từ đó tạo nên đầu so le. Mỗi
đoạn enzym cắt đầu bằng đều có các loại adaptor đặc trưng riêng.
2.1.1.4. Các nuclease
Các enzym nuclease phân hủy các axit nucleic bằng cách làm đứt các liên
kết phosphodieste là liên kết nối các nucleotit cùng một mạch với nhau. Ngoài

các enzym giới hạn đã nêu ở trên còn có các loại nuclease chủ yếu sau:
Enzym ADNase I (endonuclease) tách chiết từ tụy của bò, xúc tác phản
ứng thủy phân các liên kết ngay sau một bazo nito ở cả mạch đơn và mạch kép
hoàn toàn ngẫu nhiên.
8
Enzym S1 nuclease (endonuclease) là enzym tách chiết từ nấm mốc
Aspegillus oryzae. S1 nuclease BAL 3 (endonuclease) phân cắt cả 2 đầu 5’ và 3’
của ADN và không có khả năng cắt nội liên kết.
Enzym exonuclease III là một 3’ exonuclease cắt đầu 3’ của mạch đơn và
tạo thành các đoạn ADN có đầu 5’ nhô ra.
Enzym ARNase tách chiết từ tụy bò. Enzym này thường được sử dụng để
loại bỏ ARN trong hỗn hợp ADN và ARN.
Enzym ARNase H dùng để loại bỏ ARN trong các phân tử lai ADN-ARN,
nhất là sau phản ứng phiên mã ngược để hình thành mạch thứ hai của cADN, từ
đó tạo nên phân tử cADN kép.
2.1.2. Các vector sử dụng trong kỹ thuật ADN tái tổ hợp
Muốn chuyển được gen mong muốn từ thể cho sang vật chủ nhận (thể
nhận), hoặc tách dòng gen, điều cơ bản là cần phải có vật chuyển gen (vector
chuyển gen). Vector chuyển gen là phân tử ADN nhỏ có khả năng mang được
gen cần thiết. Vector chuyển gen phải có các đặc điểm quan trọng cần thiết sau:
Có điểm khởi đầu sao chép (origin of replication – ori) để tự sao chép mà
tồn tại độc lập trong tế bào.
Có các đoạn trình tự nhận biết cho enzym giới hạn cắt rồi để hở tạo nơi
lắp ráp các đoạn gen lạ.
Có trình tự khởi điểm (promoter).
Có dấu chuẩn chọn lọc cho phép dễ dàng phát hiện nhận biết chúng trong
tế bào chủ nhận. Thông thường dấu chuẩn chọn lọc là các gen kháng chất kháng
sinh, hoặc gen tổng hợp chất màu.
Để đảm bảo cho được tính bền vững của ADN tái tổ hợp, ngoài các đặc
điểm trên vector chuyển gen cũng cần có những đặc tính khác để cho việc tạo,

tách dòng dễ thực hiên như:
Chứa các gen vô hiệu hóa các đoạn ADN không mong muốn bị gắn nhầm
vào.
9
Có khả năng tạo nhiều bản sao để khi tách khỏi tế bào được số lượng lớn,
đảm bảo sự khuếch đại của gen lạ mong muốn được gắn vào.
Giá trị của các vector chuyển gen ở chỗ nó được cấu tạo thuận tiện cho
mục đích sử dụng. Hiện tại chưa có loại vector chuyển gen toàn năng, mà cần
phải lựa chọn vector chuyển gen cho tưng đối tượng và tùy thuộc và kích thước
của đoạn gen cần được chuyển.
Các vector chuyển gen có các ứng dụng chủ yếu:
 Tạo dòng, nhân dòng các đoạn trình tự, hoặc gen để tạo nhiều bản sao
giống nhau.
 Nghiên cứu sự biểu hiện của một đoạn trình tự ADN, hoặc một gen.
 Chuyển gen vào tế bào vi sinh vật khác (vật chủ nhận).
 Sản xuất các ARN.
 Sản xuất protein được tổng hợp từ gen đã được tạo dòng. Do tính chất
quan trọng và nhiều ứng dụng nên các vector chuyển gen ngày càng được
khám phá, hoàn thiện không ngừng. Từ những vector chuyển gen sẵn có
trong tự nhiên như plasmid ở vi khuẩn, ngày nay người ta đã tạo ra nhiều
loại vector phức tạp ứng dụng vào nhiều mục đích khác nhau, thậm chí tạo
ra cả nhiễm sắc thể nhân tạo.
2.1.2.1. Các vector plasmid
Nhiều loại plasmid được tim thấy trong tự nhiên ở các vi khuẩn và trong
một số nấm men. Chúng là những phân tử ADN mạch vòng, tương đối nhỏ so
với nhiễm sắc thể của tế bào vật chủ. Các plasmid tồn tại chủ yếu ở trạng thái
ngoài nhiễm sắc thể. Mặc dù các plasmid nói chung có thể bỏ qua (chúng không
cần thiết cho các quá trình sinh trưởng và phân chia của tế bào) nhưng chúng
thường truyền các tính trạng (chẳng hạn: tính bền vững với kháng sinh) cho vật
chủ, do vậy giúp cho việc lựa chọn dể dàng trong những điều kiện xác định. Các

gen bền vững với kháng sinh do ADN plasmid mã hóa thường được sử dụng
10
trong công việc thiết kế các vector dùng trong kỹ thuật di truyền vì chúng cung
cấp một phương tiện thuận lợi để lựa chọn các tế bào có mang plasmid.
Mỗi tế bào vi khuẩn có trung bình khoảng 20 plasmid. Các plasmid có thể
chia thành 2 nhóm:
 Tiếp hợp
 Không tiếp hợp
Các plasmid tiếp hợp có thể tự truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác
thông qua quá trình tiếp hợp. Quá trình này đòi hỏi các chức năng của các đoạn
đặc thù tra (transfer) và mob (mobilising) nằm trên plasmid.
Các plasmid không tiếp hợp thì không tự truyền đi được để vào vật nhận.
Plasmid không tiếp hợp thường nhỏ, sao chép một cách thoải mái và tồn tại
trong tế bào với số bản sao lớn hơn so với plasmid tiếp hợp. Các plasmid luôn
được cải biến để ngày càng hoàn thiện hơn qua nhiều thế hệ, thuận tiện cho công
nghệ ADN tái tổ hợp.
Plasmid thế hệ thứ nhất là những plasmid đầu tiên được sử dụng để tách
dòng như pSC1001, ColE1 …
11
Plasmid thế hệ thứ 2 được tạo ra bằng cách kết hợp các đặc tính quý của
nhiều plasmid tự nhiên, gắn thêm gen chỉ thị để tạo nên một plasmid mới. Điển
hình cho plasmid thế hệ thứ hai và cũng là một trong những plasmid được sử
dụng rộng rãi nhất trong Công nghệ di truyền, đó là plasmid pBR322
12
Plasmid nhân tạo thế hệ thứ 3 rất mạnh, có kích thước nhỏ và có một đoạn
đa liên kết (polylinker), hoặc điểm đa tách dòng (multiple cloning site). Đoạn đa
liên kết là đoạn polynucleotit tổng hợp, mang một chuỗi các vị trí nhận biết của
nhiểu loại enzym giới hạn. Nhóm plasmid này là các plasmid pUC và điển hình
là pUC18.
13